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Acta Biolgica Colombiana, Vol. 8 No.

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CIRCUITO ELCTRICO EQUIVALENTE DE UNA VESCULA SINPTICA Electric Circuit Equivalent to a Synaptic Vesicle
XAIRA CORTS1 Y RAMN FAYAD1,2 Departamento de Fsica. Universidad Nacional de Colombia. 2 Departamento de Fsica. Universidad de los Andes.

Recibido, junio 11 de 2003. Aceptado, julio 8 de 2003.

RESUMEN En el presente trabajo se desarrolla un modelo elctrico de uno de los elementos primordiales en la sinapsis nerviosa: la vescula sinptica. Dicha vescula se considera como un organelo esferoidal, despojada de neurotransmisores y se asume, adems, que su lumen, su membrana y el citoplasma neuronal se comportan como medios lineales, homogneos e isotrpicos caracterizados por conductividades y permitividades especficas. El mtodo utilizado ser la aplicacin terica de un campo elctrico (que vara en el tiempo a bajas frecuencias) sobre esta vescula, lo que induce a travs de su membrana una diferencia de potencial cuya caracterizacin se obtiene a partir de las ecuaciones de Maxwell sometidas a condiciones de contorno adecuadas, en la denominada aproximacin cuasi-estacionaria. A su vez, mediante aplicacin de la Transformada de Laplace a las expresiones resultantes se obtiene la FUNCIN DE TRANSFERENCIA, que conduce a sintetizar un circuito RLC equivalente de la vescula en estudio. El modelo predice valores de capacitancia para vesculas esfricas individuales que, al ser contrastados con los que presenta la literatura existente derivada de procesos experimentales previos, alienta la perseverancia en este enfoque terico germinal. Palabras clave: Vescula sinptica, circuito elctrico equivalente, exocitosis. ABSTRACT In the present work an electrical model of the synaptic vesicle is developed. The vesicle is considered as a spheroidal organelle without neurotransmitters in its inner space. In addition, its lumen, its membrane and the neuronal cytoplasm behave like linear, homogenous and isotropic media characterized by specific conductivities and permitivities. The theoretical approach considers the application of an electric field (varying in time at low frequencies) on this vesicle. A transmembrane potential difference is induced and its characterization is obtained from Maxwells equations subject to appropriate boundary conditions, in the so-called quasi-stationary approach. By applying the Laplace Transform to the resulting equations, the TRANSFER FUNCTION is obtained. In this way, we were able to synthesize an RLC circuit equivalent of the vesicle under study. The model predicts capacitance values for individual spherical vesicles, which contrasted with those reported in the existing literature from previous experimental processes, encourages the continuity of this theoretical approach. Key words: Synaptic vesicle, equivalent electric circuit, exocytosis.

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Artculo - Circuito elctrico equivalente de una vescula sinptica. Corts, et al.

INTRODUCCIN El cerebro es el rgano que obtiene la informacin del medio ambiente, la procesa para generar conocimiento y la transforma, si corresponde, en comportamientos definidos. El cerebro es, por lo tanto, el responsable de intrincados fenmenos como los sentimientos, los presagios, las conductas, los sueos, las concepciones abstractas y el bagaje mental evolutivo de cada individuo, en tal dimensin que podemos afirmar, sin hiprbole, que el cerebro hace de nosotros lo que somos y que somos, en esencia, nuestro cerebro. En las autorizadas palabras de uno de los padres de la neurociencia moderna, Rodolfo Llins, el yo es un estado funcional del cerebro y nada ms, ni nada menos. He aqu, instalada en el objetivo final del conocimiento de nuestra propia esencia, la razn por la cual la naturaleza y la fisiologa de las unidades funcionales del cerebro, las clulas nerviosas, sean uno de los mayores retos investigativos de la ciencia contempornea. La investigacin experimental del tejido nervioso ha sido predominante en la comprensin del sistema habiendo avanzado en la actualidad hasta el dominio de la biologa molecular. Sin embargo, no es suficiente y se requiere de una aproximacin terica para afinar el enfoque con que debe proseguirse en la bsqueda de la aprehensin, palmo a palmo, del portento total. As, en el presente artculo se desarrolla un modelo terico, fsico-matemtico, de uno de los elementos primordiales en una sinapsis nerviosa: la vescula sinptica. ANTECEDENTES Las neuronas estn limitadas por una membrana plasmtica de 6 a 8 nm de espesor (Kandel et al., 2000) que separa el medio intracelular o citoplasma neuronal del medio extracelular. La composicin interna del citoplasma difiere apreciablemente de la del fluido extracelular; as, el in potasio K+ se encuentra ms concentrado en el interior mientras en el exterior son el in sodio Na+ y el in cloro Cl los que presentan una mayor concentracin. Las observaciones experimentales realizadas por los pioneros de la electrofisiologa en sistemas de membrana, tales como las clulas excitables de vertebrados e invertebrados y, sobre todo, en el axn gigante de calamar, llevaron a Cole y Curtis (1939) a proponer un circuito elctrico sencillo cuyas propiedades constituan un modelo del comportamiento de las membranas excitables. Este circuito se denomin circuito equivalente. Cualitativamente, todas las propiedades pasivas importantes de una membrana neuronal son representadas por este circuito que consta de resistores (que representan los canales inicos), bateras (que representan los gradientes de concentracin de las especies inicas relevantes) y condensadores (que representan la capacidad de la membrana de almacenar carga elctrica). Las corrientes elctricas a travs de las membranas biolgicas se deben esencialmente al flujo inico de Na+, K+ y Cl . Las bicapas son impermeables a estos iones, que atraviesan la membrana casi exclusivamente a travs de canales inicos especficos, actuando en favor de sus gradientes de concentracin, lo que genera fuerzas electromotrices, correspondientes a los potenciales de Nernst asociados e independientes para cada uno de ellos. Los canales inicos actan, as, a modo de fuentes de potencial microscpicas. La resistencia elctrica que ofrece la unidad de rea de la membrana o resistencia especfica, RM, de la membrana excitable es una propiedad intrnseca suya y

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representa la capacidad de permitir o no el paso de iones que la atraviesen; dicha resistencia depende nicamente de la clase y del nmero de canales inicos abiertos, presentes en la membrana. Anlogamente, su conductancia, GM = 1/RM,representa la capacidad de la membrana para oponerse al flujo de una corriente inica. La conductancia no slo depender de las propiedades de la membrana sino tambin de la concentracin inica a uno y otro lado de la misma. Esto equivale a decir que los canales inicos se comportan como una resistencia variable, que representa la conductancia especfica, gi de cada canal; esta conductancia especfica individual es variable en virtud de que un canal no conduce de igual manera en todo momento. Los canales inicos son protenas sometidas a transiciones conformacionales que resultan en procesos de apertura o cierre; la conductancia total de la membrana viene dada por la suma de las conductancias individuales de los canales inicos que en un momento dado se hallen abiertos y por consiguiente, la conductancia especfica gi de una especie inica equivale al producto de la conductancia individual de su canal correspondiente por el nmero de canales abiertos por unidad de rea de la membrana. Las propiedades elctricas de la membrana asociadas a la corriente generada por una especie inica (como el in K+ potasio) se resumen, finalmente, en una resistencia variable, que representa la conductancia total de la membrana para cada tipo de in, en serie con una fuerza electromotriz (f.e.m.), que representa el voltaje generado por el gradiente de concentracin. En la figura 1 se representa el circuito equivalente que corresponde al in potasio K+. Al igual que los canales de potasio K+, los canales de sodio Na+ y cloro Cl tienen un equivalente elctrico.

Exterior de la clula
K+ K+ K+ K+

Exterior de la clula Vext gNa Vm ENa Vint gK EK g Cl ECl


K+ K+

K+ K+ K+

gK EK

K+

K+

K+ K+

K+

K+ K+

K+

Interior de la clula

K+ K+ K+

K+ K+

K+

Interior de la clula

Figura 1. Modelo elctrico del comportamiento pasivo de una membrana neuronal con canales de Na+, K+ y Cl-.

Las membranas biolgicas son estrictamente electroneutras en el sentido de que la concentracin de cargas positivas en cualquiera de los compartimientos que separan es siempre idntica a la de cargas negativas. No obstante, las membranas fosfo-

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lipdicas tienen la propiedad de poderse polarizar, es decir, de admitir una diferencia microscpica de carga entre sus caras externas, lo que, sin violar el principio de electroneutralidad, trae consigo ciertas consecuencias de tipo elctrico. La membrana polarizada acta como un condensador, de forma que las dos capas fosfolipdicas corresponden a las placas de un condensador plano y la fase hidrocarbonada de la membrana acta como medio dielctrico. As, el modelo elctrico de la membrana neuronal se complement al incorporar la tercera propiedad pasiva de la membrana: Su capacitancia, CM, definida como la capacidad con la que cuenta un aislante para separar la carga elctrica cuando sus caras externas se someten a una diferencia de potencial. En este caso, el aislante es la membrana que separa el citoplasma del medio extracelular, que son medios altamente conductivos por su composicin qumica. En otras palabras, la capacidad especfica de la membrana, CM, representa el nmero de cargas que sta separa por unidad de superficie al aplicar una diferencia de potencial a travs de la misma. As, el circuito equivalente de la membrana adquiri finalmente la forma del circuito de la figura 1. La analoga entre las propiedades elctricas de las membranas y las del circuito equivalente se apoy en una extensa evidencia experimental y se constituy as en un modelo puramente cualitativo de la misma. Un eslabn bsico de las vas de comunicacin en el sistema nervioso es la transmisin sinptica qumica. En sta, las seales son transmitidas entre neuronas a travs de mensajeros qumicos (neurotransmisores) contenidos en pequeas vesculas membranosas, denominadas vesculas sinpticas, y liberados desde la clula pre-sinptica hacia la clula post-sinptica. El primer paso en la activacin de la clula pre-sinptica es la propagacin de un potencial de accin en los terminales nerviosos. La generacin y propagacin de este potencial de accin requiere la intervencin de diversos canales inicos que se encuentran en la membrana neuronal. Una revisin de los procesos de transporte inico involucrados en la transmisin del impulso nervioso se encuentra en Corts (2003). El paso siguiente es la invasin del potencial de accin en el terminal nervioso pre-sinptico: cuando el potencial de accin invade el terminal nervioso pre-sinptico se produce una despolarizacin de su membrana; esta despolarizacin acta sobre un gran nmero de canales inicos voltaje-dependientes, entre los cuales se encuentran los particularmente importantes canales de calcio cuya apertura permite la entrada de calcio (Ca2+) hacia el terminal nervioso pre-sinptico incrementando la concentracin de calcio en su interior. Este incremento local en la concentracin de calcio intracelular promueve la fusin de las vesculas sinpticas con la membrana plasmtica del terminal pre-sinptico por la accin de protenas (como la sinaptotagmina, Borst y Sakmann, 1996) que, hipotticamente, actan como sensores de calcio (Broadie et. al., 1994, Geppert, 1994, Chapman et. al., 1995, Kelly, 1995). As, mediante este proceso de exocitosis, los neurotransmisores liberados se difunden a travs de la hendidura sinptica y se unen a protenas receptoras especficas, ionotrpicas o metabotrpicas, situadas en la membrana post-sinptica. La unin con el neurotransmisor determina un cambio conformacional de la protena receptora, lo que causa en el terminal post-sinptico la iniciacin de un potencial de accin que se propagar nuevamente a lo largo de la clula post-sinptica. Finalmente, las vesculas originales son recicladas, en un proceso conocido con el nombre

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de endocitosis, habilitndose para ser llenadas nuevamente de neurotransmisores. Estos se introducen en el lumen vesicular por mecanismos de transporte favorecidos por un gradiente electroqumico establecido por bombas inicas de protones (VATPasas) presentes en la membrana de la vescula. Luego del reciclaje, las vesculas pueden ser almacenadas cerca de los sitios de liberacin, en la membrana del terminal nervioso pre-sinptico, en lo que se conoce como reserva de vesculas, liberable instantneamente, o en sitios alejados de la membrana plasmtica constituyendo una reserva que parece ser movilizada de acuerdo con la intensidad de la estimulacin del terminal nervioso (Pieribone et al., 1995; Koenig e Ikeda, 1996; Kuromi y Kidokoro, 1998). Como resultado del proceso de exocitosis la membrana vesicular se incorpora a la membrana plasmtica y por lo tanto hay un incremento en el rea de la clula. Tal incremento puede ser estimado mediante el monitoreo de los cambios en la capacitancia asociada a la membrana celular esquematizados en la figura 2.
(a) Estado de reposo: Vescula fijada
Interior Cv Cm Complejo de fijacin/fusin Membrana plasmtica Vescula sinptica Canal de Ca2+ cerrado Exterior

(b) Despolarizacin: poro de fusin abierto Interior Cv Cm


Ca2+

Membrana plasmtica Exterior

Canal de Ca2+ abierto Puro de fusin abierto (1/Gp)

(d) Invaginacin de la membrana adherida


Cv

(c) Fusin completa: poro de fusin abierto Interior

Interior Vescula recubierta

Cm

Cm

Cv Complejo de fusin inhabilitado

Exterior

Exterior

Figura 2. Diagrama esquemtico de los cambios en la capacitancia de la membrana celular que acompaan los procesos de exocitosis y endocitosis.

Estas medidas de capacitancia son potencialmente tiles en las sinapsis nerviosas como un ndice asociado a la liberacin de neurotransmisores. As, Von Gersdorff y Matthews (1994); Von Gersdorff et al. (1996) y Matthews (1999), en sus estudios sobre clulas bipolares de terminales nerviosos de salmn reportan un salto en la capacitancia de 150fF subsecuente al proceso de exocitosis; lo que corresponde a la fusin de aproximadamente 5.700 vesculas segn Mathews (1999) y de 6.000 vesculas segn Von Gersdorff et al. (1996). Friis et al. (2000) presentan un estudio similar al anterior aplicado a clulas yuxtaglomerulares.

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200 150

Capacitancia (fF)

100

50 0 0 100 200 300 400 500 Duracin del pulso de despolarizacin (ms)

Figura 3. Capacitancia vs. duracin del pulso despolarizante. La curva se satura luego de aproximadamente 200ms a un valor cercano a 150fF, esto sugiere que la reserva de vesculas se ha liberado completamente. El voltaje se llev desde -60mV a 0mV para una duracin variable y el correspondiente salto en la capacitancia de la membrana neuronal fue registrado. Modificado de Von Gersdorff y Matthews (1994).

Dado que la vescula sinptica bajo estudio es una estructura compuesta por tres medios: el lumen, el citoplasma neuronal y la bicapa lipdica que los separa, cerrada sobre s misma (recurdese que esta bicapa presenta protenas de transporte como canales inicos y bombas de transporte activo) es lgico pensar que las propiedades elctricas de dicha vescula pueden representarse por un circuito equivalente. En el pre-sente estudio se desarrollar tal circuito pero no slo cualitativamente como lo hicie-ron Cole y Curtis hace ms de seis dcadas para la neurona sino, adems, de manera estrictamente cuantitativa. As, el modelo terico desarrollado aqu para una vescula sinptica resulta ser un circuito elctrico equivalente RLC mediante el cual se logra reproducir observaciones experimentales para los cambios de capacitancia durante el proceso de exocitosis en un terminal nervioso de una clula bipolar de salmn, adems de interpretar comportamientos e incluso sugerir estudios experimentales sobre nuevas propiedades asociadas a las vesculas sinpticas. MATERIALES Y MTODOS El estudio de un fenmeno fsico a menudo conduce a la elaboracin de un modelo; en otras palabras, dicho estudio se constituye en una identificacin del problema mediante la cual se busca disear una representacin racional, usualmente matemtica, del fenmeno, que d cuenta de los aspectos esenciales de la situacin real (Richalet et al., 1971). Tal modelo tiene dos propsitos fundamentales: primero, que pueda corresponder a un gran nmero de hechos descubiertos experimentalmente; y segundo, que pueda predecir el comportamiento del sistema bajo condiciones diferentes. Muchos modelos consideran la estructura misma del sistema, mientras otros contemplan la relacin entre la seal de entrada y su seal de salida describiendo el comportamiento de dicho sistema en relacin con las condiciones externas que lo afectan. Estos ltimos se conocen como modelos del tipo entrada - salida y un circuito

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elctrico equivalente es un buen ejemplo de ellos. As, el primer paso en la modelacin de sistemas biolgicos es la definicin de la entrada u(t) y la salida y(t) del sistema, lo que se logra mediante el anlisis de las caractersticas estructurales y fisiolgicas del elemento y el proceso a modelar. Si en el dominio de frecuencia (para un estudio detallado al respecto, refirase a Ogata K., 2001) Y(s) representa la funcin de salida del sistema y U(s) la funcin de entrada al mismo, en donde s es la variable compleja de frecuencia, la razn Y(s)/U(s) se denomina funcin de transferencia del sistema: T(s) = Y(s) U(s) (1)

La funcin de transferencia es una representacin compacta de la ecuacin diferencial que describe al sistema y es por tanto la relacin que permite modelarlo de manera directa. El sistema biolgico al que se enfocar el estudio es una vescula sinptica limitada por una membrana que, como todas las membranas biolgicas, contiene protenas de transporte convertidas en canales inicos y bombas de transporte activo que se encargan de mantener un pH particular responsable, entre otros, de procesos sinpticos como la recarga de neurotransmisores a las vesculas recicladas por endocitosis. Las vesculas sinpticas se asimilan a organelos esferoidales en los que se desprecia la contribucin de los neurotransmisores considerando, adems, que su medio interior o lumen, su membrana y el citoplasma neuronal o su medio exterior se comportan como medios lineales, homogneos e isotrpicos y estn caracterizados por propie dades elctricas especficas (conductividad y permitividad ). El fenmeno fsico por analizar ser la induccin de un potencial transmembranal por un campo elctrico aplicado sobre la vescula. Las ecuaciones que describirn la diferencia de potencial a travs de la membrana sern deducidas a partir de las ecuaciones de Maxwell sometidas a condiciones de contorno apropiadas. As, para desarrollar el modelo de entrada - salida de esta vescula esferoidal se aplicar un campo elctrico variable en el tiempo a bajas frecuencias, lo que posibilitar el logro de una funcin de transferencia caracterstica para las vesculas, mediante la cual se podr modelar tal sistema como un circuito equivalente. La entrada al sistema ser entonces el campo elctrico aplicado y la respuesta ser el potencial transmembranal inducido. As que las vesculas se encontrarn entre dos electrodos que sern dos placas paralelas perfectamente conductoras, conectadas a una fuente de tensin DC, es decir que, despreciando los efectos de borde, el campo elctrico en ausencia de la vescula ser uniforme y dirigido horizontalmente entre las placas. PRINCIPIOS BSICOS Propiedades elctricas de las vesculas. Las caractersticas estructurales (Grabe y Oster, 2001) y morfolgicas (Uchizono et al., 1979; Delcomyn, 1997; Henkel et al., 2001; Lee et al., 2001) bsicas de las vesculas sinpticas se reportan en la tabla 1. Usualmente la permeabilidad de los sistemas biolgicos se toma como, = 4 x 10-7 H/m, que es la correspondiente al espacio vaco.

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Parmetro Conductividad citoplasmtica Conductividad membranal Conductividad del lumen Permitividad citoplasmtica Permitividad membranal Permitividad del lumen Radio Espesor de la membrana

Smbolo C=e m L=i C=e m L=i R d

Valor 2.83 S/m 1.2 x 10 -6 S/m 1.82 S/m 6.4 x 10 -10 Aseg/Vm 4.4 x 10 -11 Aseg/Vm 6.4 x 10 -10 Aseg/Vm 14 150 nm 2 4 nm

Referencia [1] Gascoyne et al., (1993) [1] Bchner et al., (1999) Gascoyne et al., (1993) Bchner et al., (1999) Lee et al., (2001) Loew (1993)

Tabla 1. Parmetros elctricos y geomtricos caractersticos de vesculas sinpticas. [1] Calculada en Corts (2003) mediante valores experimentales tomados de Weiss (1996) y Grabe y Oster (2001).

Para los valores numricos reportados en la tabla 1, las condiciones necesarias para estudiar el potencial elctrico en la aproximacin cuasi-estacionaria en efecto se satisfacen como se muestra explcitamente en Corts (2003). As, para evaluar el potencial elctrico en todas las regiones del sistema vesicular, se parte de la ecuacin de Laplace en dicha aproximacin:
r
2

(r,t) = 0

(2)

Donde (r, t) representa el potencial escalar elctrico en funcin del tiempo t y de las coordenadas espaciales r. Diferencia de potencial transmembranal inducido en vesculas esferoidales en la aproximacin cuasi-estacionaria. Se considera, ahora, la distorsin del campo elctrico homogneo Eo (r, t) en un campo elctrico E (r, t) debido a la presencia de la vescula. Bajo el objetivo de buscar la diferencia de potencial transmembranal inducido se inicia con la expresin de E (r, t) en trminos del potencial elctrico en funcin del tiempo: E( r,t) = ( r,t) Donde (r, t) satisface la ecuacin de Laplace (2) con las siguientes condiciones: El campo elctrico debe ser homogneo lejos de la vescula: Lim( (r,t)) = Eo(t) (3)

El potencial debe ser finito en el interior de la vescula: Lim(r,t)<


r0

(4)

Las densidades de corriente J(r,t), las componentes tangenciales del campo elctrico E(r,t) y las componentes normales del campo D(r,t) en las fronteras entre el lumen o

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interior vesicular (i) y la membrana (m) y entre la membrana (m) y el citoplasma neuronal o exterior vesicular (e) deben ser continuas: (im) Si = 0 isu t ( m e)

Se

=0 esu t

(5)

n(i i m m) Si =

, n(m m e e)

n(i i m m) Si = isu ,

n(m m e e) Se = esu

Donde Si y Se son las superficies interna y externa de la membrana, i, m y e denotan la funcin potencial en el interior de la vescula, en la membrana y en el exterior de la misma; i, m y e las conductividades de estas tres regiones; i, m y e sus permitividades; isu, y esu son las densidades superficiales de carga inducidas sobre las superficies interna y externa de la membrana; y n es el vector unitario normal a la superficie de frontera. Los parmetros del modelo se representan el la figura 4.

i e f

x i m

d R
Eo

m, m
y

i e

i e

Figura 4. Ilustracin de los parmetros usados en las condiciones de contorno del modelo vesicular. En este caso, R es el radio de la esfera y d es el espesor de la membrana.

La diferencia de potencial transmembranal inducido por el campo elctrico sobre la membrana vesicular est dada por la diferencia aritmtica: ( r,t) = ( r,t) si ( r,t)
se

Al solucionar la ecuacin de Laplace (2) en coordenadas esfricas, proloides y obloides bajo las condiciones (3) - (7) se obtiene expresiones para el potencial trans-

Se

(6)

(7)

Si

Se

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membranal en el dominio temporal que se llevan al dominio de frecuencia mediante la aplicacin de la transformada de Laplace con el fin de obtener la funcin de transferencia definida en (1) para cada una de dichas geometras caractersticas. Para una descripcin detallada del procedimiento numrico refirase a Corts (2003). De esta manera, las expresiones para el potencial transmembranal en el dominio de frecuencia resultan ser: Vescula esfrica: R p 0 p 3 p 1p 5+ d+R+ (R,s) = E0 (s) cos p 0 p 4 p 2 p 5+ h5 (h2p3+p1 (h1+s)) + h0 (h3 p1+p3 (h4+s)) h2h3+(h1+s)(h4+s) p 2p 3+ p 1p 4 h5 (h2p4+p2 (h1+s)) + h0 (h3 p2+p4 (h4+s)) h2h3+(h1+s)(h4+s) (p2 p3p1 p4)(R+d)2 (8)

Donde es el ngulo polar que vara entre 0 y y pi y hi con i = 0,1,2,3,4,5 estn definidas en el apndice A para la geometra correspondiente. Vescula proloide: i p op 3 p 1p 5+ c0+ (0,i ,s) = E0(s) h5 (h2 p3+p1(h1+s)) + h0 (2h3 p1+p3 (h4+s)) h2h3+(h1+s)(h4+s) p 2 p 3+ p 1 p 4 h5(h2p4+2p2(h1+s)) + h0 (2h3 p2+p4 (h4+s)) p 0p 4 p 2p 5 + h2h3+(h1+s)(h4+s) p 2 p 3 p 1 p 4 1 2 01n 1+0 1+0 x (9)

x 1+

Donde vara entre 1 y 1 y se asume que las superficies interna y externa de la vescula son esferoides proloides tales que i = bi / c y 0 = b0 / c de manera que el esferoide que representa la superficie interna de la membrana es un esferoide proloide cuyo eje mayor es de longitud bi y por su parte, el esferoide que representa la superficie externa de la membrana tiene un eje mayor de longitud bo. Los dos esferoides tienen los mis-mos focos, siendo 2c su distancia interfocal. Adems pi y hi con i = 0,1,2,3,4,5 estn definidas igualmente en el apndice A para la geometra correspondiente.

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Vescula obloide: ii pop3p1p5+ c0+ (0,i,s) = hE0(s) p 0 p 4 p 2 p 5+ h5 (h2p3+p1 (h1+s)) + h0 (h3 p1+p3 (h4+s)) h2h3+(h1+s)(h4+s) p 2 p 3+ p 1 p 4 h5(h2 p4+p2(h1+s)) + h0 (h3 p2+p4 (h4+s)) h2h3+(h1+s)(h4+s) p 2 p 3 p 1 p 4 x (10)

x (1+0 arc cot(0)) Donde vara entre -1 y 1 y se asume que las superficies interna y externa de la vescula son esferoides obloides tales que i = bi / c y 0 = b0 / c de manera que el esferoide que representa la superficie interna de la membrana es un esferoide obloide cuyo eje menor es de longitud y por su parte, el esferoide que representa la superficie externa de la membrana tiene un eje menor de longitud b0. Los dos esferoides tienen los mismos focos, siendo 2c su distancia interfocal. Adems pi y hi con i = 0,1,2,3,4,5 estn definidas igualmente en el apndice A para la geometra correspondiente. La funcin de transferencia que se estaba buscando est dada, para las tres geometras, por la ecuacin (1) tomando en sta las expresiones (8), (9) y (10), para (r,s), como respuesta o salida del sistema y asumiendo que la seal de entrada es el campo elctrico aplicado Eo(s). RESULTADOS Y DISCUSIN Al encontrar la razn entre las expresiones obtenidas para (r,s) y el campo aplicado Eo(s) e introducir los parmetros geomtricos y elctricos caractersticos de estas vesculas (Tabla 1) se consigue finalmente las siguientes funciones de transferencia asociadas a la diferencia de potencial transmembranal inducido en cada tipo de vescula: Vescula esfrica: T(s) = Vescula proloide: T(s) = Vescula obloide: T(s) = 1.26 x 10 -8s2 + 89.55s + 1.47 x 1011 s2 + 4.39 x 10 9s + 1.48x1018 1.26 x 10 -8s2 + 92.36s + 1.53 x 1011 s2 + 4.13 x 10 9s + 1.39x1018 1.26 x 10 -8s2 + 89.20s + 1.47 x 1011 s2 + 4.28 x 109s + 1.61x1018

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De estas funciones de transferencia se concluye que su forma algebraica general viene dada por: T(s) = As2 + Bs + a0 s2 + Cs + c0 (11)

Siendo A, B, ao , C y co constantes particulares asociadas a cada geometra. Al multiplicar el numerador y el denominador de la ltima expresin por s se obtiene: As + B + T(s) = s+C+ a0 s c0 s

Que corresponde a la configuracin serie paralelo de la figura 5.

Circuito

Funcin de Transferencia

Zeq1 Zeq2(s) V2(s) T(s) = Zeq1(s) + Zeq2(s)

Zeq2

V1(s)

Figura 5. Configuracin serie-paralelo para un circuito equivalente y su correspondiente funcin de transferencia.

Optando por la configuracin serie-paralelo de la figura 5 para el circuito equivalente que se busca, el ordenamiento adecuado de los trminos de la expresin dar los valores correspondientes a Zeq1(s) y Zeq2(s) as: As + B + T(s) = s+C+ a0 s c0 s Zeq2(s) Zeq1(s) + Zeq2(s)

y recordando las impedancias y admitancias de resistencias, condensadores e inductores (refirase a OgataK., 2001), el circuito equivalente de la funcin de transferencia (11) resulta estar compuesto finalmente como se muestra en la figura 6. Donde Rv, Cv y Lv toman los valores reportados en la tabla 2 para cada tipo de vescula.

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Lv

Rv

Cv

Figura 6. Topologa general del circuito equivalente a la funcin de transferencia asociada al potencial transmembranal inducido sobre una vescula esferoidal por un campo elctrico aplicado. Geometra Esfrica Proloide Obloide Rv[p m2] 4.29 4.39 4.13 Cv[fF / m2] Lv[mH m2] 0.68 1.00 0.67 1.00 0.65 1.00

Tabla 2. Parmetros elctricos asociados al circuito de la figura 6 para vesculas esferoidales

Matthews (1996) reporta, valores de la capacitancia total de vesculas sinpticas con un dimetro determinado. As, a una vescula de 300nm de dimetro se asocia una capacitancia de 2.80 x 10-15F mientras que a una vescula de 50nm de dimetro corresponde una capacidad de 7.80 x 10-17F. En la tabla 3 se hace una comparacin de los datos que el presente modelo terico predice con estos valores reportados en la literatura.
Radio de la vescula [nm] 150 25 Cm [F] Modelo Terico 1.92 x 10 -15F 7.85 x 10 -17F Cm [F] Matthews et al. 2.80 x 10 -15F 7.80 x 10 -17F

Tabla 3. Tabla comparativa de las capacitancias que predice el presente modelo terico con las reportadas por Matthews (1996).

Al comparar los resultados as obtenidos con los reportados por Matthews (1996) y ms recientemente, con los de Von Gersdorff y Matthews (1999) o los de Friis et al. (2000) correspondientes a vesculas en exocitosis, se puede concluir que los valores que el presente modelo terico predice para la capacitancia se acercan igualmente a los reportados en la mencionada literatura, lo que hace procedente su aplicacin en el anlisis de la capacitancia implicada en el proceso de exocitosis. As, en un terminal nervioso de una neurona bipolar de salmn, la curva de capacitancia en funcin de la duracin temporal del impulso de despolarizacin (figura 3) se satura alrededor de 150fF, esto sugiere que la reserva de vesculas se ha liberado completamente. Para convertir esta meseta de capacitancia en un nmero de vesculas, es necesario conocer la capacitancia total de una vescula individual. En terminales de clulas bipolares de salmn, el valor medio del dimetro de una vescula es 29nm, que segn lo predice tericamente el circuito equivalente aqu implementado, corresponde a una capacitancia de 33.30aF. Luego, un salto en la capacitancia de 150fF corresponde a la fu-

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Artculo - Circuito elctrico equivalente de una vescula sinptica. Corts, et al.

sin de aproximadamente 4500 vesculas. Este valor concuerda aceptablemente con el nmero total de vesculas estimado por Von Gersdorff et al. (1996) de aproximadamente 6.000 vesculas. CONCLUSIONES El efecto de la estimulacin de una vescula mediante un campo elctrico uniforme dependiente del tiempo (en la aproximacin cuasi-estacionaria) es la induccin de una diferencia de potencial transmembranal. Luego de solucionar la ecuacin de Laplace en la aproximacin cuasi-estacionaria para vesculas esfricas, proloides y obloides bajo las condiciones de contorno adecuadas se encuentra expresiones tericas para la diferencia de potencial transmembranal inducido en cada una de estas geometras caractersticas de las vesculas sinpticas. La aplicacin del campo elctrico sobre la vescula produce una polarizacin de su membrana que se traduce en una fuerza electromecnica que acta sobre dicha membrana. Se comprueba aqu que en vesculas esferoidales bajo la aplicacin de un campo elctrico uniforme variable en el tiempo, los requerimientos bsicos para la aproximacin cuasi-estacionaria se satisfacen tanto en el caso de los efectos de propagacin como en el de los efectos capacitivos e inductivos generados por el campo elctrico sobre el sistema vesicular en estudio. De esta manera, al aplicar un campo elctrico uniforme y dependiente del tiempo en dicha aproximacin las expresiones obtenidas para la diferencia de potencial en el dominio del tiempo se pueden trasladar al espacio de frecuencia lo que hace posible encontrar una funcin de transferencia que finalmente permite disear la topologa de un circuito elctrico RLC equivalente. Este circuito sugiere la presencia de un componente inductivo en la membrana vesicular que es susceptible de verificar en algn estudio experimental posterior. As mismo, el modelo predice aceptablemente los valores de capacitancia para vesculas esfricas y aquellos correspondientes a vesculas en exocitosis reportados en la literatura. Esto hace factible que el circuito diseado se aplique en el anlisis de la capacitancia implicada en el proceso de exocitosis. As, como aplicacin final del modelo, se considera el proceso de exocitosis de una reserva vesicular en un terminal nervioso de una clula bipolar de salmn en el que la curva de capacitancia en funcin de la duracin del impulso despolarizante se satura alrededor de 150fF. Segn lo predice el presente modelo, este salto corresponde a la fusin de 4.500 vesculas que coincide aceptablemente con el nmero total de vesculas estimado por Von Gersdorff (1996) de aproximadamente 6000 vesculas. APNDICE A Definicin de pi y hi con i = 0,1,2,3,4,5. Vescula esfrica: P 0 = m q 0+ 2q5 R3 2 m q4 R3 P 1 = m q 1+ P 3 = m q 1+ 2q3 R3 2(f mq3) (R+d)3

P 2 = f m q 2+

Acta Biolgica Colombiana, Vol. 8 No. 1, 2003 39

P 4 = m q 2 Donde q0 =

2q4 (R+d)3

P5 = f + m q0

2q5 (R+d)3

(R+d)3 d(d2+3dR+3R2) R3 d(d2+3dR+3R2)

q1 =

1 d(d2+3dR+3R2) R 3( R + d ) 3 d(d2+3dR+3R2)

q2 = q3 = Mientras

q4 = q5 =

(p0p3 p1p5)R3i (2((p0 p4 p2 p5)q3 + ( p1 p5 p0 p3) q4 + (p2 p3 p1 p4) q5) ((p2 p3 p1 p4) q0 + (p0 p4 p2 p5) q1 h0 = +(p1 p5 p0 p3) q2)R3)im

(p p
2

p1 p4) R3

h1 =

p4(2q3+q1R3) m + p3 (2q4m + R3(i q2m))

(p p

2 3

p 1p 4) R 3

h2 =

p2(2q3+q1R3) m + p1(2q4m + R3(i q2m))

(p p
2

p 1 p 4) R 3

h3 =

2p4 e p4(2q3+q1(R + d)3) m + p3(2q4 + q2(R + d)3) m (p2 p3 p1 p4)(R + d)3 2p4e + p2(2q3 + q1(R + d)3) m p1(2q4 + q2(R + d)3) m (p2p3 p1p4)(R + d)3 (2p0 p4 +d3(p2 p3 p1 p4) 2p2 p5+(p2 p3 p1 p4) ( 3d2 +3dR+R2) R)e +((d3+3d2R+3dR2+R3)((p2 p3p1 p4)q0+(p0 p4p2 p5) q1 +(p1 p5p0 p3) q2)+2((p2 p5p0 p4)q3+(p0 p3p1 p5) q4 (p2 p3 p1 p4) q5))m

h4 =

h5 =

(p2p3p1p4)(R+d)3

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Artculo - Circuito elctrico equivalente de una vescula sinptica. Corts, et al.

Vescula proloide: P 0 = m q 0+ i q5 i21 i q3 i1 1 2 1 2 m q31n 1+i 1+i 1+i 1+i 1+i 1+i 1+o 1+o

P 1 = m q 1+

m q31n

P 2 = f m q 2+

i m q 4 i 1
2

1 2

mq41n

P3 =

2( m q1+o(f +o mq1m q3)) 1+o2 2o q4 1+o2 1+o

+ (f +mq3) 1n

P4 = m 2q2

+ q41n

1+o 1+o 1+o

2(1+o2) (f+m q0)2om q5 +( 1+o2) m q51n P5 = Donde 0 2+i1n q0 = 2o2i+oi 1n 1+o 1+o 1+o 1+o 1n 1+i 1+i 1+i 1+i 1+i 1+i 1+o2

2+on q1 =

1+o 1+o

2+i1n 1+o 1+o

4o4i+2oi 1n

1n

Acta Biolgica Colombiana, Vol. 8 No. 1, 2003 41

i 2+o1n q2 = q3 = 2o2i+oi 1n

1+o 1+o 1+o 1+o 1n 1+i 1+i

q4 = q5 =

2 o i 2o2i+oi 1n 1+o 1+o 1n 1+i 1+i

Mientras 2(1+i2)(p0p3p1p5)i2(p0((1+i2)p4q1+p3q2i p4q3+i p3(iq2+q4)) +p2((1+i2)p3q0+p5 q1+i p5(iq1+q3)i p3p5)+p1((1+i2)p5p2 i p5 q4 +p4((1i2)q0+i2q5)))m(1+i2)((pop4 p2p5)q3+(p1p5p0p3)q4+(p2p3 1+i p1p4)q5)m1n 1+i
2(1+i2)(p2p3 p1p4)

h0 =

2((1+i2)p3i + ((1+i2)p4q1 + p3q2 ip4q3 +ip3(i q2+q4))m)+ 1+i2(p4 q3 p3q4)m1n h1 =


2(1+i2)(p2p3 p1p4)

1+i

1+i

h2 =

2p2((1 i2)q1 + i q3)m 2p1((1 + i2)i + q2m + i(iq2 + q4)m) 1+i (1 + i2)(p2 p3 p1 p4)m 1n 1+i

(1+i2)(p2p3 p1p4)

h3 =

2o2p4e 2((1 + o2)p4 q1 + p3q2 o p4 q3 + o p3(oq2 + q4))m 1+i +(1 + o2)(p3q4m + p4(e q3m))1n 1+i
2(1 + o2)(p2p3 p1p4)

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Artculo - Circuito elctrico equivalente de una vescula sinptica. Corts, et al.

2(o p2 e+((1 + o2)p2 q1 + p1q2 o p2 q3 + o p1(oq2 + q4))m)

(1 + o2)(p1 q4 m + p2(e q3 m))1n h4 = (1 + o2)(p2p3 p1p4)

1+i

1+i

2((1 + o2)(p2 p3 p1 p4) + o(p0 p4 p2 p5))e + 2(p0((1 + o2)p4 q1 +p3q2 o p4 q3 + o p3 (oq1 + q3) op3q5) + p1((1+o2)p5 p2 o p5 q4 + p4(q0 o2q0 + o2q5)))m+(1+o2)(p2 p5e + (p2p5q3 1+ i +p1 p5 q4 + p2 p3q5 p1 p4 q5)m p0(p3 q4m + p4(e q3m)))1n 1+ i

h5 =
2(1+ o2)(p2 + p3 p1p4)

Vescula obloide: P0 = m iq0+ oq 5 o21 q5 arc cot(o) P1 = m iql+ oq 3 o21 q3 arc cot(o)

o mq 4 P2=i (f m q2)+ mq4arc cot(o) i2+1 2 oq 4 1+o2

P3=im q1+

o(f mq3) +(mq3f)arc cot(o) 1+o2 o mq 5 1+o2

P4 = m iq2

+ q 4arc cot( o)

P 5= f + i m q 0

+ mq5 arc cot(o)

Donde q0 = i 0(1+i arc cot(i)) o+i+oi (arc cot(i)arc cot(o))

q1 = q0 (1+o arc cot(o)) i (1+oarc cot(o)) 0i+oi (arc cot(o) arc cot(i)) q 0 i (1+i arc cot(i))

q2 = q3 =

q4 =

q5 i

Acta Biolgica Colombiana, Vol. 8 No. 1, 2003 43

Mientras i(1+ i2)(p0 p3 p1 p5) i + i(p0(p4((1+ i2)q1+ i i q3)+p3((1+i2)q2 +ii q4)) + p2 (p5((1+ i2)q1 + ii q3) p3((1+ i2)q0 + i i q5)) +p1(p5((1+i2)q2+ii q4)+p4((1+i2)q0+iiq5)))m(1+i2)((p0p4 h0 = p2 p5)q3 + ( p1 p5 p0 p3) q4 + ( p2p3 p1p4) q5)m arc cot( i) (1+i2)( p2p3 p1p4) i(1+ i2)p3i +(i(1+i2)(p4q1 p3q2) i p4q3 + i p3q4)m +(1+ i2(p2p3 p1p4)m arc cot( i) (1+i2)( p2p3 p1p4) p2(i(1+i2)q1+ i q3)m ip1((1+ i2)i ((1+i2)q2+iiq4)m) (1+i2)( p2p3p1p4) m arc cot( i) (1+i2)( p2p3 p1p4)

h1 =

h2 =

h3 =

o p4 e+ i(p4((1+o2)q1+i oq3)+p3((1+o2)q2+i oq4))m) +(1+ o2)(p3q4m + p4(e q3m))arc cot( o) (1+i2)( p2p3 p1p4)

h4 =

o p2 e+(i(1+ o2)(p2 q1 p1q2) op2q3 + o p1q4)m (1+o2)(p1q4m + p2( e q3m) )arc cot( o) (1+i2)( p2p3 p1p4)

(1+o2)( p2p3 p1p4) e + i(1+ o2)((p2p3 p1 p4) q0 + ( p0 p4 p2 p5) q1 +(p1p5 p0 p3) q2)m + o(p2 p5 e +(p5( p2 q3 p1q4) +(p2 q3 p1q4) q5)m + p0(p3q4 m + p4(e q3m) )) +(1+ o2)(p2 p5e +(p5 (p1q4 p2q3) + (p2p3 p1 p4)q5m h5 = p0 (p3q4 m + p4( e q3m) )arc cot( o) (1+i2)( p2p3 p1p4)

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Artculo - Circuito elctrico equivalente de una vescula sinptica. Corts, et al.

AGRADECIMIENTOS Al Departamento de Fsica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot. BIBLIOGRAFA BORST J. G., SAKMANN B. 1996. Calcium Influx and Transmitter Release in Fast CNS Synapse. Nature 383, pp. 431-434. BROADIE K., BELLEN H. J., DIANTONIO A., LITTLETON J. T., SCHWARZ T. L. 1994. Absence of Synaptotagmin Disrupts Excitation-Secretion Coupling During Synaptic Transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, pp. 10727-10731. BCHNER R., HEFTER G. T., MAY P. M. 1999. Dielectric Relaxation of Aqueous NaCl Solutions. J Phys. Chem. A 103, pp. 1-9. COLE, K., CURTIS, H. 1939. Electrical Impedance of the Squid Giant Axon During Activity. J. Gen. Physiol. 22. 649-670. CORTS X. 2003. Modelo de polarizacin RC aplicado a vesculas sinpticas. Tesis de pregrado. Universidad Nacional de Colombia. Bogot. CHAPMAN, E. R., HANSON P. I., AN S., JAHN R. 1995. Ca2+ Regulates the Interaction Between Synaptotagmin and Syntaxin 1. J. Biol. Chem. 270, pp. 23667-23671. DELCOMYN F. 1997. Foundations of Neurobiology. Freeman W. H. and Company. New York. DEBRUIN K. A., KRASSOWSKA W. 1999. Modeling Electroporation in a Single Cell. I. Effects of Field Strength and Rest Potential. Biophys. J. September. Vol. 77 No. 3, pp. 1213-1224. FIDLER L., N., NOWYCKY M. C., BOOKMAN R. J. 1990. Direct Measurement of Exocytosis and Calcium Currents in Single Vertebrate Nerve Terminals. Nature 344, pp. 449-451. FRIIS U. G., JENSEN B. L., HANSE P. B., ANDREASEN N. D., SKOTT O. 2000. Exocytosis and Endocytosis in Juxtaglomerular Cells. Acta Physiol Scand. 168, pp. 95-99. GASCOYNE PRC, PETHIG R., BURT JPH, BECKER FF. 1993. Membrane Changes Accompanying the Induced Differentiation of Friend Murine Erythroleukemia Cells Studied by Dielectrophoresis. Biochim. Biophys. Acta 1146, pp. 119-126. GEPPERT M., GODA Y., HAMMER R. E., LI C., ROSAHL T. W., STEVENS C. F., SUDHOF T. C. 1994. Synaptotagmin I: A Major Ca2+ Sensor for Transmitter Release at a Central Synapse. Cell 79, pp. 717-727. GILLIS, K. D. 1995. Techniques for Membrane Capacitance Measurements. In: Sakmann, B. and Neher, E. Editors, 1995. Single-Channel Recording (2 ed.), Plenum, New York. pp. 155-198. GRABE M., OSTER G. 2001. Regulation of Organelle Acidity. J. Gen. Physiol. April. Vol. 117. HAUS H. A., MELCHER J. R. 1990. Electromagnetic Fields and Energy. Prentice Hall. HENKEL A. W., HORSTMANNB H. M., HENKEL K. 2001. Direct Observation of Membrane Retrieval in Chromaffin Cells by Capacitance Measurements. FEBS Letters. Volume 505, Issue 3, pp. 414-418.

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