Bioqumica Experimental I

Tema 5: Cromatografa

Antonio Ortega Jimnez

Cromatografa
Tcnicas fsicas utilizadas para la purificacin de protenas y otras molculas Las muestras biolgicas son complejas mezclas de biomolculas y para analizarlas necesitaremos separarlas y fraccionarlas. Las propiedades qumicas pueden no ser suficientes para discriminar entre biomolculas del mismo tipo (cidos nucleicos, protenas,) con lo que las propiedades fsicas como la polaridad, la forma de la molcula, su afinidad, su carga son muy socorridas para diferenciar y separar las molculas. Propiedades fsicas La polaridad se da cuando se producen diferentes densidades electrnicas a travs de un enlace, y determina las interacciones polares o hidrfilas y apolares o hidrfobas. Segn la intensidad y el tipo de interacciones se modulan propiedades como la solubilidad (interaccin con disolvente), la adsorcin (interaccin con superficie de slido), volatilidad y puntos de fusin y ebullicin (interaccin entre s). Las diferentes interacciones que ejercen las molculas entre ellas en funcin de estas propiedades fsicas sirven para disear mtodos con los que separarlas. Otras propiedades fsicas tiles son la carga, que puede aparecer por presencia de grupos bsicos y cidos susceptibles a cambio en el pH, y el tamao que permite separar por centrifugacin, dilisis, filtracin en gel o electroforesis de cribado molecular. Diseo de las tcnicas Sern necesarios mtodos para separar los componentes de una mezcla, en la cromatografa sern separados en funcin de la distribucin entre dos fases: una estacionaria o fija y otra mvil. La separacin se debe a una fuerza impulsora del movimiento y otra que se opone a l que son diferentes para cada molcula La separacin puede darse en una fase, o en dos inmiscibles, normalmente una fase mvil, que proporciona la fuerza impulsora, y otra estacionaria que establece la fuerza de retardo. En los sistemas de dos fases la separacin de molculas se origina en la tambin diferente interaccin con las dos fases para cada molcula. El grado de separacin depende de las fuerzas de interaccin. Cuanto ms interaccione la partcula con una de las fases, mayor grado de separacin. Las partculas que interaccionan con la fase estacionaria fuertemente se mueven ms lentamente que otras. El coeficiente de distribucin/particin/reparto (Kp) es la relacin entre la concentracin de soluto en la fase estacionaria (Ce) y la fase mvil (Cm). Es el cociente de concentraciones de lo que se ha pegado y lo que no lo ha hecho.

El coeficiente de reparto de las sustancias de la muestra determina el resultado de la separacin, si ha sido mucha o no. El desplazamiento de las molculas por la fase estacionaria con la fuerza proporcionada por la fase mvil genera fenmenos de reparto que permiten

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separar las molculas por la polaridad, que determina las interacciones con las fases. Para que se produzca fuerza retardadora debe cumplirse que la molcula a aislar tiene polaridad similar a la fase estacionaria, y que las fases estacionaria y mvil tienen polaridades opuestas

Parmetros medibles
-FLUJO: volumen de fase mvil que pasa por la columna en una unidad de tiempo. Cmo de rpido van las molculas por la columna. nalogo al concepto de caudal. -GASTO LINEAL : longitud de columna recorrida por la fase mvil por unidad de tiempo. Anlogo a la velocidad. Es el flujo partido por el rea de la base de la columna. -TIEMPO DE RETENCIN TR: el tiempo necesario para que el componente atraviese la columna. Se considera atravesada cuando ya se ha producido el pico. -VOLUMEN DE ELUCIN : la cantidad de fase mvil que debe aadirse para la elucin de un soluto. Depende de la naturaleza de la interaccin del soluto con la fase estacionaria. A ms volumen, ms interaccin con la fase estacionaria. -FACTOR DE CAPACIDAD O RETENCIN: cociente de la velocidad de desplazamiento del soluto y la velocidad de una sustancia que no es retenida en absoluto por la fase estacionaria. Se aplica a cada sustancia por separado. -FACTOR DE SELECTIVIDAD: razn entre tiempos de retencin de dos compuestos. Cuanto ms distinto de 1 sea, mejor se separan en una cromatografa. Se aplica a pares de sustancias. De todos los parmetros, el ms importante es el TR, el cual puede ser matizado. Distinguimos varios tiempos El tiempo muerto es el tiempo que la molcula no interacta con la fase estacionaria. El tR propiamente dicho es el tiempo que tarda en salir El tiempo de retencin relativo es la diferencia de ambos. El factor de selectividad es el cociente del tiempo de retencin de dos sustancias. Lo ideal es que est en torno a 2 (o 0,5). No interesa que sea bajo porque entonces no hay resolucin, ambas protenas habrn salido muy cerca y probablemente solapen, pero tampoco interesa que sea muy alto, porque indicara una resolucin excesiva que conlleva prdida de tiemo.

La resolucin es la capacidad de un sistema cromatogrfico para separar dos sustancias, refirindose no solo a la diferencia de tiempo de retencin (distancia entre picos, es bueno que haya un poco, pero demasiado es malo, porque conlleva una cromatografa larga), sino tambin la rapidez con la que se alcanza el pico una vez la sustancia empieza a salir (ancho del pico, es bueno un pico estrecho). A

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mayor resolucin, ms claros y ntidos estarn los picos, la separacin habr sido espaciada y compacta. Depende de los factores de selectividad Ejemplos Las bebidas alcohlicas sufren una cromatografa. Las barricas podridas del vino de Jerez intercambian iones con los lquidos destilados como el whiskey o el ron. Aplicaciones No solo sirven para purificar y separar componentes, pero tambin sirven para analizar, identificar y cuantificar los compuestos, como en el test de alcoholemia. El HPLC se utiliza en el anlisis de la orina de los deportistas. La medicin de la contaminacin del aire se hace con cromatografa de gases. Sirve para analizar una mezcla y la relacin de componentes, su cantidad (cuatificacin) Tambin nos permite identificar los componentes y purificarlos Se utilizan da a da en los laboratorios, en control alimentario, purificacin de protenas, en estudios forenses y metablicos El cromatograma En un cromatograma se representa la absorbancia de las biomolculas que salen de la columna en funcin del tiempo o de fracciones de volumen constante. Los picos representan el momento mximo de elucin de una molcula, cuanto ms desplazado a la derecha est, ms ha tardado en salir, es decir, tiene un mayor tiempo de retencin. Los solapamientos de picos representan el intervalo de tiempo en el que salen 2 protenas a la vez porque no se han separado lo suficiente. Esto se puede arreglar aumentando la longitud de la columna. El rea del pico representa la cantidad de molcula separada. Lo ideal es tener picos pronunciados y separados. 29/10/10

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Los cromatogramas se emplean en cromatografas de columna. Se observa la salida de las sustancias por la columna con medidas del pH, conductancia elctrica, absorbancia. En la grfica vemos representado con una lnea roja, el gradiente isocrtico, lineal, de sal. La cromatografa se har de tal forma que los picos de absorbancia estn perfectamente separados, y que sean lo ms estrechos posible. El rea bajo la curva A es proporcional a la concentracin de A, cuando pasa por el detector. Es posible mediante calibracin calcular la cantidad de una sustancia que est presente en la mezcla, incluso en muy pequeas cantidades: (ng/ml) El rea del pico B es menor que la del pico A. Puede ser porque hay menos cantidad de B que de A, pero tambin pudiera ser porque B absorbe menos luz a 280 nm que A (es orientativo y estimativo, pero tiene ese problema). En otras palabras los cromatogramas nos dan una idea de cmo ha ido nuestra cromatografa pero no cuantifican. Se cuantifica con Bradford, Lowry, o cualquier otro mtodo. Tipos de cromatografas Hay 2 tipos de cromatografa: plana y en columna, segn cmo se disponga la fase estacionaria La plana se hace en un soporte o filtro. En columna se hace en un cilindro en el cual vertemos nuestra fase estacionaria. Cromatografa plana -Cromatografa en papel: separa muestras lquidas o secas. La fase mvil es un solvente lquido y la fase estacionaria es una tira de papel de filtro. El lquido sube por tensin superficial y arrastra todas las sustancias, que se mueven ms o menos rpido segn su interaccin con la fase mvil. Tiene poca resolucin. -Cromatografa en capa fina (TLC): separa muestras lquidas o secas. La fase mvil es un solvente lquido y la fase estacionaria es una lmina de vidrio o aluminio cubierta con una capa fina de almina, slice, carbonato, etc. La ventaja de usar slice es que es un material polar, pero admite adiciones de grupos qumicos apolares, con lo que se puede usar en fases reversas. La muestra se va moviendo por la superficie de la placa, sin llegar a introducirse en su interior Esta tcnica se ha utilizado mucho para molculas de bajo peso molecular y que se encuentran en baja cantidad La gran diferencia entre ambas, es que en la segunda se dispone una capa fina de almina, carbonato sobre la placa cromatogrfica de vidrio. Adems, en vez de

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empapar el soporte, las muestras solo van por un lado, con lo que aumenta la resolucin para la misma cantidad de muestra, se obtiene una separacin an mayor. La resolucin aumenta porque se minimizan todas las interacciones que no son partcula-superficie de la placa. En la otra cara no hay mancha. Las manchas no traspasan la placa En ambas cromatografas Una pequea cantidad de muestra se deposita con un capilar de vidrio, sobre el adsorbente, muy cerca del extremo inferior de la placa. Se secan las muestras con un secador. Se introduce la placa en una cubeta de cromatografa, que contiene en el interior el disolvente con el que va a desarrollarse el cromatograma. La altura del disolvente en dicho frasco o cubeta debe ser tal, que ste no toque la zona donde se encuentra la pequea mancha de producto depositado. Llegar a l por capilaridad. Las que ms suben sern las que menos interaccionen con la fase slida. Se puede medir la distancia que recorren por la fase slida. As sacamos la movilidad relativa y con un patrn identificar las manchas y asignrselas a compuestos concretos. Ver artculo de la alfa amilasa Podemos realizar cromatografas en dos dimensiones, en las que tras la finalizacin de una cromatografa monodimensional, aplicamos un nuevo disolvente a la placa, con lo que proporcionamos nuevas movilidades a las molculas. El movimiento ha de producirse en una direccin perpendicular a la primera. Se pueden dividir manchas de molculas que tenan movilidad igual en un disolvente y distinta en el nuevo.

Esta TLC 2D demostr la fijacin de CO2 por las plantas. No son tcnicas que nos permitan purificar compuestos, sino identificarlos y analizarlos.

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Los compuestos separados de la mezcla se pueden visualizar por caractersticas mesurables como la fluorescencia, radiactividad, color, o por modificacin con reactivos qumicos. Se pueden utilizar placas fluorescentes de manera que en luz UV toda la placa fluorezca excepto donde hay mancha. Se pueden identificar las manchas por comparacin con un patrn de referencia de composicin conocida. Se utiliza el valor Rf, anlogo a la movilidad electrofortica:

tomando como referencia el centro de la mancha, que idealmente no superar los 5 mm de dimetro Una desventaja es que es difcil reproducir valores de Rf aunque en teora sean constantes para un eluyente y compuesto dado. Adems para dos compuestos con Rf igual, no me permite identificar. Realizado ese anlisis cuantitativo, se pueden raspar, recortar o eluir las manchas para hacer una determinacin cuantitativa de los componentes, por separado. Cromatografa en columna Empaquetamos una matriz adsorbente dentro de un tubo, y gracias a una llave en el fondo del tubo podemos ir recuperando cada fraccin separada. La matriz debe permitir el flujo a travs, con lo que debe estar rota, permitiendo el contacto entre las dos fases. El adsorbente se encuentra inmovilizado en la columna gracias a la colocacin de un filtro en el extremo inferior de la columna que no permite su paso. Me permite fragmentar, e identificar compuestos. Puede ser analtica pero tambin preparativa. -Cromatografas lquidas: separan muestras lquidas. La fase mvil es un solvente lquido y la fase estacionaria se encuentra en una columna compuesta por partculas esfricas slidas -Cromatografa de gases: separa muestras gaseosas (o lquidos volatilizados). La fase mvil es un gas y la fase estacionaria una columna que contiene un lquido o partculas esfricas slidas. FILTRACIN EN GEL O CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR Parmetros importantes en la filtracin en gel:

Vi = volumen interno de la matriz

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Este volumen es el ms importante, porque consiste en el volumen de los canales en la matriz. La accesibilidad de las molculas a este espacio viene determinada por el peso molecular de las partculas, y va a ser el principal factor de separacin. El lmite inferior de resolucin ser aquel tamao a partir del cual reducciones no se traducen en un mayor acceso a este volumen. De la misma manera, el lmite superior resolutivo es aquel en el que aumentos del volumen no se traducen en un menor acceso a este espacio (porque se ha vuelto 0).

El V0 es el volumen que hay que aplicar para eluir las sustancias que no se filtran, es decir, aquellas que se hallan por encima del lmite de exclusin o resolutivo, y tambin es siempre el volumen dentro de la columna que no ocupa el gel, por eso es el volumen vaco Estos 3 volmenes suman el total del volumen en la columna Ve=volumen de elucin = volumen de tampn aadido para que salga (eluya) la muestra. El volumen de soluto a aadir para que salga por el tubo. El volumen de elucin es el volumen vaco ms la fraccin del volumen interno de la matriz el cual es accesible a la partcula. Es por esto que solo se separan molculas cuando entre ellas ha habido un cambio en Vi, ya que V0 es constante. Cambios en Vi solo son provocados por cambios en la masa. El logaritmo del peso molecular de las protenas que salen por la columna es una funcin del volumen relativo de elucin para el que salen. El volumen relativo de elucin es Ve/V0. Todas las columnas tienen unos lmites de exclusin fuera de los cuales no son capaces de separar molculas 30/10/13 Nos puede servir para determinar peso molecular gracias a la comparacin con un patrn de peso molecular.

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO Podemos separar las protenas en funcin de su tamao, pero si la matriz que metemos en la columna tiene carga podemos separar las protenas tambin en funcin de la densidad de carga, que consiste en dividir la carga de la molcula por su peso molecular. Para purificar protenas de una carga se ponen matrices de la carga opuesta. En la matriz se suelen utilizar grupos amino y carboxilo. La matriz se hace con agarosa o celulosa.

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La carboximetil (CM) celulosa sirve para que se peguen molculas con carga positiva, mientras que la dietilaminoetil (DEAE) sirve para adsorber cargas negativas. Nos interesan: -Soluciones con baja fuerza inica porque las sales, que aumentan a fi, apantallan las cargas. -Necesitamos matriz de carga opuesta. -Tambin debemos cuidar el pH de la solucin, ya que es una variable que determina las cargas de las protenas. Esto se debe a que las protenas son anfteras. -Por ltimo, el tampn debe ser el adecuado para controlar el pH que nos interesa. Si nos equivocamos podemos hacer que el tampn compita con las protenas. Si vamos a intercambiar aniones, necesitamos tampones catinicos y viceversa. Por tanto el tampn tendr la misma carga que la matriz. Cmo despegamos las protenas que se han adsorbido? Aumentando la fuerza inica, que anula la interaccin electrosttica por apantallamiento de carga. Recordemos que una fuerza inica baja era necesario para que se produjera la unin, as que es lgico romperla subiendo la fuerza inica. Las que tengan menor densidad de carga empiezan a despegarse antes que las que tienen ms densidad

Los extremos son mutantes a los que se les han cambiado aminocidos con una carga determinada por la opuesta. La zona azul tiene carga positiva. Si cargamos nuestra columna de CM con estas tres plastocianinas y empezamos a despegar, se despega primero la ms neutra, y la ms negativa la ltima.

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La lnea azul representa la conductividad, que aumenta porque va subiendo la concentracin de sal. La concentracin de sal sube porque la estamos subiendo para despegar las protenas. El cromatoenfoque consiste en una cromatografa de intercambio inico en la cual en vez de someter la muestra a un gradiente de fuerza inica, lo sometemos a un gradiente de pH. Cuando metemos soluciones con pH=pI, la protena no tiene carga y sale de la columna. Cambia el tampn de elucin. Por ejemplo, aplicas un pH=4 en la columna con CM y se te pegan las protenas con carga +. Conforme lavamos con pH cada vez superiores, se van despegando las protenas con punto isoelctrico creciente, que son las que van adquiriendo carga negativa y se despegan de la matriz. Para generar un gradiente isocrtico de pH, el cual consigue la mxima resolucin, utilizaremos anfolitos. Si en vez de crear un gradiente isocrtico creamos uno discontinuo, generaremos varios frentes de pH que implican un cambio brusco de pH. Este frente va barriendo la columna llevndose todas las protenas cuyo pI esta entre el par de valores de pH que delimita el frente, lo que probablemente implicar que protenas distintas se separen a la vez, de ah la prdida resolutiva. CROMATOGRAFA DE INTERACCIONES HIDRFOBAS Si aumentamos mucho la fuerza inica, podemos unir molculas a una matriz hidrfoba (octil-sepharosa) por interacciones hidrfobas. Diluyendo sulfato amnico aumentamos la I y conseguimos que se adsorban las sustancias ms hidrfobas a una matriz apolar. Despegamos bajando la concentracin de sal, recuperando la repulsin electrosttica. Las ms hidrosolubles salen primero, al revs que en el intercambio inico. Tambin se puede eluir con un gradiente decreciente de disolvente.

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LA CROMATOGRAFA DE AFINIDAD Unir de forma especfica la molcula a la matriz. El nquel se une muy bien de forma muy especfica a las histidinas. Se une covalentemente a la matriz algo muy afn a la molcula que queremos purificar. Muchas veces se ponen metabolitos que son sustratos de enzimas. La elucin se hace introduciendo los mismos ligandos que hemos unido a la matriz. Inmunoafinidad: tendremos que despegar los antgenos unidos a anticuerpos bajando el pH. Un problema de esta tcnica es la posibilidad de desnaturalizar la protena. FPLC (FAST PHARMACIA LIQUID CROMATOGRAPHY) Cromatografa lquida a presin Se diferencia de otras cromatografas estndar en la velocidad de flujo, la presin de la muestra (mayores) y el dimetro de las partculas en la fase estacionaria (menor). Se hacen las partculas de la matriz (fase estacionaria) muy pequeas con el objetivo de aumentar la resolucin, pero esto presenta la problemtica de la tensin superficial, que puede bloquear el movimiento. Esto se soluciona aumentando la presin. Cuanta ms presin insuflemos, ms pequeas pueden ser nuestras beads y ms resolucin podremos alcanzar. Las columnas se pueden eluir a) por gravedad b) con una bomba peristltica. El uso de bombas peristlticas ha permitido disminuir los tiempos de separacin, y con ellas podemos controlar el flujo de fase mvil. Conforme han ido avanzando nos han permitido crear gradientes. La gran ventaja de hacer las partculas ms pequeas es que permite aumentar la superficie de interaccin con la fase mvil por unidad de volumen. Aumentamos tambin la relacin de superficie/volumen de la fase mvil que interacciona, con lo que aumenta la eficiencia. Las columnas son ms pequeas, pero aumenta la superficie de interaccin. Se requiere un esfuerzo a la hora de hacer pasar el flujo por la matriz, se consigue con la alta presin.

HPLC (HIGH PERFORMANCE /PRESSURE LIQUID CROMATOGRAPHY )

Para qu se utiliza el HPLC? Se puede utilizar para purificar, pero solo pequeas cantidades, porque hay mucha eficiencia pero baja produccin. Se utiliza por excelencia para determinar los componentes de una disolucin. Para poder soportar la presin, las bolas se hacen de silicio. Puede estar desnudo o recubierto de un polmero. Si solo hay silicio, polar, hablamos de una fase normal, que se usa en exclusin molecular.

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Si est recubierto de polmero puede ser fase reversa o normal. (Reversa si el polmero es no polar). En ese caso las sustancias que ms se retienen son las ms apolares. En fase normal, cuando ms polar sea el componente, ms tarda en salir En fase reversa, los solutos polares estaran ms tiempo en la fase mvil, salen antes. Los no polares se retienen ms tiempo. Fase reversa Fase normal Estacionaria APOLAR POLAR Mvil POLAR APOLAR

Por su reproducibilidad y amplia aplicacin, LA FASE REVERSA SE UTILIZA EN APROXIMADAMENTE EL 80% DE TODOS LOS MTODOS DE HPLC Se utilizan los mismos detectores que en FPLC o en cromatografas liquidas: UVvisible, fluorescencia

Cromatografa de gases
La fase mvil es un gas inerte. La fase estacionaria puede ser

lquido o slido
Se trabaja con muy poca cantidad de muestra, solutos volatilizados. Tiene mucha resolucin. No es una tcnica preparativa. Si es una cromatografa gas-lquido, la separacin se produce por reparto, si es gas-slido, por adsorcin a ste. En la cromatografa gas-lquido, la separacin de componentes se realiza en funcin de la afinidad por ambas fases, la cual viene determinada por la volatilidad, de manera que cuando ms voltil es el compuesto, ms afinidad tiene por la fase mvil y antes sale de la columna. APLICACIONES Tiene gran capacidad analtica, separando los compuestos de una mezcla para su posterior anlisis. Detectores: ionizacin de llama, captura electrnica, conductividad trmica, etc. Son distintos a los de HPLC. El detector de conductividad trmica se basa en que la resistencia elctrica del alambre por el que pasa el gas depende de la velocidad de flujo y la conductividad trmica del gas, lo cual es caracterstico del gas. La corriente variar en funcin de la resistencia, que es funcin del gas en concreto El detector de ionizacin de llama es el ms utilizado y se fundamenta en que la ionizacin provocada por una llama vara con la composicin de la fase mvil que

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va saliendo de la columna, lo que se traduce en una corriente registrada. Lo malo es que destruye la muestra y no controla las impurezas. El detector de captura electrnica tambin se fundamenta en la ionizacin, pero utiliza como sistema de ionizacin un istopo - como 63Ni o 3H. El sistema registrador-integrador nos permite identificar cada compuesto segn el tiempo en que aparece el pico, y su cantidad segn su rea. El conjunto de picos constituye el cromatograma de la muestra. PARMETROS La temperatura, que determina si vamos a separar o analizar los componentes. La reduccin de la temperatura produce mejor separacin pero puede alargar en exceso la elucin. Variando la temperatura los compuestos volatilizan a tiempos diferentes y pasan a la fase mvil y se eluyen de forma diferencial. Los compuestos a separar no pueden tener una temperatura de ebullicin muy alta. Tambin el gas portador, el hidrgeno es bueno, aunque se ioniza ms fcilmente que el helio, que es el que se utiliza ms. El flujo de gas ha de ser controlado. El cable se suele enrollar en el interior del horno. Hay varios tipos de columnas, las ms utilizadas son los capilares y las columnas empacadas. Las empacadas tienen en su interior filamentos de acero de unos pocos mm con un recubrimiento poroso de tierra de diatomeas. Nos sirven para las columnas de gaslquido. Las empacadas tienen ms superficie de interaccin. Distinguir entre cromatografas preparativas y analticas. Fuentes Tema 9 Bioqumica: tcnicas y mtodos. Muy bien explicado Apuntes de clase y diapos de Fernando