________________________________ _________________________________ Ing. Mara Emilia Ruz Snchez Miembro Asesor DEDICATORIA
Con todo cario, respeto y amor a mi familia.
A mi madre EDMITH ISABEL GOMEZ SANTILLAN por el impulso que me brinda en todo momento para salir adelante en mi futuro profesional.
A LEYLITH, ROSLIA Y HEGEL, mis hermanos, compaeros y grandes amigos desde mi niez.
A mis queridos ABUELOS, TIOS y PRIMOS, Que siempre me brindan su apoyo moral en todo momento.
DEDICATORIA ESPECIAL
Este esfuerzo constituye para m la voluntad de superacin, de humildad y ejemplo digno
Por eso se lo dedico a mis queridas tas MARIA LUISA MADUELL Y MARICARMEN FIGUEROA Y TODOS LOS MIEMBROS DE LOS MISIONEROS DE JESUS por sus enseanzas que me brindan en todo momento y las ganas de superacin que me inculca siempre a seguir para ser una persona de bien y dirigirme por el camino de la responsabilidad y del trabajo.
DEDICATORIA ESPECIAL
Un agradecimiento al DOCTOR CARLOS NOLTE CAMPOS Y AL INGENIERO AGUSTIN CERNA MENDOZA por brindarme sus enseanzas sobre la vida profesional que ahora comienzo y las oportunidades que no debo desaprovechar durante mi vida como profesional.
AGRADECIMIENTO
A la Ing. Mara Emilia Ruz Snchez, por su apoyo incondicional como asesora de la presente tesis.
Mi agradecimiento especial al Bilogo Marco Len Martnez, por las enseanzas que me brind durante la realizacin de mi tesis.
Al Ing. Henri Delgado Haya, por las enseanzas y el tiempo que ocup en impartirme parte de su conocimiento en la realizacin de mi trabajo de tesis.
A mis compaeros tesistas del laboratorio, Juan Carlos Guerrero Abad y Henry Manuel Vera Tudela Ramrez, por todo el apoyo brindado en todo momento durante la tesis en el Laboratorio de Cultivos de Tejidos vegetales.
Al subproyecto desarrollo de tecnologas de bajo costo para la propagacin in Vitro y el cultivo de orqudeas en la Regin San Martn, por haber financiado todo el trabajo de investigacin de la presente tesis.
A todos mis MAESTROS, a quienes considero como pilares para mi formacin en mi vida profesional.
NDICE
Contenido Pg.
I. INTRODUCCIN 01
II. OBJETIVOS 2.1 Objetivo General . 02 2.2 Objetivos Especficos . 02
III. REVISIN DE LITERATURA 3.1. Aspectos Histricos del Cultivo de orqudeas . 03 3.2. Propagacin in Vitro de orqudeas 3.2.1. Propagacin por semillas. . 06 3.2.2. I. INTRODUCCIN
La gran mayora de especies de orqudeas que se comercializan en nuestro pas, son producto de recolecciones ilegales e indiscriminadas de nuestros bosques tropicales. Consecuentemente la tala del bosque, junto a la recoleccin no controlada con fines comerciales, viene produciendo una rpida disminucin de las poblaciones naturales de orqudeas, algunas de las cuales se encuentran en peligro de desaparecer. Es el caso de Cattleya rex Obrien en el departamento de San Martn. Cientos de plantas de esta especie recolectadas anualmente son enviadas a Lima, para ser exportadas, o donde generalmente mueren. LEON (1995).
Nuestras especies nativas de orqudeas, amenazadas o en peligro de desaparecer, pueden protegerse utilizando las tcnicas de propagacin masiva in vitro, siempre y cuando se asegure su reproduccin en cantidades adecuadas (OSPINA, 1 968).
Las orqudeas producidas in vitro podran distribuirse en grandes cantidades a viveros comerciales, disminuyendo la dependencia de orqudeas tomadas de su hbitat original. La composicin del medio nutritivo para esta tcnica es compleja y con costos relativamente altos, puesto que las especies a introducir tienen diferentes requerimientos nutricionales y se necesita adecuar un medio que le brinde todos los nutrientes necesarios para el normal desarrollo de las plntulas.
El presente trabajo de investigacin busca identificar un medio de cultivo alternativo y adecuado; formulado con insumos disponibles y de bajo costo, para la micropropagacin de orqudeas. II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Determinar medios de cultivo alternativos para la germinacin y crecimiento de orqudeas, a bajo costo y eficientes al uso de insumos locales.
2.2. Objetivos especficos
2.2.1 Determinar el efecto de los diferentes medios de cultivo puestos en estudio, en la propagacin in vitro de Cattleya rex, Oncidium lanceanum y Mormodes sp.
2.2.2 Determinar la relacin costo beneficio de los medios de cultivo empleados en el trabajo de investigacin.
III. REVISIN DE LITERATURA
3.1. Aspectos histricos del cultivo de orqudeas. Los primeros intentos de germinacin de semillas de orqudeas fueron realizadas en Europa por Moore (1 849) al sembrarlas en compost o sustratos que haban sido utilizados para cultivar plantas adultas, practica que fue adoptada por los cultivadores comerciales de su poca, ARDITTI (1984).
Posteriormente Noel Bernard (***) realizo una serie de experimentos que le permitieron explicar el rol del hongo micorrzico en la germinacin de semillas de orqudeas (Bernard 1990), demostrando la importancia de esta asociacin simbitica y germinando exitosamente distintas especies e hbridos de orqudeas terrestres y epfitas. Otros investigadores continuaron su trabajo, ARDITTI (1990).
- WENT y THIMANN (1 937), descubren la auxina (cido indol Actico). Hormona reguladora de crecimiento que estimula el desarrollo de races, ARDITTI (1990).
- CAPLIN Y STEWARD (1 948), determinan que la leche de coco tiene un efecto en la formacin de clulas aisladas de races de zanahoria, ARDITTI (1990).
- SKOOG y MILLER (1 957), combinan auxinas y citoquininas, controlando la formacin de brotes y races, ARDITTI (1990). - MURASHIGE y SKOOG (1 962), logran desarrollar el medio nutritivo que actualmente es el ms utilizado para muchas de las especies de orqudeas, ARDITTI (1990).
- La semilla de la orqudea consta de una testa gruesa, que encierra un embrin. La cual tiene aspecto caracterstico en forma de red y diferente para cada especie. La testa est formada por un tejido muerto, compuesto en un 96% de aire, de tal forma que cada semilla puede ser considerada como un autntico globo, PIERIK (1989).
- SING, demostr que el 2, 3, 5 trifenil tretazolium es til para determinar la viabilidad de las semillas, donde los embriones viables se tien de rojo, mientras que los no viables quedan blancos, LEON (1995).
- Los protocormos deben ser transferidos antes que induzcan hiperhidricidad o felonizar y luego mueran, DELGADO (2001).
- A pesar del descubrimiento del medio de cultivo KNUDSON, se comprob que no siempre es posible hacer un medio en el que una determinada especie de orqudea pueda germinar y desarrollarse; se han descrito muchos medios nutritivos para muchos gneros y especies diferentes, ARDITTI (1982).
- Arditti (1984); Pierik, et al, (1 988), Las orqudeas germinan asimbiticamente despus de la inhibicin formando un pequeo cuerpo esfrico denominado protocormo, a partir de cuya base surgen rizoides y a continuacin primordios de races y hojas, todo lo cual permite distinguir etapas bien definidas que se usan en el clculo de ndices de crecimiento, ESPINOZA (2001).
- Algunas especies de orqudeas pueden germinar de 4 a 8 semanas despus de su siembra, y la multiplicacin se efecta dentro de las 12 a 16 semanas, empleando el medio de micropropagacin que sirve para multiplicar todas las especies con xito, DONAYRE (2000).
- Un medio de cultivo con sales M&S, suplementadas con vitaminas, azcar, ANA y BAP, permite una rpida germinacin de las semillas y un crecimiento de las plntulas, dado que se desarrollan bien las hojas y forman races, SELENA (1999).
- El medio de cultivo utilizado en la fase de multiplicacin para el cultivo de plantas ornamentales fue el M&S (1962) aumentado la concentracin de BA a 2 mg/l y ANA 0.3 mg/l, ACEVES (2000).
- Para la fase de enraizamiento en el cultivo de plantas ornamentales, se utiliza las mismas sales M&S en el medio de cultivo, omitindose la citoquinina (BA). Complementado con 1.5 g/l de carbn activado, 20 g/l de sacarosa y agregando auxina (ANA), las condiciones de incubacin fueron las mismas que para las etapas anteriores, ACEVES (2000).
- Mauro M. & Arditti (1994), probaron la influencia de diferentes dosis de benzilaminopurina (BA) y cido naftaleneacetico (ANA), en el medio de cultivo Murashige y Skoog (M&S) en Cattleya sp. ellos sugirieron que para la multiplicacin se utilizar el medio suplementado con la combinacin de 10mg/l de BA y 0.1 mg/l de ANA, y para el desarrollo de plntulas con el incremento de hojas y raz, se utilizara el medio suplementado con 10mg/l de ANA. ESPINOZA (2001).
- Arditti y Ernest, 1993, varios aditivos se han usado en el cultivo in Vitro, tal es el caso del agua de coco, la cual posee una gran cantidad de componentes, entre ellos encontramos algunas fitohormonas con diferentes concentraciones como: auxinas, citocininas y giberelinas y, se ha usado rutinariamente en un sinnmero de mtodos de propagacin, ESPINOZA (2001).
3.2. Propagacin In Vitro de orqudeas. ARDITTI (1990) las tcnicas de propagacin de orqudeas pueden ser de dos tipos:
3.2.1. Propagacin por semillas a. Por semillas provenientes de cpsula dehiscente Se utiliza semillas de cpsulas dehiscentes, las semillas son esterilizadas con una solucin de hipoclorito de sodio en concentraciones de 0,5 a 1,0% por 10 30 minutos, dependiendo del tipo de semilla, para favorecer su esterilizacin es conveniente usar un agente que rompa la tensin superficial de la solucin esterilizante (Tween 20) ,es un agente que permite el mejor contacto del esterilizante con la semilla, se utiliza a razn de 2 gotas/100 ml o reemplazado por detergente casero, como Hipoclorito de calcio y sodio.
b. Por semillas provenientes de cpsula no dehiscente(cpsula verde) La cpsula es separada de la planta madre, se eliminan las partes que no sern necesarias o que pueden ser una fuente de contaminacin (restos de ptalos y de columna), se enjuaga con agua y detergente y se sumerge por unos segundos en alcohol etlico al 75%, luego se esteriliza sumergindola en una solucin de Hipoclorito de calcio al 2 - 4% por 20 minutos.
La siembra se hace directamente sin necesidad de enjuague, para abrir la cpsula se hacen dos cortes longitudinales a lo largo de la sutura de dehiscencia y dos cortes transversales se retiran el pedazo de cpsula seleccionado y se procede a la siembra.
3.3. Medios de cultivo. Los medios de cultivos empleados tienen diversas composiciones y se emplean como lquido o geles (ROCA y MROGINSKI, 1991). Los constituyentes bsicos incluyen todos los elementos minerales esenciales para el desarrollo de la planta, macro y micro nutrientes; un azcar (usualmente sacarosa, sucrosa o glucosa); vitaminas como la tiamina, glicina entre otros; sustancias reguladoras del crecimiento; y otros compuestos. Entre estas juegan un papel esencial las auxinas y las citoquininas cuyas proporciones relativas favorecen el desarrollo del tallo y el de la raz, citado en RUZ (2003).
Usando las sustancias qumicas necesarias y las combinaciones apropiadas de nutrientes, as como su forma qumica adecuada, ha sido posible establecer cultivos para casi todas las partes de la planta en diversas especies vegetales, citado en RUZ (2003).
3.4. Sustancias orgnicas complejas usadas en la germinacin asimbitica de semillas de orqudeas. Un gran numero de aditivos se usan para favorecer la germinacin asimbitica de semillas de orqudeas y el subsecuente desarrollo y diferenciacin de los protocormos (ARDITTI, 1967).
Los ms frecuentemente usados son el endosperma lquido de coco, el jugo de tomate y el fruto del pltano. STEWARD AND SIMMONDS (1954) reportaron que las capas formativas del fruto del pltano poseen sustancias que estimulan la divisin en clulas de zanahoria; con solo esta evidencia disponible, KHALIFAH (1966 b) lleg a la conclusin de que estas sustancias responsables de la divisin celular eran las citokininas.
Encontraron que el fruto del pltano contiene pequeas cantidades de compuestos inductores de la divisin celular [zeatina, zeatin-ribosido y 6-( 2 - isopentilamino) purina] pero que comparados con el endosperma lquido del coco su actividad era extremadamente baja: 20 ml. de este aditivo daban una respuesta similar a 500 g de pltano. Sin embargo, existen evidencias de que el efecto del pltano sobre el desarrollo de las orqudeas puede deberse a la presencia de otros compuestos distintos a las citokininas, pues se ha reportado la presencia de compuestos afines a giberelinas y auxinas en el mismo (KHALIFAH, 1966a, 1966b).
VALMAYOR (1972), report que el endosperma lquido del coco solamente permite una pobre diferenciacin en protocormos de Dendrobium, Vanda y Cattleya, mientras que su combinacin con extractos de pltano resulta en un buen desarrollo de races y tallos.
3.5. Carbn activado. El carbn activado utilizado en cultivo de tejidos es el carbn resultante de la combustin de tejidos vegetales (madera, residuos de madera, papel, lignina, etc). Actualmente es incluido con frecuencia en la formulacin de medios de cultivo In Vitro de orqudeas, tanto para la siembra de plntulas como de protocormos obtenidos a partir de semillas o de meristemas (YAM ET. AL., 1990).
Algunos solutos de una solucin son adsorbidos por el carbn activado cuando entran en contacto con este; el grado de adsorcin depende de la temperatura, el pH, y la composicin qumica de la sustancia adsorbida, siendo mayormente adsorbidos los compuestos moderadamente polares y poco solubles, como fenoles, fito hormonas y vitaminas, en comparacin con los muy polares o los apolares: azucares, sorbitol, manitol, inositol, etc. que no son adsorbidos (WEATHERHEAD ET. AL., 1979).
Las sales inorgnicas muy disociadas no son adsorbidas por el carbn activado, pero si lo son los de muy baja solubilidad como cationes di- o poli valentes. Es por ello en estos casos importante el uso de agentes quelantes (EDTA) que incrementan la solubilidad de los mismos (YAM ET. AL., 1990).
Varios mecanismos se han propuesto para explicar el efecto benfico del carbn activado en el cultivo de orqudeas (WEATHERHEAD ET. AL., 1978). En primer lugar la contribucin de minerales en forma de impurezas estara enriqueciendo el medio de cultivo. Segundo, la capacidad para adsorber metabolitos fitotxicos que estaran siendo liberados al medio de cultivo por los tejidos (fenoles y sus oxidados, hidroxiquinonas, cido para hidro benzoico). Tercero la adsorcin de sustancias producidas durante la esterilizacin en el medio de cultivo, como el hidroximetil-furfural, resultado de la deshidratacin de las hexosas que afectan el crecimiento y desarrollo de las plntulas. Cuarto, la adsorcin de etileno que inhibe el crecimiento y la diferenciacin de las plntulas y protocormos.
Para el cultivo de orqudeas se utiliza carbn activado en medios de germinacin de semillas y en medios de desarrollo como para etapas posteriores (replante) a una concentracin de 2 g/l.
3.6. Experiencias en cultivo In Vitro de orqudeas con medios de cultivo casero. 3.6.1 Medios de cultivo para simbra de semillas y meristemas. Para un laboratorio casero, podemos preparar medios de cultivo con componentes de facil adquisicion o de precios bien baratos. Y el mejor, tan eficientes y en algunos casos hasta mejores de los mas tradicionales medios usados en sofisticados laboratorios de biotecnologia. En cualquier feria libre o mercado de productos de culinaria casera podemos adquirir los componentes para los medios de cultivos. Y quien sabe hacer una vitamina para consumo, sabr tambien con seguridad hacer un exelente medio para reproducir orquideas (MACHADO, 2003).
3.6.2 Reseta de un Figura N 01: Materiales e insumos para un medio de cultivo casero medio de cultivo para cultivar semillas. MACHADO, 2003. menciona que: todos los componentes deben ser de cultivo organico sin agroquimicos:
1. Pltano seda semi madura con cascara (mitad) aproximadamente 50 g. 2. Papaya (una cuchara de sopa bien llena) aproximadamente 50 g. 3. Tomate cereza (cinco pequeos tomates) aproximadamente 50 g. 4. Agua de coco verde (1 vaso) aproximadamente 120 ml. 5. Azucar (una cuchara de sopa) aproximadamente 20 g. 6. Agar agar (una cuchara de sopa) aproximadamente 10 g. 7. Polvo de carbon (una cuchara de te) aproximadamente 01 g. 8. Agua destilada completar para un litro. IV. MATERIALES Y MTODOS
4.1. Ubicacin del experimento El presente trabajo se desarrollo en el Laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales (LCTV) de la Universidad Nacional de San Martn Tarapoto, situado en la Ciudad Universitaria, cuya ubicacin poltica y geogrfica se menciona a continuacin:
4.1.1 Ubicacin Poltica Lugar : LCTV UNSM - T Distrito : Morales Provincia : San Martn Departamento : San Martn
4.1.2 Ubicacin Geogrfica Longitud Oeste : 76 22 48.4 Latitud Sur : 06 29 13.2 Altitud : 278 m.s.n.m. Clima : Bosque seco - Tropical (bs T). Holdridge 1 978
4.2. Materiales De laboratorio: - Botellas de wisky - Erlermeyer de diferentes graduaciones - Placas petri - Pinzas de acero quirrgico - Mangos de bistur - Hojas de bistur No. 10 y 11 - Papel aluminio - Alcohol - Complejo B - Agua de coco - Agar - agar - Azcar - Pltano seda - Carbn vegetal - Mecheros - Algodn - Hipoclorito de sodio - Potencimetro - Destilador de agua - Agua destilada - Balanza analtica - Refrigerador - Autoclave - Cmara de flujo laminar - Agua destilada 1000 ml
Material fotogrfico: - Cmara digital profesional
Materiales de oficina: - Papel bond A-4 - Lapiceros - Computadora - Memoria USB
4.3. Metodologa 4.3.1. Proceso de la propagacin in Vitro de orqudeas. a. Preparacin y desinfeccin de cpsula indehiscente (cerrada) a.1. Preparacin de los materiales Para la desinfeccin de capsulas cerradas se preparo una solucin desinfectante al 1.0% de NaOCl. Se sumergi las capsulas a la solucin desinfectante por un intermedio de 20 minutos.
Para el proceso de siembra, con la ayuda de un bistur se aperturo la capsula cerrada, realizando tres cortes longitudinales, se extrajo la semilla y se coloco en un erlenmeyer de 125 ml con 75 ml de agua destilada estril y con una esptula estril se procedi a homogenizar, con el fin de tener una suspensin. Para la desinfeccin se sigui el mismo proceso propuesto por LEON (1995).
Antes de la siembra, se obtuvo una muestra de semilla para observar al microscopio (mayor aumento 100X), siguiendo el proceso propuesto por DONAYRE (1996), pero existe otro mtodo mas confiable para determinar la viabilidad (mtodo del 2, 3, 5 trifenil tetrazolium), como lo menciona LEN (1995).
a.2. Trabajo en cmara de flujo laminar. En la cmara de flujo laminar se procedi a abrir la capsula haciendo tres cortes a la capsula con la ayuda de una hoja de bistur nmero 10 y de esta manera se obtuvo las semillas y se coloc en un principio en una placa petri estril para luego introducirlos en un erlemeyer de 125 ml contenida con 75 ml de agua destilada estril para as obtener la suspensin de las semillas, tal como muestra la figura N 01.
a.3. Proceso de siembra. Despus de haber obtenido la suspensin, se realiz la siembra, utilizando una esptula tipo cuchara estril y desinfectada para evitar contaminaciones, con el cual se tom una pequea cantidad de la suspensin (una cucharada) y se coloc en las botellas de wisky que contenan los diferentes medios de cultivo (tratamientos puestos en estudio), posteriormente se coloc la tapa de algodn y luego se sello con papel aluminio y plstico, tal como muestran en las figuras N 02, 03, 04, 05, 06, y 07, anotndose despus los datos de siembra Y para su posterior ubicacin en la cmara (cuarto) de incubacin a una temperatura de 21 25C, con una humedad relativa de 60%.
Figura N 02: Obtencin de semillas de capsula verde
b. Establecimiento de las semillas Al cabo de un tiempo de ser sembradas las semillas en las botellas de wisky que contenan 100 ml de medio de cultivo/botella. Se observ el desarrollo de las semillas, acondicionado a una temperatura de 21 24C con una humedad relativa de 40 60%.
Se sabe que la semilla de las orqudeas son muy pequeas entre 0.4 1.25 mm y de un embrin diferenciado y suspendida dentro de una estructura reticulada (testa) y rodeada de un gran volumen de aire Figura N 03: Esterilizacin Figura N 04: Siembra Figura N 08: Sellado Figura N 07: Esterilizacin Figura N 05: Dispersin Figura N 06: Tapado (en algunas especies), lo que permite flotar por periodos largos.
El embrin de la orqudea esta formado por clulas relativamente indiferenciadas con abundantes cuerpos de lpidos y protenas que constituyen su nica fuente de reserva, pero utilizando el cultivo in vitro, las semillas comenzaran a germinar y desarrollarse ya que cuenta con nutrientes que aceleran su desarrollo en condiciones de laboratorio.
Aproximadamente a 3 semanas y media (21 30 das) despus de la siembra en el medio de cultivo (germinacin), se observ el proceso de rompimiento de testa que cubre el embrin de la semilla de Cattleya sp. y Oncidium lanceanum, tal como muestra las figuras N 08, 09, 10, 11, 12 y 13; esto se da por germinacin del embrin y tambin por las condiciones favorables para su desarrollo (temperatura, foto periodo y humedad).
D F Figura N 09: A 10 X (T0) Figura N 10: A 10 X (T1)
Figura N 11: A 10 X (T2)
c. Multiplicacin de protocormos En su segunda etapa de propagacin in vitro (multiplicacin) se continu con los mismos tratamientos sin adicionar ningn otro componente a los mismos, para as poder determinar la eficiencia de los medios de cultivo propuestos.
En esta fase los protocormos comenzaron a diferenciarse algunos en plntulas y desarrollaron hojas (figura N 14), esto gracias a las condiciones ambientales controladas en el laboratorio, el medio de cultivo y tambin los repiques realizados cada 30 das, evitando as el retrazo en su desarrollo, esto se hace porque el medio de cultivo se agota y es necesario el reemplazo por un nuevo medio.
Se podr observar que los protocormos se estn formando algunas en plntulas ya diferenciadas, esto debido a que el medio utilizado esta favoreciendo su desarrollo y siempre controlando las condiciones ambientales en el laboratorio para su desarrollo y estar nuevamente en las condiciones de un nuevo medio de enraizamiento y desarrollo, tal como se puede observar en la figura N 15. Figura N 12: A 10 X (T3)
Figura N 13: A 10 X (T4)
Figura N 14: T4 a simple vista
d. Enraizamiento y desarrollo de las plntulas Al cabo de un periodo donde los protocormos estaban formando algunas plntulas, se procedi al cambio de un medio mas nutritivo, el mismo que se consigui agregando a todos los tratamientos 100 ml de endospermo liquido de coco (agua de coco verde), llegando a la fase de enraizamiento y desarrollo de las plntulas, en esta etapa se estableci un nmero determinado de plntulas por botella (48 plntulas/botella), siempre con las mismas condiciones ambientales para su enraizamiento y desarrollo, en esta fase las plntulas tendrn mayor tamao y formaran races (Firuras N 16, 17, 18, 19, 20 y 21).
Figura N 15: Protocormos a (10X) Figura N 16: Diferenciacin
4.4. Diseo Experimental Se utilizo un Diseo Completamente al Azar (DCA) con cinco (5) tratamientos y diez (10) repeticiones, donde se estableci cinco (5) tipos de medios para la fase de germinacin y desarrollo. 4.4.1 Medios de Cultivo Cuadro N01: Componentes y dosis del medio de cult ivo T 0 para germinacin. Reactivos e insumos g/200 ml stock Concentracin final Figura N 17: Cattleya maxima T3 Figura N 18: Oncidium lanceanum T4 Figura N 19: Cattleya maxima T4 Figura N 21: Cattleya maxima T0 Figura N 20: Oncidium lanceanum T0 Figura N 22: Oncidium lanceanum T3 Nitrato de amonio 20,625 1,031 Nitrato de potasio 23,750 1,188 EDTA 0,466 0,032 Sulfato ferroso heptahidratado 0,348 Cloruro de calcio dihidratado 17,600 0,880 Fosfato de potasio monobsico (g/l) 6,800 0,085 Molibdato de sodio dihidratado 0,010 0,004 g/l Cloruro de cobalto dihidratado 0,001 cido brico 0,248 Yoduro de potasio 0,033 Sulfato de manganeso monobsico 0,676 0,198 g/l Sulfato de manganeso heptahidratado 14,800 Sulfato de zinc heptahidratado 0,345 Sulfato de cobre pentahidratado 0,001 Tiamina 0,100 0,400 cido nicotnico 0,100 0,500 Sucrosa (g) .. 20,000 C. Activado (g) ..... 2,000 Agar agar (g) .. 8,000 Agua destilada (ml) .. 1000,000 pH .. 5.1 5.4
Medio N01: Establecido por Len M. en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV), UNSM T Cuadro N02: Componentes y dosis del medio de cul tivo T 0 para la fase de enraizamiento y desarrollo.
Reactivos e insumos g/200 ml stock Concentracin final Nitrato de amonio 20,625 1,031 Nitrato de potasio 23,750 1,188 EDTA 0,466 0,032 Sulfato ferroso heptahidratado 0,348 Cloruro de calcio dihidratado 17,600 0,880 Fosfato de potasio monobsico (g/l) 6,800 0,085 Molibdato de sodio dihidratado 0,010 0,004 g/l Cloruro de cobalto dihidratado 0,001 cido brico 0,248 Yoduro de potasio 0,033 Sulfato de manganeso monobsico 0,676 0,198 g/l Sulfato de manganeso heptahidratado 14,800 Sulfato de zinc heptahidratado 0,345 Sulfato de cobre pentahidratado 0,001 Tiamina 0,100 0,400 cido nicotnico 0,100 0,500 Sucrosa (g) .. 20,000 C. Activado (g) ..... 2,000 Agar agar (g) .. 8,000 Agua de coco (ml) .. 100,000 Agua destilada (ml) .. 1000,000 pH .. 5.1 5.4
Medio N02: Establecido por Len M. en el Laborato rio de Cultivo de Tejidos vegetales (LCTV), UNSM T Cuadro N03: Componentes y dosis del medio de cul tivo T 1 para germinacin.
Insumos g/200 ml stock Cantidades finales de pxto. Fertilizante Bayfolan (11 9 8) (ml) . 7,100 Complejo B (ml) . 3,000 Azcar blanca (g) . 20,000 Agar agar (g) . 10,000 Carbn vegetal molido (g) . 2,000 Agua destilada (ml) . 1000,000 pH . 5.1 5.4
Medio N03: Establecido por Len M. y Padilla, E. en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV), UNSM T
Cuadro N04: Componentes y dosis del medio de cult ivo T 1 para la fase de enraizamiento y desarrollo.
Insumos g/200 ml stock Cantidades finales de pxto. Fertilizante Bayfolan (11 9 8) (ml) . 7,100 Complejo B (ml) . 3,000 Azcar blanca (g) . 20,000 Agar agar (g) . 10,000 Agua de coco (ml) . 100,000 Carbn vegetal molido (g) . 2,000 Agua destilada (ml) . 1000,000 pH . 5.1 5.4
Medio N04: Establecido por Len M. y Padilla, E. en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV), UNSM T Cuadro N05: Componentes y dosis del medio de cul tivo T 2 para germinacin.
Insumos g/200 ml stock Cantidades finales de pxto. Agua de coco desproteinizado (ml) . 200,0000 Complejo B (ml) . 3,000 Azcar blanca (g) . 20,000 Agar agar (g) . 10,000 Carbn vegetal molido (g) . 2,000 Agua destilada (ml) . 1000,000 pH . 5.1 5.4
Medio N05: Establecido por Len M. y Padilla, E. en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV), UNSM T
Cuadro N06: Componentes y dosis del medio de cult ivo T 2 para la fase de enraizamiento y desarrollo.
Insumos g/200 ml stock Cantidades finales de pxto. Agua de coco desproteinizado (ml) . 200,000 Complejo B (ml) . 3,000 Azcar blanca (g) . 20,000 Agar agar (g) . 10,000 Carbn vegetal molido (g) . 2,000 Agua de coco (ml) . 100,000 Agua destilada (ml) . 1000,000 pH . 5.1 5.4
Medio N06: Establecido por Len M. y Padilla, E. en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV), UNSM T
Cuadro N07: Componentes y dosis del medio de cul tivo T 3 para germinacin.
Insumos g/200 ml stock Cantidades finales de pxto. Fertilizante Bayfolan (11 9 8) (ml) . 7,100 Complejo B (ml) . 3,000 Azcar blanca (g) . 20,000 Agar agar (g) . 10,000 Carbn vegetal molido (g) . 2,000 Agua de coco (ml) . 100,000 Agua destilada (ml) . 1000,000 pH . 5.1 5.4
Medio N07: Establecido por Len M. y Padilla, E. en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV), UNSM T
Cuadro N08: Componentes y dosis del medio de cult ivo T 3 para la fase de enraizamiento y desarrollo.
Insumos g/200 ml stock Cantidades finales de pxto. Fertilizante Bayfolan (11 9 8) (ml) . 7,100 Complejo B (ml) . 3,000 Azcar blanca (g) . 20,000 Agar agar (g) . 10,000 Agua de coco (ml) . 200,000 Carbn vegetal molido (g) . 2,000 Agua destilada (ml) . 1000,000 pH . 5.1 5.4
Medio N08: Establecido por Len M. y Padilla, E. en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV), UNSM T Cuadro N09: Componentes y dosis del medio de cul tivo T 4 para germinacin.
Insumos g/200 ml stock Cantidades finales de pxto. Fertilizante Bayfolan (11 9 8) (ml) . 7,100 Complejo B (ml) . 3,000 Azcar blanca (g) . 20,000 Agar agar (g) . 10,000 Carbn vegetal molido (g) . 2,000 Pltano seda (g) . 40,000 Agua destilada (ml) . 1000,000 pH . 5.1 5.4
Medio N09: Establecido por Len M. y Padilla, E. en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV), UNSM T
Cuadro N10: Componentes y dosis del medio de cult ivo T 4 para la fase de enraizamiento y desarrollo.
Insumos g/200 ml stock Cantidades finales de pxto. Fertilizante Bayfolan (11 9 8) (ml) . 7,100 Complejo B (ml) . 3,000 Azcar blanca (g) . 20,000 Agar agar (g) . 10,000 Pltano seda (g) . 40,000 Agua de coco (ml) . 100,000 Carbn vegetal molido (g) . 2,000 Agua destilada (ml) . 1000,000 pH . 5.1 5.4
Medio N10: Establecido por Len M. y Padilla, E. en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV), UNSM T 4.4.2 Procedimiento para la preparacin del medio de cultivo. En un vaso precipitado se colocaron 500 ml de agua destilada. Se pesaron los componentes slidos (azcar, agar-agar, carbn activado, etc). Para el tratamiento T0 (Testigo) se agrego las cantidades de las sales minerales especificados por Murashige & Skoog (1962) contenidos en stocks A, B, G, C, D, E y F. Para los tratamientos (T 1 , T 2 , T 3 y T 4 ) no se utilizo las soluciones stock; para cada uno los tratamientos mencionados anteriormente se agregaron los siguientes componentes. - Para T 1 : Bayfolan y complejo B. - Para T 2 : Coco desproteinizado y complejo B. Cabe indicar que para la desproteinizacin del endospermo lquido de coco (agua de coco), se sigui el siguiente procedimiento; colocamos 300 ml de agua de coco en un vaso de precipitado de 500 ml y lo calentamos hasta hervir en una cocina, el agua de coco debe hervir por 5 minutos y luego se filtr, con algodn y un embudo (Figura N 22). - Para T 3 : Bayfolan, complejo B y agua de coco. - Para T 4 : Bayfolan y complejo B, pero antes se debe preparar una suspensin (jugo) con 300 ml de agua destilada y pltano seda (figura N 23), licuado hasta homogenizar y luego se agreg esta mezcla a la solucin anterior. Para cada etapa de propagacin, preparamos diferentes tipos de medio de cultivo, con diferentes concentraciones de componentes; germinacin: cinco (05) medios (Tratamientos); para enraizamiento y desarrollo tambin cinco (5) medios de cultivo (Tratamientos). Luego adicionamos los componentes slidos a cada solucin establecida por separados segn su formulacin y tipo de medio requerido para cada caso. Luego de aplicar los componentes enrazamos a 1000 ml. A cada medio de cultivo establecido se ajust su pH de 5.1 5.4, como se muestra en la figura N 24. El medio de cultivo se distribuy en botellas de wisky, colocando 100 ml de medio de cultivo por botella, con la ayuda de una medida de dispersin de (100 ml), obteniendo 10 botellas de medio del T 0
para la fase de germinacin, y al mismo tiempo 10 botellas para la fase de enraizamiento y desarrollo. Todas las botellas con medio de cultivo, se pas a la esterilizacin en una olla autoclave de capacidad de 40 litros a temperatura de 121 C, con una presin de 15 lb, por un periodo de 15 minutos (figura N 25). Despus de enfriado, se agito el medio para tener homogeneidad y luego se almacen en la sala de incubacin a la temperatura de 20 a 24C hasta el momento de su uso, donde se las ubico horizontalmente para una mejor solidificacin (figura N 26).
4.4.3 Especies. Cattleya sp. y Oncidium lanceanum
4.4.4. Anlisis de Varianza. Se da a conocer que a partir de la primera fase (germinacin) y la segunda fase (enraizamiento y desarrollo) de la propagacin in vitro, para el caso de la primera fase se hizo un recuadro de 4 cm 2 sobre la Figura N 23: Filtrado de agua de coco Figura N 24: Preparacin del homogenizado de pltano Figura N 25: Medicin del pH Figura N 26: Esterilizacin del medio de cultivo Figura N 27: Enfriado del medio de cultivo superficie del vidrio de las botellas de wisky, con la finalidad de lograr la facilitacin en la toma de datos, para el caso de la segunda fase, se coloc en cada botella 48 plntulas por cada especie por tratamiento (Cattleya sp. y Oncidium lanceanum).
Cuadro N11: Anlisis de varianza del experimento en la primera fase (germinacin y formacin de protocormos). Fuente de variabilidad G.L. Tratamientos 5 1 = 4 Error 5(10 1)= 45 Total (5 x 10) 1 = 49
4.4.5. Modelo Matemtico. Yij = + i + ij Donde: = Media General i = Efecto del i-simo tratamiento ij = Efecto aleatorio del error 4.5. Evaluaciones realizadas 4.5.1. Establecimiento de las semillas
a) Viabilidad. Se evalu la viabilidad de las semillas observando al microscopio (aumento 100x). Donde se tom 10 muestras de semillas al azar, en cada uno de los cuales se realizo la evaluacin y se hizo el recuento de semillas viables y no viables, obtenindose el porcentaje de viabilidad de la siguiente manera:
Total de semillas viables % Viabilidad = --------------------------------------- x 100% Total de semillas
b) Contaminacin. Se evalu presencia de microorganismos (hongo) por observacin directa, a los 07 das despus de la siembra, en dos momentos de siembra: 07/08/07 y 09/08/07, para luego obtener el porcentaje de contaminacin en cada momento de siembra, por medio de la formula general.
c) Porcentaje de Germinacin. Se evalu el porcentaje de germinacin, al cabo de una (1) semana despus de la siembra, y despus se tomo observaciones cada 7 das, donde se procedi a tomar 10 botellas al azar por cada tratamiento y se hizo el recuento total de semillas y de semillas germinadas que se encontraban dentro del cuadro de 2 cm x 2 cm, para luego obtenerse el porcentaje de germinacin en cada cuadrado y elevado al nmero total de semillas por botella evaluado por medio de la formula general.
Semillas germinadas % germinacin = -------------------------------------- x 100% Total de semillas
d) Rompimiento de testa. Se evalu el rompimiento de testa de las semillas en el medio de cultivo (germinacin). Se procedi a tomar las cinco (5) botellas establecidas y observar la velocidad de rompimiento de testa de las semillas por cada cuadrado (en cada botella), esto cada 7 das en 4 evaluaciones.
e) Color verde vivo y verde transparente. Se evalu el estado de protocormos en buen estado (verdes) y vitrificados o a punto de morir (verde transparente o tornndose como vidrio) a 75 das despus de la siembra, donde contamos el nmero de protocormos vivos y vitrificados de los dos cuadrados de 2 cm. x 2 cm. (Dos cuadrados en cada botella) en las cinco (5) botellas establecidas por los cinco (5) tratamientos.
f) Color verde y marrn Se evalu el estado de protocormos en buen estado (verdes) y fenolizados o muertos (marrn) a 90 das despus de la siembra, donde contamos el nmero de protocormos vivos y muertos de los dos cuadrados de 2 cm. x 2 cm. (dos cuadrados en cada botella) en las cinco (5) botellas establecidas por los cinco (5) tratamientos.
4.5.2. Etapa de Enraizamiento y Desarrollo. Se estableci cinco (5) medios de cultivo para el enraizamiento y desarrollo, con 10 repeticiones (botellas) y por cada botella se coloc 48 plntulas.
a) Nmero de hojas. Se evalu el nmero de hojas de las plntulas, donde se procedi a contar el nmero de hojas de cada plntula (10 plntulas/botella) obtenindose un promedio final que representara el nmero de hojas/botella en cada tratamiento, para luego realizar el Anlisis de Varianza y Duncan.
b) rea folear. Se evalu el rea folear de las plntulas, procedindose a medir el largo y el ancho de las hojas, de cada plntula (10 plntulas/botella) utilizando un papel milimetrado, obtenindose un promedio final que representa el rea folear en cada tratamiento, para luego realizar el anlisis de varianza y prueba de Duncan. Cabe indicar que las mediciones se realiz a cada hoja que apareca (es decir que la hoja que fue medida antes, ya no se volva a medir).
c) Altura de plntulas. Se evalu la altura de las plntulas, tomndose la longitud de las plntulas con un papel milimetrado. De cada plntula (10 plntulas/botella) obtenindose un promedio final que representara la altura de plntulas/botella, esto a las cinco (5) botellas evaluadas en los cinco (5) tratamientos, para luego realizar el anlisis de varianza y prueba de Duncan.
d) Nmero de races. Se evalu el nmero de races, donde se procedi a contar el nmero de races de cada plntula (10 plntulas/botella) obtenindose un promedio final de races/botella, esto a las cinco (5) botellas evaluadas en los cinco (5) tratamientos, para luego realizar el anlisis de varianza y Prueba de Duncan.
e) Contaminacin. Al igual que para la primera etapa se evalu la presencia de microorganismos (hongo) por observacin directa, a los 07 das despus de la siembra, en dos momentos de siembra: 04/12/07 y 06/12/07, para luego obtener el porcentaje de contaminacin en cada momento de siembra, por medio de la formula general.
f) Color verde vivo y verde transparente. Al igual que para la primera fase se evalu el estado de plntulas en buen estado (verdes) y vitrificados o a punto de morir (verde transparente o tornndose como vidrio) a 60 das despus de la siembra, donde contamos el nmero de plntulas vivas y vitrificadas en las cinco (5) botellas establecidas por los cinco (5) tratamientos.
g) Color verde y marrn. Tambin se evalu el estado de plntulas en buen estado (verdes) y fenolizados o muertos (marrn) a 60 das despus de la siembra, donde contamos el nmero de plntulas vivas y muertas en las cinco (5) botellas establecidas por los cinco (5) tratamientos.
4.5.3 Anlisis de costos. Se determin el costo de los diferentes medios de cultivo propuestos, los mismos que representan los diferentes tratamientos del presente trabajo investigacin. Para esto se realiz la cotizacin respectiva de todas las sales nutritivas y minerales que se utiliza en el medio de cultivo propuesto por Murashige y Skoog en 1962, modificada para el cultivo de orqudeas por Len en 1995, y de los insumos y fertilizante, utilizados en los medios caseros propuestos como tratamientos, esto se puede observar en los cuadros 12, 13, 14, 15 y 16. Cuadro N 12. Costos de 1 litro de medio de cultivo M&S (T 0 ). componente Costo (S/.) Q. Pxto total Q. Usado (g/l) Total nitrato de amonio (g) 89.605 1000 1.65 0.14784825 Nitrato de potasio (g) 59 500 1.9 0.2242 Cloruro de calcio (g) 65 500 0.44 0.0572 Sulfato de magnesio (g) 97 500 0.016 0.003104 Sulfato de zinc (g) 95 500 0.0086 0.001634 acido borico (g) 65 500 0.0062 0.000806 Ioduro de potasio (g) 150 250 0.00083 0.000498 acido molibdico (g) 536.95 500 0.00005 5.3695 cloruro de cobalto (g) 125 100 0.000025 0.00003125 sulfato de hierro (g) 125 500 0.0278 0.00695 agente quelante Na2 - EDTA (g) 125 500 0.0373 0.009325 Tiamina HCl (g) 135 100 0.0004 0.00054 acido nocotinico (g) 69 25 0.0005 0.00138 sucrosa (g) 62 500 20 2.48 agar - agar (g) 224 500 10 4.48 carbon activado (g) 110 1000 2 0.22 agua destilada (L) 9.7 1000 1000 9.7 agua de coco * 0.5 400 100 0.125 Equipo Costo/H Tiempo usado Total Autoclave 0,675 0,75 H 0,50625 Costo total del medio de cultivo para germinacin 17.8398202 Costo total del medio de cultivo para desarrollo 17.9648202 * Slo se utiliza para medio de desarrollo. Cuadro N 13. Costos de1 litro de medio de cultivo T 1 . Insumos Costo (S/.) Q. Pxto total Q. usado/L Total (S/.) Fertilizante Bayfolan (11 9 8) (ml)
22 1000
7.1 0.1562 Complejo B (ml) 3.3 120 3 0.0825 Azcar blanca (g) 2.3 1000 20 0.046 Agar agar (g) 224 500 10 4.48 Carbn vegetal molido (g) 1.2 1000 2 0.0024 Agua destilada (ml) 9.7 1000 890 8.63203 agua de coco* 0.5 400 100 0.125 Equipo Costo/H Tiempo usado Total Autoclave 0,675 0,75 H 0,50625 Costo total del medio de cultivo para germinacin 14.87538 Costo total del medio de cultivo para desarrollo 14.03038 * Slo se utiliza para medio de desarrollo.
Cuadro N 14. Costos de 1 litro de medio de cultivo T 2 . Insumos Costo (S/.) Q. Pxto total Q. usado/L Total (S/.) coco desproteinizado (ml) 0.5 350 200 0.28571429 Complejo B (ml) 3.3 120 3 0.0825 Azcar blanca (g) 2.3 1000 20 0.046 Agar agar (g) 224 500 10 4.48 Carbn vegetal molido (g) 1.2 1000 2 0.0024 Agua destilada (ml) 9.7 1,000 697 6.7609 agua de coco* 0.5 400 100 0.125 Equipo Costo/H Tiempo usado Total Autoclave 0,675 0,75 H 0,50625 Costo total del medio de cultivo para germinacin 13.09805 Costo total del medio de cultivo para desarrollo 12.2887643 * Slo se utiliza para medio de desarrollo.
Cuadro N 15. Costos de 1 litro de medio de cultivo T 3 . Insumos Costo (S/.) Q. Pxto total Q. usado/L Total (S/.) Fertilizante Bayfolan (11 9 8) (ml)
22 1000
7.1 0.1562 Complejo B (ml) 3.3 120 3 0.0825 Azcar blanca (g) 2.3 1000 20 0.046 Agar agar (g) 224 500 10 4.48 Carbn vegetal molido (g) 1.2 1000 2 0.0024 Agua destilada (ml) 9.7 1,000 689.9 6.69203 Agua de coco 0.5 400 100 0.125 Agua de coco* 0,5 400 100 0.125 Equipo Costo/H Tiempo usado Total Autoclave 0,675 0,75 H 0,50625 Costo total del medio de cultivo para germinacin 14.03038 Costo total del medio de cultivo para desarrollo 12.21538 * Slo se utiliza para medio de desarrollo. Cuadro N 15. Costos de 1 litro de medio de cultivo T 4 . Insumos Costo (S/.) Q. Pxto total Q. usado/L Total (S/.) Fertilizante Bayfolan (11 9 8) (ml)
22 1000
7.1 0.1562 Complejo B (ml) 3.3 120 3 0.0825 Azcar blanca (g) 2.3 1000 20 0.046 Agar agar (g) 224 500 10 4.48 Carbn vegetal molido (g) 1.2 1000 2 0.0024 Agua destilada (ml) 9.7 1,000 889.9 8.63203 pltano seda (g) 0.2 93.032 40 0.08599192 agua de coco* 0.5 400 100 0.125 Equipo Costo/H Tiempo usado Total Autoclave 0,675 0,75 H 0,50625 Costo total del medio de cultivo para germinacin 14.9613719 Costo total del medio de cultivo para desarrollo 14.1163719 * Slo se utiliza para medio de desarrollo. V. RESULTADOS
5.1. Evaluacin del establecimiento de las semillas
Cuadro N12: Viabilidad de las semillas de Cattleya sp, expresado en porcentajes antes de la siembra. Nde muestras Cantidad de semillas Viables o buenos (%) No Viable o Vanos (%) 1 247 72,5 27,5 2 247 70,0 30,0 3 242 72,7 27,3 4 245 73,9 26,1 5 247 72,5 27,5 6 247 74,9 25,1 7 246 75,2 24,8 8 244 76,2 23,8 9 245 77,9 22,1 10 248 77,8 22,2 X 245.8 74,36 25,64
Grfico N01: Viabilidad de las semillas Cattleya sp.
Cuadro N 13: Viabilidad de las semillas de Oncidium lanceanum, expresado en porcentajes antes de la siembra.
Nde muestras Cantidad de semillas Viables o buenos (%) No Viable o Vanos (%) 1 246 66,3 33,7 2 248 75,4 24,6 3 243 75,3 24,7 4 247 75,7 24,3 5 245 78,4 21,6 6 273 67,0 33,0 7 248 75,9 24,1 8 245 77,6 22,4 9 246 76,8 23,2 10 247 77,7 22,3 X 248,8 74,61 25,39
Grfico N02: Viabilidad de las semillas de Oncidium lanceanum
74.36 25.64 0 20 40 60 80 Viable s No viables 74.61 25.39 0 20 40 60 80 Viables No viables
5.1.1. Contaminacin.
Cuadros N14: Nmero de botellas con Cattleya sp. contaminadas en medio de cultivo (Germinacin), primer momento de siembra: 07/08/07; despus de 2 semanas.
N Cantidad de botellas Contaminados No contaminado s 1* 50 0 50 % 100 0 100
Cuadro N15: Nmero de botellas con Oncidium lanceanum contaminadas en medio de cultivo (Germinacin), segundo momento de siembra: 09/08/07; despus de 2 semanas.
N Cantidad de botellas Contaminados No contaminado s 2 50 0 50 % 100 0 100
Grafico N03.a: Siembra 1 Grafico N03.b: Siemb ra 2
5.1.2. Porcentaje de Germinacin.
Cuadros N16: Anlisis de Varianza para el porcent aje de germinacin de semillas de Cattleya sp. en un medio de germinacin a 30 das de la siembra.
F. de V. GL SC CM FC FT Tratamientos t-1 4 139.32 34.82983274 5.99273 (2.87-4.43) Error (t)(r-1) 20 116.24 5.812015798 Total rt-1 24 255.56 ** Altamente significativo X = 73,94% R 2 =54,52% C.V= 3,26%
Grafico N04: Prueba de DUNCAN al 0.01% para el P orcentaje de germinacin de semillas de Cattleya sp. en un medio de germinacin a 30 das de la siembra.
Cuadro N17: Anlisis de Varianza para el porcenta je de germinacin de semillas de Oncidium lanceanum en un medio de germinacin a 30 das de la siembra.
F. de V. GL SC CM FC FT Tratamientos t-1 4 118.98 29.7441129 3.68957 (2.87-4.43) Error (t)(r-1) 20 161.23 8.061671879
Total rt-1 24 280.21
X=74,98% R 2 =42,46% C.V=3,78%
Grfico N05: Prueba de DUNCAN al 0.01% para el po rcentaje de germinacin de semillas de Oncidium lanceanum en un medio de germinacin a 30 das de la siembra.
a b ab b b a ab b ab ab
5.1.3. Rompimiento de testa.
Cuadro N18: Velocidad de rompimiento de testa de semillas de Cattleya sp., en un medio de germinacin durante 4 evaluaciones expresado en cantidad.
Tto. Velocidad de rompimiento de testa en un medio de cultivo (germinacin) expresado en proporcin. 7 das 14 das 21 das 28 das T 0 0,8 5.4 31.6 42.2 T 1 7,0 14,4 34,6 59,0 T 2 5,0 14,6 39 60,0 T 3 21,0 50,6 56,4 35,6 T 4 23,6 71,8 64,0 4,8 x 11,48 31,36 45,12 40,32 Total 57,4 156,8 225,6 201,6
Grfico N06: Velocidad de rompimiento de testa
Cuadro N19: Velocidad de rompimiento de testa de semillas de Oncidium lanceanum, en un medio de germinacin durante 4 evaluaciones expresado en cantidad.
Tto. Velocidad de rompimiento de testa en un medio de cultivo (germinacin) expresado en proporcin. 7 das 14 das 21 das 28 das T 0 5,0 17,0 37,8 48,8 T 1 15,2 25,4 40,8 63,0 T 2 12,0 32,4 56,0 53,2 T 3 24,2 65,8 32,4 31,4 T 4 25,2 70,6 69,0 6,2 x 16,32 42,24 47,2 40,52 Total 81,6 211,2 236 202,6
Grfico N07: Velocidad de rompimiento de testa 0 10 20 30 40 50 60 70 80 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias v e l o c i d a d
d e
r o m p i m i e n t o
T0 T1 T2 T3 T4
5.1.5. Color verde vivo y verde transparente. Cuadro N20: Cuadro de observacin del nmero de p rotocormos de color verde (Vivos) y verde transparente (vitrificados) de Cattleya sp. a los 75 das despus de la siembra.
Cuadro N21: Cuadro de observacin del nmero de p rotocormos de color verde (Vivos) y verde transparente (vitrificados) de Oncidium lanceanum a los 75 das despus de la siembra.
Grafico N 09: Protocormos vivos y vitrificados. 148 15.2 173.8 13.2 169.6 13.8 167.8 19.4 175.2 17.2 0 50 100 150 200 T0 T1 T2 T3 T4 Vivos Vitrificados
5.1.6. Color verde y marrn Cuadro N22: Cuadro de observacin del nmero de p rotocormos de color verde (Vivos) y marrn (Muertos) de Cattleya sp. a los 75 das despus de la siembra.
Grafico N 10: Protocormos vivos y fenolizados (marrn). 172.6 6.6 170 6 172.6 6.2 180 5.4 187.2 4.4 0 50 100 150 200 T0 T1 T2 T3 T4 Vivos Marrn
Cuadro N23: Cuadro de observacin del nmero de p rotocormos de color verde (Vivos) y marrn (Muertos) de Oncidium lanceanum a los 75 das despus de la siembra. T 0 T 1 T 2 T 3 T 4
Cuadro N24: Anlisis de varianza para determinar el nmero de hojas de Cattleya maxima en fase de enraizamiento y desarrollo a 24 semanas despus de la siembra. F. de V. GL SC CM FC FT(0.01-0.05) Tratamientos t-1 4 15.68 3.92 73.5 2.56-3.77 Error (t)(r-1) 45 2.4 0.053333333 Total rt-1 49 18.08 ** Altamente significativo X = 3,72 R 2 =86,72% C.V= 6,20%
Grfico N12: Prueba de Duncan para determinar el nmero de hojas de Cattleya maxima a 24 semanas despus de la siembra. a a a a b
Cuadro N25: Anlisis de varianza para determinar el nmero de hojas de Oncidium lanceanum en fase de enraizamiento y desarrollo a 24 semanas despus de la siembra. F. de V. GL SC CM FC FT(0.01-0.05) Tratamientos t-1 4 31.32 7.83 37.0894737 2.56-3.77 Error (t)(r-1) 45 9.5 0.211111111 Total rt-1 49 40.82 ** Altamente significativo X = 3,94 R 2 =76,72% C.V = 11,66%
Grfico N13: Prueba de Duncan para determinar el nmero de hojas de Oncidium lanceanum a 24 semanas despus de la siembra.
a a a b a 5.3.2. Altura de las plntulas.
Cuadro N26: Anlisis de varianza para determinar la altura de plntulas en mm de Cattleya maxima en fase de enraizamiento y desarrollo a 24 semanas despus de la siembra. F. de V. GL SC CM FC FT Tratamientos t-1 4 307.1948 76.7987 287.947134 (2.57 - 3.77) Error (t)(r-1) 45 12.002 0.266711111
Total rt-1 49 319.1968
** Altamente significativo X=9.58 mm R 2 =96,24% C.V= 5,43% Grfico N14: Prueba de Duncan al 0.01% para deter minar la altura de plntulas en mm de Cattleya maxima a 24 semanas despus de la siembra.
Cuadro N27: Anlisis de varianza para determinar la altura de plntulas en mm de Oncidium lanceanum en fase de a b e d cd enraizamiento y desarrollo a 24 semanas despus de la siembra.
F. de V. GL SC CM FC FT Tratamientos t-1 4 2435.941 608.9852 371.811058 (2.55 - 3.77) Error (t)(r-1) 45 73.705 1.637888889
Total rt-1 49 2509.646
** Altamente significativo X=18.67 mm R 2 =97,10% C.V= 6,9%
Grfico N15: Prueba de Duncan al 0.01% para deter minar la altura de plntulas en mm de Oncidium lanceanum a 24 semanas despus de la siembra.
5.3.3. Nmero de races.
Cuadro N28: Anlisis de varianza para determinar el nmero de races del Cattleya maxima en fase de a b c d e enraizamiento y desarrollo a 24 semanas despus de la siembra. F. de V. GL SC CM FC FT(0.01-0.05) Tratamientos t-1 4 7.92 1.98 10.011236 2.56-3.77 Error (t)(r-1) 45 8.9 0.197777778 Total rt-1 49 16.82 ** Altamente significativo X = 1,94 R 2 =47,08% C.V= 22,92%
Grfico N16: Prueba de Duncan para determinar el nmero de races de Cattleya maxima a 24 semanas despus de la siembra.
Cuadro N29: Anlisis de varianza para determinar el nmero de races del Oncidium lanceanum en fase de enraizamiento y desarrollo a 24 semanas despus de la siembra. F. de V. GL SC CM FC FT(0.01-0.05) a a ab bc c Tratamientos t-1 4 13.52 3.38 15.0594059 2.56-3.77 Error (t)(r-1) 45 10.1 0.224444444 Total rt-1 49 23.62 ** Altamente significativo X = 2,26% R 2 =57,23% C.V= 20,96%
Grfico N17: Prueba de Duncan para determinar el nmero de races de Oncidium lanceanum a 24 semanas despus de la siembra.
a a ab b c VI. DISCUSIN
6.1. Viabilidad 6.1.1 Para Cattleya sp. El cuadro N12, nos muestra los resultados de la prueba de viabilidad de las semillas de Cattleya sp. antes de la siembra, registrando un 74,36% promedio de semillas viables, de un total de 245,8 semillas evaluadas, en medio de germinacin, esta prueba se realiz por medio del microscopio, para saber si las semillas eran viables o no, tambin para determinar si las semillas estn en buen estado y libre de agentes contaminantes, lo cual afectara al medio de cultivo y prdida de mano de obra.
6.1.2 Para Oncidium lanceanum. El cuadro N 13, muestra de manera clara los resultados de la prueba de viabilidad para las semillas de Oncidium lanceanum antes del momento de la siembra, registrando un 74,61% en promedio para las semillas viables, de un total de 248,8 semillas evaluadas, al igual que para Cattleya sp. en este caso se sigui los mismos procedimientos para la evaluacin de este parmetro.
Esto conforme lo realizado por RODRGUEZ 1996, en donde menciona que para determinar la viabilidad de las semillas de Phragmipedium kovachii, se puede realizar por medio del microscopio electrnico, donde se observar las semillas a simple vista, y se reconoce las viables o las no viables.
Existe otro mtodo como es el 2, 3, 5 trifenil tretazolium (TTZ) al 1%, donde se coloca una pequea muestra de semillas ms una pequea cantidad del TTZ, por un periodo de 24 a 72 horas, luego se extrae y se lo coloca en una placa petri, y se puede distinguir las semillas viables y no viables, esto conforme lo mencionado por LEN (1995).
6.2. Porcentaje de contaminacin Los cuadros N14 y 15, de 2 semanas de sembradas l as semillas del Cattleya sp. y Oncidium lanceanum, no se encontr contaminacin por ningn tipo de microorganismos, esto debido al buen trabajo realizado en la cmara de flujo laminar, cabe mencionar tambin que la tcnica de desinfeccin de las semillas utilizado para este trabajo ha sido buena y bien empleada, dado a que las botellas de wisky contenidas con medio de cultivo y semillas de las especies antes mencionadas se mantuvieron sin contaminarse hasta el momento de la transferencia a un medio de cultivo de desarrollo.
Conforme lo indicado por DONAYRE 2000, indica que el material a sembrar pueda tener presencia de algn patgeno que pueda afectar el desarrollo y germinacin de las semillas, para el cual es necesario utilizar algn desinfectante que pueda disminuir la contaminacin, por ejemplo el hipoclorito de sodio o de calcio, agua oxigenada (peroxido de hidrogeno) y alcoholes, en concentraciones mininas (0.1 0.5%).
Referente a lo que son desinfectantes utilizado por ARDITTI 1999, sugiere que tambin podemos utilizar un agente que rompa la tensin superficial con la semillas (Tween 20) y que acta esterilizando y desinfectndolo completamente y as permitiremos que las semillas al sembrarlas no puedan contaminarse.
6.3. Porcentaje de germinacin. 6.3.1 Para Cattleya sp. El cuadro N16 y el grfico N 04, representan el anlisis de varianza y la prueba de Duncan respectivamente respecto al porcentaje de germinacin de Cattleya sp., con valores para el C. V. con 3,26% y un R 2 con 54,32%, para el caso del C. V. corrobora la confiabilidad de los resultados obtenidos, en el caso del R 2 muestra que el diseo no se ajusta para la evaluacin de este parmetro. En el grfico N 04 se observa el resultado de la prueba de Duncan con respecto al porcentaje de germinacin con resultados de T 0 con 72,63%, T 1 con 71,38%, T 2 con 72,5%, T 3 con 75,27% y T 4 con 77,91%, esto nos indica que el medio de cultivo con pltano tiene un mejor resultado para germinar semillas de Cattleya sp.
6.3.2 Para Oncidium lanceanum. El cuadro N17 representa el anlisis de varianza respecto al porcentaje de germinacin de Oncidium lanceanum, con valores para el C. V. con 3,78% y un R 2 con 42,46%, para el caso del C. V. corrobora la confiabilidad de los resultados obtenidos, en el caso del R 2 muestra que el diseo al igual que para Cattleya sp., no se ajusta para la evaluacin de este parmetro. En el grfico N 05 se observa el resultado de la prueba de Duncan con respecto al porcentaje de germinacin con resultados de T 0 con 71,23%, T 1 con 74,60%, T 2 con 74,97%, T 3 con 76,36% y T 4 con 77,74%, esto corrobora la informacin obtenida con Cattleya sp., lo que muestra que el medio de cultivo con pltano es adecuado para la germinacin in Vitro de orqudeas Cattleya sp. y Oncidium lanceanum.
La razn de este resultado fue que el embrin de la semilla comenz a romper la testa, debido a que el medio de cultivo influyo en la germinacin absorbiendo el embrin los nutrientes que contena (sales, vitaminas, reguladores, sustancias orgnicas, etc). Otros factores que ayudaron a la germinacin fueron la alta humedad en el medio de cultivo, la temperatura y la luz (fotoperiodo 16/8) controlada por un timer.
Este resultado concuerda con lo planteado para el proceso de propagacin in Vitro de Cattleya spp. y Psychopsis versteegianum, por LEN 1995, donde menciona que las semillas de estas especies tienen mejor germinacin bajo condiciones in Vitro, y que pueden germinar en un perodo de 30 das en buena cantidad y uniforme, gracias al medio de cultivo empleado, como tambin el manejo brindado a la semilla para que germinen como las condiciones ambientales, una buena desinfeccin evitando as perdidas de semillas por contaminacin.
6.4. Rompimiento de testa. En los cuadros N 18 y 19, muestran los resultados de las evaluacin del das al rompimiento de la testa, donde se puede apreciar que para el caso del tratamiento T 4 a los 14 das se tuvo el mayor nmero de semillas rompiendo la testa, seguido del tratamiento T 3 , a diferencia que en el tratamiento T 0 , se observa el mayor nmero de semillas que rompieron la testa est a los 28 das despus de la siembra, la razn es porque la testa al ser una estructura reticulada que cubre al embrin y compuesta por clulas indiferenciadas con cuerpos lipidito, protenas, al entrar en contacto con el medio de cultivo, comienzo a desarrollarse y activarse para poder realizar el rompimiento, posteriormente formar protocormo y luego plntula. El hecho de romper la testa en menos tiempo indica que el proceso de germinacin y aparicin del protocormo ser en menos tiempo, lo que implica un aceleramiento del proceso de germinacin.
Este resultado tiene relacin con lo afirmado por PIERIK 1989, cuando menciona que el proceso de rompimiento de testa es rpido y se da por las condiciones ambientales brindadas a la semilla (temperatura, fotoperiodo 18/6, humedad relativa, etc) y al medio de cultivo, donde las semillas al entrar en contacto con el medio reaccionan instintivamente y comienzan a desarrollarse.
6.5. Color verde y verde transparente. Los cuadros N 20 y 21, muestran al cabo de 75 das despus de la siembra de semillas de Cattleya sp. y Oncidium lanceanum en el medio de cultivo para germinacin, se obtuvo en promedio los siguientes resultados: T 0 con 13,6 y 15,2; T 1 con 14,4 y 13,2; T 2 con 29,2 y 13,8; T 3 con 34,4 y 19,4 y T 4 con 32 y 17,2; estos valores representan a los protocormos que sufrieron el problema de vitrificacin (color verde transparente), esto es debido al tiempo transcurrido en el medio de cultivo, se observ que el proceso de vitrificacin es producto de la competencia y el agotamiento de los nutrientes del medio de cultivo, lo que implica que hay que realizar el cambio del medio de cultivo en menos tiempo (cada 30 das).
6.6. Color verde y marrn. En los cuadros N22 y 23, podemos observar que al cabo de 90 das despus de la siembra de las semillas de Cattleya sp. y Oncidium lanceanum en el medio de germinacin, se tuvo los promedios siguientes: T 0 con 6,6 y 10,4; T 1 con 6 y 4,2; T 2 con 6,2 y 4; T 3 con 5,4 y 3 y T 4 con 4,4 y 1,2; estos valores representan a los protocormos que estaban sufrieron problema de fenolizacin o muerte (color marrn), al igual que para vitrificacin este problema aparece debido al tiempo transcurrido antes del repique, ya que es necesario el reemplazo cada cierto tiempo (30 das), como tambin la cantidad de protocormos y fueron eliminando sustancias como fenoles y anhdrido carbnico, contaminando el medio de cultivo, creo que es necesario la adiccin de una dosis ms de carbn vegetal o activado, como tambin adicionar una dosis de antioxidantes como cido ctrico o cido ascrbico para as neutralizar algunas sustancias que pudieran ser excretadas por los protocormos, porque sufren estragos y decoloracin.
Referente a lo que es repique tanto para el tem 6.5 y 6.6; indica RODRGUEZ 1999, que es necesario realizar repique cada 30 das, para evitar fenolizaciones, porque sabemos que algunas especies contienen sustancias endgenas que exudan de la superficie cortados al medio de cultivo, el cual se puede evitar utilizando antioxidante, adems si la humedad relativa es muy baja, durante el periodo de cultivo se puede presentar deshidratacin del medio y aumentar la salinidad.
As mismo para lo que es repique (tem 6.5 y 6.6), menciona DONAYRE 2000, que consiste en separar los protocormos que se encuentra en un medio inicial y transferirlos en diferentes frascos a un nuevo medio de cultivo, repitiendo la operacin cada 4 semanas como mximo. Tambin se indica que los protocormos deben ser transferidos cada 30 das como mximo de un medio a otro, antes de sufrir hiperhidricidad o fenolizacin, esto conforme lo mencionado por DELGADO 2001
6.7. Nmero de hojas en fase de desarrollo y enraizamiento. 6.7.1 Para Cattleya sp. El cuadro N24, representa el anlisis de varianza respecto al nmero de hojas en la fase de desarrollo y enraizamiento de Cattleya sp., con valores para el C. V. con 6,2% y un R 2 con 86,72%, los mismos que corroboran la confiabilidad de los resultados obtenidos durante la investigacin y la alta determinacin entre la variable evaluada y los tratamientos en estudio. En el grfico N 12 se observa el resultado de la prueba de Duncan con respecto al nmero de hojas en la etapa de desarrollo, en el factor medio de cultivo se observa que no existe diferencia estadstica entre los tratamientos T 0
con 4, T 1 con 4, T 3 con 4 y T 4 con 4; la diferencia estadstica radica entre los tratamientos mencionados y el tratamiento T 2 con 2,6, los mismos que lo superan, quienes provocaron la mayor formacin de hojas promedios en las plntulas por tratamientos esto nos indica que el medio de cultivo con pltano tiene un mejor resultado para germinar semillas de Cattleya sp.
6.7.2 Para Oncidium lanceanum. El cuadro N25 representa el anlisis de varianza respecto al nmero de hojas en la etapa de desarrollo y enraizamiento de Oncidium lanceanum, con valores para el C. V. con 11,66% y un R 2 con 76,72%, los mismos que corroboran la confiabilidad de los resultados obtenidos durante la investigacin y la alta determinacin entre la variable evaluada y los tratamientos en estudio. En el grfico N 13 se observa el resultado de la prueba de Duncan con respecto al nmero de hojas en la etapa de desarrollo, en el factor medio de cultivo se observa diferencia estadstica en T 0 y T 4 , ambos con 4,5; superan a T 3 con 4,3; que supera a T 1 con 4; que supera a T 2 con 2,4, esto corrobora la informacin obtenida con Cattleya sp., lo que muestra que el medio de cultivo con pltano es adecuado para el desarrollo de plntulas de orqudeas Cattleya sp. y Oncidium lanceanum.
De la interaccin de los medios de cultivos con respecto al nmero de hojas en fase de desarrollo, respondieron mejor las botellas con medio de cultivo M&S (T 0 ) y el medio de cultivo con pltano (T 4 ), a ambos agregados agua de coco, las botellas que con medio de cultivo con coco desproteinizado y agua de coco (T 2 ) fue el que form menor nmero de hojas y las plntulas se tornaron color amarillo y truncaron sus desarrollo, esto debido a la falta de nutrientes en el medio y debido a las fitohormonas que se encuentran en el agua de coco, durante esta fase. ESPINOZA 2001, menciona que el agua de coco contiene fitohormonas (auxinas, citoquininas y giberelinas) que ayudan a un mejor desarrollo de las plntulas, siempre y cuando las concentraciones deben estar estandarizadas, para evitar problemas durante su desarrollo.
6.8. Altura de plntula en fase de desarrollo. 6.8.1 Para Cattleya sp. El cuadro N26, representa el anlisis de varianza respecto al nmero a la altura de plntulas en la fase de desarrollo y enraizamiento de Cattleya sp., con valores para el C. V. con 5,43% y un R 2 con 96,24%, los mismos que corroboran la confiabilidad de los resultados obtenidos durante la investigacin y la alta determinacin entre la variable evaluada y los tratamientos en estudio. En el grfico N 14 se observa el resultado de la prueba de Duncan con respecto a la altura de plntulas en la etapa de desarrollo, en el factor medio de cultivo se observa que existe diferencia estadstica entre los tratamientos T 4 con 12 mm, supera a los tratamientos T 3 con 11 mm, que supera a T 1 con 10,2 mm; que supera a T 0 con 9,6 mm; el mismo que supera a T 2 con 4,8 mm, estos valores indican que las plntulas de Cattleya sp. se desarrollan mejor en un medio de cultivo con la adicin de agua de coco y pltano. 6.8.2 Para Oncidium lanceanum. El cuadro N27 muestra el anlisis de varianza respecto a la altura de plntulas en la etapa de desarrollo y enraizamiento de Oncidium lanceanum, con valores para el C. V. con 6,9% y un R 2 con 97,10%, los mismos que corroboran la confiabilidad de los resultados obtenidos durante la investigacin y la alta determinacin entre la variable evaluada y los tratamientos en estudio. En el grfico N 15 se observa el resultado de la prueba de Duncan con respecto a la altura de plntulas expresados en mm en la etapa de desarrollo, en el factor medio de cultivo se observa diferencia estadstica en T 4 con 28,3 mm, supera a los tratamientos T 3 con 23,9 mm, que supera a T 1 con 17,8 mm; que supera a T 0 con 15,2 mm; el mismo que supera a T 2 con 8,2 mm, esto corrobora la informacin obtenida con Cattleya sp., lo que muestra que el medio de cultivo con pltano y agua de coco es adecuado para el desarrollo de plntulas de orqudeas Cattleya sp. y Oncidium lanceanum.
ESPINOZA 2001, menciona que el agua de coco contiene fitohormonas que ayudan a un mejor desarrollo de las plntulas, siempre y cuando las concentraciones son variadas y que ayuden al desarrollo de las mismas.
6.9. Nmero de races. 6.9.1 Para Cattleya sp. El cuadro N28, representa el anlisis de varianza respecto al nmero de races en la fase de desarrollo y enraizamiento de Cattleya sp., con valores para el C. V. con 22,92% y un R 2 con 47,08%, estos dados nos indican que el diseo no se ajusta para evaluar estos parmetros. El grfico N 16 muestra el resultado de la prueba de Duncan con respecto al nmero de races en la etapa de desarrollo, en el factor medio de cultivo se observa que existe mnima diferencia entre los tratamientos T 4 con 2,5; supera a los tratamientos T 3 con 2,2; que supera a T 1 con 2; que supera a T 0 con 1,6; el mismo que supera a T 2 con 1,4; donde T 4 obtuvo el mayor nmero de races; esto nos indica que el medio de cultivo con pltano y agua de coco tiene un mejor resultado para el desarrollo y enraizamiento de plntulas de Cattleya sp.
6.9.2 Para Oncidium lanceanum. El cuadro N29 representa el anlisis de varianza respecto al nmero de races en la etapa de desarrollo y enraizamiento de Oncidium lanceanum, con valores para el C. V. con 20,96% y un R 2 con 57,25%, estos datos muestran que el diseo no se ajusta para la evaluacin de ste parmetro de la investigacin. En el grfico N 17 se observa el resultado de la prueba de Duncan con respecto al nmero de races en la etapa de desarrollo y enraizamiento, en el factor medio de cultivo se observa una mnima diferencia entre los tratamientos T 4 con 2,9; supera a los tratamientos T 3 con 2,6; que supera a T 1 con 2,4; que supera a T 0 con 2; el mismo que supera a T 2 con 1,4; esto corrobora la informacin obtenida con Cattleya sp., lo que muestra que el medio de cultivo con pltano y agua de coco es adecuado para el desarrollo y enraizamiento de plntulas de orqudeas Cattleya sp. y Oncidium lanceanum.
El medio que obtuvo buen desarrollo fue el T 4 tanto para Cattleya sp. y Oncidium lanceanum ya que contena en su composicin pltano y agua de coco (que contiene fitohormonas). Segn en lo referente a auxinas, ARDITTI 1990, menciona que las plntulas responde a los cambios de medio y la composicin que contengan, como el caso de auxinas que acta directamente en la formacin de races , as como las condiciones ambientales controladas (temperatura, luz y humedad relativa, fotoperiodo 16/8). Se menciona tambin que para la fase de enraizamiento, se utiliza las mismas sales M&S, omitindose las citoquininas (BA). Complementado con 1.5 gr/l de carbn activado, 20 gr/l de sacarosa y agregando auxinas (ANA) mencionado por AVECES (2000).
ESPINOZA 2001, menciona que el agua de coco contiene fitohormonas que ayudan a un mejor desarrollo de las plntulas, siempre y cuando las concentraciones son variadas y que ayuden al desarrollo y a la formacin de races de las mismas.
6.10. Costos 6.10.1 Costos de los medios de cultivos para germinacin. Los cuadros N 12, 13, 14, 15 y 16 muestran los costos de los diferentes medios de cultivo, los mismos que representan los tratamientos del trabajo de investigacin, en donde podemos comparar los costos que van con los siguientes precios: T 0 con S/. 17,84 el litro de medio de cultivo, T 1 con S/. 14,89 el litro, T 2 con S/. 13,1 el litro, T 3 con S/. 14,03 el litro y T 4 con S/. 14,96 el litro, como se puede observar en los cuadros de varianza y en los grficos de las pruebas de Duncan los mejores resultados obtenidos en la investigacin corresponden a los tratamientos T 0 , T 3 y T 4 si realizamos una observacin minuciosa el T 0 (Testigo), nos resulta ms costoso que el tratamiento T 3 y T 4 , en este caso el tratamiento que mayor resultado dio fue el T 4 que mantiene una diferencia de dos y 88/100 nuevos soles (S/. 2,88), lo que implica un ahorro de este monto para el productor, esto solo para un litro de medio de cultivo, si lo vemos desde el punto de vida de produccin entonces estamos hablando de 50 litros de medio de cultivo a ms, por lo que se tendra un ahorro de S/. 144,00 a ms.
6.10.2 Costos de los medios de cultivos para desarrollo y enraizamiento. En los cuadros N 12, 13, 14, 15 y 16 se muestran los costos de los diferentes medios de cultivo (Tratamientos), como se puede observar los costos van desde T 0 con S/. 17,96 el litro de medio de cultivo, T 1
con S/. 14,03 el litro, T 2 con S/. 12,29 el litro, T 3 con S/. 12,22 el litro y T 4 con S/. 14,12 el litro, los cuadros de varianza y los grficos de las pruebas de Duncan muestran que los mejores resultados obtenidos en la investigacin corresponden a los tratamientos T 0 , T 3 y T 4 esto indica que el T 0 (Testigo), nos resulta ms costoso que el tratamiento T 3 y T 4 , en este caso el tratamiento que mayor resultado dio fue el T 4 que mantiene una diferencia de tres y 84/100 nuevos soles (S/. 3,84), lo que implica un ahorro de este monto para el productor, esto solo para un litro de medio de cultivo, si lo vemos desde el punto de vida de produccin entonces estamos hablando de 50 litros de medio de cultivo a ms, por lo que se tendra un ahorro de S/. 192,00 a ms.
6.10.3 Costos de produccin de una planta in Vitro. En los tems anteriores se muestran solo los costos de los medios de cultivo, si a stos los agregamos el costo de la energa consumida por la cmara de flujo laminar y la energa consumida por los fluorescentes usados para la incubacin de las semillas hasta sus completo desarrollo (plantas listas para la aclimatacin), que corresponde un promedio de 9 meses entonces, y al mismos tiempo le adicionamos la cantidad de medios litros de medios de cultivo utilizado hasta esta etapa entonces tenemos los costos de produccin de una planta in Vitro, en el cuadro N 31 del anexo se muestran los costos que comprende para las plantas producidas con el T 0 = S/. 0,50; T 1 = S/. 0,44; T 2 = S/. 0,39; T 3
= S/. 0,43 y T 4 = S/. 0,40; como se puede observar los tratamiento T 2 y T 4 muestran el menor costo de produccin, pero si revisamos los cuadros de anlisis de varianza y los grficos de las pruebas de Duncan nos damos cuenta que el tratamiento T 2 no muestra diferencia significativa, pero el tratamiento T 4 si lo que indica que producir plantas in Vitro utilizando este medio de cultivo resulta ms rentable para el productor, esto si lo observamos desde el punto de vista de produccin (A gran escala).
VII. CONCLUSIONES
7.1. El protocolo establecido durante el proceso de propagacin in Vitro de las especies Cattleya spp. y Oncidium lanceanum, permiti la germinacin de las semillas, formacin de protocormos, desarrollo y enraizamiento de las plntulas.
7.2. Se encontraron diferencias significativas entre los medios de cultivo T 4 (con la adicin de pltano seda), T 3 (con la adicin de endospermo lquido de coco), T 2 (solo con coco desproteinizado), T 1 (solo con fertilizante) y el medio de cultivo M & S (T 0 ) modificado para la germinacin de semillas de las especies Cattleya spp. y Oncidium lanceanum. Siendo el ms adecuado el medio T 4 .
7.3. La utilizacin de sustancias orgnicas complejas como el pltano seda homogeneizado (40 g/l) y endosperma lquido de coco (100 ml/l), en la composicin de los medios, promueven una rpida diferenciacin de los protocormos y el desarrollo vegetativo y radicular de las plntulas.
7.4. En la etapa de desarrollo y enraizamiento, en lo referente a nmero de hojas y altura de plntula de Cattleya sp. y Oncidium lanceanum, el tratamiento que nos dio buenos resultados fue el T 4 con resultado de 4 y 12 mm respectivamente para Cattleya spp., para Oncidium lanceanum 4,5 y 28,3 mm respectivamente; esto a 24 semanas despus de la siembra.
7.5. En la etapa de desarrollo y enraizamiento, en lo referente a nmero de races de Cattleya sp. y Oncidium lanceanum, el tratamiento que nos dio buenos resultados fue el T 4 con 2,5 races en promedio para Cattleya maxima y 2,9 para Oncidium lanceanum, esto a 24 semanas despus de la siembra.
VIII. RECOMENDACIONES
8.1. Emplear herramientas apropiadas para la siembra el cultivo in Vitro de orqudeas (Cattleya sp. y Oncidium lanceanum) en botellas de wisky, para evitar contaminacin.
8.2. Utilizar para la produccin masiva de orqudeas de las especies Cattleya sp. y Oncidium lanceanum el medio de cultivo con la adicin de sustancias orgnicas complejas como el pltano seda homogenizado y el endospermo lquido de coco (Tratamiento T 4 ).
8.3. Realizar ensayos de propagacin in Vitro de otras especies de orqudeas utilizando el medio de cultivo casero con la adicin de sustancias orgnicas complejas como el pltano seda homogenizado y el endospermo lquido de coco (Tratamiento T 4 ).
8.4. Evaluar posteriormente otros agentes gelidificantes que remplacen al agar agar utilizado para el presente trabajo de investigacin, de esta manera se estar abaratando ms los costos de la produccin de plantas utilizando el cultivo in Vitro.
8.5. Continuar con diferentes trabajos de investigacin en especies de orqudeas en peligro de extincin utilizando el medio de cultivo con pltano seda homogenizado y endospermo lquido de coco (Tratamiento T 4 ).
8.6. El LCTV de la Universidad Nacional de San Martn Tarapoto, debe empezar a producir orqudeas con miras a la produccin utilizando el medio de cultivo con pltano seda homogenizado y endospermo lquido de coco (Tratamiento T 4 ). IX. RESUMEN
El presente trabajo de investigacin se realiz en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Universidad Nacional de San Martn - Tarapoto, con el objetivo de evaluar la eficiencia de cinco medios de cultivo in Vitro para germinacin, desarrollo y enraizamiento en Cattleya sp. y Oncidium lanceanum a partir de semillas, para plntulas libres de patgenos y se adecu un diseo completamente al azar, 5 x 10 (medios de cultivo) y 10 repeticiones.
Las semillas en un promedio de 30 das despus de la siembra en un medio de germinacin, comenzaron a germinar y empezar su desarrollo y formacin de protocormos, observando un nivel muy bajo de contaminacin luego de 2 semanas, esto debido a la asepsia que se manej al momento de la introduccin de semillas a condiciones in Vitro y en todo momento durante el repique y transferencia de las plntulas de una medio de germinacin a uno de desarrollo y enraizamiento.
A 24 semanas despus de la siembra en medio de desarrollo y enraizamiento (Fase II), las plntulas mostraron un resultado promedio de 4 hojas para Cattleya sp. y 4,5 hojas para Oncidium lanceanum, con una altura en mm de 12,0 para Cattleya sp. y 28,3 para Oncidium lanceanum; 2,5 races para Cattleya sp. y 2,9 races para Oncidium lanceanum, estos datos solo para el tratamiento T 4 , que demostr mayor eficiencia en todo el proceso de propagacin in Vitro de las especies mencionadas.
Se muestra el costo de cada medio de cultivo empleado para el trabajo de investigacin, los mismos que representan los cinco tratamientos, al mismos tiempo se determin el costo de produccin de una planta producida en condiciones in Vitro, con estos datos se muestran que los costos de produccin del cultivo in Vitro de especies de orqudeas no es tan costoso puesto que con el presente trabajo de investigacin se demostr que los costos de produccin se puede minimizar utilizando el medio de cultivo con pltano seda homogenizado y endospermo lquido de coco (Tratamiento T 4 ).
SUMMARY
Present fact-finding work came true in Cultivations Laboratory of Woven Vegetables of National University San Martin - Tarapoto, for the sake of evaluating the five means efficiency of cultivation in Vitro in order to germination, I develop and enraizamiento in Cattleya sp. and Oncidium lanceanum starting from nuts, in order to free seedlings of pathogenic and a design was made suitable completely at random, 5 x 10 (cultivation means) and 10 repetitions.
The nuts in a 30- days average after the planting in a germination midway, they began to germinate and beginning his development and protocorms formation, observing a very low contamination level right after 2 weeks, this due to the asepsis that in Vitro was driven in a minute of the nuts introduction to conditions and all the times during the ringing and one seedlings transference halfway of germination of one accord of development and enraizamiento.
They pointed out a worked out 4 leaves average in order to Cattleya sp. and 4,5 to 24 weeks after the planting in between development and enraizamiento (Phase II), the seedlings leaves in order to Oncidium lanceanum, with a height in mm of 12,0 in order to Cattleya sp. and 28,3 in order to Oncidium lanceanum; 2,5 roots in order to Cattleya sp. and 2,9 roots in order to Oncidium lanceanum, these data alone prop the treatment T 4 , that principal demonstrated efficiency in all the propagation process sorts mentioned in Vitro.
He shows the cost out of every midway of cultivation once was used in order to the fact finding work, the same ones that they represent five treatments, at the same time the production cost of a manufactured plant in conditions determined in Vitro, with these data itself species in Vitro of orchids show up than the production costs of the cultivation he is not so difficult once was put than it was demonstrated that it happens to me that the production costs can be minimized with the present fact finding work utilizing the cultivation midway with banana silk homogenizado and liquid coconut endosperm (Treatment T 4 ).
X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. ACEVES R. J.L. 2000. Propagacin comercial de plantas ornamentales por cultivo in Vitro de tejidos vegetales para beneficio social de la comunidad. Veracruz Mxico.
2. ARDITTI, J. 1967. Factors Affecting the Germination of Orchid Seeds. Bot. Rev. 33, 1-97.
3. ARDITTI J. 1977. Clonal Propagation of Orchids by Means of Tissue Culture _ A Manual. Pag. 203 293. En : Arditti (editor) Orchid Biology: reviews and Perspectives Vol. I Croneli University Press. Ithaca, New York.
4. ARDITTI, J. 1 982. Orchid sedd germination and seedling culture A. Manual. En J.
5. ARDITTI, J. 1 984. An History of Orchid Hibridation, Seed Germination and Tissue Culture. Bot. J. Linn. Soc. 89 New York. Pp: 359 381.
6. ARDITTI, J. 1 990. Lewis Knudson: His Science, His times and his legacy. Lindleyana. 5 Pp 1 79.
7. ARDITTI J. 1 993. Micropropagation of orchids. J. Wiley & Sons Inc. New York. Pp 520 521.
7. CALZADA B. 1982. Mtodos Estadsticos para la Investigacin. Editorial Milagros S. A. Lima Per 644p
8. DELGADO H., 2001. Propagacin in vitro de pltano, pia, y orqudeas en el Laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales de la UNSM Informe de prcticas Pre Profesionales. Facultad de Ciencias Agrarias de la UNSM
9. DONAYRE T. A. 2000. Mtodos en la Propagacin de semillas de orqudea Laboratorio de Recursos Genticos y Biotecnologa. UNMSM. Lima Per.
10. ESPINOZA G. A. 2 001. Proliferacin de rhynchostele bictoniense (orchidaceae) a partir de semillas y explantes de material cultivado in Vitro. Universidad Nacional Autnoma de Mxico Laboratorio de Cultivo de Tejido vegetales.
11. HOLDRIDGE, L. R. 1 978. Ecologa Basada en zonas de vida. IICA. San Jos Costa Rica. 216 p.
12. KHALIFAH R. 1966b. Giberelin-like substances from the developing banana fruit. Plant. Phys. 41, 771-773. 13. LEON, M. 1 995. Tesis Conservacin de Especies Peruanas de Orqudeas Utilizando Tcnicas de Cultivo de Tejidos In Vitro. UNALM. Pp 14 15.
14. MACHADO, D. 2003. Orqudeas. Manual prctico de reproduccin. Editorial Expresso e Cultura.
15. OSPINA, M. 1968. "La desaparicin de valiosas orqudeas nativas de Amrica Latina". Orquideologa, Vol.III, Nro.2. Colombia. Pag: 29-38.
16. PIERIK R. L. M. 1 989. Cultivo in Vitro de las plantas superiores.
17. PRTCHAR H. W. 1 989. Modern methods in orchid conservation the role of physiology, ecology and management. University of Cambridge the pitt Building. New York USA.
18. ROCA, W y L. MROGINSKI 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Pp. 499 - 553 554.
19 RUZ R., 2003. Micropropagacin y determinacin cromosmica del gnero Crotn productoras de ltex.
20. SELENA L. A. 1 999. Propagacin in Vitro de orqudeas a partir de semilla sexual. Universidad de Caldas A. A. Manizales - Colombia
21. SNOW, R. 1985. Improvements in Methods for The Germination of Orchid Seeds. AOS. Bull. Vol: 54 Nro.2, Pag: 179-182.
22. STEWARD F. C. and N. W. SIMMONDS 1954. Growth Promoting Substances in the Ovary and Inmature Fruit of the Banana. Nature 173, 1083-1084.
23. VALMAYOR, H. 1972. Further Investigation into Nutrient Media. Proc. 7th World Orchid Conf. Colombia 211-229.
24. WEATHERHEAD and G. HENSHAW, 1979. Effects of Activated Charcoal as an Additive to Plant tissue Culture Media: Part 2. Z. Pflanzenphysiol. 89: 399-405
25. YAM, T.; R. ERNST; J. ARDITTI; H. NAIR and M. WEATHERHEAD. 1990. Charcoal in Orchid Seed Germination and Seedling Culture. Lindleyana 5 (4), 256-265.
XI. ANEXOS
Cuadro N30: Anlisis de costos totales de los med ios de cultivos. costo de medios de cultivo y E Cantidad precio unitario Sub total Medio germinacin T0 2 17.8398202 35.6796404 Medio germinacin T1 1 14.87538 14.87538 Medio germinacin T2 1 13.09805 13.09805 Medio germinacin T3 1 14.03038 14.03038 Medio germinacin T4 1 14.9613719 14.9613719 Medio desarrollo T0 2 17.9648202 35.9296404 Medio desarrollo T1 2 14.03038 28.06076 Medio desarrollo T2 1 12.2887643 12.2887643 Medio desarrollo T3 2 12.34038 24.68076 Medio desarrollo T4 1 14.1163719 14.1163719 subtotal 207.721119 E consumida por la cmara de flujo Cantidad precio unitario Sub total Medio germinacin T0 2 2.52 5.04 Medio germinacin T1 1 2.52 2.52 Medio germinacin T2 1 2.52 2.52 Medio germinacin T3 1 2.52 2.52 Medio germinacin T4 1 2.52 2.52 Medio desarrollo T0 2 4.536 9.072 Medio desarrollo T1 2 4.536 9.072 Medio desarrollo T2 1 4.536 4.536 Medio desarrollo T3 2 4.536 9.072 Medio desarrollo T4 1 4.536 4.536 subtotal 51.408 E consumida en incubacin meses precio/mes Sub total E consumida por 2 fluorescentes al mes 9 17.28 155.52 Total de costo de produccin/tratamiento Total Tratamiento T0 241.241281 Tratamiento T1 210.04814 Tratamiento T2 187.962814 Tratamiento T3 205.82314 Tratamiento T4 191.653744
Cuadro N 31: Costos de produccin de una planta producida in Vitro. tratamiento N botellas N plantas costo/planta T0 10 48 0.502586 T1 10 48 0.43760029 T2 10 48 0.3915892 T3 10 48 0.42879821 T4 10 48 0.39927863
Figura N28: Fertilizante utilizado para la prepar acin de los medios de cultivo.
Figura N 29: Complejo B+Zn, usado como fuente vitamnica de los medios de cultivo
Figura N 30: Licuadora utilizado para el homogenizado de pltano seda.
Figura N 31: Botellas de wisky usadas para el trabajo de investigacin. Figura N 32:
Figura N 32: Diferencia entre los tratamiento en la primera fase.
Figuras N 33: Desarrollo de plntulas en los tratamientos T 1 y T 2 .
T 4 T 0 T 1 T 2 T 3 Figura 33 a: Desarrollo de plntulas de Cattleya maxima en el tratamiento T 2 Figura 33 b: Desarrollo de plntulas de Cattleya maxima en el tratamiento T 1 Figuras N 34: Primer ensayo para la segunda fase en T 4 con Cattleya rex y Phalaenopsis sp.
Figura N 35: Incubacin de las semillas sembradas en los medios de cultivos.
Figuras N 36: Flor de Cattleya rex y Cattleya maxima.
Figura N 34 a: Cattleya rex en medio de cultivo de desarrollo T4 Figura N 34 b: Phalaenopsis sp. en medio de cultivo de desarrollo T4
Figura N 37: Flor de Oncidium lanceanum. GLOSARIO
ANA cido naftalacetico
AUXNA Hormona vegetal que ocasiona el crecimiento de las plantas por elongacin celular.
CPSULA Fruto seco, con una o ms cavidades que contienen varias semillas y cuya dehiscencia se efectan segn el plano que no es perpendicular al eje del fruto.
CITOQUININA Grupo de reguladores de crecimiento que induce a la formacin de yemas y multiplicacin celular.
DEHISCENCIA Accin de abrirse naturalmente las anteras de una flor o el pericarpio de un fruto, para dar salida al polen o a la semilla.
ENRAZAR Agregar, nivelar con agua o solucin.
EMBRIN En las plantas fanergamas, esbozo de la futura planta, contenido en la semilla.
FENOLIZACIN Coloracin marrn del protocormo por muerte a causa de formacin de fenoles en el medio de cultivo.
IN VTRO Cultivo en vidrio
INHIBICIN Componente de los sistemas de regulacin, fisiolgicos, que actan en los seres vivos.
LCTV Laboratorio de Cultivo de tejidos Vegetales
PROTOCORMO Estructura diferenciada formada del desarrollo de las semillas, para luego formarse una plntula en condiciones in Vitro.
SIMBIOSIS Asociacin de individuos animales o vegetales de diferentes especies, sobre todo si los simbiontes sacan provecho de la vida en comn.
STOCK Cantidad de componentes que se tienen en una sola solucin.
TESTA Cubierta externa de la semilla, derivada del tegumento y de consistencia y dureza variables.
TTZ Trifenil tetrazolium
VITRIFICACIN Hacer que algo adquiera las apariencias del vidrio.