TEMA 5: AMINOCIDOS Y

ENLACE PEPTDICO
5.1. AMINOCIDOS
Los aminocidos son biomolculas se construyen en torno a un carbono
que est unido a cuatro sustituyentes diferentes: un grupo carboxilo, un grupo
amino, un hidrgeno y un radical distinto -R, que sirve para clasicarlos. Debido a la presencia de
este carbono asimtrico, llamado carbono !, son molculas con actividad ptica, aunque slo son
proteingenos los de la serie L.
El hecho de que existan grupos carboxilo y amino sobre el carbono ! convierte a los
aminocidos en anfteros, sustancias cuya carga depende del pH del medio. As, adems de la
naturaleza del radical -R, este hecho permite clasicar los 20 aminocidos codicados
genticamente (si bien en las protenas puede aparecer un nmero mayor de stos, debido a su
posterior alteracin).
AMINOCIDOS
Aminocidos apolares alifticos: glicina (Gly, G), alanina (Ala, A), valina (Val, V), leucina
(Leu, L), isoleucina (Ile, I) y metionina (Met, M).
Aminocidos aromticos: fenilalanina (Phe, F), tirosina (Tyr, Y) y triptfano (Trp, W).
Aminocidos polares sin carga: serina (Ser, S), treonina (Thr, T), cistena (Cys, C), prolina
(Pro, P), asparragina (Asn, N) y glutamina (Gln, Q).
Aminocidos cargados positivamente a pH siolgico: lisina (Lys, K), arginina (Arg, R) e
histidina (His, H).
Aminocidos cargados negativamente a pH siolgico: cido asprtico (Asp, D) y cido
glutmico (Glu, E).
A pesar de tener radicales distintos, los aminocidos pueden agruparse as en funcin de
muchas caractersticas fsicas y qumicas comunes. Por ello, la estructura primaria de una misma
protena puede variar mucho de unas especies a otras, manteniendo nicamente el balance entre
aminocidos apolares y polares, el nmero de cargas... para que se pliegue de la misma manera en
el espacio.
Aunque la funcin fundamental de todos estos aminocidos es la sntesis de protenas,
tambin pueden comportarse como neurotransmisores, hormonas o como sustrato metablico para
producir energa. Sin embargo, esto ltimo lleva implcita la necesidad de excretar el grupo
amonio, muy txico para el organismo.
5.2. PUNTO ISOELCTRICO
Al ir variando con el pH, es posible calcular en qu valor de la escala la carga de un
determinado aminocido es nula, lo que se conoce como punto isoelctrico. Normalmente, durante
el transcurso de una valoracin con una base fuerte, el primer grupo que pierde su protn es el
carboxilo del carbono ! y, a continuacin, lo hace el grupo amino de este mismo carbono.
Carcter anftero de los aminocidos
En el caso de los aminocidos monoamino monocarboxlicos, la fuerza del grupo carboxilo
del carbono ! es algo mayor que un cido dbil corriente (como el cetico) y su pKa es algo ms
cido; el pKa del grupo amino tambin es algo ms cido que una base dbil corriente. As, para
estos aminocidos el punto isoelctrico se calcula con la media de los pKa que caracterizan los dos
equilibrios que sufre la especie.
Para el resto de aminocidos, su punto isoelctrico tambin se calcula con la semisuma de los
dos pKa que caracterizan los equilibrios que conducen a la especie neutra. Generalmente, primero
pierde el protn el carboxilo del carbono !, despus el del radical, y a continuacin, los grupos
amino. Normalmente, el amino del radical es ltimo grupo que se desprende de este protn, al
tener el pKa ms cido, salvo en el caso de la histidina, donde el pKa del grupo amino del radical
es menor que el del carbono !.
5.3. REACCIONES QUMICAS CON AMINOCIDOS
Si bien la reaccin fundamental de los aminocidos es la de formar un enlace entre su
carboxilo y el amino de otro aminocido mediante un grupo amida (enlace peptdico), no es la
nica. Algunas reacciones qumicas que presentan los aminocidos son las siguientes:
Proteccin del grupo carboxilo: mediante la formacin de un ster, el grupo carboxilo del
aminocido se bloquea con un alcohol o un fenol, eliminando su reactividad durante la sntesis
qumica de pptidos.
Proteccin del grupo amino: de una forma anloga, se puede hacer reaccionar el grupo
amino con clorocarbonato de bencilo para hacerlo no reactivo.
Aminocidos monoamino monocarboxlicos
Aminocidos monoamino dicarboxlicos
Aminocidos diamino monocarboxlicos
Reacciones qumicas de los aminocidos:
- COOH:
- Amidas: R-COOH + R'-NH
2
R-CO-NH
2
- steres: R-COOH + R'-OH R-CO-O-R'
Proteccin (R', fenol)
- NH
2
:
- Proteccin grupo amino:
- Bases de Schiff: R'-COH + R-NH
2
R-CO-NH
2
-Descarboxilacin/desaminacin
con ninhidrina (570 nm)
Formacin de bases de Schiff: las bases de Schiff son intermediarios del metabolismo de los
aminocidos, formados por la reaccin de su grupo amino con un aldehdo.
Descarboxilacin o desaminacin con ninhidrina: esta reaccin sirve para la identicacin de
aminocidos, de manera que la solucin se vuelve de color prpura. Sin embargo, no tiene el
mismo efecto con la prolina, tcnicamente un iminocido,
pues adquiere un tono amarillento.
Formacin de enlaces disulfuro: se trata de la
interaccin covalente ms relevante que mantiene las
estructuras ms superiores de las protenas, de manera que
se forma un puente con dos tomos de azufre de los
radicales de dos cistenas. El proceso de formacin est
catalizado por una enzima del retculo endoplsmico, la PDI
(protein disulfuro isomerasa). Esta misma enzima, cuando se
combina con el compuesto "-mercaptoetanol, tambin es
capaz de romper estos enlaces.
Reaccin de Ellman: el puente disulfuro que contiene la molcula de DTNB (cido 5,5-
ditiobisnitrobenzoico) se rompe al reaccionar con los grupos tioles de las cistenas no implicadas en
los propios enlaces disulfuro de la protena, liberndose un mol de DTNB por cada mol de cistena
reactiva. As, junto con la PDI y el "-mercaptoetanol, se puede conocer cuntas cistenas contiene
una determinada macromolcula.
5.4. ENLACE PEPTDICO
El enlace peptdico, un enlace de tipo amida muy
dirigido y que conlleva la prdida de una molcula de agua,
es el encargado de unir dos aminocidos para formar un
dipptido. La disposicin de las molculas al formar el
enlace peptdico hace que siempre reaccione el grupo
carboxilo del primer aminocido con el grupo amino del
segundo, de manera que todas las cadenas polipptidicas
incorporan nuevos monmeros por su extremo C-terminal.
Las diferencias de electronegatividades hacen que sobre el oxgeno del grupo carboxilo aparezca
una carga parcial negativa y, sobre el hidrgeno del grupo amino, una positiva; un hecho
importante de cara a la formacin de puentes de hidrgeno.
Reacciones qumicas de los aminocidos:
!"#$%&'()#(&*)+
HS-CH
2
-CH
2
-OH
1.- Oxidacin de tioles/reduccin de puentes disulfuro:
Protein disulfuro
isomerasa (PD)
2.- Reaccin de ELLMAN:
DTNB= cido 5,5'-ditiobisnitrobenzoico
Valora el n de tioles libres por la produccin de ac. tionitrobenzoico (412 nm)
Reacciones qumicas de los aminocidos:
!"#$%&'()#(&*)+
HS-CH
2
-CH
2
-OH
1.- Oxidacin de tioles/reduccin de puentes disulfuro:
Protein disulfuro
isomerasa (PD)
2.- Reaccin de ELLMAN:
DTNB= cido 5,5'-ditiobisnitrobenzoico
Valora el n de tioles libres por la produccin de ac. tionitrobenzoico (412 nm)
Enlace peptdico:
As pues, las protenas comparten un mismo esqueleto de la forma N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-
C-C-... que, a pesar de tener nicamente enlaces simples, no es nada exible. Adems, al unirse los
aminocidos, aparecen dos enlaces cuyas longitudes son diferentes a lo esperado: el enlace C-N es
ms corto de lo normal y el C=O, algo ms largo. Esto se debe a que el enlace peptdico es una
estructura resonante con enlaces que tienen un orden algo mayor que 1 pero menor que 2, y que no
permiten el giro de los tomos a su alrededor, sino slo en torno al carbono ! de cada residuo.
Por este motivo, los cuatro tomos implicados en el enlace peptdico (C, O, N e H)
permanecen siempre en un mismo plano, con la posibilidad de que aparezca una isomera
geomtrica, o de tipo cis-trans. Cuando se sintetizan protenas, inicialmente siempre lo hacen en
forma trans, de forma que los radicales de cada residuo se van alternando. Ms tarde, la enzima
PPI (peptidil prolil cis-trans isomerasa) puede transformar los enlaces en los que interviene la
prolina hasta adoptar una conguracin cis.
Si bien la estructura primaria de las protenas permite el giro de los tomos en torno a los
carbonos !, existen unas ciertas posiciones que los planos de los enlaces peptdicos no pueden
adoptar, pues colisionaran los unos con los otros. Las posiciones posibles se denen por los
distintos valores de los ngulos # y $, representados en el diagrama de Ramachandran. Los
escasos ngulos permitidos de este diagrama revelan bsicamente tres conformaciones secundarias
posibles: las !-hlices con giro a derechas, las !-hlices con giro a izquierdas (que no aparecen en
protenas) y las lminas ".
Generalmente, los distintos radicales de los aminocidos no inuyen
en los ngulos # y $, ni siquiera los que son muy voluminosos en los
aromticos, pues cuentan con carbonos " espaciadores, en forma de grupos
CH
2
. Sin embargo, este grupo no aparece en los radicales de algunos
aminocidos como la treonina o la isoleucina, y se reduce an ms el
espacio conformacional permitido.
Enlace peptdico : Hbrido resonancia entre 2 estructuras electrnicas extremas
Consecuencias: Es polar, est en un plano y est estabilizado
por resonancia (isomera cis-trans)
Peptidil-prolil cis-trans isomerasas (PP)
Restricciones conformacionales de la cadena polipeptdica
i=0, Ci----C'i trans Ni----H
i=0, Ci----Ni trans Ci----Oi
5.5. PLEGAMIENTO DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA
La conformacin tridimensional las protenas es caracterstica para cada una de ellas y
fundamentales para su funcin. Su plegamiento es espontneo, y no requiere de otras sustancias o
de aporte energtico para llevarse a cabo. Esto queda demostrado al aportar compuestos como la
urea (capaz de formar puentes de hidrgeno con los aminocidos), que altera esta conformacin y
desnaturaliza la macromolcula, pues al eliminar la urea del medio, la protena se vuelve a plegar
instantneamente de la misma manera.
A pesar de esto, en la clula s existen algunas protenas llamadas chaperonas implicadas en
el plegamiento de las cadenas polipeptdicas, no para hacerlo posible, sino ms eciente. Gracias a
las chaperonas se evita que se produzcan interacciones no deseadas con otras molculas. Tambin
pueden incluirse en este grupo de sustancias catalizadoras las enzimas PDI y PPI.
El plegamiento de la cadena polipeptdica comienza siempre gracias a las interacciones
hidrofbicas entre los radicales de los aminocidos apolares y aromticos, favorecidas por la
ganancia entrpica de las molculas de agua. Adems, gracias a la creacin de ncleos hidrfobos
aparecen fuerzas electrostticas muy fuertes entre aminocidos polares, que tambin contribuyen a
la estabilizacin de las estructuras superiores de la protena, al tiempo que, por la proximidad de
los tomos, se hacen notar otras fuerzas como las de van der Waals.
Asociadas a esta cadena polipeptdica, muchas protenas pueden presentar otras molculas
distintas a aminocidos, llamadas grupos prostticos. De esta manera, se habla de lipoprotenas,
glucoprotenas, fosfoprotenas, hemoprotenas, avoprotenas, metaloprotenas...
5.6. TCNICAS DE ANLISIS DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA
Aunque se siguen utilizando, las tcnicas tradicionales que permiten conocer el orden de los
aminocidos en la cadena polipeptdica estn quedando cada vez ms obsoletas gracias a la
secuenciacin de los genomas. Esta forma, la ms eciente, permite conocer la estructura primaria
de todas las protenas traduciendo el mensaje de las bases nitrogenadas a aminocidos siguiendo
el cdigo gentico.
Una de las primeras tcnicas que se emple fue la llamada degradacin de Edman. Para
llevarla a cabo, lo primero que se necesita es puricar la muestra de protena a analizar y tomar
varias alcuotas para tratarlas con diferentes agentes proteolticos.
La funcin de estos agentes es la de cortar la cadena y as obtener diferentes polipptidos.
Una de las alcuotas se deja reaccionar con la proteasa tripsina, una enzima que corta esta cadena
por el carbono terminal de las lisinas o las argininas. Otra sustancia que se puede emplear es la
quimiotripsina, que slo acta sobre los carbonos terminales de los aminocidos aromticos
(fenilalanina, tirosina y triptfano). Si se logran secuenciar las distintas series de polipptidos de
las alcuotas, es posible volver a reconstruir la cadena original.
La degradacin de Edman propiamente dicha es la que se realiza para la identicacin de
cada aminocido concreto en estos polipptidos, utilizando molculas de PITC (fenilisotiocianato).
El extremo amino terminal de cada pptido reacciona con el PITC hasta que se rompe el primer
enlace peptdico por reordenacin de los electrones y se libera un derivado de la tiazolinona
diferente para cada aminocido, que se puede identicar por cromatografa. Lavando la protena y
volviendo a repetir el protocolo con ms PITC para obtener las distintas tiazolinonas y secuenciar
todos los polipptidos.
Esta tcnica tambin pas a estar obsoleta con el desarrollo de la espectrometra de masas,
especialmente la llamada MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time-Of-Flight).
El inicio del anlisis requiere tambin de la fragmentacin de la protena en varios pptidos por
accin de la tripsina, que se cargan por un pulso de lser. Al quedar cargados, se pueden hacer
volar hacia un detector que relaciona su tiempo de llegada con su masa.
El conjunto de masas registradas por el detector
compone la huella peptdica de la protena y, al comparar sta
con la base estadstica informatizada de todo el conjunto de
protenas conocidas a partir de la secuencia del genoma,
puede determinarse cul es la secuencia de aminocidos
original.
Existen algunas variantes de la tcnica del MALDI-TOF,
como es la ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry), donde la mezcla lquida de
polipptidos se hace pasar por una aguja electricante, transformndose en una mezcla de gases
ionizados y hacindose volar hacia el detector. Adems, es posible acoplar dos espectrmetros en
serie, en la llamada MS-MS, de forma que se consigue que al detector llegue un mayor nmero de
polipptidos ms pequeos, haciendo ms improbable un error al comparar con la base estadstica.
DEGRADACN DE EDMAN
Anlisis de la estructura primaria de las protenas:
Espectrometra de masas:
MALD-TOFF
Huella peptdica
5.7. SNTESIS ARTIFICIAL Y RECONOCIMIENTO DE PROTENAS
En la actualidad, el mtodo ms ecaz para obtener grandes cantidades de una determinada
protena ocurre a travs de microorganismos. En el genoma de una bacteria se incorpora el gen que
codica para la protena deseada, y la propia clula se encarga de utilizar su maquinaria
traduccional para sintetizarla.
Tambin existen formas articiales de sintetizar una cadena polipeptdica en el laboratorio,
siguiendo nicamente mtodos qumicos. Esta sntesis articial se lleva a cabo en sentido contrario
al que seguira un ribosoma en la clula, uniendo el grupo amino del aminocido C-terminal con el
carboxilo del penltimo, y as sucesivamente.
Para evitar que se produzcan reacciones no deseadas entre otros grupos, el grupo carboxilo
del aminocido C-terminal se bloquea con una partcula de resina slida insoluble, dejando su
grupo amino libre para poder formar el primer enlace peptdico. Cuando se incorpora el
penltimo aminocido de la cadena, ste debe llevar bloqueado su grupo amino con un compuesto
llamado Fmoc (9-uorenilmetoxicarbonil), para que slo sea reactivo su grupo cido.
El enlace peptdico se
establece entonces entre estos dos
aminacidos gracias a la accin de
la DCC (diciclohexilcarbodiimida),
una molcula que recoge la
molcula de agua liberada y se
transforma en diciclohexilurea. Si
la sntesis del pptido debe
continuar, el grupo Fmoc del
grupo amino terminal se libera y
se permite la entrada de un nuevo
aminocido de la misma manera.
Esta tcnica permite formar
no protenas completas, sino
oligopptidos de unos 10 12
residuos. Este fragmento proteico
es suciente para funcionar como
antgeno y producir una respuesta
inmunitaria especca al ser
inoculada en un animal de
laboratorio. Gracias a esto, al
extraer el suero del animal se
obtienen inmunoglobulinas que
son especcas contra la protena
que a estudiar, un primer paso
esencial de cara al reconocimiento
y el marcaje de protenas en las clulas.
Sntesis de pptidos:
9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc)