UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA DEPARTAMENTO BIOQUIMICA, BIOLOGIA MOLECULAR Y FARMACOLOGIA SECCION DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA

MOLECULAR PRACTICAS DE LABORATORIO EN BIOQUIMICA 2010

ELECTROFORESIS DE PROTENAS
Prof. Roco Inga Pea Intro !""#$n La electroforesis de protenas se basa en la migracin de protenas a travs de un campo elctrico. Esta tcnica es til como un mtodo analtico, a !ue las protenas pueden ser separadas visuali"adas, sean anali"adas en su conformacin nativa como denaturada. La electroforesis permite determinar el peso molecular de una protena o si est# formada por varias subunidades. Estas caractersticas pueden determinarse dependiendo del tipo de electroforesis !ue se realice. La electroforesis de protenas es llevada a cabo generalmente en un gel de poliacrilamida el cual acta como un tami" molecular. E%&"tro'or&(#( &n )&%&( & *o%#+"r#%+,# + &n "on #"#on&( &(n+t!r+%#-+nt&(

El gel $%$&P'(E est# compuesto principalmente por los reactivos 'crilamida bis& acrilamida $%$. Las acrilamidas son agentes !ue forman polmeros en forma de una red, de)ando poros a travs de los cuales pasar#n las protenas. El tamao del poro depende de la concentracin de estas acrilamidas. Para manipularlo se debe utili"ar mascarilla guantes a !ue es neurot*ica al contacto por va respiratoria. El $%$ es un detergente !ue posee carga negativa e interacta fuertemente con las protenas, favoreciendo su desnaturali"acin. La protena desnaturali"ada en presencia de $%$ es as recubierta por una carga negativa uniforme +,.- g de $%$ por g de protena, una molcula de $%$ para dos amino#cidos apro*imadamente.. %e esta manera las propiedades elctricas de cual!uier protena se /acen uniformes la migracin de la protena en el campo elctrico no depende de su secuencia particular de amino#cidos si no de su tamao. Eliminadas otras variables, el factor de migracin +Rf. de la protena ser# funcin nicamente de su peso molecular +P0.. 'l graficar el logaritmo del peso molecular versus la distancia recorrida se observar# una recta. La preparacin de los geles de poliacrilamida para $%$&P'(E se reali"a con el e!uipo 0ini Protean II de Bio-Rad. %ependiendo del tamao de las muestras !ue !ueramos separar se utili"ara un gel separador con diferente concertacin de acrilamida.

Rango efectivo de separacin de protenas en geles de poliacrilamida R+n)o & t+,+.o( 3 +"r#%+,# +4/#(+"r#%+,# + &n (&*+r+/%&( 01D+2 &% )&% (&*+r+ or 12&3435&346.,5&34,4 ,5&227 ,3.,5&5-7 ,7 las protenas m#s grandes no se mueven significativamente en el gel

Co,*on&nt&( *+r+ %+ *r&*+r+"#$n R&+"t#5o G&% "on"&ntr+ or 0632 0,%2 'gua 'crilamida89isacrilamida +1484.: p;v. =ris&>?l ,.- 0 p> :.: =ris&>?l ,.4 0 p> 2.: $%$ ,4@ =E0E% 'P$ +,4@. O/8&t#5o( 1.5 4.:1 && 4.21 4.44.44.44-

&

o( )&%&( SDS4PAGE G&% (&*+r+ or G&% (&*+r+ or 0127632 01632 0,%2 0,%2 1.,32 3.15 5.,6 3.&& 4., 4.3 4.442 5.<3.&& 4., 4.3 4.442

,. ?onocer los principios de la tcnica de electroforesis $%$&P'(E. 3. Abservar el perfil de protenas de las diferentes fracciones obtenidas durante la purificacin de la Pira"inamidasa por cromatografa de intercambio inico reali"ada en la pr#ctica anterior. M+t&r#+%&( 9 R&+"t#5o( Pr&*+r+"#$n &% G&% - 9uffers8 =ris&>?l ,.-0 p> :.: +gel separador. ;=ris&>?l 4.-0 p> 2.: +gel apilamiento. - 9uffer de ?orrida electrofortica +=ri"ma base 4.43-0, $%$ 4.,@, (licina 4.30. - %odecil sulfato de sodio +$%$. al ,4@ - Persulfato de amonio +'P$. ,4@ - B,B,BC,BC& tetramet/ l etilen diamina +=E0E%. - $olucin de 'crilamida8bisacrilamida +1484.:. S#&,/r+ & ,!&(tr+ - 9uffer de muestra -D +5.: ml >3AE 4.- 0 =ris&>?l p> 2.:, ,.3 mlE (licerol , mlE $%$ al ,4@, 3mlE '"ul de bromofenol al 4.,@, 4.-ml., 90E + 9eta&0ercaptoet/anol. T#n"#$n &% G&% 9 D&"o%or+"#$n

4 '"ul de ?oomassie 4.3-@ 8 4.3-gr de ?oomasie 9lue R3-4 en <4ml metanol8 >34 +,8, v;v. ,4ml de #cetido actico glacial. Filtrar la solucin con papel G/atman ,. 4 %ecolorante8 144ml 'gua destilada, ,-4ml de metanol 14@ -4ml 'cido actico ,4@.

E:!#*o( 9 ,+t&r#+% '!n)#/%& ?#mara electrofortica Fuente de poder 0icropipetas =ips, tubos eppendrof (uantes, mandil, regla, calculadora, papel milimetrado

0arcadores de Peso 0olecular8

9road Range 0arHer M+r"+ or & P&(o Mo%&"!%+r + !t#%#-+r &n %+ *r;"t#"+<

Presenta 6 bandas: Albumina - 66 KDa Ovoalbumina - 45 KDa Gliceraldehido-3-fosfato - 36 KDa Papa na - 3! KDa Anhidrasa "arb#nica $ !% KDa Pepsin#&eno - !4 KDa

'e utili(ar) una muestra de prote na *as! $ !4 KDa como muestra conocida+
Pr&*+r+"#$n &% )&% SDS4PAGE por lo tanto

El gel est# compuesto por dos fases +ver figura ad)unta.8 ,. (el de apilamiento, el cual presenta menor concentracin de acrilamida poros de ma or tamao. 3. (el de separacin, de ma or concentracin poros de menor tamao.

Para la polimeri"acin +gelificacin. del gel, se me"clan las acrilamidas, el buffer =ris, el persulfato de 'monio el =E0E%, en cantidades adecuadas. El persulfato de amonio +'P$. dona los radicales necesarios para la polimeri"acion de la acrilamida&bis&acrilamida, reaccin !ue es acelerada por el =E0E%. Esta reaccin se in/ibe a p> #cido. NOTA< El 'P$ el =E0E% deben ser agregados )usto antes de me"clar vertir la solucin a la c#mara. %e otro modo, se gelificar# la solucin no podr# formarse el gel de forma adecuada.

Tr+t+,#&nto & %+ ,!&(tr+(< ,. =omar 3- uL de la muestra me"clar con ,- uL del 9uffer de carga +Loading buffer.. S& *!& &n !t#%#-+r otro( /!''&r( & #'&r&nt& "on"&ntr+"#$n7 3. >ervir la muestra por - minutos luego sembrar 34&3- uL en el gel de poliacrilamida. 1. Luego de ,&3 /oras apro*imadamente detener la electroforesis colorear con '"ul de ?oomassie.

NOTA: Cuando las protenas en una muestra estn muy diludas puede realizarse una precipitacin previa: 4. Tomar 500 uL de la fraccin de purificacin y colocar en un tubo de microcentrfu a 5. ! re ar 500 uL de "tanol absoluto #. $e%ar en &ielo por '0 minutos (. Centrifu ar a ')000 rpm por 5 minutos. *. Lavar el precipitado con buffer fosfato

+. ,esuspender el precipitado en )0 ul de buffer fosfato

T#n"#$n &% G&% 9 D&"o%or+"#$n7 ,. ?olocar el gel en un depsito cubrir ste con al menos - veces su volumen de la solucin de coloracin, incubar a temperatura ambiente al menos 5 /oras con agitacin suave constante. 3. =ranscurrido el tiempo remover el colorante conservarlo para su uso futuro. 1. %ecolorar el gel con solucin decolorante por 5 I : /oras. CUESTIONARIO ,. 3. 1. 5. J ?u#l es la funcin del gel de apilamientoK J?u#l es la funcin del L&mercaptoetanolK J?u#l es el propsito de /ervir la muestra antes de la corrida en los geles $%$&P'(EK Msted anali"a una me"cla de protenas8 la protena ' es /eterodimrica con subunidades de ,- H%a 6- H%a, la otra protena 9 es /omotrimrica con subunidades idnticas de 3- H%a. >aga un gr#fico de los perfiles de corrida !ue espera encontrar si /ace una corrida en gel $%$&P'(E una corrida en gel P'(E no denaturante. -. Msted /a recibido un tubo eppendorf !ue contiene una me"cla de 1 protenas ', 9 ? !ue debe anali"ar. $egn los datos !ue se presentan en el cuadro de aba)o, grafi!ue el patrn de bandas +indicando la identidad de la banda. !ue usted esperara encontrar al correr esta me"cla en8 a. un gel $%$&P'(E b. un gel bidimensional. 0uestra ' 9 ? ?aracteristica >omotrmero 0onmero >eterodmero =amao +N%a. <4 +tamao total. -4 14 5pI 2,2.5,-

6.1

2. 'nalice los geles !ue se /an obtenido en la pr#ctica. Ou diferencias observa entre los perfiles de protenas obtenidos en el e*tracto crudo en las fracciones obtenidas durante la purificacinK ?mo /a resultado la purificacin de la Pira"inamidasaK %iscuta los resultados. 6. (rafi!ue en papel milimetrado el peso molecular +0G. de las protenas del Est#ndar vs el factor de migracin +Rf.. Mtili"ando su gr#fico, determine el peso molecular de la en"ima Pira"inamidasa.