PCR em Tempo Real (qRT-PCR)

O termociclador de PCR em Tempo Real (7500 Real Time PCR System Applied Biosystems) um equipamento que deve ser calibrado corretamente, seguindo as instrues do fabricante. As calibraes mensais so: Background e Optical; j as calibraes semestrais so: ROI e Pure Spectra. Todas as etapas a seguir esto descritas para utilizao do kit Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), cujo fluorforo intercalante de DNA.

OTIMIZAO DOS PRIMERS

1) Desenhar os primers para a reao de PCR em Tempo Real utilizando o Primer3 ou Primer Expressv3.0.

2) Fazer 4 mix (um para cada concentrao), o mix para 5 reaes (triplicata + branco + erro). Aps a sntese do par de primers, necessrio determinar a concentrao ideal de uso destes. Fazer alquotas dos primers diludos para 10 M. Para isto, devemos utilizar uma concentrao fixa de cDNA (20 ng) e variar as concentraes de primers nas reaes.

Gradiente da concentrao dos primers: 0,25 M; 0,4 M; 0,5 M e 0,7 M. [primer]= 0,25 M Volume 50 L [primer]= 0,4 M Volume 50 L [primer]= 0,5 M Volume 50 L [primer]= 0,7 M Volume 50 L

Reagente Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) Primer F (10 M) Primer R (10 M) H20 Milli-Q

2,5 L 2,5 L 40 L

4,0 L 4,0 L 37 L

5,0 L 5,0 L 35 L

7,0 L 7,0 L 31 L

3) Pipetar 19 L do mix em um poo da placa de 96 well, esta ser a reao de branco (um branco por mix).

Protocolos Sandro R. Valentini

4) Ao restante do mix, adicionar 4 L de cDNA (referente a 80 ng de RNA total convertido em cDNA), homogeneizar bem, e pipetar na placa de 96 wells as triplicatas da reao (20 L cada). Realizar este procedimento para todos os mix.

5) Selar a placa com adesivo ptico, centrifugar por 1 min/1.000xg/4C. 6) Ligar o computador e o equipamento, colocar a placa no 7500 Real Time PCR System, abrir o 7500 System SDS Software v1.3, programar a placa. Em Instrument colocar volume final 20 L, adicionar Curva de dissociao e iniciar a corrida.

7) Aps o trmino da reao de PCR, analisar a Curva de dissociao para cada par de primers, esta deve ter apenas um pico mostrando a especificidade do par de primers. Na Amplification plot possvel verificar qual a melhor concentrao dos primers a ser utilizada (menor concentrao de primers que gera a mxima amplificao). Caso no seja possvel determinar esta concentrao, ou seja, caso no existam pelo menos duas concentraes de primers que sejam coincidentes com relao mxima amplificao obtida, realizar novamente esta etapa com outras concentraes.

VALIDAO DOS PRIMERS

1) Com a concentrao dos primers fixa, deve-se variar a concentrao de cDNA, afim de determinar os valores de slope e de R2 para calcular a eficincia deste par de primers.

Gradiente da concentrao do cDNA: 100 ng; 50 ng; 25 ng; 12,5 ng e 6,25 ng.

2) Fazer 5 Mix para 5 reaes (triplicata + branco + erro), um para cada concentrao de cDNA: Exemplo para um par de primes com concentrao ideal de 0,25 M:

Protocolos Sandro R. Valentini

Reagente Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) Primer F (10 M) Primer R (10 M) H20 Milli-Q

[primer]= 0,25 M Volume 50 L

2,5 L 2,5 L 40 L

3) Pipetar 19 L do mix em um poo da placa de 96 well, esta ser a reao de branco (um branco para cada um dos 5 mix diferentes).

4) Ao restante do mix, adicionar 4 L de cDNA (nas diferentes concentraes), homogeneizar bem, e pipetar na placa de 96 wells as triplicatas da reao (20 L cada). Realizar este procedimento para todos os mix.

5) Selar a placa com adesivo ptico, centrifugar por 1 min/1.000xg/4C.

6) Ligar o computador e o equipamento, colocar a placa no 7500 Real Time PCR System, abrir o 7500 System SDS Software v1.3, programar a placa. Em Instrument colocar volume final 20 L, adicionar Curva de dissociao e iniciar a corrida.

7) Aps o trmino da reao de PCR, novamente analisar a Curva de dissociao para cada par de primers, a qual deve ter apenas um pico. Verificar na Curva padro de amplificao quais os valores de slope e de R2, podendo ajustar a linha do Ct (manual ou auto). Caso no seja possvel validar o par de primers com este gradiente de concentraes de cDNA, realizar novamente esta etapa com outras concentraes, de maneira que os valores de Ct estejam entre 5 e 25. Calcular a eficincia deste par de primers pela frmula: [Eficincia = 10(-1/slope) 1]. Uma vez que a concentrao ideal dos primers (Otimizao) for determinada, e estes estiverem validados (Validao) no necessrio repetir estas etapas.

Protocolos Sandro R. Valentini

ANLISE POR PCR EM TEMPO REAL

1) O RNA extrado que foi convertido em cDNA dever ser utilizado (vide protocolos Extrao de RNA e Transcrio reversa). Diluir sua amostra para uma quantidade referente a 80 ng de RNA total transcrito reversamente em cDNA. Devemos sempre realizar as reaes com os pares de primers do gene de interesse e do controle endgeno na mesma placa.

2) Mix para 5 reaes (triplicata + branco + erro), exemplo para um par de primes com concentrao ideal de 0,25 M: [primer]= 0,25 M Volume 50 L

Reagente Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) Primer F (10 M) Primer R (10 M) H20 Milli-Q

2,5 L 2,5 L 40 L

3) Pipetar 19 L do mix em um poo da placa de 96 well, esta ser a reao de branco (um branco para cada mix diferente).

4) Ao restante do mix, adicionar 4 L de cDNA (~20 ng/L), homogeneizar bem, e pipetar na placa de 96 wells as triplicatas da reao (20 L cada). Realizar este procedimento para todos os mix.

5) Selar a placa com adesivo ptico, centrifugar por 1 min/1.000xg/4C.

6) Ligar o computador e o equipamento, colocar a placa no 7500 Real Time PCR System, abrir o 7500 System SDS Software v1.3, programar a placa colocando o tipo de anlise desejada. Em Instrument colocar volume final 20 L, adicionar Curva de dissociao e iniciar a corrida.

7) Aps o trmino da reao de PCR, novamente analisar a Curva de dissociao para cada par de primers, a qual deve ter apenas um pico. Realizar a anlise desejada com os dados (valores de Ct) obtidos.

Protocolos Sandro R. Valentini