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OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

11 N umero de publicaci on: 21 51

k 2 168 971 kN umero de solicitud: 200001792 kInt. Cl. : C12P 23/00

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SOLICITUD DE PATENTE

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22 Fecha de presentaci on: 19.07.2000

71 Solicitante/s: ANTIBIOTICOS, S.A.U.

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Avda. de Antibi oticos, 59/61 24080 Le on, ES

43 Fecha de publicaci on de la solicitud: 16.06.2002

72 Inventor/es: Costa P erez, Javier;

Estrella Castro, Antonio; Marcos Rodr guez, Ana Teresa; Gonz alez de Prado, J. Emiliano; Peiro Cez on, Enrique E.; Collados de la Vieja, Alfonso y Esteban Morales, Manuel

43 Fecha de publicaci on del folleto de la solicitud:

16.06.2002

74 Agente: Tavira Montes-Jovellar, Antonio

54 T tulo: Procedimiento de producci on de -caroteno. 57

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Procedimiento de producci on de -caroteno. La presente invenci on se reere a un nuevo procedimiento para la producci on de -caroteno a partir de cultivos sumergidos de hongos mucorales como Blakeslea, Choanephora o Phycomyces mediante la adici on al medio de cultivo de lecitina conjuntamente con un control de pH una vez comenzada la fermentaci on, procedimiento que incluye un paso de recuperaci on de -caroteno con disolventes naturales toxicol ogicamente inocuos, lo que permite obtener una simplicaci on en el proceso, una optimizaci on en el rendimiento, junto con un incremento en la puricaci on del producto.

k kResumen:

Venta de fasc culos: Ocina Espa nola de Patentes y Marcas. C/Panam a, 1 28036 Madrid

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DESCRIPCION Procedimiento de producci on de -caroteno.
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Campo de la invenci on La presente invenci on se reere a un nuevo procedimiento para la obtenci on de carotenoides, especialmente -caroteno, a partir de cultivos sumergidos de hongos mucorales del g enero Blakeslea. Se describe un m etodo de fermentaci on que permite obtener un incremento en la producci on de -caroteno y en la concentraci on relativa de este respecto de otros carotenoides, basado en la incorporaci on al medio de cultivo de lecitina de soja as como a una estrategia denida de control de pH durante la fermentaci on. Asimismo, la presente invenci on describe un proceso optimizado, para la puricaci on y aislamiento de -caroteno cristalino de elevada pureza, a partir del caldo de fermentaci on obtenido anteriormente, mediante una simplicaci on del proceso de puricaci on e incremento de rendimiento de recuperaci on utilizando disolventes considerados como naturales y/o aquellos incluidos en la clase 3 de la ICH (International Conference of Harmonization). Estado de la t ecnica

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Los carotenoides son compuestos abundantes en los vegetales, primera fuente de la que se obtuvieron, y han sido objeto de numerosos estudios debido a sus propiedades como antioxidantes y como precursores de vitamina A. Representan el m as extendido grupo de pigmentos naturales existente en la naturaleza. Se utilizan en la industria como suplemento y colorante alimenticio en margarinas, aceites, salsas, sopas, etc. (Ninet L. y Renaut J. 1979. En: Peppler HJ., Perlman D. (eds). Microbial Technology, 2nd edn, vol.1 Academic Press, NY, pp. 529-544). Los carotenoides son isoprenoides que contienen una cadena poli enica de dobles enlaces conjugados caracter stica, procedente de una condensaci on de dos precursores geranilgeranil (Pfander (1992). Meth. Enzimol.). Existen dos grupos de pigmentos: los carotenos y sus derivados oxigenados, las xantolas. El -caroteno posee una f ormula emp rica C40 H56 , con un peso molecular de 536.85 y la siguiente formula molecular desarrollada:

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Trans Beta Caroteno La obtenci on de -caroteno como compuesto de alta pureza ha estado ligada a la reacci on de s ntesis qu mica cl asica, en procesos que hoy en d a son objeto de pol emica al considerarse que v as alternativas partiendo de fuentes de origen natural v a fermentaci on o productos naturales unidos a procesos de extracci on empleando solventes y condiciones de reacci on menos dr asticas, resultan m as ventajosas. Los carotenoides y dem as componentes terp enicos derivados en general y el -caroteno en particular pueden obtenerse a partir de fuentes naturales, bien sea productos vegetales: tomate, zanahoria, en los que se encuentra en porcentajes muy peque nos o partiendo de cultivos de algas, hongos, etc., seleccionados, en los que la proporci on de estos componentes puede aumentar. Procedimientos de obtenci on de oleorresinas ricas en carotenoides y en -caroteno a partir de vegetales, aceites o algas se describen en diversas patentes.

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En la mayor a de los casos los procedimientos de extracci on descritos requieren una etapa de molienda/extrusi on del fruto para facilitar la extracci on del solvente y liberar el contenido intracelular rico en -caroteno.

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El procedimiento de extracci on de estos componentes debe hacer frente a la relativa baja concentraci on y a la particular disposici on de los mismos en agrupaciones almacenadas intracelularmente. En consecuencia la extracci on del -caroteno requiere m etodos adecuados que permitan solubilizar el producto, previa preparaci on, para el acceso del agente solubilizante, bien mediante penetraci on de las paredes celulares o mediante rotura previa de las paredes celulares, liberando el contenido intracelular. Los procedimientos descritos en US 3268606, US 2959522 utilizan disolventes halogenados como diclorometano, cloroformo etc., o del tipo de hidrocarburos arom aticos: benceno, tolueno, etc., se encuentran con las dicultades de toxicidad inherentes a este tipo de disolventes, y que se traducen en su inclusi on dentro de los grupos I y II de la Gu a para disolventes residuales de uso en aplicaciones farmac euticas o alimentarias y seg un la cual los recomendables son los integrantes del grupo Clase III. La mayor a de los m etodos de extracci on de -caroteno a partir de algas emplean aceites. Estos m etodos no son los mas adecuados para obtener -caroteno en forma cristalina, sino para obtener extractos oleosos, como se describen en las patentes US 4680314; US 4713398; US 5019668; US 5378369 en los que se solubiliza el -caroteno y se comercializa como tal. El uso de CO2 supercr tico se ve limitado por la escasa solubilidad encontrada en el para el -caroteno. Se ha contemplado el empleo de otros solventes a presi on en condiciones supercr ticas o como gases licuados, tales como propano o etileno en los cuales la solubilidad es mayor. No obstante el uso de estos disolventes hidrocarbonados dicultar a el uso del -caroteno en la industria alimentaria. El -caroteno puede ser obtenido de forma alternativa a partir de caldos de fermentaci on de determinados hongos mucorales como Phycomyces, Blakeslea, etc., los cuales presentan como ventaja frente a las fuentes naturales anteriormente descritas, la elevada concentraci on de este compuesto en relaci on a la cantidad de biomasa seca as como el posible incremento de producci on utilizando cepas superproductoras obtenidas por t ecnicas de mutag enesis cl asica o biolog a molecular o bien mediante la optimizaci on del proceso de fermentaci on utilizando materias primas complejas, determinados inductores de la producci on o inhibidores de la producci on de otros carotenoides estructuralmente relacionados que eviten la producci on de los mismos. En cualquiera de los m etodos de producci on de -caroteno con el hongo B. trispora se utilizan cultivos mixtos, debido a que se obtienen rendimientos de -caroteno muy superiores a los encontrados en las estirpes (+) y (-) por separado (Ciegler, A. 1965). Advan. Appl. Microbiol. 7: 19).
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Las harinas de c tricos han sido a nadidas al medio de fermentaci on de -caroteno como sustituto de la -ionona, un estimulador qu mico de la ruta biosint etica [Ciegler, A. 1965. Adv. Appl. Microbiol. 7, 1-34]. La adici on de derivados de c tricos, previamente tratados con a lcali, permitieron incrementar el contenido de -caroteno hasta 1.7 g/l [Upjohn Co., 1965. Dutch Patent 65/00,788].
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Un estudio anal tico encaminado a identicar el o los factores estimulantes de la producci on de caroteno, contenidos en las harinas de c tricos, revel o que el a cido c trico es el principal componente adem as de una peque na cantidad de a cido m alico, as como un tercer acido no identicado, cuyo Rf es similar al a cido gluc onico o al a cido 2-ketogluc onico. Este estudio concluye que la funci on del a cido c trico en el incremento de la producci on es no espec ca y podr a actuar como un precursor de metabolitos tempranos de la ruta biosint etica. Adicionalmente se encontraron un 42 % de carbohidratos, de ellos el 50 % sacarosa y el resto az ucares reductores (glucosa y fructosa) [Pazola, Z., Ciegler, A., Hall, H.H. 1966. Nature 5043:1367-1368]. Las lecitinas son compuestos con una estructura de glicerofosfatidilcolina, estando presentes en todos los organismos vivos (plantas y animales), siendo constituyentes signicativos del tejido nervioso y del cerebro. Son sustancias incoloras, untuosas al tacto, que funden alrededor de 60C y se descomponen ecula de lecitina la constituye una mezcla de por calentamiento a poco de rebasar los 100 C. La mol diglic eridos de acido este arico, palm tico y oleico, ligados al ester de colina del acido fosf orico. Como la mol ecula tiene car acter dipolar, se emplean profusamente como surfactante y emulsicante comestible, de origen natural, con aplicaci on en la industria alimentaria general (chocolate, margarina, etc.), diet etica, farmac eutica y cosm etica [Furia, T.E. (ed.) CRC Handbook of Food Additives. 2nd ed. Cleveland: The Chemical Rubber Co., 1972. 879]. La lecitina comercial procede fundamentalmente de la soja, obtenida como un subproducto de la fabricaci on del aceite de soja, aunque tambi en puede obtenerse del ma z y otras semillas vegetales [Hawley, G.G. The condensed Chemical Dictionary. 9th ed. New York: Van Nostrand Reinhold Co., 1977.509]. La lecitina de soja contiene a c. Palm tico 11.7 %, este arico 4 %, palmitoleico 8.6 %, oleico 9.8 %, linoleico 55 %, linol enico 4 %, acidos C20-C22 (incluyendo araquid onico) 3

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5.5 % [The Merck Index. 9th ed. Rahway, New Yersey:Merck & Co., Inc.,1976.712]. El efecto de la lecitina de soja sobre la fermentaci on ha sido estudiado fundamentalmente en relaci on con su utilizaci on en piensos como suplemento fosfolip dico y el efecto sobre la fermentaci on del rumen, con incidencia sobre la digestibilidad de las grasas y el nivel s erico de triglic eridos y colesterol de terneros y ovejas (Jenkins TC, Jim enez T, y Cross DL (1989) Inuence of phospholipids on ruminal fermentation in vitro and on nutrient digesti on and serum lipids in sheep J Anim Sci 67(2):529-537; Jenkins TC y Fotouhi, N (1990) Eects of lecithin and corn oil on site of digesti on, ruminal fermentation and microbial protein s ntesis in sheep J Anim Sci 68(2):460-466; Jenkins TC (1990) Nutrient digesti on, ruminal fermentation and plasma lipids in steers fed combinations of hydrogenated fat and lecithin J Dairy Sci 73(10):2934-2939) as como sobre la producci on de leche en vacas (Abel-Caines SF, Grant RJ y Morrison M (1998) Eect of soybean hulls, soy lecithin, and soapstock mixtures on ruminal fermentation and milk composition in dairy cows J Dairy Sci 81(2):462-470). En la producci on de mildiomicina mediante fermentaci on por Actinomycetes, se encontr o en algunos casos un incremento importante de producci on por la incorporaci on al medio de cultivo de componentes de naturaleza N-metilo (especialmente grupos trimetil-amonio), entre ellos colina, beta na, lecitina, tetrametilamonio, etc., o sustancias naturales ricas en dichos compuestos, o incluso una combinaci on de ambos, para evitar una posible sobredosicaci on de otros componentes de la sustancia natural en cuesti on [US 4.334.022]. Otras patentes desarrolladas en los a nos 80 se reeren a la incorporaci on de la lecitina para favorecer el proceso fermentativo en la harina de soja desgrasada con el n de mejorar su procesabilidad y digestibilidad [JP 58116648] as como a su efecto activador sobre el cultivo de microorganismos utilizados en el procesamiento de alimentos [DE 3546511; EP 0223161]. Por otra parte, el car acter emulsionante de este compuesto ha sido tenido en cuenta en aplicaciones de eliminaci on de aceites por v a microbiana [DE 149056] o en el tratamiento por enzimas de euentes org anicos de desecho [EP 0421223] y en la formaci on de compost a partir de residuos de alto contenido en grasas [JP 7033570]. En una aplicaci on reciente, la lecitina se ha empleado tambi en para la mejora del medio de cultivo del hongo Lagenidium giganteum, permitiendo un mayor crecimiento y adem as una mayor efectividad como agente de biocontrol frente a los mosquitos del hongo incubado en tales condiciones [WO 98/58049]. En la producci on de beta-caroteno por fermentaci on de Blakeslea trispora se ha descrito la utilizaci on de algunos agentes surfactantes (como el Span 20, monolaurato de Sorbit an, SIGMA) para incrementar la producci on, gracias a que permiten un crecimiento disperso del micelio (Seon-Won Kim, Weon-Taek Seo y Young-Hoon Park (1997) Enhanced production of -carotene from Blakeslea trispora with Span 20 Biotechnology Letters 19(6):561-562). Sin embargo, no se describe efecto alguno sobre la relaci on del contenido en -caroteno producido respecto a otros carotenoides tambi en presentes en los cultivos de Blakeslea trispora ( -caroteno, -zea-caroteno, etc.). Los procesos para obtener el -caroteno a partir de caldos de fermentaci on, descritos hasta el momento, implican generalmente una etapa de extracci on y sucesivas cristalizaciones y recristalizaciones e incluso etapas de puricaci on cromatogr aca, lo que debido a la naturaleza de estas sustancias, exige un consumo elevado de disolventes debido a la baja solubilidad de los mismos (US 5310554; EP 0242148; US 3369974), Biochemistry and Molecular Biology International, 39, 1077-1084 (1996) y a menudo las purezas alcanzadas en el producto son excesivamente bajas. Adem as, los disolventes habitualmente empleados, diclorometano, cloroformo, hexano, benceno o tolueno, dicultan el uso del -caroteno obtenido en la industria alimentaria por su toxicidad. Cuando los cristales de -caroteno son obtenidos directamente por cristalizaci on del extracto org anico a partir de un caldo de fermentaci on mediante evaporaci on directa del disolvente, los cristales obtenidos no poseen la pureza necesaria comparados con el -caroteno sint etico, siendo necesarias diversas etapas de recristalizaci on y/o puricaci on con el consiguiente consumo de disolvente, complejidad del proceso y p erdidas de producto que originan unos bajos rendimientos de recuperaci on del mismo. Recientemente se ha descrito la preparaci on de cristales de -caroteno en la patente PCT WO 98/03480, por sucesivos lavados con agua o alcoholes de bajo peso molecular, partiendo de un extracto de acetato de etilo obtenido por extracci on de la biomasa procedente de un caldo de fermentaci on, que aun obteniendo una alta pureza en cristales de -caroteno, exige un consumo elevado de solventes como acetato de etilo y etanol, sucesivas etapas de lavado y cristalizaci on que dan lugar a que los rendimientos 4

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de recuperaci on del producto sean bajos. Resumen del invento
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El objeto de la presente invenci on es el incremento de la producci on de -caroteno, en un proceso de fermentaci on con hongos mucorales (Blakeslea, Phycomyces, etc.), m as espec camente Blakeslea trispora mediante el cultivo del hongo en un medio de fermentaci on que contiene cantidades variables de lecitina de soja, aplic andose al cultivo una estrategia denida de control de pH durante la fermentaci on. Asimismo, en esta invenci on se describe la obtenci on de -caroteno cristalino de elevada pureza a partir de un caldo de fermentaci on, empleando disolventes considerados como naturales. Disolventes naturales ser an aquellos que, por una parte sean toxicol ogicamente inocuos y/o los que est en incluidos en la clase 3 de la ICH (International Conference of Harmonization). En su consideraci on general el proceso comprende las siguientes etapas: 0) Fermentaci on en un medio de cultivo con lecitina y en condiciones de control de pH predeterminadas 1) Separaci on de la Biomasa h umeda desde la fuente natural de bios ntesis (el caldo de Fermentaci on por ejemplo) 2) Puricaci on de la Biomasa h umeda por tratamiento con alcohol 3) Separaci on de la Biomasa puricada del alcohol

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4) Acondicionamiento de la Biomasa puricada mediante secado mas disgregaci on o ruptura de la misma 5) Extracci on s olido-l quido del -caroteno con un disolvente org anico

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6) Concentraci on del extracto rico 7) Precipitaci on/cristalizaci on por adici on de alcohol 8) Filtraci on

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9) Secado El m etodo aqu descrito nos permite recuperar -caroteno cristalino con una pureza superior al 90 %, preferiblemente superior al 95 % y m as preferiblemente superior al 98 %.

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Descripci on detallada del invento La presente invenci on describe un procedimiento para incrementar la producci on de -caroteno, en un proceso de fermentaci on con hongos mucorales (Blakeslea, Choanephora o Phycomyces, m as espec camente Blakeslea trispora). La invenci on consiste en cultivar el hongo B. trispora en un medio de fermentaci on que contiene subproductos derivados de la manipulaci on de c tricos, en particular harinas de c tricos, los cuales han sido obtenidos mediante un proceso de eliminaci on de pectinas por tratamiento con hidr oxido c alcico y sucesivos tratamientos de cambio de pH y lavados para concentrar determinados componentes que inducen la producci on de -caroteno. Dentro de las harinas de c tricos, pueden ser utilizadas harinas procedentes de, por ejemplo naranja, pomelo, mandarina, etc. y dentro de cada una de ellas las diferentes variedades de cada uno de ellos como por ejemplo Navel, Navelina, Clementina Wasinghton, Valencia-late etc. La invenci on consiste por una parte en que el medio de cultivo contiene tambi en lecitina de soja y por otra parte en aplicar una estrategia denida de control de pH durante la fermentaci on. El efecto conjunto de estas variables permite un incremento en la producci on de beta-caroteno y en la concentraci on relativa de este respecto de otros carotenoides minoritarios. Los organismos utilizados para la fermentaci on pueden ser estirpes aisladas (+) o (-) o una mezcla de las estirpes (+) y (-) de hongos mucorales, m as espec camente B. trispora o bien mutantes de B. trispora superproductores de -caroteno. Varias mezclas de estirpe (+) y (-) del hongo pueden ser utilizadas en el proceso de fermentaci on de esta invenci on.

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El proceso de fermentaci on puede realizarse en cualquier medio de cultivo que contenga una o m as fuentes de carbono, una o m as fuentes de nitr ogeno, sales minerales, tiamina y proporciones variables de harinas de c tricos procedentes de un u nico c trico y una u nica variedad o mezclas de harinas de c tricos de diferentes frutos y/o variedades y lecitina de soja en proporciones variables que van desde un 0.1 % al 10 % y preferiblemente del 0.5 % al 5 % y m as preferiblemente entre el 0.5 % al 1.5 %. Las fuentes de carbono que se pueden utilizar como nutrientes sencillos o complejos incluyen carbohidratos o grasas, como por ejemplo dextrinas, almidones, glucosa, sacarosa, fructosa, aceites animales o vegetales. Dentro de las fuentes de nitr ogeno pueden utilizarse fuentes org anicas e inorg anicas como por ejemplo harina de soja, harina de ma z, destilados solubles, extracto de levadura, harina de algod on, peptonas, case na o sulfato am onico. Entre las sales minerales que pueden adicionarse al medio de cultivo se encuentran fosfatos, sulfatos, cloruros de cationes monovalentes como sodio, potasio o amonio o divalentes como calcio o magnesio. Las proporciones de los nutrientes se determinan en base a las necesidades de crecimiento del microorganismo y a los niveles de producci on. La fermentaci on se lleva a cabo en condiciones aer obicas y en cultivo sumergido. La temperatura de fermentaci on puede oscilar entre 20 C y 32 C aunque se preere entre 25 C y 28 C. El pH del cultivo evoluciona libremente en las primeras horas, en que tiene lugar el crecimiento inicial del hongo en el fermentador, y se controla posteriormente por medio de adici on de a cido y/o a lcali en el rango 6,5 - 7,2, aunque preferiblemente 6,7 - 6,9. El inicio del control de pH depende de la evoluci on del crecimiento, pero en general tiene lugar entre las 12 y las 50 horas de fermentaci on, preferiblemente entre 24 y 36 horas. La incorporaci on de la lecitina en el medio, debido al car acter anp atico de dicha mol ecula, favorece la emulsi on de los aceites en medios de cultivo en que estos se encuentran en elevada concentraci on, como es el caso frecuentemente en los medios de fermentaci on de beta-caroteno. Esta acci on por una parte favorece la utilizaci on del aceite por parte del microorganismo y por otra parte se ha encontrado que activa sorprendentemente la ruta de la carotenog enesis favoreciendo la transformaci on del gamma-caroteno en beta-caroteno, aumentando la producci on de este u ltimo y su concentraci on relativa respecto a otros carotenoides, en especial el gamma-caroteno, con lo que se reduce de forma importante la presencia de este en el producto nal, incrementando su pureza en all-trans-beta-caroteno. Este efecto, adem as, se ve potenciado cuando se efect ua un adecuado control de pH durante la fermentaci on, de forma que el ajuste de pH a partir de las 24-36 horas de fermentaci on favorece la reducci on del gamma-caroteno de forma a un m as acusada, incrementando la concentraci on relativa de la forma beta. La presencia de gamma-caroteno en los caldos de fermentaci on de hongos mucorales en cultivos en fase estacionaria ha sido anteriormente descrita (Murillo FJ, Torres-Mart nez S, Arag on CM y Cerda-Olmedo E (1981) Substrate transfer in carotene bios ntesis in Phycomyces Eur J Biochem 119(3):511-516; Candau R, Bejarano ER, Cerda-Olmedo E (1991) In vivo chanelling of substrates in an enzyme agr egate for beta-carotene bios ntesis Proc Natl Acad Sci USA 88(11):4936-4940; Fraser PD, Ruiz-Hidalgo MJ, L opez-Matas MA, Alvarez MI, Eslava AP y Bramley PM (1996) Carotenoid bios ntesis in wild type and mutant strains of Mucor circinelloides Biochim Biophys Acta 1289(2):203-208). Esta presencia se ha descrito tambi en en Blakeslea trispora (Mehta BJ y Cerda-Olmedo E (1999) Lycopene cyclization in Blakeslea trispora Mycoscience 40(3)307-310). En ambos casos se describen efectos inhibitorios por parte de algunas sustancias como la nicotina, 2-(4-cloro-feniltio)-trietilamina, alfa-picolina e imidazol sobre la producci on de beta-caroteno, favoreciendo sin embargo la acumulaci on de licopeno y gamma-caroteno debido al bloqueo de la licopeno-ciclasa. Sin embargo, no se han descrito anteriormente procedimientos encaminados a reducir el contenido en gamma-caroteno de las fermentaciones de B. trispora incrementando la producci on de beta-caroteno y por tanto la pureza del producto nal obtenido. Este efecto de reducci on del contenido en gamma-caroteno de los caldos de fermentaci on de Blakeslea trispora resultado de la presente invenci on tiene trascendencia en el sentido de que permite cumplir las especicaciones de producto nal que tanto a nivel de Farmacopea como de legislaci on alimentaria establecen la necesidad de un m nimo del 96 % de pureza de beta-caroteno en el producto nal. Dada la caracter stica del componente carotenoide biosintetizado en la fermentaci on, de ser intracelular, el procedimiento de recuperaci on a partir del caldo de cultivo, preparado de acuerdo con los procedimientos al uso, implica la separaci on de la biomasa del caldo, con el prop osito de eliminar o re6

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ducir las p erdidas en el caldo sin biomasa. Esta separaci on puede hacerse por los procedimientos establecidos de A) Filtraci on, empleando las tecnolog as al uso de ltros, bien sean de bandas, rotatorios, prensas, etc., en los que una barrera constituida por la tela ltrante separa la biomasa y permite pasar la fase l quida sin biomasa, o B) Centrifugaci on, en la que haciendo uso de la diferencia de densidades entre el caldo y la biomasa (normalmente mayor) se emplea una m aquina del tipo de un separador centr fugo, decantador o similar, en el que la fase pesada se concentra y se separa de la fase l quida con la menor cantidad posible de biomasa. El reducir p erdidas y optimizar las caracter sticas de cada fase respectiva consiguiendo la mayor cantidad de biomasa con el mayor contenido de residuo seco y eliminar la mayor cantidad de caldo de fermentaci on, con la menor cantidad de materia activa es una de los objetivos de esta invenci on. El micelio h umedo resultante contiene m as del 95 % de los carotenoides producidos en la fermentaci on, preferiblemente m as del 97 % y m as preferiblemente m as del 99 %. El contenido en carotenoides de la fase acuosa es, por tanto, inferior al 5 %, preferiblemente inferior al 3 % y m as preferiblemente inferior al 1 %. Este s olido h umedo del micelio, estar a en disposici on de permitir, mediante las etapas ulteriores, la separaci on de beta-caroteno, pero la comprobaci on de que, relacionado con la Fermentaci on, mantiene un porcentaje relativamente elevado de componentes lipof licos, entre 15 y 20 % ( acidos grasos y aceites) y que en etapas ulteriores plantean problemas de puricaci on, conducen a introducir, en este punto, una etapa de puricaci on de la biomasa. Esta etapa de puricaci on implica una resuspensi on de la biomasa con una cantidad de alcohol: metanol, etanol, propanol, isopropanol, o cualquier otro alcohol en el que la solubilidad del -caroteno sea muy baja, en proporci on adecuada para conseguir la m axima puricaci on de los componentes lip dicos, es decir el micelio h umedo se resuspende con una cantidad de alcohol que oscila entre 1 ml/g y 10 ml/g de micelio h umedo. La temperatura de resuspensi on oscila entre la temperatura ambiente y la de ebullici on del alcohol. El tiempo de contacto oscila entre 5 minutos y 24 horas. La resuspensi on alcoh olica as preparada se ltra o centrifuga, de modo que el contenido en s olidos en el ltrado o claricado sea pr acticamente nulo. El micelio h umedo resultante, que contendr a alcohol m as agua en diversa proporci on, contiene m as del 93 % de los carotenoides producidos en la fermentaci on, preferiblemente m as del 95 % y m as preferiblemente m as del 97 %. En la mezcla resultante de restos de caldo con alcohol el contenido en carotenoides es inferior al 2 %, preferiblemente inferior al 1 %. Mediante este tratamiento con alcohol se consigue eliminar una serie de sustancias lipof licas solubles en alcohol, en cantidad variable en funci on de las caracter sticas del caldo utilizado, efectuando una puricaci on previa extremadamente importante y que nos va a permitir obtener un producto nal cristalino de elevada pureza. Adem as, al eliminar una proporci on variable de agua del micelio h umedo inicial, se facilita considerablemente el proceso de secado. Alternativamente al conjunto de estas dos etapas de separaci on de la Biomasa y de puricaci on por resuspensi on, se plantea el hecho de que mezclando directamente el caldo de cosecha con el alcohol en proporciones de volumen entre 1:0,5 y 1:5 (caldo/alcohol) y a temperaturas entre la temperatura ambiente y la de ebullici on de la mezcla, preferentemente entre temperatura ambiente y 50C, manteniendo el tiempo m nimo de contacto se consigue un efecto de puricaci on equivalente al descrito, con lo que se simplica el proceso al eliminar una operaci on de separaci on s olido/liquido. El hecho de que el producto carotenoide sea intracelular implica que la biomasa puricada requiere un acondicionamiento bien mediante secado m as molienda, secado m as disgregaci on o solo disgregaci on de la biomasa, que favorezca la mezcla con disolventes y facilite la extracci on de estos. El micelio deshidratado/puricado se seca. El secado puede hacerse por los procedimientos habituales en lotes (batch) o en continuo. La temperatura de secado oscila entre la temperatura ambiente y 150 C, as preferiblemente estar por debajo de 50 C. El tiempo preferiblemente no debe sobrepasar los 60C y m de secado es funci on de la temperatura empleada, oscilando entre 1 hora y 72 horas. Debido a la posible descomposici on de estos carotenoides por oxidaci on con el ox geno atmosf erico, es conveniente efectuar esta operaci on de secado en ausencia de ox geno, bien bajo atm osfera de nitr ogeno o al menos a vac o. Para conseguir una buena accesibilidad del disolvente al carotenoide a extractar es necesaria una operaci on de ruptura previa del micelio, de modo que la supercie de contacto sea m axima. El tama no de part cula optimo del micelio seco y roto debe ser inferior a 3 mm, preferiblemente inferior de 1 mm y 7

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m as preferiblemente inferior a 0.5 mm. La molienda puede hacerse sobre el producto seco, mediante los sistemas mec anicos con partes giratorias o jas: mazas, tamices etc., por el paso a trav es de cilindros giratorios presionando uno sobre el otro o mediante el sistema de secado tipo ash (instant aneo) en el equipo jet mill (molino de chorro) donde el producto h umedo se alimenta a una corriente de un gas en recirculaci on y a temperatura elevada, de manera que el tiempo de residencia sea el m nimo para conseguir vaporizar el contenido de componentes l quidos, y se transporta, al variar las densidades el producto, hasta un cicl on donde se recupera. Durante el tiempo de secado y en el trayecto tiene lugar asimismo un efecto de homogeneizaci on al chocar las part culas con las paredes. Para la extracci on del -caroteno a partir de un micelio acondicionado tal y como se ha descrito, se pueden emplear diversos disolvente org anicos. Esta invenci on se referir a al uso de disolventes de grado alimentario considerados como naturales, tales como los esteres de acilo, preferiblemente acetatos de etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, que conjugan la solubilidad razonablemente elevada para los componentes carotenoides con su compatibilidad como disolventes incluidos en el Grupo de Clase 3 de la ICH. Estos disolventes son admisibles tanto a nivel espa nol como comunitario, en los ambitos tanto farmac eutico como alimentario (RDL 12/04/96 y RDL 16/10/96). La temperatura de extracci on oscila entre la temperatura ambiente y la de ebullici on del disolvente, on ser a el m nimo necesario para conseguir la preferiblemente entre 50C y 80 C. El tiempo de extracci solubilizaci on, entre 1 segundo y 1 hora, preferiblemente entre 1 minuto y 15 minutos. La cantidad de disolvente empleada depende de la temperatura y de la riqueza del micelio en carotenoides, oscilando entre 5 ml/g y 20 ml/g. El n umero de extracciones var a desde 1 hasta 3. La cantidad de carotenoides extractados es superior al 85 %, preferiblemente superior al 90 % y m as preferiblemente superior al 95 %. Una vez obtenido el extracto rico en carotenoides es necesario concentrarlo hasta un determinado volumen. La concentraci on nal de carotenoides en el disolvente tras concentrar oscila preferentemente entre 10 y 40 g/l. La temperatura de concentraci on debe ser inferior a 80 C, preferiblemente inferior as preferiblemente inferior a 50 C. El tiempo de concentraci on debe ser inferior a 1 hora, a 70 C y m preferiblemente inferior a 30 min., y m as preferiblemente inferior a 15 min. Una vez concentrado el extracto al volumen requerido se hace necesario adicionar un insolubilizante de los carotenoides, concretamente un alcohol y m as concretamente metanol, etanol, isopropanol, anhidros, o cualquier otro alcohol en el que la solubilidad del -caroteno sea muy baja, en proporciones entre 1/1 y 6/1 respecto al volumen del disolvente tras la concentraci on, con lo cual el rendimiento en -caroteno cristalino aumenta considerablemente. La adici on del alcohol ejerce tambi en un efecto puricante, resuper andose un producto m as puro que cuando no se adiciona. El tiempo de cristalizaci on oscila entre 15 min. y 24 horas, preferiblemente entre 1 h y 12 h y m as preferiblemente entre 3 y 8 horas. La temperatura de cristalizaci on debe ser inferior a 25 C, preferiblemente inferior a 5 C. La separaci on de los cristales de las aguas de cristalizaci on se puede efectuar por ltraci on o centrifugaci on, desplazando las aguas de cristalizaci on que ba nan los cristales lavando con el mismo alcohol empleado para insolubilizar. Los cristales obtenidos se secan a vac o y temperatura ambiente durante al menos 1 h. hasta obtener un contenido de disolventes residuales acorde con las especicaciones de concentraci on m axima establecidas por la legislaci on, y que, en el caso del -caroteno, se establece en una p erdida por secado < 0,2 %.
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La pureza en beta-caroteno de los cristales obtenidos, corresponde a un T tulo - determinado por espectrofotometr a mediante lectura de la Absorci on a 455 nm disuelto en ciclohexano (E1 % 1 cm = 2500) seg un m etodo espectrofotom etrico de la USP, EP, BP, superior a 90 %, preferentemente superior al 95 % y m as preferentemente superior al 98 % con un contenido en otros carotenoides inferior al 4 %, preferiblemente inferior a 2 %. Asimismo el producto cristalino obtenido puede manejarse y comercializarse como tal o formando parte de formulaciones en las que la proporci on de -caroteno var e entre el 1 y el 85 %, mezclado con diversos excipientes o compuestos, como es el caso de aceites de soja, ma z, oliva, etc. con diversos grados de pureza y acompa nado de antioxidantes tipo tocoferol. Un objeto de la presente invenci on es proporcionar una formulaci on de carotenoides dispersable en agua, que contiene aproximadamente 1 a 25 partes en peso de polvo seco de carotenoide encapsulado en una matriz de almid on de calidad alimentaria 8

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que proporciona -caroteno incluido en el polvo encapsulado en una condici on estable. Los productos de la presente invenci on son formulaciones s olidas de -caroteno, dispersables en agua.
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Los almidones utilizados son un almid on modicado de ma z de calidad alimentaria de elevado peso molecular, que permite un sencillo emulsionamiento de la fase org anica en agua. Despu es de separar el disolvente, la dispersi on satisface la gama de colores del -caroteno. Este almid on alimentario modicado no produce suciente redispersabilidad del polvo seco. Por ello, se a nade tambi en otro almid on. La segunda variedad es una mezcla de almidones de calidad alimentaria de diferentes pesos moleculares en un rango de 1.000-700.000; este segundo tipo de almid on proporciona una buena dispersabilidad del producto nal. Como el -caroteno es sensible a la oxidaci on, se pueden disolver antioxidantes en el disolvente que contiene el -caroteno para intensicar la estabilidad contra el deterioro. En la presente invenci on se puede utilizar cualquier antioxidante autorizado en alimentos, incluido entre otros el -tocoferol de origen natural o sint etico. El nivel de antioxidante ser a el suciente para proteger al -caroteno. Este tendr a que ser 0,1 a 0,3 veces la cantidad de -caroteno. Tambi en se puede a nadir palmitato de ascorbilo a la formulaci on debido al efecto antioxidativo sin ergico de la asociaci on de ambos antioxidantes. El m etodo de esta invenci on es especialmente aplicable para la recuperaci on de -caroteno cristalino de una fuente microbiana, preferiblemente algas, hongos o levaduras, m as preferiblemente de hongos del orden de los Mucorales, y m as preferiblemente B. trispora. La extrema pureza conseguida en los cristales obtenidos por la presente metodolog a y el empleo de disolventes considerados como naturales hace que estos cristales sean aplicables en la industria alimentaria, farmac eutica o de cosm eticos. Ejemplo 1

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La adici on de lecitina de soja al medio de cultivo disminuye el contenido en gamma-caroteno cuando se fermenta en matraz. Se prepara un medio de in oculo que contiene por litro: harina de soja, 23 g; harina de ma z, 47 g; fosfato monopot asico 0,5 g; clorhidrato de tiamina, 0,002 g. Su pH inicial es de 6,3. El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de 500 ml a raz on de 67 o 100 ml. Despu es de esterilizar, se siembran a partir de suspensiones de esporas las estirpes B. trispora estirpe(+) y B. trispora estirpe(-) en matraces separados y se incuban a 25 C durante 48 horas. Se prepara un medio base de fermentaci on que contiene por litro: harina de soja, 44 g; harina de ma z, 19 g; harina de naranja, 10 g; fosfato monopot asico dib asico 0,5 g; isoniazida, 0,28 g; clorhidrato de tiamina, 0,002 g; aceite vegetal 100 g. El medio de cultivo que contiene lecitina de soja se prepara seg un la descripci on anterior y se suplementa con un 1 % de lecitina. El pH se ajusta a 6,3. El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de 250 ml a raz on de 20 ml. Para la fermentaci on de -caroteno se inoculan matraces que contienen medio de fermentaci on con un 10 % de un cultivo mixto de las estirpes de B. trispora (+) y B. trispora (-). Todos los matraces se on se adiciona -ionona incuban a 25C en un agitador orbital a 250 rpm. A las 48 horas de fermentaci en los matraces que corresponde, a raz on de 1 ml por litro de medio de cultivo y se recoge el micelio al 60 d a de fermentaci on. La extracci on de -caroteno se realiza mediante cualquier m etodo descrito de rotura celular que permita liberar el contenido intracelular, se solubiliza en cualquier solvente en el que resulte soluble como por ejemplo acetona. Su concentraci on se puede determinar mediante medida espectrofotom etrica, pero se preere el uso de cromatograf a liquida (HPLC), mediante de cualquiera de los m etodos descritos en la bibliograf a. La adici on de lecitina de soja incrementa la producci on de -caroteno en un 5 % y disminuye la producci on de -caroteno en un 60 %. (ver Figura 1). Este experimento demuestra que la lecitina permite incrementar la producci on de -caroteno y adem as obtener un producto m as puro.

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Ejemplo 2 La incorporaci on de lecitina al medio de cultivo incrementa la producci on de beta-caroteno y reduce el nivel relativo de gamma-caroteno en fermentador piloto. Cuando se combina con el control de pH, el efecto sobre la producci on de gamma-caroteno es a un mayor. Se prepara un medio de in oculo que contiene por litro: harina de soja, 23 g; harina de ma z, 47 g; fosfato monopot asico 0,5 g; clorhidrato de tiamina, 0,002 g. Su pH inicial es de 6,3. El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de 2000 mL a raz on de 500 mL. Despu es de esterilizar, se siembran a partir de suspensiones de esporas B. trispora estirpe(+) y B. trispora estirpe(-) en matraces separados y se incuban on orbital a 250 rpm y 5 cm. de excentricidad. a 25 C durante 48 horas, con agitaci Se transere est erilmente cada una de las cepas a un tanque intermedio de crecimiento con un medio de cultivo cuya composici on por litro es: Pharmamedia, 29 g; harina de ma z, 47 g; fosfato monopot asico 0,5 g; clorhidrato de tiamina, 0,002 g; antiespuma, 1 g. Su pH inicial es de 6,0. Despu es de incubar 36-48 h, se realiza la mezcla de las cepas (+) y (-) y se siembra con un 10 % de la mezcla el medio base de fermentaci on, cuya composici on por litro es la siguiente: harina de soja, 50 g; harina de ma z, 25 g; harina de naranja, 15 g; fosfato monopot asico dib asico 0,5 g; isoniazida, 0,28 g; clorhidrato de tiamina, 0,002 g; aceite vegetal 80 g; antiespuma, 0,175 g. Este medio de cultivo se suplementa con un 1 % de lecitina de soja. on variable entre 150 y 250 rpm y La fermentaci on se verica a una temperatura de 25-28C con agitaci una aireaci on de 1-1,5 v/v/m. El control de pH se realiza con amon aco o acido sulf urico, manteni endose dos condiciones diferentes dependiendo del ensayo: sin control de pH con un rango entre 6,5 y 7,5, o con control a 6,8 0,1 desde las 36 horas de fermentaci on. Entre las 40 y 50 horas de fermentaci on se adicionan 10 g/L de una soluci on de -ionona al 10 % en aceite vegetal. Entre las 50 y 60 horas se adicionan 10 g/L de una soluci on de etoxiquina al 2,5 % en aceite vegetal. La fermentaci on se prolonga durante 100-140 horas, al cabo de las cuales se valora la producci on de -caroteno: la extracci on de -caroteno se realiza mediante cualquier m etodo descrito de rotura celular que permita liberar el contenido intracelular, se solubiliza en cualquier solvente en el que resulte soluble como por ejemplo acetona. Su concentraci on se puede determinar mediante medida espectrofotom etrica, pero se preere el uso de cromatograf a l quida (HPLC), mediante cualquiera de los m etodos descritos en la bibliograf a. Los resultados de las pruebas realizadas con medio de cultivo con y sin lecitina y las dos condiciones de control de pH anteriormente citadas se recogen en la tabla siguiente:
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Medio de cultivo

pH

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Sin lecitina Sin lecitina

Rango 6.5 - 7.5 Control 6.8 desde 36h Rango 6.5 - 7.5 Control 6.8 desde 36h

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4.4 2.1

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Estos datos indican de forma clara que la incorporaci on de lecitina al medio de cultivo incrementa la producci on de beta-caroteno (5 % de incremento) y reduce el nivel relativo de gamma-caroteno (en un 43 %). Cuando se combina con el control de pH, el efecto sobre la producci on de gamma-caroteno es a un mayor (63 %).

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Ejemplo 3 Se cosechan 3 l de caldo fermentaci on. El t tulo del caldo es de 6 g de -caroteno por litro. La biomasa de este caldo se recupera mediante ltraci on por Buchner, obteniendo 1000 g de biomasa h umeda. La biomasa h umeda se resuspende en 3 l de isopropanol aze otropo 85/15 y se agita durante 30 minutos. La biomasa puricada se vuelve a recuperar mediante Buchner. Esta biomasa se seca en estufa bajo vac o a temperatura inferior a 45C y en un tiempo de 18 horas, hasta que el contenido en disolventes residuales es del orden 1-2 %. Se obtienen 270 g de biomasa seca y puricada con un contenido de -caroteno equivalente a una riqueza del 6,5 %. La biomasa seca se muele en molino de martillos y tamiz de 1 mm obteni endose un s olido con la misma riqueza espec ca y acondicionado para permitir la extracci on con el disolvente.
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La extracci on se efect ua mezclando los 270 g de biomasa molida con 4500 ml de acetato de isobutilo endose en agitaci on durante 5 minutos. Se separa la biomasa agotada del disolvente a 70 C, manteni rico ltrando por placa ltrante. La biomasa agotada se lava con 500 ml de acetato de isobutilo caliente sobre el propio ltro, mezclando los dos disolventes. El total de acetato de isobutilo rico se concentra bajo vac o y manteni endose la temperatura por debajo de 45 C hasta reducir el volumen a 700 ml, con lo que ha cristalizado en parte el -caroteno. Para completar la cristalizaci on y obtener un -caroteno m as puro, se a naden 2100 ml de isopropanol. La mezcla se mantiene en agitaci on entre 0-5C y bajo nitr ogeno durante 3 horas. Se ltra por Buchner, lavando los cristales con 25 ml de isopropanol sobre el Buchner. Se recogen los cristales y se secan, obteni endose 14 g de cristales de -caroteno con una pureza del 96 % medida en espectrofot ometro. Ejemplo 4 Se cosecha una cantidad de caldo de fermentaci on del orden de 500 l, con un titulo en -caroteno de 5,5 g/l. Se mezcla directamente con 1500 l de isopropanol aze otropo con agua 85-15 y se calienta es de mantener en agitaci on durante 30 min. se procede a separar la biomasa la mezcla a 40C. Despu del l quido por centrifugaci on con un decantador. Se recogen del orden de 180 Kg. de biomasa h umeda puricada. Esta biomasa se seca en secadero rotativo bajo vac o hasta conseguir un contenido en disolventes residuales del orden de 1-2 %. La temperatura ha de ser inferior a 45 C y el tiempo del orden de 12-24 h. Se obtienen 45 Kg. de biomasa seca con un contenido -caroteno equivalente a una riqueza espec ca del 5,9 %, pureza ligeramente inferior. La biomasa seca se muele en molino con martillos y tamiz de 1 mm obteni endose un s olido con la misma riqueza espec ca y acondicionado para permitir la extracci on con el disolvente. Como alternativa la biomasa h umeda se seca en un turbo secador ash (tipo jet mill) en cuyo caso no es necesaria la molienda.

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La extracci on se efect ua mezclando los 45 Kg. de s olido molido con 800 l de Acetato de Isobutilo a on durante 15 min. Se separa la biomasa agotada del disolvente rico por 70C y se mantiene en agitaci centrifugaci on con decantador. El total de Acetato de Isobutilo se concentra bajo vac o y manteniendo la temperatura por debajo de 45 C hasta reducir el volumen a 110 l, con lo que se ha cristalizado en parte el -caroteno. Para completar la cristalizaci on del -caroteno se a naden 330 l de isopropanol. Se mantiene la mezcla en agitaci on mientras se enfr a, durante 3 h a 0 -5C. Se ltra por un Buchner recogiendo los cristales de beta-caroteno que se secan. Se obtienen 2,1 Kg de producto con una pureza de 96 % por espectrometr a. Descripci on de la gura 1

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A: Porcentaje de producci on de -caroteno con lecitina (columna de la derecha) o sin ella (izquierda). B: Porcentaje de producci on de -caroteno con lecitina (columna de la derecha) o sin ella (izquierda).
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REIVINDICACIONES 1. Procedimiento de producci on de carotenoides que comprende las etapas de:
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(1) Fermentaci on de una biomasa a base de hongos mucorales en cultivo sumergido (2) Separaci on de la biomasa (3) Secado de la biomasa y disgregaci on de la misma

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(4) Extracci on s olido/l quido de los carotenoides contenidos en la biomasa, con disolventes org anicos (5) Concentraci on de un extracto rico en carotenoides (6) Precipitaci on-cristalizaci on de los carotenoides mediante adici on de alcohol

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(7) Filtraci on y secado nal, caracterizado por a nadir al medio de cultivo en la etapa (1), lecitina, puricar la biomasa de producci on de carotenoides, eliminando de la misma sustancias lipof licas, y utilizar en la etapa de extracci on (4), disolventes de baja toxicidad incluidos en la clase III de la ICH. 2. Procedimiento seg un la reivindicaci on 1, caracterizado porque el cultivo sumergido se lleva a cabo en condiciones aerobias, el hongo mucoral es del g enero Blakeslea, particularmente B. trispora y el carotenoide obtenido es el -caroteno.

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3. Procedimiento seg un las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque se a nade lecitina de soja en un porcentaje del 0.1-10 %, preferentemente del 0.5-5 % y m as preferiblemente del 0.5-1.5 %. 4. Procedimiento seg un la reivindicaci on 2, caracterizado porque se cultivan estirpes (+) y/o (-), o bien mutantes seleccionados de B. trispora, superproductores de -caroteno. 5. Procedimiento seg un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que la temperatura durante la fermentaci on oscila entre 20-32.

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6. Procedimiento seg un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el paso de puricaci on de la biomasa para eliminar sustancias lipof licas consiste en la suspensi on de la misma en un alcohol en que la solubilidad de los carotenoides es baja. 7. Procedimiento seg un la reivindicaci on 1, caracterizado porque la puricaci on de la biomasa se lleva a cabo en el propio medio de cultivo o, alternativamente, una vez separada de dicho medio. 8. Procedimiento seg un cualquiera de las reivindicaciones 1, 6 y 7, caracterizado la cantidad de alcohol a a nadir se encuentra entre 1 ml/g y 10 ml/g, la temperatura durante la suspensi on oscila entre la temperatura ambiente y la de ebullici on del alcohol a nadido, siendo el tiempo de contacto de 5 a 24 h.

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9. Procedimiento seg un la reivindicaci on 7, caracterizado porque cuando la puricaci on de la biomasa se produce directamente sobre el caldo de cultivo las proporciones caldo:alcohol, oscilan entre 1:0,5 - 1:5. 10. Procedimiento seg un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de secado-disgregaci on (3) de la biomasa se puede llevar a cabo en lotes o en continuo, en ausencia de ox geno, a una temperatura que oscila entre la ambiente y 150C y durante un tiempo que va de 1 h a 72 h. 11. Procedimiento seg un la reivindicaci on 10, caracterizado porque la disgregaci on de la biomasa se produce por medios convencionales hasta alcanzar un tama no de part cula inferior a 3 mm. 12. Procedimiento seg un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el alcohol empleado en la puricaci on de la biomasa se selecciona entre metanol, etanol, propanol o isopropanol, o mezclas de los mismos. 13. Procedimiento seg un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de extracci on (4) se repite entre 1 y 3 veces y consiste en el lavado de la biomasa seca y disgregada con 12

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disolventes org anicos de baja toxicidad, a una temperatura comprendida entre la ambiente y la de ebullici on del disolvente, durante un tiempo que oscila entre 1 s y 1 h, en una cantidad que oscila entre los 5 ml/g y 20 ml/g, obteni endose un extracto rico en carotenoides con un contenido de los mismos superior al 85 %, preferentemente del 90 % y m as preferentemente superior al 95 %.
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14. Procedimiento seg un la reivindicaci on 13, caracterizado porque el disolvente empleado en la etapa de extracci on (4) consiste en un ester de acilo, preferentemente un acetato de etilo, propilo, isopropilo, butilo o isobutilo, o mezclas de los mismos.
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15. Procedimiento seg un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el extracto rico en carotenoides se somete a una etapa de concentraci on (5) por medios convencionales, a una on de temperatura inferior a los 80C, durante un tiempo inferior a 1 h, hasta alcanzar una concentraci carotenoides del orden de entre 10 y 40 g/l. 16. Procedimiento seg un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el extracto enriquecido en carotenoides se somete a una etapa (6) de precipitaci on-cristalizaci on mediante la adici on de un alcohol, en proporci on 1/1 a 1/6 respecto al volumen del disolvente empleado en la etapa (4) de extracci on, a una temperatura de cristalizaci on inferior a los 25C y durante un tiempo de cristalizaci on que oscila entre 15 min y 24 h.

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 OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

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kES 2 168 971 kN. solicitud: 200001792 kFecha de presentaci on de la solicitud: 19.07.2000 kFecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl.7 :

C12P 23/00, A23L 1/275

DOCUMENTOS RELEVANTES Categor a Documentos citados Reivindicaciones afectadas 1-7,12,14, 17,20,21 1-7,12,14, 17,20,21

US 3268606 A (JAEGER, H.K.) 23.01.1966, todo el documento.

US 2959521 A (ZAJIC, J.E.) 08.11.1960, reivindicaciones 1,2,5,8,9,10; tabla 1; columna 1, l neas 15-40; columna 2, l nea 48 - columna 3, l nea 34. US 5714658 A (HEIDLAS et al.) 03.02.1998, columna 1, l neas 26-28; columna 2, l neas 54-64; columna 3, l neas 4-10; tabla. WO 9803480 A1 (GIST-BROCADES) 29.01.1998, todo el documento.

1-7,12,14, 17,20,21

1,2,6-10, 13-15,20 1,2,6-9, 12,14,20 1-5,17-22

WO 9850574 A1 (GIST-BROCADES) 12.11.1998, todo el documento.

US 5422247 A1 (FINKELSTEIN et al.) 06.06.1995, todo el documento.

Categor a de los documentos citados

X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categor a ecnica A: reeja el estado de la t on no escrita O: referido a divulgaci on P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci de la solicitud es de la fecha E: documento anterior, pero publicado despu de presentaci on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones Fecha de realizaci on del informe 14.05.2002

para las reivindicaciones n : Examinador A. Polo D ez

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