1.1.

Crescimentos microbiano
O crescimento celular definido como o aumento coordenado de todos os constituintes celulares. Este aumento pode estar associado ao aumento do tamanho de uma clula ou do nmero de clulas, em consequncia da multiplicao celular, ou a ambos. O crescimento microbiano normalmente associado ao crescimento de uma populao de clulas de um dado microrganismo, ou seja, com o aumento do nmero de clulas da populao. Grande parte dos microrganismos multiplica-se por fisso binria ou por gemulao, em resultado do que uma clula dar origem a duas ao fim de um certo tempo, tempo de gerao ou de duplicao. Durante um ciclo de diviso celular correspondente ao tempo de gerao ou duplicao, todos os componentes celulares mensurveis (por exemplo, cidos nucleicos, protenas, lpidos) duplicam, acompanhando a duplicao do nmero de clulas e da quantidade de biomassa presente. Em condies nutricionais e ambientais adequadas, s quais o microrganismo est adaptado, a populao celular encontra-se numa fase de crescimento equilibrado, a fase de crescimento exponencial. O crescimento microbiano pode ocorrer em meio lquido com as clulas em suspenso ou associado a superfcies, sob a forma de biofilmes.

Crescimento de clulas em suspenso Curva de crescimento em meio lquido Curva de crescimento microbiano
O crescimento microbiano frequentemente acompanhado com base na curva que representa o crescimento de uma populao de um determinado microrganismo, em sistema fechado ou em batch (cultura em descontnuo). Neste caso, um meio de cultura lquido contendo os nutrientes necessrios ao crescimento celular inoculado com uma populao de clulas viveis do microrganismo em causa e incubado em condies ambientais favorveis sua multiplicao, como ilustrado na figura. Se acompanharmos o crescimento da populao de clulas ao longo do tempo e representarmos graficamente o logaritmo do nmero de clulas por unidade de volume (ou, da Densidade ptica da cultura, D.O, ou da concentrao da Biomassa Microbiana, X) em funo do tempo, obter-se- uma curva caracterstica, como ilustrado na animao, que exibe as vrias fases do crescimento microbiano em descontnuo. Fases do crescimento em descontnuo Fase de latncia (ou "LAG")

Durante o perodo de tempo que se segue inoculao do meio de cultura, as clulas do microrganismo tm normalmente que se adaptar ao novo meio. Durante este perodo inicial, pode, pois, no ocorrer multiplicao celular, pelo menos em condies de equilbrio. Durante este perodo verifica-se, por exemplo, a sntese de novas enzimas. Estas podem ser necessrias sntese de compostos essenciais ao crescimento e que no se encontrem presentes no meio de cultura ou para a hidrlise ou metabolizao dos compostos presentes e que so as nicas fontes de carbono, azoto, etc, a que o organismo no se encontra adaptado. Esta fase dita de latncia pode ter uma durao mais ou menos extensa consoante o estado fisiolgico da cultura usada como inculo e as condies de crescimento. Por exemplo, a presena de uma % elevada de clulas no-viveis no inculo, um meio de cultura contendo um nutriente essencial difcil de metabolizar ou a incubao em condies ambientais de stresse a que o organismo no se encontra adaptado, conduzem normalmente a fases de latncia extensas. Fase exponencial (ou "EXP") Aps um curto perodo de acelerao, a taxa de crescimento da populao microbiana torna-se constante, isto , as clulas sofrem diviso e o seu nmero duplica aps um determinado intervalo de tempo. Durante esta fase, em que todos os nutrientes esto presentes em excesso, os microrganismos dividem-se e a populao cresce com uma taxa especfica de crescimento mxima que depende do potencial gentico do microrganismo, da composio do meio de cultura e das condies de crescimento (temperatura, pH, disponibilidade de gua, etc.). Fase de desacelerao Durante esta fase ocorre um declnio da taxa especfica mxima de crescimento, em resultado da diminuio para valores limitantes do crescimento da concentrao de um (ou mais) nutrientes essenciais ao metabolismo celular e/ou do aumento da concentrao de produtos do metabolismo txicos para as clulas. Fase estacionria Na fase estacionria o esgotamento de um nutriente essencial e/ou a acumulao de produtos inibidores do metabolismo leva a que diviso da populao pare. No entanto, em carncia de nutrientes, as clulas podem manter-se viveis durante perodos de tempo mais ou menos longos, custa das reservas endgenas, que usam em processos de manuteno. Contudo, mais cedo ou mais tarde, verifica-se um declnio da concentrao de clulas viveis durante a fase de morte celular. Fase de morte

Durante a fase de morte ocorre a perda irreversvel da capacidade de diviso celular (morte celular). Tal origina um decrscimo da concentrao de clulas viveis na populao microbiana ao longo do tempo.

Acompanhamento da curva de crescimento

Avaliao quantitativa do crescimento microbiano A determinao da evoluo ao longo do tempo da concentrao de um componente celular, da concentrao de clulas ou da biomassa em suspenso em meio de crescimento lquido, permite obter experimentalmente a curva de crescimento da populao microbiana e calcular a taxa especfica de crescimento e o tempo de gerao ou de duplicao do microrganismo em questo nas condies de crescimento testadas.

Para acompanhar e traar a curva de crescimento de uma populao microbiana, ento necessrio fazer a avaliao quantitativa da evoluo da concentrao de clulas ao longo do tempo. Esta pode basear-se em mtodos directos, como por exemplo:

contagem de clulas totais; contagem de clulas viveis; determinao da biomassa seca. Ou em mtodos indirectos, como o caso da:

Anlise espectrofotomtrica da Densidade ptica (D.O.) da cultura Embora, em teoria, quando o crescimento de uma populao microbiana equilibrado, o seu acompanhamento possa basear-se na quantificao de qualquer constituinte celular (por exemplo cidos nucleicos, protenas, lpidos), o crescimento usualmente acompanhado com base na determinao daDensidade ptica da cultura, da concentrao de clulas (totais ou viveis) ou da massa celular(biomassa). A seleco do mtodo a utilizar depende do tipo de microrganismo e do problema particular em causa.

Contagem de clulas totais

Mtodo de contagem directa de clulas totais atravs da cmara de contagem Neubauer e recurso ao microscpio.

Este mtodo baseia-se no preenchimento com uma suspenso de clulas a contar, de uma cavidade situada entre uma lmina e uma lamela. Esta cavidade, localizada no centro da lmina, encontra-se dividida em quadrados de dimenses bem definidas e, assim, de volume conhecido.

Utilizando o microscpio, possvel contar o nmero de clulas presentes em cada quadrado e, assim, conhecer o nmero de clulas por unidade de volume, como ilustrado na figura acima. A lmina utilizada para este tipo de contagem frequentemente designada por hemocitmetro, dado que tem origem nas cmaras inicialmente concebidas para contar clulas do sangue. A contagem directa ao microscpio permite estimar fcil e rapidamente o nmero total de clulas numa populao microbiana. Contudo, tem vrias limitaes, nomeadamente:

No permite distinguir clulas viveis de clulas mortas; Clulas muito pequenas, como o caso das clulas de muitas bactrias, so difceis de distinguir; um mtodo pouco preciso; O fraco contraste entre as clulas transparentes e o meio circundante, quando a amostra no corada, dificulta (ou inviabiliza) a contagem. Nestes casos, necessrio utilizar um microscpio de contraste de fase;

O mtodo no adequado para quantificar suspenses celulares pouco densas (por exemplo, no caso de suspenses bacterianas com menos de 106 clulas/mililitro); Clulas mveis devem ser imobilizadas antes de se proceder contagem.

Contagem de clulas viveis Contagem de Unidades Formadoras de Colnias (UFCs) Na contagem directa ao microscpio referida anteriormente so contadas tanto clulas viveis como clulas mortas. Em muitos casos estamos interessados somente na contagem do nmero de clulas viveis. O modo usual de realizar uma contagem de clulas viveis consiste em determinar o nmero de clulas capazes de formar colnias num meio de cultura slido com composio adequada ao crescimento do microrganismo em causa. Assume-se que cada colnia originada a partir de uma nica clula vivel, o que nem sempre verdade (p. ex. duas ou mais clulas que formem um agregado, daro origem a uma nica colnia). Por isso, os resultados so normalmente expressos em Unidades Formadoras de Colnias (UFCs) e o mtodo vulgarmente designado por contagem de UFCs. Procedimento geral para a contagem de UFCs numa suspenso celular, atravs do recurso contagem de colnias isoladas por espalhamento, aps sujeio da suspeno de clulas a diluies sucessivas. Aps diluio conveniente da suspenso celular em gua ou em soluo salina (0,9% (p/v) de NaCl) estreis, espalha-se um volume conhecido (0,1 ml) de cada suspenso diluda sobre meio de cultura slido com composio adequada para a multiplicao celular do microrganismo em causa contido numa caixa ou placa de Petri. Pretende-se que as clulas fiquem distanciadas de modo a que,

aps vrias divises celulares, originem colnias visveis vista desarmada (o que s se verifica aps mais de um dia de incubao a temperatura ptima, por exemplo 30-35C para organismos mesfilos) e bem isoladas umas das outras. O grau de diluio da suspenso celular deve ser escolhido de modo a que o nmero de colnias isoladas em cada placa no seja inferior a 20 ou superior a 300 colnias. Nota Todo o material utilizado deve ser esterilizado previamente e todos os passos do procedimento devem ser realizados em condies de asspsia, ou seja, junto chama do bico de Bunsen e/ou numa cmara de fluxo laminar. Apesar dos erros experimentais associados contagem do nmero de UFCs (p. ex. erros cometidos nas diluies ou associados ao deficiente arrefecimento do espalhador de vidro aps esterilizao pelo calor na chama do bico de Bunsen, ou ao deficiente isolamento das clulas presentes nas amostras diludas), este mtodo fornece uma informao muito importante sobre o nmero de clulas viveis numa populao. O mtodo tem a virtude de ser bastante sensvel, permitindo que suspenses celulares contendo muito poucas clulas possam ser quantificadas. O uso de meios de cultura selectivos e condies de cultura especficas para incubao das placas de Petri inoculadas com as suspenses celulares, pode permitir o isolamento de colnias e, por conseguinte, a contagem de microrganismos diferentes numa populao mista. possvel, assim, com base neste mtodo, detectar uma contaminao microbiana em alimentos, amostras clnicas, amostras de gua, etc. Anlise espectrofotomtrica da Densidade ptica (D.O.) de uma cultura microbiana A avaliao da turbidez de uma cultura microbiana constitui um mtodo rpido, embora indirecto, de estimar a concentrao celular. Um feixe de luz focado numa suspenso microbiana parcialmente desviado (disperso da luz) pelas clulas, e a percentagem de luz no desviada (transmitncia, T) medida por recurso a um espectrofotmetro. A quantidade de luz que atravessa a suspenso celular depende da concentrao de clulas na suspenso e do tamanho destas, do comprimento de onda e da intensidade(I0) da luz incidente e do dimetro do tubo que contm a suspenso celular. A Densidade ptica (D.O.) da cultura corresponde Absorvncia, que determinada com base na expresso D.O = log ( I0/I )), onde I0 a intensiade da luz incidente e I a intensidade da luz transmitida atravs da suspenso de clulas. Comprimentos de onda frequentemente usados para medio da Densidade ptica de suspenses de clulas de bactrias ou leveduras incluem 540, 600 ou 640 nm.

Representao do percurso efectuado pelo feixe de luz emitido pela fonte num espectrofotmetro (percurso ptico).

Representao do percurso efectuado pelo feixe de luz emitido pela fonte num espectrofotmetro (percurso ptico). A fotoclula (detector) quantifica a luz que no foi desviada pelas clulas presentes na suspenso microbiana, I, medindo-se a Densidade ptica (D.O) dessa suspenso (com base na Absorvncia).

Fig. 1 - Para suspenses celulares muito concentradas deixa de haver uma relao linear entre a D.O. da cultura e o nmero de clulas na suspenso celular (grfico esquerda). Exemplo de duas curvas de crescimento reais, obtidas com base na medio da D.O. da suspenso celular ao longo do tempo, para dois microrganismos diferentes (grfico direita).

Existe, dentro de certos limites, uma relao linear entre a Absorvncia ou D.O. da cultura e o nmero total de clulas por mililitro de suspenso, ou seja a concentrao celular. Contudo, para suspenses celulares muito densas (por exemplo com superior a 0,4) frequentemente

necessrio diluir as culturas de modo a que todos os valores de D.O. medidos estejam includos na parte linear da curva D.O. versus concentrao celular (ver grfico do lado esquerdo). Este mtodo no permite distinguir entre clulas viveis e clulas mortas e no permite obter directamente valores absolutos da concentrao de clulas, sendo especialmente utilizado quando se pretende confirmar se uma dada cultura se encontra em crescimento ou para acompanhar o crescimento microbiano com base no aumento da D.O. medida a um comprimento de onda particular.

Actividade de auto-avaliao

No grfico, do lado direito, so apresentadas 2 curvas de crescimento tpicas (em unidades de Densidade ptica) de dois microrganismos com diferentes taxas de crescimento. Qual dos dois se divide mais depressa?

Organismo A Organismo B

Tempo de gerao ou duplicao

Fig. 2 - Representao do processo de duplicao de um microrganismo ao longo do tempo O tempo de gerao ou duplicao de um microrganismo definido como o tempo necessrio para que ocorra uma gerao, isto , para a formao de 2 clulas a partir de uma. Entre os microrganismos procariotas (bactrias), esta ocorre principalmente por fisso binria. O tempo de gerao ou duplicao varia grandemente entre microrganismos. Por exemplo, em condies nutricionais e ambientais ptimas, a bactria Escherichia coli pode ter um tempo de duplicao de somente 30 minutos. Algumas bactrias podem sofrer diviso celular mais rapidamente, mas a maior parte divide-se com tempos de duplicao de 1-3 horas. Alm disso, o

tempo de gerao/duplicao de um dado microrganismo depende da composio do meio de crescimento e de condies ambientais, como a temperatura, pH, disponibilidade de gua, etc.. Clculo do tempo de gerao ou duplicao, g, de uma populao microbiana em crescimento exponencial
Tempo 0 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 ... 10 N total de clulas 1 2 4 8 32 32 64 128 256 512 1024 2048 4096 8192 ... 1048576

(nmero de clulas no inicio do crescimento exponencial) (nmero de clulas aps 5,5 horas de crescimento exponencial) Com base na equao (2):

tem-se que n, o nmero mdio de geraes que ocorreram durante as 5,5 horas de crescimento exponencial igual a 10. Tal significa que o tempo mdio de uma gerao (g) 0.55 h ou 33 minutos.

Crescimento exponencial
Caracterizao O crescimento exponencial de uma populao microbiana em suspenso em meio lquido caracterizado pela duplicao do nmero de clulas e, por conseguinte, da massa (biomassa).

Processo de duplicao de um microrganismo durante a fase de crescimento exponencial. Aps a duplicao (ou replicao) do material gentico a clula divide-se para dar uma clula-filha com as mesmas caractersticas da clula inicial.

Cintica do crescimento exponencial Durante o crescimento exponencial, o nmero de clulas aumenta de acordo com uma exponencial de base 2 (ver Tempo de gerao ou duplicao). De facto, a duplicao de 2 clulas em 4 pode ser expressa como , a de 4 em 8 expressa como , e por a adiante. Existe pois uma

relao entre o nmero de clulas presentes no incio (tempo zero) do crescimento exponencial e o nmero de clulas presente aps um perodo t desse crescimento exponencial, dada pela seguinte equao:

clulas presentes no incio do crescimento exponencial e n o nmero de geraes que ocorreram durante o perodo t de crescimento exponencial. possvel exprimir o parmetro n em funo de , numa populao em crescimento exponencial, com base na equao:

O tempo de duplicao ou gerao, g, pode ser calculado como t/n, onde t o tempo de durao (horas ou minutos) do crescimento exponencial e n o nmero de geraes ocorridas durante essa fase do crescimento exponencial. Com base na avaliao quantitativa do crescimento de uma populao de clulas de um determinado microrganismo, possvel conhecer os valores de ao longo do tempo t, (como

exemplificado na tabela junta). O conhecimento de dados experimentais deste tipo permite, com base na equao anterior, calcular o tempo que a populao microbiana demora a duplicar o nmero

de clulas, em condies bem definidas, isto , o seu tempo de gerao ou duplicao. tambm possvel, calcular a taxa especfica de crescimento do microrganismo em questo, como exemplificado na prxima pgina. A taxa especfica de crescimento, , e o tempo de gerao ou duplicao, g, de uma populao microbiana so parmetros muito importantes em Microbiologia. Os valores de e g dependem da estirpe microbiana em questo e so fortemente influenciados pelas condies ambientais e pela composio do meio de cultura. Por um lado, o seu conhecimento permite prever como evoluir a concentrao de um microrganismo ao longo do tempo de crescimento exponencial. Por outro lado, so parmetros que do indicao sobre a resposta do microrganismo s diversas condies ambientais incluindo a moificao do meio de cultura. O clculo dos valores de g e de um dado microrganismo, em condies de cultura diferentes, til, por exemplo, para:

seleccionar as condies de cultura ptimas para o crescimento desse microrganismo; estudar o efeito que uma determinada alterao das condies ambientais exerce sobre o crescimento do microrganismo. Clculo da taxa especfica de crescimento

Fig. 3 - Comparao entre a curva aritmtica (a laranja) e a curva logartmica (a azul) do aumento do nmero total de clulas ao longo do tempo durante a fase do crescimento exponencial.

Para uma populao de clulas em crescimento exponencial, se representarmos graficamente os valores do nmero de clulas em funo do tempo de crescimento, obtm-se uma funo exponencial (representao aritmtica no grfico acima). Esta representada pela equao (1): (1)

que traduz o carcter exponencial do crescimento microbiano, e onde clulas no tempo e

a concentrao de

a concentrao de clulas no inicio do crescimento exponencial.

Se aplicarmos logaritmos naturais de um e do outro lado da equao (1), obtm-se: (2)

onde a taxa especfica de crescimento do microrganismo em causa, nas condies de crescimento testadas (as suas unidades so o inverso do tempo; por exemplo , ). Este

parmetro do crescimento, que reflecte a sua cintica, corresponde ao declive da recta que resulta da representao grfica do logaritmo natural do nmero de clulas em funo do tempo (representao logartmica no grfico acima).

A taxa especfica de crescimento est relacionada com o nmero de geraes (ou o tempo de cada gerao) que ocorrem por unidade de tempo numa cultura em crescimento exponencial. De facto, quanto maior for a taxa especfica de crescimento, mais rapidamente se divide a populao, maior o nmero de geraes que ocorrem no mesmo perodo de tempo e menor o tempo de cada gerao. A partir dos resultados de uma experincia de crescimento como os apresentados, possvel calcular o valor da taxa especfica de crescimento da populao microbiana.

Assim, se considerarmos os resultados experimentais apresentados na tabela acima (representados graficamente na figura acima), o valor da taxa especfica de crescimento, , pode ser calculado com base numa anlise de regresso linear dos valores de lnNt e t correspondentes fase de crescimento exponencial. O valor de corresponde ao declive da recta representada pela equao (2) (no de esperar que os resultados experimentais se possam alinhar sobre a recta representada). Uma estimativa mais grosseira do valor de pode ser obtida do seguinte modo:

A taxa especfica de crescimento e o tempo de duplicao ou geraode uma populao microbiana esto intimamente relacionados entre si e o valor de um pode ser calculado a partir do conhecimento do valor do outro, com base na equao (3): (3)

que se obtm por substituio de (2)).

=2

(que traduz uma duplicao celular) e t = g na equao

Crescimento microbiano em biofilmes

A maior parte da actividade bacteriana na natureza ocorre, no com as clulas individualizadas, mas com as bactrias organizadas em comunidades sob a forma de um biofilme. Esses biofilmes so constitudos por uma comunidade estruturada de clulas aderentes a uma superfcie inerte (abitica) ou viva (bitica), embebidas numa matriz de exopolissacrido. A associao dos organismos em biofilmes constitui uma forma de proteco ao seu desenvolvimento, fomentando relaes simbiticas e permitindo a sobrevivncia em ambientes hostis. Em ecossistemas aquticos, mais de 99,9% das bactrias crescem em biofilmes associadas a uma grande variedade de superfcies. No Homem, a variedade de infeces bacterianas crnicas envolvendo biofilmes bastante significativa, podendo estas ser causadas por uma nica ou mais espcies (consultar o tpico Formao de biofilmes e envolvimento em infeces humanas). Os biofilmes mais comuns na natureza so heterogneos, compostos por duas ou mais espcies, podendo os produtos do metabolismo de uma espcie auxiliar o crescimento das outras e a adeso de uma dada espcie fornecer ligandos que promovem a ligao de outras. Inversamente, a competio pelos nutrientes e a acumulao de metabolitos txicos produzidos pelas espcies colonizadoras podero limitar a diversidade de espcies num biofilme.

Atravs de tcnicas microscpicas, tem sido possvel observar a grande heterogeneidade espacial dos biofilmes, em que coexistem clulas em diferentes estados fisiolgicos. Esta heterogeneidade constitui uma importante estratgia de sobrevivncia porque essas clulas tero maior probabilidade de sobreviver a agresses externas. Etapas de desenvolvimento de um biofilme 1. Adeso a uma superfcie O padro de desenvolvimento de um biofilme envolve vrias etapas: a adeso inicial superfcie, seguida da formao de microcolnias e, na maioria dos casos, a diferenciao das microcolnias em macrocolnias envolvidas numa matriz de exopolissacrido, formando biofilmes maduros (figura 1).

Fig. 1 - Representao esquemtica das vrias etapas de desenvolvimento de um biofilme de acordo com o modelo aceite para Pseudomonas aeruginosa (adaptado de Ghigo et al., 2003 ). A adeso de uma bactria a uma superfcie abitica , geralmente, mediada por interaces inespecficas (e.g., foras hidrofbicas), enquanto que a adeso a um tecido vivo ou desvitalizado normalmente mediada por mecanismos moleculares especficos de ancoragem, nomeadamente atravs de lectinas, ligandos ou adesinas. A adeso primria de um organismo a uma superfcie um processo reversvel que envolve a aproximao deste superfcie, de forma aleatria ou atravs de mecanismos de quimiotaxia e de mobilidade (etapa I da figura 1). Quando o microrganismo atinge

uma proximidade crtica da superfcie, a ocorrncia de adeso depende do balano final entre foras atractivas e repulsivas (e.g. interaces electrostticas e hidrofbicas, foras de Van der Waals, impedimento estereoqumico, etc) geradas entre as duas superfcies. A repulso entre duas superfcies pode ser ultrapassada atravs de interaces moleculares especficas mediadas por adesinas, que so protenas localizadas em estruturas que irradiam da superfcie celular. Foi ainda demonstrado que os mecanismos de mobilidade das clulas, dependentes de pili superficiais e do flagelo polar so fundamentais no processo de iniciao de um biofilme. 2. Maturao do biofilme Aps a adeso primria, as clulas fracamente ligadas consolidam o processo de adeso produzindo exopolissacridos que complexam os materiais da superfcie e os receptores especficos localizados nos flagelos, Pili ou fmbrias. Na ausncia de interferncia mecnica ou qumica, a adeso torna-se, nesta fase, irreversvel (etapa II da figura 1). Durante este estgio de adeso, os microrganismos individualizados ou planctnicos podem colar-se uns aos outros, formando agregados na superfcie a que aderem. Aps a adeso irreversvel da bactria superfcie, inicia-se o processo de maturao do biofilme (etapas III e IV da figura 1). A densidade e complexidade do biofilme aumenta medida que as clulas se dividem (ou morrem) e os componentes extracelulares gerados pelas bactrias interagem com molculas orgnicas e inorgnicas do ambiente circundante para formar o glicoclix. Nesta fase, os biofilmes tornam-se altamente hidratados, formando-se estruturas abertas compostas por 73 a 98% de material no celular, incluindo exopolissacrido e canais por onde circulam os nutrientes. O crescimento de qualquer biofilme limitado pela disponibilidade de nutrientes no ambiente circundante e pela sua propagao a clulas localizadas no interior do biofilme. Factores como o pH, difuso de oxignio, fonte de carbono e osmolaridade controlam tambm a maturao do biofilme Quando completamente maduro, o biofilme funciona como um consrcio funcional de clulas, com padres de crescimento alterados, cooperao fisiolgica e eficincia metablica. Nesta fase, as clulas localizadas em regies diferentes do biofilme exibem diferentes padres de expresso gentica. 3. Ruptura do biofilme Quando o biofilme atinge uma determinada massa crtica e o equilbrio dinmico alcanado, as camadas mais externas do biofilme comeam a libertar clulas em estado planctnico, que se podem rapidamente dispersar e multiplicar, colonizando novas superfcies e organizando novos biofilmes em novos locais (etapa V da figura 1). Com a ausncia de nutrientes e/ou de oxignio ou

dificuldades na sua difuso, a diminuio do pH e a acumulao de metabolitos secundrios txicos, inicia-se um processo de morte celular junto superfcie e subsequente desintegrao do biofilme.

Controle do crescimento microbiano

Os microrganismos podem ser encontrados em todo o lado. Por isso, de modo a obter e manter uma cultura pura, necessrio assegurar a ausncia de quaisquer organismos indesejveis (contaminantes). Para tal, o microbiologista recorre esterilizao do meio de cultura e utiliza tcnicas de assepsia, que evitam a ocorrncia de contaminaes durante a manipulao de culturas puras e meios de cultura estreis. O controlo do crescimento microbiano pode ser efectuado quer atravs da inibio do crescimento quer da induo da morte dos microrganismos viveis. Os agentes antimicrobianos que destroem ou tornam bactrias ou fungos inviveis so designados bactericidas ou fungicidas. Por outro lado, os agentes que inibem o crescimento bacteriano ou de fungos so bacterostticos ou fungistticos. O controlo do crescimento microbiano pode ser alcanado por descontaminao,

desinfeco e esterilizao, podendo ser usados tanto mtodos fsicos como qumicos.

Controlo por mtodos fsicos

A esterilizao de um qualquer material ou equipamento consiste na destruio ou remoo de todas as formas de vida, patognicas ou no, a ele associadas. Para a obteno e manuteno de uma cultura pura, recorre-se tanto esterilizao do meio de cultura como do material de laboratrio a utilizar no seu manuseamento. Entre os agentes fsicos de esterilizao, utilizam-se, principalmente, o calor, a filtrao e a radiao (por exemplo, radiao no-ionizante, como a Ultra-Violeta, e radiao ionizante, como os raios X e os raios ).

Esterilizao pelo calor: autoclavagem

Fig. 1 - Esterilizao por calor hmido em autoclave

Fig. 2 - Placas depois de autoclavadas.

A utilizao de calor em ambiente hmido um dos mtodos mais eficazes de destruio de microrganismos. A morte das clulas microbianas por aco do calor hmido resulta da desnaturao das protenas e da destabilizao da membrana citoplasmtica. Ocorre quando as clulas so sujeitas a temperaturas superiores temperatura mxima de crescimento dos microrganismos em causa. A esterilizao por calor hmido efectuada em autoclave (figura 1), que consiste numa cmara com vapor de gua saturado presso de 1 atm acima da presso atmosfrica, a que corresponde, em locais ao nvel do mar, uma temperatura de ebulio da gua de 121C. No laboratrio de Microbiologia, usual sujeitar o material a esterilizar a 121C (1 atm; presso relativa) durante 15 minutos, de modo a assegurar a morte de todas as formas de vida microbianas, incluindo a dos endsporos bacterianos, mais resistentes ao calor que as clulas vegetativas. Contudo, o tempo necessrio para se esterilizar convenientemente os materiais, a esta temperatura, depende da natureza do material a esterilizar e/ou do seu volume. O calor hmido sob presso utilizado na esterilizao de meios de cultura que no contenham componentes termolbeis e na esterilizao de material de plstico e de vidro a utilizar nos trabalhos experimentais de Microbiologia. tambm usado na descontaminao de roupas e instrumentos mdicos e cirrgicos, assim como de diversos materiais, reutilizveis ou descartveis, contaminados com culturas de clulas viveis, antes de serem lavados ou colocados no lixo.

Esterilizao por filtrao

Fig. 1 - Sistemas de filtrao usados para a esterilizao por filtrao. A filtrao envolve a remoo de clulas de microrganismos de solues lquidas ou de gases atravs do atravessamento de membranas filtrantes. Estas podem ser de vrios materiais (mais vulgarmente, acetato de celulose ou de policarbonato) e tm dimetros de poro muito pequenos (usualmente 0,2 m) onde as clulas microbianas ficam retidas.

Esta tcnica muito utilizada em laboratrios de Microbiologia para esterilizar meios de cultura com componentes que possam sofrer alterao por aco do calor (p.ex. vitaminas, antibiticos, acares, aminocidos) e na indstria farmacutica para esterilizao de solues de vitaminas, de agentes quimioteraputicos, soro etc.. Contudo, a maior parte dos vrus so suficientemente pequenos para atravessarem os poros destas membranas filtrantes, pelo que esta tcnica no assegura a esterilidade total das solues ou gases filtrados.

Fig. 2 - Sistemas de filtrao usados para a esterilizao por filtrao. Para alm de ser utilizada para esterilizar solues, a filtrao atravs de membranas filtrantes pode tambm ser utilizada para concentrar clulas microbianas a partir de volumes grandes de amostras lquidas, como acontece na anlise bacteriolgica de guas. O ar que circula em cmaras de fluxo laminar de segurana biolgica(Fotografia abaixo) ou em salas limpas frequentemente sujeito a filtrao atravs de filtros de elevada eficincia (High Efficiency Particle Air HEPA- Filter) que permitem a reteno de pelo menos 99,999% das clulas e esporos microbianos ou outras partculas presentes no ar.

Fig. 3 - Aspecto exterior de uma cmara de fluxo laminar onde feita a esterilizao do ar por filtrao de modo a deixar o seu ambiente interior estril.

Controlo por mtodos qumicos

Um composto qumico, natural ou sinttico, que mata um microrganismo ou inibe o seu crescimento designado agente antimicrobiano. Os agentes antimicrobianos variam em relao sua toxicidade selectiva. Alguns actuam de forma no selectiva, com efeitos similares em todos os tipos de clulas, enquanto que outros so muito selectivos e muito mais txicos para determinado tipo de clulas. Certos agentes qumicos txicos possuem uma toxicidade to grande que por vezes tm que ser diludos de modo a reduzir o seu efeito. Em soluo mais diluda, estes agentes podem ser utilizados como desinfectantes ou como antispticos. Os desinfectantes so compostos qumicos que matam os microrganismos e que so usados na remoo de parte ou da totalidade dos microrganismos patognicos em objectos inanimados. Este tipo de agentes antimicrobianos so normalmente usados em superfcies de equipamentos, paredes, cho, em laboratrios, hospitais e na Indstria Alimentar, com a finalidade de diminuir a carga microbiana. Os antispticos so desinfectantes que matam os microrganismos ou inibem o seu crescimento e que so suficientemente no txicos para serem aplicados a tecidos vivos. Muitos destes compostos so usados na higiene pessoal ou no tratamento de ferimentos superficiais. Por outro lado, certo material hospitalar ou de laboratrio termos sensveis (ex: termmetros, seringas, placas de Petri de plstico, etc) no pode ser esterilizado atravs do calor. Nestas situaes, o processo de esterilizao levado a cabo em equipamentos fechados semelhantes a autoclaves, em que usado um composto qumico como por exemplo o xido de etileno, formaldedo, cido peractico ou perxido de hidrognio (esterilizao a frio) (ver exemplos de alguns esterilizantes mais comuns, fim para que so usados e modo de aco). Certos agentes antimicrobianos tm uso teraputico. Devido sua toxicidade selectiva, so especialmente teis no tratamento de doenas infecciosas pois podem ser utilizados in vivo para matar os microrganismos causadores de uma dada infeco sem afectar o hospedeiro ( por exemplo o caso dos antibiticos com aco antibacteriana).

Efeito de agentes antimicrobianos Efeito dos agentes antimicrobianos no crescimento possvel observar trs tipos de efeito distintos quando um agente antimicrobiano adicionado a uma cultura bacteriana na fase exponencial do crescimento:

Efeito bacteriosttico: o crescimento inibido, mas no ocorre morte celular. Os agentes bacteriostticos so frequentemente inibidores de sntese proteica e actuam por ligao aos ribossomas;

Efeito bactericida: ocorre morte das clulas mas no h lise celular; Efeito bacterioltico: h induo da morte celular por lise, levando diminuio da turbidez da cultura e do nmero de clulas viveis. Exemplos de agentes bacteriolticos so os antibiticos que inibem a sntese da parede celular em bactrias, como o caso da penicilina.

Quantificao da actividade antimicrobiana A actividade antimicrobiana de um composto pode ser quantificada com base na determinao da concentrao mnima do composto capaz de inibir o crescimento de um dado microrganismo, um valor chamado CIM (Concentrao Inibitria Mnima), ou MIC ("Minimum Inhibitory

Concentration") em ingls. Este valor pode ser determinado atravs do mtodo das diluies sucessivas ou do mtodo da difuso em agar, ou ainda atravs do uso de tiras contendo um gradiente de concentrao de antibitico, conhecido como E-teste. No mtodo das diluies sucessivas, so preparados tubos de ensaio contendo o meio de cultura suplementado com concentraes crescentes do agente antimicrobiano. Cada um dos tubos inoculado com o microrganismo a testar. Terminado o perodo de incubao, avalia-se o crescimento microbiano, visvel atravs da turbidez da cultura. A concentrao inibitria mnima do crescimento, MIC, a concentrao mnima de agente antimicrobiano para a qual j no se observa crescimento do microrganismo, como ilustrado na figura seguinte. O valor MIC de um dado agente antimicrobiano no constante, sendo influenciado pela natureza do microrganismo testado, pela quantidade de inculo, pelo tempo de incubao, pela composio do meio de cultura e pelas condies ambientais, tais como a temperatura, o pH e o arejamento. Quanto todas estas condies so padronizadas, possvel comparar a actividade de diferentes agentes antimicrobianos face a um certo microrganismo e determinar, por exemplo, qual o agente antimicrobiano mais efectivo contra esse microrganismo, ou avaliar a actividade de um mesmo agente relativamente a diferentes microrganismos.

Fig. 1 - Aspecto de um halo de inibio causado pela introduo de um disco contendo um antibitico que leva a que no haja crescimento microbiano na zona envolvente. No mtodo da difuso em agar, um disco de papel impregnado com uma quantidade conhecida de agente antimicrobiano colocado na superfcie de meio de cultura slido apropriado contido numa placa de Petri e previamente inoculado com o microrganismo a testar. Durante a incubao da placa de Petri a uma temperatura adequada para o crescimento do microrganismo teste, o agente antimicrobiano sofre difuso do disco de papel para o meio slido. A uma certa distncia do disco, o valor MIC atingido. Um halo (zona transparente) de inibio formado h volta do disco, onde no crescem colnias do microrganismo. Assim, aps 24-48 h de incubao medido o dimetro do halo de inibio formado volta do disco. O dimetro do halo de inibio proporcional quantidade de agente antimicrobiano presente no disco, solubilidade do agente, ao coeficiente de difuso no meio de cultura slido e eficcia global do agente antimicrobiano. Este mtodo rotineiramente usado para determinar a sensibilidade a antibiticos de microrganismos patognicos.

Agentes antimicrobianos de uso teraputico Certos compostos qumicos com aco antimicrobiana podem ser usados nos seres vivos para o controlo de doenas infecciosas - agentes antimicrobianos de uso teraputico. Os agentes quimioteraputicos podem ser molculas produzidas por microrganismos ou plantas com efeito contra outros microrganismos (antibiticos) ou podem ser molculas com as mesmas propriedades mas sintetizadas quimicamente (agentes sintticos). Um aspecto crtico de um agente quimioteraputico a sua toxicidade selectiva, isto , a sua capacidade para inibir ou matar bactrias ou outro microrganismo patognico sem afectar adversamente o hospedeiro. Cada agente ou grupo de agentes quimioteraputicos tem um espectro de aco antimicrobiana. Os antibiticos com aco antibacteriana so especialmente teis no tratamento de doenas infecciosas causadas por bactrias patognicas. Podem ser divididos em vrias classes, de acordo com a sua estrutura qumica e com os seus alvos e modos de aco.

Alvos de aco de antibiticos Embora seja conhecido um vasto nmero de antibiticos, menos de 1% tem valor prtico em terapia. Por outro lado, alguns antibiticos tornam-se bastante mais eficazes aps modificao qumica (antibiticos semi-sintticos).

Em organismos pertencentes ao domnio Bacteria, os principais alvos de aco de antibiticos so a

parede celular, a membrana citoplasmtica e os processos de biossntese de protenas e de cidos nucleicos (figura abaixo). A sensibilidade dos diferentes grupos de microrganismos a um determinado antibitico ou agente antimicrobiano varivel. Embora as bactrias Gram-positivas sejam de uma forma geral mais sensveis aos antibiticos que as bactrias Gram-negativas, existem antibiticos eficazes apenas contra as bactrias Gram-negativas. Um antibitico eficaz contra bactrias Gram(+) e Gram(-) diz-se de largo espectro. Um antibitico de espectro estreito apenas eficaz contra um grupo especfico e restrito de bactrias. A eficcia de um antibitico na inibio do crescimento de um dado microrganismo pode ser avaliada com base em diferentes mtodos, entre eles o mtodo da difuso em agar, que se baseia na determinao do dimetro dos halos de inibio do crescimento.

1.3. Tcnicas microbiolgicas bsicas

O microbilogo utiliza tcnicas especficas para estudar os microrganismos. Nos habitats naturais, os microrganismos crescem frequentemente em populaes mistas mais ou menos complexas, que incluem vrias espcies microbianas. Contudo, para estudar um dado microrganismo, necessrio obter a uma populao de clulas desse microrganismo em cultura pura ou axnica. Assim, o isolamento de um determinado microrganismos a partir de populaes mistas, a manuteno e conservao de culturas puras e o crescimento de populaes microbianas puras em meios de cultura laboratoriais so tcnicas bsicas e essenciais em Microbiologia. Os microrganismos so ubquos, isto , esto presentes em todo o lado. Por isso, para obter e manter uma cultura pura essencial evitar que outros microrganismos (contaminantes), entrem em contacto com ela. Assim, com o objectivo de evitar a ocorrncia de contaminaes, o microbilogo recorre a tcnicas de assepsia e esterilizao e desinfeco dos materiais que usa no manuseamento das culturas puras de microrganismos. Estas tcnicas so crticas no controlo e preveno do desenvolvimento de microrganismos, quer seja no laboratrio quer em processos industriais, nomeadamente nas industrias alimentar e farmacutica, ou na preveno de doenas infecciosas.

Meios de cultura

Os meios de cultura (preparaes slidas, lquidas ou semi-slidas que contm todos os nutrientes necessrios para o crescimento de microrganismos) so utilizados com a finalidade de cultivar e manter microrganismos viveis no laboratrio, sob a forma de culturas puras. Os meios de cultura devem ter na sua composio, os nutrientes indispensveis ao crescimento do organismo em questo, sob forma assimilvel e em concentrao no inibitria do crescimento. Alm disso, aps a sua preparao, cada meio de cultura deve ser submetido a esterilizao, por forma a eliminar qualquer organismo vivo contaminante. Por outro lado, para manter uma cultura pura, necessrio que o meio de cultura que se pretende utilizar seja mantido desprovido de qualquer organismo vivo contaminante. Para a preveno de contaminaes durante a manipulao de culturas puras recorre-se a tcnicas de assepsia. De um ponto de vista geral, os meios de cultura podem ser classificados tendo em conta o seu estado fsico, a sua composio qumica e os objectivos funcionais a que se destinam. A especificidade dos meios de cultura muito importante, nomeadamente no isolamento e identificao de certos microrganismos (por exemplo, no isolamento de microrganismos do solo) ou em testes de sensibilidade a antibiticos ou na anlise microbiolgica de guas, de alimentos, etc. Estado fsico dos meios de cultura Um meio de cultura lquido contem todos os nutrientes necessrios ao crescimento do microrganismo, dissolvidos em gua. Uma vez preparado, este pode ser inoculado com uma cultura pura do microrganismo que se pretende cultivar e ser colocado a incubar em condies ptimas (temperatura e arejamento) para o crescimento do microrganismo em causa (animao abaixo). Por forma a averiguar o grau de pureza do inculo preparado, recorre-se, normalmente, transferncia de uma amostra do inculo para a superfcie de um meio de cultura slido com a mesma composio, contido numa placa de Petri.

Os meios de cultura slidos so preparados a partir da adio, ao meio lquido correspondente, de um agente solidificante (o agar - com uma concentrao de cerca de 1.5-2% p/v), antes da esterilizao do meio (ver como preparar um meio de cultura slido). Os meios de cultura podem ainda ter um estado fsico intermdio (semi-slido), que obtido atravs da adio de uma quantidade reduzida de agente solidificante (0.3 a 0.5% de agar). A consistncia menos firme destes meios permite a mobilidade de microrganismos que sejam mveis. Composio qumica A composio de um dado meio de cultura est dependente da espcie que se pretende cultivar. O conhecimento do habitat natural de um dado microrganismo muitas vezes til na seleco do meio de cultura adequado, j que as suas necessidades nutricionais reflectem esse mesmo habitat.

Em microbiologia so utilizados basicamente dois tipos de meios de cultura:

Meios de cultura sintticos ou definidos meios de cultura cuja composio qumica perfeitamente conhecida. Meios de cultura complexos - meios de cultura cuja composio exacta desconhecida. Como componentes apresentam ingredientes como peptonas, cuja formula no conhecida. Um exemplo deste tipo de meios o meio LB que um meio rico apropriado ao cultivo de diversos microrganismos, em particular de bactrias. Classificao funcional dos meios de cultura Os meios de cultura podem ser usados na seleco e crescimento de um determinado microrganismo ou na identificao de uma espcie em particular. Desta forma, a funo de um dado meio depende da sua composio. O isolamento de uma determinada estirpe microbiana pode ser feito atravs do recurso e/ou combinao dos seguintes tipos de meios:

Meios selectivos suprimem o crescimento de determinados microrganismos em benefcio de outros. Exemplo: meio selectivo para pesquisa de coliformes, utilizado na anlise microbiolgica de guas: os meios complexos que permitem o isolamento de coliformes (enterobactrias Gram negativas) so

suplementados com sais biliares ou com o sal lauril-sulfato de sdio, que actuam como agentes inibidores do crescimento de bactrias Gram positivas.

Meios diferenciais permitem a distino entre diferentes grupos de microrganismos com base na capacidade de metabolizar componentes especficas do meio de cultura ou na morfologia (aparncia) das colnias. Permitem, por vezes, a identificao de microrganismos com base nas suas caractersticas biolgicas. Exemplo: meio Agar de sangue, que permite a distino entre bactrias hemolticas e nohemolticas. O padro de hemlise (dos glbulos vermelhos de sangue) no meio agar de sangue permite destinguir bactrias, tais como Streptococcus pyogenes (causadora da faringite) que causa a lise completa dos glbulos vermelhos do sangue produzindo halos transparentes volta das colnias, Streptococcus mutans (causa crie dentria), que no hemoltica, e Streptococcus pneumoniae (causadora de pneumonia bacteriana) que lisa parcialmente os glbulos vermelhos do sangue.

Cultura pura
Cultura pura ou axnica A cultura pura de um dado microrganismo uma cultura de clulas gentica e morfologicamente idnticas. A imobilizao das clulas num meio slido torna possvel a visualizao do crescimento em massas celulares isoladas denominadas colnias. As colnias microbianas so caracterizadas por uma forma e tamanho que depende do prprio organismo, de condies ambientais como sejam: da quantidade de oxignio e de nutrientes disponveis no meio de cultura e de outros parmetros fisiolgicos. Para obter uma cultura pura podem ser usadas as tcnicas de:

riscado em meio slido espalhamento em meio slido incorporao Riscado em meio slido Aps recolha do inculo com a ponta da ansa, este espalhado na superfcie do meio de cultura slido (contido em placas de Petri ou tubos de vidro), riscando a superfcie com a ponta da ansa contendo o inculo, tal como ilustrado na figura abaixo. A ansa deve ser esterilizada sempre que se mude de direco, por forma a ir reduzindo o nmero de clulas presentes no inculo. Este mtodo permite o isolamento e obteno de culturas puras atravs do isolamento de colnias. Espalhamento em meio slido

Neste mtodo, aps diluio apropriada da amostra, so espalhados superfcie do meio slido, 0.1 ml da amostra, com o auxlio de uma vareta de vidro em L, previamente esterilizada. As placas so posteriormente incubadas, em posio invertida em atmosfera e temperatura adequadas, at ao aparecimento de colnias. A observao das colnias obtidas superfcie de um meio de cultura slido permite avaliar o grau de pureza de uma dada cultura. A presena de mais de um tipo de colnias na mesma placa indica que a cultura original no estava pura, ou seja, que se encontrava contaminada com outro microrganismo. Incorporao

No mtodo por incorporao, a amostra diluda pipetada directamente sobre a placa de Petri e s depois adicionado o meio de cultura slido apropriado, no estado liquefeito. Neste mtodo, obtmse colnias superfcie e no interior do agar. Em todos os mtodos, as placas devem ser incubadas em posio invertida. A temperatura e tempo de incubao dependem do microrganismo em causa.

Isolamento e cultivo de microrganismos

O estudo dos microrganismos est muitas vezes dependente da possibilidade de cultivar e manter microrganismos viveis no laboratrio, sob a forma de culturas puras. As necessidades nutricionais especficas dos microrganismos variam de espcie para espcie, sendo possvel distinguir vrios grupos nutricionais de microrganismos. Com o conhecimento dos nutrientes necessrios ao crescimento dos microrganismos, possvel a formulao de meios de cultura que promovam o crescimento de um determinado microrganismos no laboratrio.

O isolamento de um determinado microrganismo em cultura pura a partir de uma populao mista (por exemplo, presente numa amostra de solo, na gua de um rio, num esgoto, num alimento ou tecido contaminado, etc.) envolve, em geral, o uso de meios de cultura slidos e o recurso a tcnicas de isolamento de colnias, como seja pelo mtodo de espalhamento em placa, ilustrado na animao ao lado. Este mtodo permite obter colnias individualizadas e espacialmente separadas que, teoricamente, so originadas a partir de uma nica clula, correspondendo, por isso, a uma cultura pura de um microrganismo particular. Sabe-se, contudo, que cerca de 90% a 99% do nmero total de microrganismos que existem no Ambiente (por exemplo, no solo, gua ou ar) no so cultivveis em meios de cultura e outras condies laboratoriais conhecidos. Este facto tem limitado a possibilidade de serem isolados, a partir do Ambiente, microrganismos com potencial interesse para aplicaes biotecnolgicas. Contudo, presentemente, em consequncia do grande desenvolvimento das tcnicas da Biologia Molecular nas ltimas dcadas, o microbiologista pode identificar e estudar os microrganismos com base na anlise directa das suas macromolculas (em particular do seu DNA), sem que seja necessrio isol-los em meios de cultura laboratoriais. Entre as tcnicas da Biologia Molecular que permitem este progresso salienta-se a Reaco em Cadeia da Polimerase (PCR Polymerase Chain Reaction).

Manuteno de microrganismos viveis no laboratrio

Vrias metodologias permitem a manuteno de culturas viveis no laboratrio durante perodos de tempo mais ou menos longos, nomeadamente: Manuteno em rampas de meio slido

Fig. 1 - Exemplo da manuteno de um microrganismo numa rampa de meio slido. A cultura semeada com o auxlio de uma ansa em meio agarizado apropriado contido em tubos de ensaio rolhados, e, em seguida, incubada em condies ptimas de crescimento para o microrganismo em causa. Os tubos so depois guardados a 4C durante semanas ou meses, dependendo do microrganismo a conservar. Congelao

So preparadas suspenses de uma cultura pura do microrganismo em causa, em meio estril contendo glicerol, e armazenadas em arcas congeladoras especiais (que permitem uma temperatura igual ou inferior a 70C) ou em azoto lquido (-196C). Muitos microrganismos podem ser mantidos viveis durante anos, se congelados temperatura de 70C ou a temperaturas inferiores. Liofilizao As culturas de microrganismos podem ser conservadas temperatura ambiente no laboratrio durante anos, aps o seu tratamento por liofilizao. Este processo consiste na congelao da suspenso de clulas a temperaturas baixas (tipicamente, 20C), seguida da sua sujeio a presso muito reduzida (ex. 0.005 atmosferas), o que permite a sublimao da gua (passagem do estado slido ao estado gasoso) e assim a desidratao das clulas.