Contenido

EVALUACIN DEL CURSO PRCTICO ........................................................................... 3 REGLAMENTO DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA APLICADA. .......................................................................................................................................... 5 FORMATO PARA LOS REPORTES DE LAS PRCTICAS ............................................... 7 1 CONTROL DE MICROORGANISMOS............................................................................ 9 2 MUESTREO, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS ........................ 13 3 AISLAMIENTO Y SELECCIN PRIMARIA DE MICROORGANISMOS HALOFILOS .... 21 4 EVALUACIN MICROBIOLGICA DE SUPERFICIES VIVAS E INERTES.................. 24 5 ANLISIS MICROBIOLGICO EN ALIMENTOS (NMERO MS PROBABLE) .......... 29 6 ANLISIS MICROBIOLGICO EN COSMTICOS. ...................................................... 38 7 CONTROL MICROBIOLGICO DE MATERIAS PRIMAS Y PRODUCTOS FARMACUTICOS NO ESTRILES ............................................................................... 46 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO .................................................................... 59 SOLUCIONES ................................................................................................................. 74 PREPARACIN Y DILUCIN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU ANLISIS MICROBIOLGICO ......................................................................................................... 79 CRITERIOS PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA ..................... 84 CLCULO DEL NMP ....................................................................................................... 88 TRATAMIENTO DE RESIDUOS ...................................................................................... 99

Microbiologa Aplicada

M en C. Dante Israel Len de la O. Profesor del curso Enero 2013.

PRCTICAS DE MICROBIOLOGA APLICADA EVALUACIN DEL CURSO PRCTICO Se realizarn tres evaluaciones parciales y un final ordinario. Los cuales se especificar los puntos de evaluacin en el documento de la planeacin de la materia y el encuadre. Dentro de la evaluacin del trabajo prctico se califica lo siguiente: La habilidad individual en el desempeo del trabajo de laboratorio La exposicin del protocolo de la prctica, el cual consiste en exponer el trabajo que se realizar al inicio de la prctica La disciplina del alumno.

El examen ordinario no se promedia con otra evaluacin adicional como en el caso de las evaluaciones parciales.

La calificacin final del laboratorio corresponder al promedio de las tres evaluaciones parciales ms el resultado del examen ordinario.

La asistencia al laboratorio se registrar durante los primeros 10 minutos de inicio de la sesin, si el alumno llega despus de que se pas lista se le permitir la entrada al laboratorio pero no se le quitar la falta. Aquellos alumnos que no cumplan con el 80% de asistencia al laboratorio no tendrn derecho a la calificacin obtenida aunque sea aprobatoria.

Solo se justificarn dos faltas en el curso con comprobante mdico externo a la USB

REGLAMENTO DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA APLICADA. 1. Est prohibido entrar al laboratorio sin portar la bata blanca de manga larga y abotonada. La bata no podr ponerse ni quitarse en el interior del laboratorio. 2. Queda estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio. 3. El alumno tiene la responsabilidad de revisar con anticipacin el calendario de prcticas que est incluido en el presente manual, para enterarse de las actividades que se harn en la sesin, adems de conocer el material extra que debe traer para desarrollar la prctica. 4. Para realizar el trabajo prctico del curso se formarn equipos de dos a cinco personas. 5. Los integrantes del equipo tienen la responsabilidad de pedir el material necesario para el desarrollo de la prctica con una semana de anticipacin. En caso de que no se solicite a tiempo no se realizar la prctica y contar como cero para su evaluacin. 6. Solo al inicio de cada prctica se aplicar un examen preliminar que contiene los puntos ms importantes de su desarrollo. Este examen tendr una duracin de 3 minutos. Si el alumno llega despus de haber realizado este examen no se le aplicar posteriormente y contar como cero para su evaluacin. 7. Los reportes de las prcticas sern entregados al profesor en la fecha sealada en el calendario de prcticas, la cual corresponde a una semana despus del trmino de la prctica. Por cada da de retraso de la entrega del reporte se descontar un punto de la calificacin 8. Los telfonos celulares debern ser apagados antes de ingresar al laboratorio, alumno que conteste una llamada o abandone el laboratorio para hacerlo, se le pedir que salga del laboratorio por esa sesin y la falta se le considerar en el rubro de disciplina. 9. Cada equipo deber traer un rollo de cinta adhesiva para etiquetar su material de trabajo. La etiqueta deber incluir la fecha, nmero de equipo, nmero de la prctica y las siglas de la materia (BI). No est permitido marcar el material con
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plumn indeleble ni con algn material auto-adherible diferente a la cinta adhesiva. 10. Todo el material de desecho que resulte de una prctica deber ser eliminado adecuadamente por los integrantes del equipo, en un tiempo menor de 7 das despus de finalizada la prctica. 11. Cada tres retardos se cuentan como una falta. Por cada dos registros de indisciplina se descontar un punto sobre la calificacin del parcial. Por las faltas desarrolladas como incumplimiento en el etiquetado del material, eliminacin incorrecta de los desechos entre otras sern sancionadas con un punto menos en la prctica respectiva. 12. En caso de sufrir un accidente conserve la calma y avise de inmediato al profesor.

FORMATO PARA LOS REPORTES DE LAS PRCTICAS Por cada prctica realizada se deber entregar un reporte escrito, el cual contendr los siguientes puntos: Portada Introduccin: con una extensin mxima de una cuartilla. Objetivos. Materiales y mtodos: redactados en voz pasiva, en pasado y en texto seguido.

Resultados: se presentarn en forma de tablas, grficas, esquemas y deben describirse en forma impersonal. Discusin: junto con los resultados son la parte ms importante del reporte, deben estar redactados de manera clara y sencilla, haciendo referencia a sus tablas, grficas y dibujos. En caso de que los resultados obtenidos no sean los esperados debe darse una explicacin bien argumentada sobre las posibles causas. Para poder hacer una buena discusin es indispensable leer las referencias relacionadas con el tema de la prctica, de manera que se tenga una mayor informacin. Es muy importante que las referencias que se consulten sean citadas en el texto como sigue: de acuerdo a Pineda y col. (2004) segn lo reportado por otros autores (Pineda et al. 2004).

Conclusiones: las obtenidas directamente de los resultados de la prctica. Bibliografa: utilizando el siguiente formato

Cuestionario resuelto. Como anexo.

Para libros: Apellido del primer autor, iniciales, iniciales del segundo autor, Apellido del segundo autor (ao). Ttulo del libro, nmero de edicin (en caso de ser de la segunda en adelante), editorial, ciudad o pas de impresin, pginas consultadas.

Para revistas: Apellido del primer autor, iniciales, iniciales del segundo autor, Apellido del segundo autor (ao). Ttulo del artculo, iniciales del ttulo de la revista, Volumen: pgina inicial del artculo-pgina final.

Para referencias de internet: Direccin completa y fecha de consulta. Las referencias de internet no sern tomadas en cuenta para la evaluacin del reporte si se trata de informacin copiada y pegada de la referencia. Reportes idnticos sern calificados con cero, no importando que equipo trabaj en realidad.

PRACTICA 1 CONTROL DE MICROORGANISMOS. OBJETIVO Analizar el grado de control del crecimiento microbiano que tienen ciertas sustancias qumicas

INTRODUCCIN Desde hace mucho tiempo es un reto el control de enfermedades infecciosas por destruccin, disminucin de su nmero o inhibicin de microorganismos. (Garca et. al., 1999) Las razones principales para controlar los microorganismos son: prevenir la transmisin de enfermedades, evitar el deterioro de los alimentos y evitar la contaminacin tanto en procesos industriales que requieran cultivos puros, como en laboratorios de diagnstico o investigacin. (Stanier et.al., 1996) Se puede llevar a cabo con diferentes mtodos en funcin del lugar a aplicar y el grado de erradicacin microbiana que se pretende conseguir. (Garca et. al., 1999) Por esto es conveniente definir algunos conceptos: Esterilizacin: proceso fsico o qumico que destruye toda forma de vida de vida microbiana, incluidas las esporas. Desinfeccin: tiene por objeto la destruccin de microorganismos mediante agentes de naturaleza qumica (desinfectantes), con el fin de disminuir el nmero de formas vegetativas a niveles mnimos. Desinfectante: es la sustancia qumica que inhibe o destruye microorganismos al aplicarla sobre material inerte sin alterarlo significativamente. Asepsia: trmino que se aplica a los procedimientos utilizados para prevenir que los microorganismos progresen en un medio determinado (quirfano, laboratorio. etc.) Antispticos: son agentes desinfectantes que se utilizan sobre superficies corporales con el fin de reducir la cantidad de flora normal y de contaminantes microbianos de carcter patgeno. Tienen un menor grado de toxicidad que los desinfectantes y generalmente menor grado de actividad. Determinados preparados pueden utilizarse como antispticos o como desinfectantes indistintamente, pero a diferentes concentraciones en cada caso.
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Antimicrobianos: son sustancias qumicas producidas por microorganismos o sintetizadas qumicamente que a bajas concentraciones son capaces de inhibir e incluso de destruir microorganismos sin producir efectos txico en el husped. (Garca et. al., 1999)

Hay ciertos factores que tienen que ser considerados a la hora de aplicar agentes qumicos o fsicos para el control de microorganismos. Concentracin del agente qumico. Intensidad del agente fsico. Tiempo de exposicin. Temperatura. Nmero de organismos. Clase de organismo. Estado fisiolgico de las clulas. Naturaleza del medio ambiente. (Stanier et.al., 1996)

MATERIAL 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL Cultivo slido contaminado con bacterias con cantidad de colonias incontable (CESPED). 4 pipetas estriles de 1 ml. 1 pipeta de 10 ml. 8 cajas petri con agar nutritivo. 2 varillas acodadas. Asa bacteriolgica. 1 caja petri de vidrio. 2 mecheros Fisher. Etanol al 70% Formaldehido al 10% Glutaraldehido 2% Cloro. Papel filtro. RESULTADOS.

MTODO Preparar las soluciones de alcohol, glutaraldehido, formaldehido y cloro a la concentracin especificada.
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Cortar crculos de medio centmetro de dimetro de papel filtro y juntar 6 en una paquete compacto. Tomar una asada de la caja Petri y hacer estra masiva por toda la caja. Poner los crculos de papel perfectamente compactados en el centro de la caja Petri. Aadir una de las soluciones para el control de microorganismos (500 L). Incubar por 2 das a temperatura de 29 C en condiciones controladas. Revisar los cultivos diario, en caso de ser necesario, impregnar de nuevo los cilindros con los reactivos en solucin. Anotar observaciones, sobre todo la presencia de halo alrededor de los cilindros y la cantidad de colonias formadas. Realizar observacin macroscpica y microscpica de los cultivos, realizar tincin de Gram para tener informacin sobre el microorganismo(s) utilizado(s). RESULTADOS. Completar la tabla 1. Poniendo el nmero de colonias en placa que se encontraron en el experimento. Tabla 1 Control de Microorganismos FORMALDEHIDO ALCOHOL 70% GLUTERALDEHIDO CLORO

EQUIPO 1 2 3 4

CUESTIONARIO 1. Cul es el fundamento de accin de cada una de las soluciones 2. Explique por qu en algunas soluciones problema no se evit el crecimiento de microorganismos. 3. Qu beneficios presenta usar soluciones reguladoras del crecimiento de microorganismos en lugar de mtodos fsicos? BIBLIOGRAFA

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Garca J.A,. (1999). Microbiologa Clnica. Ed. Haurcourt Brace. Pgs. 308311. Stanier R. (1996). Microbiologa. Ed. Revert. Pgs. 176-177.

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PRCTICA 2 MUESTREO, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS OBJETIVOS

a) b)

c)

El alumno conocer la normatividad e importancia del muestreo, transporte y almacenamiento de muestras para el anlisis microbiolgico. El alumno conocer el procedimiento para la toma, transporte y almacenamiento de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. El alumno realizar la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.

INTRODUCCIN Los alimentos se muestrean por tres razones principales: para control de calidad, establecer la vida til; para controlar la higiene de los productos, las tcnicas de manipulacin, cuando se sospecha que son causantes de toxiinfecciones alimentaras o como consecuencia de denuncias de los consumidores. Las muestras para el anlisis deben llegar al laboratorio en las mismas condiciones microbiolgicas que en el momento del muestreo. Debe evitarse la contaminacin de las muestras, el desarrollo o muerte microbiana, durante la toma de muestras y durante su transporte y almacenamiento. Todas las muestras se colocaran en recipientes antes de someterse a la observacin del analista. Tanto los instrumentos para la toma de muestra como los recipientes sern estriles. Si est presente el propietario del alimento se le permitir que observe la toma de muestra. Las muestras se transportaran y almacenaran bajo condiciones que impidan cambiar en el recuento microbiano. Para la conservacin y transporte de las muestras refrigeradas y congeladas se utilizaran recipientes dotados de material aislante. Las muestras se enviarn al laboratorio tan pronto como sea posible, preferentemente dentro de las dos horas de tomada y solo en circunstancias despus de transcurridas cuatro horas. Si hay algn retraso, las muestras se almacenaran en condiciones que minimicen cualquier cambio microbiano.

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INVESTIGACIN PRELIMINAR

d) e) f) g)

Cul es el procedimiento para la toma de muestra de agua domiciliaria? Qu cantidad de muestra se debe tomar para el anlisis microbiolgico de alimentos? Por qu es importante realizar el anlisis microbiolgico de los alimentos? Cules son las instancias oficiales que llevan a cabo la vigilancia sanitaria de los alimentos?

MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapn esmerilado de material esterilizable, no txico y de tamao acorde con la cantidad de muestra deseada. Bolsas de polietileno estriles de varias medidas Hieleras de poliestireno Papel aluminio Papel estraza Etiquetas adheribles Cinta testigo Marcadores indelebles Algodn Cerillos o encendedor Instrumentos para toma de muestra: muestreadores, cucharones, esptulas, cuchillos, pinzas, etc. (de acero inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar los resultados). Lmparas de alcohol. Frasco con etanol o isopropanol al 70 %. Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio. Hielo o bolsas refrigerantes. Bata, cubre boca, cofia y guantes estriles. Autoclave con termmetro de mercurio calibrada a 121 1C. Horno a 170 5C. Termmetros metlicos de -40 a 100C, con escala de 1C.

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DESARROLLO EXPERIMENTAL

PREPARACIN DEL MATERIAL PARA LA TOMA DE MUESTRA

a) Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo y transporte de muestras, que van a estar en contacto directo con el alimento, debe estar limpio, estril y libre de substancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos. b) El material para la toma de muestra que requiera esterilizacin, se envolver en forma individual, debidamente identificado, con papel de estraza antes de esterilizarlo. c) La tapa de los frascos se proteger con papel de estraza o aluminio fijndolos adecuadamente. d) Colocar cinta testigo en el material a esterilizar. e) El material que se utilice para la toma de muestra debe ser esterilizado en autoclave a 121C durante 15 minutos o en horno a 170C por dos horas, de acuerdo a su naturaleza. f) Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar contaminacin posterior. g) De ser necesario, si se requiere mayor nmero de utensilios, limpiar los que hayan sido usados y empaparlos con etanol o isopropanol al 70%, posteriormente flamearlos y colocarlos en recipientes estriles para evitar su contaminacin o inmediatamente utilizarlos.

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PROCEDIMIENTO

a) La toma de muestra de productos envasados con presentacin comercial para venta al menudeo se llevar a cabo en forma aleatoria y no asptica, tomndose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus anlisis, envindose al laboratorio tal como se presentan al consumidor. b) Tratndose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir stos y extraer la muestra en condiciones aspticas para evitar la contaminacin microbiana. c) Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precauciones estrictamente aspticas. d) Cuando se requiera tomar muestras aspticamente, stas no deben tomarse en reas donde las condiciones sanitarias puedan dar lugar a la contaminacin de las mismas. e) Es necesario que el personal que lleve a cabo el muestreo se lave las manos antes de desarrollar ste. f) Para muestreo asptico debe utilizar: bata, cofia y cubre boca. De ser necesario el contacto directo de las manos con el producto debern usarse guantes estriles. g) La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse nicamente al momento de introducir sta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine. h) Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin deber ser diferente de la que se enva para su anlisis. i) Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la persona que elabora los alimentos, sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estriles con los utensilios
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que emplea normalmente. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon, esto nicamente si el traslado es menor a una hora, de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeracin. j) En el caso de alimentos lquidos o semilquidos se deber agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y despus efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles. k) En alimentos slidos cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con ayuda de utensilios estriles como sacabocados, cucharas, cuchillos, etc. l) En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa. m) Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel, antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo. n) Los alimentos preparados de consumo inmediato que se venden sin envasar o a granel se consideran como alimentos perecederos y los productos no envasados en los cuales no est definida su vida til o de anaquel, se determinar la fecha de caducidad, con base en productos de caractersticas similares. o) Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia sanitaria ser nicamente por duplicado, la primera se enviar al laboratorio oficial para su anlisis y la segunda se quedar en poder del interesado para su anlisis particular si es necesario. p) En caso de impugnacin presentada en los trminos que seala la Ley General de Salud, en productos perecederos, la toma de muestra subsiguiente la llevar a cabo personal autorizado tomando cinco muestras en forma aleatoria del lote existente o la cantidad o nmero estipulado en la norma correspondiente del producto, la cual ser analizada por el laboratorio acreditado para realizar terceras y el resultado obtenido ser el que definitivamente acredite que el producto cumple con los requisitos y especificaciones sanitarias exigidas. El nmero de submuestras del total

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que determinen el cumplimiento sern tres de cinco o lo que estipule la norma correspondiente. IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA

a) En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o despus de colocar en l la muestra, mediante rtulo o etiqueta (indelebles), con los siguientes datos: b) Fecha, lugar, hora del muestreo, nmero de lote y temperatura de la toma de muestra si es que procede. c) La etiqueta deber colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, la caja, en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada. CONSERVACIN Y TRANSPORTE

a) El manejo y transporte de las muestras deber efectuarse de tal manera que se impida su ruptura, alteracin o contaminacin, evitando su exposicin a la luz solar directa. b) Las muestras deben entregarse al laboratorio lo ms rpidamente posible. Los alimentos perecederos se transportarn bajo condiciones de temperatura de 2 a 8C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recoleccin. c) En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0C, empleando para conservarla hielo seco. Para la refrigeracin es recomendable el empleo de recipientes con lquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plstico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados. d) En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presin que puedan ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las
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deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura. e) En el caso de muestras no perecederas, evitar que se daen, humedezcan o contaminen con otras. f) Los productos con presentacin comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente, siempre y cuando sta no exceda de 45C. g) Para la conservacin, durante el transporte de las muestras no est permitido el empleo de sustancias qumicas. h) Las muestras que se entreguen al laboratorio debern acompaarse de un informe que adems de contener la identificacin de la muestra, incluya los siguientes datos: i) Nmero de unidades y/o cantidad.

j) Clave nica que permita la identificacin del domicilio del fabricante, representante y/o distribuidor. k) Indicar nombre genrico y especfico del producto, as como la marca comercial y cualquier otra informacin que se considere importante. l) Observaciones, en donde se seale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algn otro dato que sea significativo para determinar los anlisis microbiolgicos que sean necesarios. m) La muestra testigo podr eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnacin.

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INFORME DE RESULTADOS a) Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos y los objetivos de la prctica. BIBLIOGRAFA Dey, B.P. and Lattvada, C.P. 1998. Microbiology Laboratory Guidebook. 3 rd Ed. Vol. 1 & 2. USDA/FSIS/USA. Fernndez, E.E. 2000. Microbiologa e Inocuidad de los Alimentos, Universidad autnoma de Quertaro. Mxico. PROY-NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Secretara de Salud. Mxico. Roberts, D; Hooper, W. y Greenwood, M. 2000. Microbiologa Prctica de los Alimentos. Mtodos para el examen de microorganismos de los alimentos de inters para la salud pblica. Acribia, S. A. Zaragoza, Espaa. pag 91-94

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PRCTICA 3 AISLAMIENTO Y SELECCIN PRIMARIA DE MICROORGANISMOS HALOFILOS OBJETIVO: Aplicar las tcnicas de seleccin de microorganismos para obtener microorganismos resistentes a condiciones extremas. INTRODUCCIN Existen microorganismos en casi todos los lugares de la tierra, aquellos que sobreviven en condiciones extremas son catalogados como extremfilos. Las codiciones extremas pueden ser varias, por ejemplo: temperaturas mayores a 50 C o menores de -10 C. Los microorganismos extremfilos tambin son considerados aquellos que viven en lugares con concentraciones de algn compuesto, que para otros sera sumamente txico, por ejemplo: altas concentraciones de sal, sulfatos, nitratos, etc. Estos microorganismos, por su capacidad de resistencia, son los ms buscados para el anlisis e investigacin de nuevos desarrollos. MATERIAL Por equipo: 1 matraz Erlenmeyer de 125 ml con 90 ml de solucin salina estril 4 pipetas de 1 ml estriles 1 pipeta de 10 ml estril 2 tubos de ensaye con 7 ml de medio inclinado de agar nutritivo 2 cajas de Petri con agar nutritivo 5%, 8%, 15% y 30% NaCl 2 cajas de Petri con agar cuenta estndar 5%, 8%, 15% y 30% NaCl 1 mortero de porcelana con pistilo estriles 2 varillas acodadas 1 caja de Petri de vidrio limpia 2 Mecheros Fisher 100 ml de etanol. Productos slidos salados contaminados por bacterias.

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MTODO Aislamiento de microorganismos productores 1. Pesar 10 g de las muestras de tipo slido. 2. En condiciones aspticas, colocar la muestra en el mortero y con ayuda del pistilo macerar completamente el contenido. 3. Sembrar por distribucin con varilla de vidrio estril la dilucin por duplicado en el medio agar nutritivo, y el agar cuenta estandar al 5%, 8%, 15% y 30% NaCl. 4. Incubar las cajas durante 48 horas a 29 C. RESULTADOS En la siguiente tabla reportar la fuente de aislamiento para cada cepa. En el informe deber presentar el fundamento del porqu de cada eleccin. Equipo 1 2 3 4 5 6 7 8 Fuente de aislamiento de las cepas

CUESTIONARIO
1. Cul es el fundamento de la resistencia que presentan los microorganismos a altas concentraciones de sal? Adaptaciones fisiolgicas que les permiten retener agua. Uno de los mecanismos que han desarrollado es albergar en el interior de sus tejidos concentraciones de un soluto compatible a las sales (cido polihidroxibutrico o PHB) mayores que en el exterior. As el agua penetra por smosis.

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2. Escriba el nombre cientfico de tres microorganismos extremfilos. Pseudomonas

salinaria, Micrococcus sp, Staphylococcus aereus

3. Cul es la aplicacin industrial de estos microorganismos? Industria alimentaria en donde se requiere preservar y conservar las caractersticas sensoriales de los alimentos, en la industria de plsticos en la que se busca generar nuevas tecnologas amigables con el ambiente y en la industria farmacutica con la incorporacin de principios activos que originan nuevos productos.

REFERENCIAS Pelczar M.J., E.C.S. Chan and N.R. Krieg (1993). Microbiology concepts and applications, Mc Graw Hill, USA. Steele, D.B. and D.M. Stowers (1991). Techniques for selection of industrially important microorganisms, Annu. Rev. Microbiol., 45:89-106.

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PRCTICA 4 EVALUACIN MICROBIOLGICA DE SUPERFICIES VIVAS E INERTES OBJETIVOS El alumno conocer la normatividad e importancia de realizar el anlisis microbiolgico de superficies vivas e inertes. El alumno conocer la metodologa para la determinacin de organismos mesoflicos aerobios y organismo coliformes. El alumno determinar organismo mesoflicos aerobios y organismos colformes en superficies vivas e inertes.

INTRODUCCIN Hay tres razones principales para tomas muestras del ambiente: investigacin de un brote sospechoso de toxiinfeccin alimentaria donde se piensa que las superficies pueden ser vehculos de contaminacin cruzada, buscar la ruta de contaminacin de una parte limpia a partir de otra sucia, comprobar las normas de higiene y la eficacia de un procedimiento de limpieza. Las pruebas utilizadas pueden ser cualitativas o cuantitativas. Puesto que ningn mtodo extrae todas las bacterias de una superficie, los mtodos cuantitativos solo se emplearan como gua de los niveles de contaminacin alcanzada. La comparacin de la contaminacin bacteriana de las superficies antes y despus de su limpieza, da una buena idea sobre la eficacia de esta. Los recuentos bacterianos de las superficies dependen de varios factores. Por ejemplo, el tiempo transcurrido entre su empleo y la toma de muestras influye en el gnero de bacterias recuperadas. La eleccin del mtodo de muestreo depende de las circunstancias. Para superficies relativamente limpias sirven y son tiles las placas y portaobjetos de contacto. Las superficies sucias se muestrean mejor con el mtodo de las torundas, tambin en el caso del interior de recipientes.

Los paos o telas de secar constituyen riesgos de contaminacin cruzadas ya que las zonas de alimentos crudos y cocinados se limpian con el mismo. Las telas se
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muestran mediante impresiones por contacto o sumergindolas total parcialmente en un diluyente. INVESTIGACIN PRELIMINAR h) i) j) k) l) m) n) o)

Cmo se define una superficie viva y una superficie limpia? Cules son las especificaciones microbiolgicas para superficies vivas e inertes? Cul es la importancia de analizar microbiolgicamente superficies vivas e inertes? Qu diferencia hay entre limpieza y sanitizacin? Mediante un cuadro establezca las principales caractersticas de los agentes de limpieza y sanitizantes empleados en la industria alimentara Qu representa la presencia de organismo colformes y mesofilicos aerobios en superficies vivas e inertes? Defina y de ejemplos de organismos mesoflicos aerobios y organismos coliformes. Qu mtodos se pueden utilizar para validar los sistemas de limpieza de manos y equipos?

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS Autoclave u Horno a 180C Balanza digital Cuenta colonias Refrigerador Incubadora a 352C 4 cajas Petri 1 pipetero metlico 4 pipetas de 2 ml 4 pipetas de 10 ml 4 bolsas de plstico transparente 2 esponjas estriles Benzal 4 frascos de 100 ml de agua peptonada 0.1% 1 matraz con 200 ml de agar bilis rojo violeta 1 matraz con 200 ml de agar cuenta estndar Agar bilis rojo violeta. Agar cuenta estndar.

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DESARROLLO EXPERIMENTAL

SUPERFICIES VIVAS: MANOS SUCIAS h) Vaciar 100 ml de agua peptonada al 0.1 % en una bolsa de plstico nueva. i) Introducir y lavar las manos de la persona en la bolsa que contiene el agua peptonada al 0.1 %. j) Regresar el agua peptonada al frasco de dilucin siendo esta la dilucin 10-1 despus realizar la dilucin 10-2 en un tubo que contiene 9 ml de agua peptonada al 0.1 %. k) Sembrar por duplicado la dilucin 10-2 para organismos mesoflicos y para organismos coliformes. l) Determinar organismos coniformes y organismos mesoflicos aerobios en UFC/cm2. SUPERFICIES VIVAS: MANOS LIMPIAS

a) La misma persona ahora se lava las manos con jabn y agua de la llave, despus se vuelve a lavar las manos en la bolsa de plstico que contiene 100 ml de agua peptonada al 0.1%. b) Regresar el agua peptonada al 0.1 % al frasco siendo esta la dilucin 10 -1. c) Sembrar por duplicado la dilucin 10-1 para organismos mesoflicos y para organismo coliformes. d) Determinar organismos coniformes y organismos mesoflicos aerobios en UFC/cm2.

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SUPERFICIES INERTES: SUPERFICIES SUCIAS

a) Medir 25 X 25 cm2 de la superficie de la mesa. b) Limpiar el rea con una esponja estril humedecida con agua peptonada al 0.1 %. c) Lavar la esponja dentro de la bolsa que contiene 100 ml de agua peptonada al 0.1 %, el agua se regresa al frasco, siendo sta la dilucin 10 -1 y realizar la dilucin 10-2. d) Sembrar por duplicado la dilucin 10-2 para organismos mesoflicos y para organismos coniformes. e) Determinar organismos coniformes y organismos mesoflicos aerobios en UFC/cm2. SUPERFICIES INERTES: SUPERFICIES LIMPIAS

a) Limpiar el rea seleccionada con benzal, despus limpiar con una esponja estril humedecida con agua peptonada dejar secar y lavarla dentro de la bolsa que contiene 100 ml de agua peptonada al 0.1%. b) Regresar el agua peptonada al 0.1 % al frasco, siendo sta la dilucin 10-1. c) Sembrar por duplicado la dilucin 10-1 para organismos mesoflicos y para organismos coniformes. d) Determinar organismos coliformes y organismos mesoflicos aerobios en UFC/cm2 INFORME DE RESULTADOS Reportar todos los resultados en un cuadro, expresados en UFC/cm2 e interpretar con base a las normas.
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BIBLIOGRAFA ICMSF. 1980. Ecologa microbiana de los alimentos. Vol. 1. Factores que afectan la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Acribia. Zaragoza, Espaa. Pg. 242-271. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Secretara de Salud. Mxico. NOM-093-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Prcticas de higiene y sanidad en la preparacin de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos. Secretara de Salud. Mxico. NOM-112-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Determinacin de bacterias coliformes Tcnica del Nmero ms Probable. Secretara de Salud. Mxico. Roberts, D; Hooper, W. y Greenwood, M. 2000. Microbiologa Prctica de los Alimentos. Mtodos para el examen de microorganismos de los alimentos de inters para la salud pblica. Acribia. S. A. Zaragoza, Espaa. Pg. 91-94

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PRCTICA 5 ANLISIS MICROBIOLGICO EN ALIMENTOS (NMERO MS PROBABLE) ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES Y FECALES OBJETIVOS El alumno conocer la normatividad e importancia de la determinacin de organismos coliformes totales y fecales El alumno aplicar la metodologa para la determinacin de organismos coliformes totales y fecales El alumno determinar organismos coliformes totales y fecales en muestras de alimentos y aguas. El alumno aplicar las tablas del NMP para reportar los resultados de la determinacin de organismos coliformes.

INTRODUCCIN Los organismos coliformes se definen como bacilos Gram negativos, aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas dentro de 48 h de incubacin a 35C. Este definicin pretende involucrar bacterias de hbitat tpicamente intestinal (Escherichia coli), si bien existen microorganismos que satisfacen la definicin y que frecuentemente se localizan en ambientes extraintestinales ( Enterobacter aerogenes). De hecho, el grupo no se configura a base de gneros microbianos, sino de cepas que en el desarrollo de la prueba cumplen con la definicin. Ms an, algunas cepas de Salmonella, por ejemplo, se comportan como coniformes por el hecho de fermentar la lactosa, en tanto que cepas de E. coli lentas fermentadoras de la lactosa (patgenas), quedan fuera de la definicin. Las bacterias ms prominentes del grupo pertenecen a gneros de las familias Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa: Escherichia, Enterobacter, Citrobacter y Klebsiella.

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La E. coli es el tpico coliforme en el sentido de que se trata de una bacteria cuyo hbitat natural es el contenido intestinal de los animales de sangre caliente. Por tal razn, su hallazgo en un alimento o en el agua es ms significativo desde un punto de vista sanitario, que el de cualquier otro coliforme. En la materia fecal los coliformes alcanzan cifras de 10 6 a 109 UFC/g. Debido a su capacidad de sobrevivencia y gran potencial para desarrollar en la materia orgnica, pueden recuperarse de una diversidad de substratos extraintestinales: piel humana y de animales, vegetales, insectos, aguas superficiales, tierra y cualquier material que entre en contacto con ellos. La presencia de coliformes en los alimentos resulta de su exposicin al medio ambiente y a las posibilidades de desarrollo que encuentren en tales substratos. Es evidente que su hallazgo en un alimento no involucra necesariamente a la materia fecal. En los alimentos los coliformes adquieren un significado distinto al que reciben en el agua. Los factores ms determinantes de esta diferencia radican en su capacidad para multiplicarse en los alimentos, en la operacin de fuentes no fecales de contaminacin y a la presencia de coliformes residuales en el equipo y utensilios en plantas y servicios de alimentos. El recuento de los coliformes puede efectuarse por la tcnica del nmero ms probable o por la tcnica de vaciado en placa. Los coliformes fecales se refieren a aquellos coliformes que tienen capacidad para fermentar la lactosa con produccin de gas a temperaturas de 44-45C. Excepto esto, los coliformes fecales se identifican del resto de los coliformes en lo que se refiere a su resistencia al medio ambiente, agentes qumicos y factores que favorecen o impiden su desarrollo. La tcnica para su recuento es el nmero ms probable (NMP), con caldo lauril triptosa como medio presuntivo incubado a 35C por 48 h y caldo EC que contiene sales biliares que le dan selectividad como confirmativo, incubado a 44.5 0.2 C. El NMP se computa en las tablas correspondientes en la forma indicada para los coliformes totales. INVESTIGACIN PRELIMINAR p) q) r) s) Cules son los microorganismos considerados como coliformes? Qu microorganismo conforma principalmente a los coliformes fecales? Qu ventajas y desventajas presentan los mtodos de vaciado en placa y el nmero ms probable para determinar coliformes? Qu otro nombre recibe la tcnica del nmero ms probable?
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t) u)

Cul es el fundamento de la tcnica del nmero ms probable? Cul es el fundamento de la tcnica de vaciado en placa para coliformes totales?

MATERIALES Y REACTIVOS Autoclave o Horno a 180C Balanza digital Cuenta colonias Potencimetro Refrigerador Incubadora a 352C 4 cajas Petri 1 pipetero metlico 1 cilindro metlico para cajas Petri 4 pipetas de 2 mL 4 pipetas de 10 mL 1 probeta de 250 mL 1 vaso de precipitados de 500 mL 1 esptula 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL 4 frascos de dilucin 1 mechero 1 soporte, 1 varilla Benzal Agua destilada 4 frascos con 90 mL de agua peptonada al 0.1% 1 matraz con 100 mL de agar bilis rojo violeta 9 tubos con 10 mL de caldo lactosado con campana de Durham 9 tubos con 10 mL de caldo bilis verde brillante al 2% con campana de Durham Muestras de alimentos

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DESARROLLO EXPERIMENTAL A) COLIFORMES TOTALES EN PLACA PREPARACIN DE LA MUESTRA La preparacin de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM110-SSA1-1994 preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico (ANEXO 2).

PROCEDIMIENTO a) Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a la inoculacin. b) Colocar 1 mL de las diluciones de las muestras preparadas segn la NOM110-SSA1-1994, en una caja Petri. Realizar por duplicado. c) Agregar de 15 a 20 mL de agar rojo-violeta-bilis-lactosa (RVBA), fundido y mantenido a 45 1C. En el caso de cajas Petri de plstico de 10-15 ml de medio. d) Mezclar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. e) Dejar una caja control con 15 mL de medio para verificar la esterilidad. f) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 min. g) Despus de que est el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 mL de medio RVBA a 45 1C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique. h) Incubar las cajas en posicin invertida a 35C 1C, durante 24 2 h.
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i) Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias tpicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitacin debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfologa colonial es semejante a lentes biconvexos con un dimetro de 0.5 a 2 mm.

EXPRESIN DE RESULTADOS Considerar las placas con 15 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilucin. Para la expresin de resultados, consultar el ANEXO 3 (clculo de los valores de la cuenta en placa) y los criterios establecidos.

5.3.1 PLACAS QUE CONTIENEN MENOS DE 15 COLONIAS Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias caractersticas, reportar el nmero obtenido seguido de la dilucin correspondiente.

5.3.2 PLACAS CON COLONIAS NO CARACTERSTICAS Si en las placas no hay colonias caractersticas, reportar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilucin.

INFORME DE RESULTADOS Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL), en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35C durante 24 2 h. En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la dilucin ms baja utilizada. En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: no desarrollo de coliformes por mL.

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En un cuadro presentar los resultados obtenidos de las muestras analizadas contemplando las especificaciones de acuerdo a la normatividad. Interpretar los resultados obtenidos considerando las causas posibles que pudieran dar origen a dichos valores.

B) BACTERIAS COLIFORMES TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE 5.1 PREPARACIN DE LA MUESTRA La preparacin de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM110-SSA1-1994 preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico (ANEXO 2).

5.2 PROCEDIMIENTO PARA AGUA POTABLE Y HIELO Para el anlisis de agua potable, agua purificada y hielo, se emplea la serie de 5 tubos inoculados, 5 tubos con 10 mL, 5 tubos con 1 mL y 5 tubos con 0.1 mL (cuadro 4 del ANEXO 4).

5.2.1 PRUEBA PRESUNTIVA a) Agitar la muestra. Transferir volmenes de 10 mL de muestra a cada uno de 5 tubos con 20 mL de caldo lactosado de mayor concentracin y 1 mL y 0.1 mL de muestra a cada uno de los tubos de las series de 5 respectivamente con 10 mL de caldo lactosado de concentracin sencilla o caldo lauril sulfato triptosa con prpura de bromocresol (ver preparacin en el ANEXO 1). b) Incubar los tubos a 35C. examinar a las 24 2 h y observar si hay formacin de gas, si la formacin de gas no se observa en ese tiempo, incubar por 48 2 h. 5.2.2 PRUEBA CONFIRMATIVA a) De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una azada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin, caldo lactosa lauril bilis verde brillante.

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b) Incubar a 35 0.5C por 24 2 h o si la formacin de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 2 h. 5.3 PROCEDIMIENTO PARA ALIMENTOS Preparar suficiente nmero de diluciones para asegurar que todos los tubos correspondientes a la ltima dilucin rindan un resultado negativo.

5.3.1 PRUEBA PRESUNTIVA a) Inoculacin. Tomar 3 tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentracin. Usar una pipeta estril para transferir a cada tubo 10 mL de la muestra si es lquida o 10 mL de la dilucin primaria inicial, en el caso de otros productos. b) Tomar 3 tubos de concentracin sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar una pipeta estril para transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra si es lquida o 1 mL de la dilucin primaria en el caso de otros productos. c) Para diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el prrafo anterior, usando una pipeta diferente para cada dilucin. Mezclar suavemente el inculo en el medio. d) Incubar los tubos a 35 0.5C por 24 2 h y observar si hay formacin de gas, en caso contrario prolongar la incubacin hasta 48 2 h. 5.3.2 PRUEBA CONFIRMATIVA a) De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una azada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin. b) Incubar a 35 0.5C por 24 2 h o si la formacin de gas no se observa en este tiempo, prolongar la incubacin por 48 2 h. c) Se considera una combinacin de tres tubos por cada dilucin de la serie. Para algunos productos y siempre y cuando que se requiera una mayor precisin en los resultados, ser necesario inocular una serie de cinco o diez tubos.
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EXPRESIN DE RESULTADOS Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que d formacin de gas despus del periodo de incubacin requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.

El cuadro 3 del ANEXO 4 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar. Ejemplo1. Cuando slo una dilucin muestra 3 tubos positivos, elegir sta y las diluciones mayores posteriores. Ejemplo 2. Cuando ms de una dilucin muestra 3 tubos positivos y la ltima da menos de tres, elegir esta ltima y las dos diluciones anteriores ms bajas. Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilucin hay 3 tubos positivos y stos se encuentran en ms de tres diluciones. Seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente. Ejemplo 4 y 5. Cuando los tubos positivos slo se encuentran en la muestra sin diluir (1 mL o 1 g) y en la primera dilucin (1 mL o 10 -1 g), seleccionar las tres primeras diluciones para el clculo del nmero ms probable. En cada caso se obtiene un nmero de tres cifras, lo cual es representado en los cuadros 4 al 7 del ANEXO 4, segn corresponda. En la columna que indica el nmero de tubos positivos se busca el ndice del NMP. Los lmites de confianza estn representados en los cuadros 4 al 7.

BIBLIOGRAFA

Banwart, G.J. 1989. Basic food microbiology. 2nd Ed. Chapman & Hall. New York, USA. Pg. 371-392. Fernndez, E.E. 2000. Microbiologa e inocuidad de los alimentos. Universidad Autnoma de Quertaro. Mxico. Pg. 51-54. Jay, J.M. 1992. Modern food microbiology. 4th Ed. Chapman & Hall. New York, USA. Pg. 416-421. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para cuenta de bacterias aerobias en placa. Secretara de Salud. Mxico.
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NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Secretara de Salud. Mxico. NOM-112-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Determinacin de bacterias coliformes: Tcnica del Nmero Ms Probable. Secretara de Salud. Mxico. NOM-113-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. Secretara de Salud. Mxico. PROY-NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Secretara de Salud. Mxico. Roberts, D; Hooper, W. y Greenwood, M. 2000. Microbiologa Prctica de los Alimentos. Mtodos para el examen de microorganismos de los alimentos de inters para la salud pblica. Acribia. S. A. Zaragoza, Espaa. Pg. 116-122.

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PRCTICA 6 ANLISIS MICROBIOLGICO EN COSMTICOS. ANLISIS DE CREMAS

CUENTA TOTAL DE HONGOS, LEVADURAS Y MESOFLICOS AEROBIOS. OBJETIVO Determinar la presencia de microorganismos como Hongos, levaduras y mesoflicos aerobios en productos cosmticos mediante la utilizacin de diversas tcnicas microbiolgicas para as detectar errores en el procedimiento de produccin

INTRODUCCIN Hoy en da el farmacutico es el profesional responsable de la produccin de cosmticos de calidad, seguros y eficaces para lograr este objetivo del control microbiolgico se considera de gran importancia, ya que en estos productos se pueden presentar las condiciones necesarias para la multiplicacin de microorganismos capaces de deteriorar al producto o lo que es peor, afectar la salud del consumidor. Los cosmticos, productos de higiene y perfumes son preparaciones constituidas por sustancias naturales o sintticas, de uso externo en las diversas partes del cuerpo humano como la piel, el sistema capilar, las uas, los labios, los rganos genitales externos, los dientes y las membranas mucosas de la cavidad oral; con el objetivo exclusivo o principal de limpiarlos, perfumarlos, alterar su apariencia y/o corregir olores corporales y/o protegerlos o mantenerlos en buen estado.(Martini et al., 1997) Consideraciones generales para la manipulacin de las muestras antes de realizar el anlisis microbiolgico. Una vez que se recibe una muestra de un producto cosmtico, sta se debe analizar lo ms pronto posible, sin embargo, cuando es necesario almacenarla se debe hacer en un lugar limpio que se encuentre a temperatura ambiente. Las muestras nunca se deben incubar, refrigerar o congelar antes o despus de su anlisis microbiolgico. Es importante inspeccionar cuidadosamente el aspecto que presenta la muestra en el momento que se recibe y se debe anotar cualquier irregularidad que se observe en el envase.
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Antes de abrir el envase y tomar la muestra del producto para realizar el anlisis microbiolgico, se debe desinfectar su superficie con cualquiera de las siguientes soluciones desinfectantes: Etanol al 70% (v/v) y HCl al 1% en agua Yodo al 4% en etanol al 70% Glutaraldehido al 2%

Si es necesario despus de desinfectarlas se debe secar el envase con una gasa estril. Para hacer el anlisis microbiolgico es importante utilizar una porcin representativa del contenido de la muestra. Cuando se trata de productos que contienen menos de 1g o menos de 1mL, se debe analizar el contenido completo del envase. Cuando se dispone de una sola muestra a la que se deben realizar otros ensayos (qumico, toxicolgico, etc.), se debe tomar primero la parte de muestra que va a ser utilizada en el anlisis microbiolgico. En este caso la cantidad de muestra a tomar, depender del contenido total del producto. Por ejemplo, si la muestra contiene slo 5mL, se pueden usar 1 2mL para realizar este anlisis. De preferencia, el anlisis microbiolgico se realiza bajo campana de flujo laminar, sin embargo, si no es posible, se puede acondicionar una cabina para realizar este ensayo. Todas las manipulaciones de la muestra se deben realizar aspticamente. Cuando se preparan muestras cosmticas para la realizacin de un anlisis microbiolgico, es importante garantizar que los microorganismos, que pudiesen estar como contaminantes, van a ser detectados y que el analista, durante la realizacin del ensayo, no aporta ningn tipo de contaminante. Para ello es importe incorporar completamente la muestra en el medio de cultivo en condiciones aspticas.(Wilkinson et al., 1982)

Contenido microbiano en materia prima La industria cosmtica tiene que usar agua y sistemas de agua validados y controlados. Hay que tener en cuenta las siguientes consideraciones generales:
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Composicin qumica Naturaleza fsica Origen y disponibilidad Uniformidad de lote Uso destinado del producto Concentracin de la materia usada en el producto Procesos de manufactura Historia de la materia prima Condiciones de almacenamiento Actividad del agua

Criterios especficos Se recomienda como mnimo usar 10g 10mL de muestra. Limites microbiolgicos para productos cosmticos Hay que tener en cuenta criterios como uso del producto, ruta de administracin y poblacin que es el objetivo que establecen las guas microbiolgicas para seguridad y eficacia (calidad). (Wilkinson et al., 1982) Dado que los productos cosmticos no son productos estriles, pueden sufrir contaminacin microbiana por el ambiente, materia prima, componentes, entre otros. Las formulaciones que pueden soportar microorganismos o que son susceptibles de contaminacin microbiana deben contener conservadores para retardar el crecimiento microbiano. Se recomienda que los equipos utilizados en los procesos de fabricacin de los cosmticos deben estar diseados para una fcil limpieza y sanitizacin; as como aplicar las buenas prcticas de fabricacin (NOM 059 SSA1 1993) para evitar accidentes humanos o contaminacin microbiana ambiental durante la fabricacin. Es responsabilidad de los fabricantes asegurarse que: Ningn microorganismo presente sea capaz de crecer en el producto. Las especies y cantidad de microbios no representen un peligro al consumidor cuando se usa el producto tal cual se indica. Ningn microorganismo presente debe comprometer la estabilidad del producto.
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El producto, empacado y la integridad del cerrado deben ser seguros y sometidos a un control de calidad.

Criterios especficos Se usa el mtodo de conteo en placa y como paso previo es necesario inactivar los inhibidores del crecimiento microbiano si estn presentes. Limites Microbianos CTFA (The Cosmetics, Toiletry, and Fragance Association) Cuantitativos: Productos para bebe menos de 100 UFC/g o mL Productos para el rea de los ojos menos de 100 UFC/g o Ml Resto de productos menos de 1000 UFC/g o Ml

Cualitativos: Ausencia de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, y Pseudomonas aeruginosa.

Limites microbianos Defienden dos categoras de cosmticos: Categora 1: Productos dirigidos a nios menores de 3 aos, rea de los ojos y membranas mucosas Categora 2: Otros productos

Lmites cuantitativos: Categora 1: Total de microorganismos mesfilos viables menos de 100 UFC/g o mL en 0.5 g o mL de producto. Categora 2: Total de m.o. aerbico mesfilos viables menos de 1000 ufc/g o mL en 0.1 g o mL de producto.

Limites cualitativos: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans son considerados los principales patgenos potenciales en productos cosmticos. Las pruebas especficas para estos patgenos no deben ser detectadas en 0.5 g o mL en productos cosmticos de la categora 1 y en 0.1 g o mL en cosmticos de la categora 2. (wilkinson et al., 1982)

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MATERIALES Y REACTIVOS. Solucin desinfectante. 8 matraces Erlenmeyer de 500 mL. 15 cajas Petri. Bolsas de polipapel esteriles. Guantes estriles. Bolsa de residuos. Caldo Letthen modificado y caldo dextrosa Sabuoraud. 4 frascos estriles de 200 mL. Tween 80 estril Bao mara 2 codos de vidrio estriles 8 pipetas de 10 mL. 8 pipetas de 1 mL. 1 probeta de 500 mL. Estufa. Pipeteros. Material para esterilizar. (gasa, algodn, papel craft, etc.)

MTODO. Todo el procedimiento se hizo de acuerdo a la NOM-089-SSA1-1994. TOMA DE MUESTRA (DEL PRODUCTO) Analizar la muestra tan pronto como sea posible. Si es necesario almacenar, debe hacerse a la temperatura ambiente. No incube, refrigere o congele las muestras antes o despus de su anlisis. Inspeccione las muestras cuidadosamente antes de abrirlas y anote cualquier irregularidad del contenedor de dichas muestras. Desinfecte la superficie del contenedor con un algodn estril impregnado con cualquiera de los siguientes desinfectantes: Solucin de etanol al 70% (v/v) y cido clorhdrico 1% (v/v) (alcohol cido). Solucin de etanol al 70% con 4% de yodo Solucin de glutaraldehdo al 2% Benzal al 0,001%

Antes de abrir y tomar la muestra o contenido; secar la superficie con gasa estril.
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Homogeneizar el producto al tomar la muestra necesaria de acuerdo a su estado fsico. Para lquidos, agitar el contenido del envase; para semislidos y polvos, mezclar el contenido con una esptula estril; para slidos, raspar el producto con esptula estril y tomar una muestra representativa; y para aerosoles, despus de limpiar aspticamente el recipiente, expeler apropiadamente la cantidad de producto previa agitacin. PREPARACIN PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS Para las muestras que sean miscibles en caldo Letthen modificado y caldo dextrosa Sabuoraud, adicionar 1 g o ml en 90 ml de caldo Letthen modificado y 1 g o ml en 90 ml de caldo dextrosa Sabuoraud en condiciones aspticas. Para las muestras que no sean miscibles en caldo Letthen modificado y caldo dextrosa Sabuoraud (ejemplo, cremas, labiales, etc.), en 2 frascos estriles o bolsas de polietileno estriles debidamente etiquetados; uno para caldo Letthen modificado y otro para caldo dextrosa Sabuoraud, adicionar 1 g o 1 ml de la muestra y agregar 0,5 ml de tween 80 estril a cada uno de los frascos o bolsas previamente marcados y homogeneizar la muestra. En caso de usar los frascos poner en bao mara a 45C hasta formar una emulsin homognea (el tiempo de exposicin en el bao no debe exceder de 15 minutos). Posteriormente agregar a cada uno de los frascos o bolsas 90 ml de caldo Letthen modificado y 90 ml de caldo dextrosa Sabuoraud respectivamente y agitar perfectamente.

PROCEDIMIENTO Incubar a 30C 2 durante 7 das los medios de cultivo inoculados. Marcar los frascos o bolsas que se enturbien al agregar la muestra. Confirmar si existe crecimiento a los 2 y 7 das de incubacin. Cuando el crecimiento sea evidente o se tenga duda de desarrollo microbiano, hacer una resiembra en agar Letthen modificado y agar extracto de malta, inoculando 0,5 ml de cultivo del caldo Letthen modificado y caldo dextrosa Sabuoraud respectivamente, empleando el mtodo de vaciado en placa o de dispersin con codos de vidrio esterilizado. Incubar durante 4 das a 30C 2.
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INTERPRETACIN DE RESULTADOS Observar si hay crecimiento en los medios inoculados: Si no hay crecimiento reportar: menos de 10 UFC/ml o g de muestra, concluyendo el ensayo. Si se presenta crecimiento, continuar con la prueba definitiva que se describe a continuacin.

CUENTA TOTAL DE MESOFLICOS AEROBIOS, HONGOS Y LEVADURAS. Agregar por separado 10 ml o g de muestra a 90 ml de medio caldo dextrosa Sabuoraud y caldo Letthen modificado (dilucin 10-1) cuando las muestras sean miscibles en stos. Para las muestras que no son miscibles; en dos frascos o bolsas estriles debidamente etiquetados: Uno para caldo Letthen modificado y otro para caldo dextrosa Sabuoraud, adicionar 10 g o ml de muestra y colocar 5 ml de tween 80 estril a cada uno de los frascos o bolsas previamente marcados. En caso de usar los frascos poner en bao de agua a 45C hasta formar una emulsin homognea (el tiempo de exposicin en el bao de agua no debe exceder de 15 minutos). Posteriormente agregar a cada uno de los frascos o bolsas 85 ml de caldo Letthen modificado y 85 ml de caldo dextrosa Sabuoraud respectivamente y agitar perfectamente. (Dilucin 10-1) A partir de la dilucin 10-1, realizar diluciones seriadas segn el crecimiento esperado de la siguiente manera: Tubo. Dilucin. Volumen agregado. caldo Letthen modificado o caldo dextrosa Sabuoraud (ml): 1 10-2 o 1:100 1 ml de dilucin 10-1 9 2 10-3 o 1:1000 1 ml de dilucin 10-2 9 3 10-4 o 1:10 000 1 ml de dilucin 10-3 9 4 etc.

Para la cuenta estndar total, realizar las diluciones en caldo Letthen modificado; y para la cuenta de hongos y levaduras, realizar las diluciones utilizando el caldo dextrosa Sabuoraud. Mezclar hasta homogeneizar. Colocar 1 ml de cada dilucin en cajas de Petri estriles previamente marcadas con la dilucin, registro y fecha,
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agregar de 18 a 20 ml de medio de cultivo cuidando que la temperatura no sea mayor de 45C; para cuenta estndar total, utilizar agar Letthen modificado; y para cuenta de hongos y levaduras, emplear agar extracto de malta o Agar papa dextrosa. Homogeneizar el inculo en el medio de cultivo, rotando la caja sembrada de izquierda a derecha, vertical y horizontal 6 veces en cada ocasin. Dejar solidificar el medio de cultivo en las cajas. Si se emplea el mtodo de dispersin con codos de vidrio, utilizar 0,5 ml de inculo por cada dilucin y colocarlo en cajas de Petri conteniendo agar Letthen modificado y agar extracto de malta para cuenta estndar total y cuenta de hongos y levaduras respectivamente. Dispersar el inculo con codos de vidrio estriles. Dejar que se absorba el inculo. Invertir las cajas e incubar: a 30c 2 durante 48 horas para la cuenta estndar total; a 22C durante 5 das para la cuenta de hongos y a 35C por 48 horas para la cuenta de levaduras. INTERPRETACIN DE RESULTADOS. CUENTA TOTAL DE HONGOS Y LEVADURAS. Contar el nmero de hongos y levaduras que se encuentren. Reportar el nmero de colonias /ml o g de muestra multiplicando por el inverso de la dilucin observada. En el caso de utilizar el mtodo por dispersin de codo de vidrio, el resultado se multiplicar por 2, concluyendo la prueba. CUENTA TOTAL DE MESOFLICOS AEROBIOS. Contar las cajas en donde se encuentren de 25 a 250 UFC. Reportar el nmero de UFC/ml o g de muestra multiplicando por el inverso de la dilucin observada. En el caso de utilizar el mtodo por dispersin con codo de vidrio, el resultado obtenido se multiplicar por 2. BIBLIOGRAFA Martini MC, Chivot M. (1997). Dermocosmtica y esttica: 3- Cosmetologa. 1 edicin, tomo 3, Editorial Masson, pp: 1- 4 Wilkinson JB, Moore RJ, Rodrguez Nava M, Rodrguez Devesa D. (1982). Cosmetologa de Harry. 1 edicin, Editorial Daz de Santos, pp: 973-988

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PRCTICA 7 CONTROL MICROBIOLGICO DE MATERIAS PRIMAS Y PRODUCTOS FARMACUTICOS NO ESTRILES OBJETIVO Al finalizar el trabajo prctico, el estudiante estar en capacidad, mediante la consulta bibliogrfica y la aplicacin de las tcnicas microbiolgicas, de realizar el control microbiolgico de materias primas y productos farmacuticos no estriles, utilizando metodologas oficiales.

INTRODUCCIN Durante el proceso de fabricacin, almacenamiento y uso, los medicamentos son susceptibles de contaminarse con microorganismos como bacterias, mohos y levaduras, y por consiguiente se pueden deteriorar. La contaminacin de los productos farmacuticos, representa un riesgo para la salud del usuario; este riesgo se relaciona con la severidad de la infeccin o enfermedad que los microorganismos contaminantes, patgenos u oportunistas, pueden producir. Por otra parte, el deterioro microbiano podra conllevar a cambios en las caractersticas fsicas y qumicas que conduciran a que el producto deteriorado no sea apto para ser usado. Es por ello, que las materias primas y los productos farmacuticos terminados, deben ser sometidos a un anlisis microbiolgico que demuestre que cumplen con ciertas especificaciones establecidas por los organismos oficiales, para garantizar que los productos son adecuados para el uso al que estn destinados. Este anlisis o control microbiolgico de las materias primas y de los productos medicamentosos no estriles, involucra la realizacin de dos tipos de ensayos: a. Recuentos microbianos, referidos bsicamente al recuento total de bacterias aerobias mesfilas y/o recuento de mohos y levaduras. b. Investigacin de microorganismos patgenos objetables, llamados tambin indicadores especficos, como Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus.

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FUNDAMENTO Consiste en determinar el nmero de bacterias aerobias mesfilas y el nmero de mohos y levaduras en materias primas y productos farmacuticos no estriles, y realizar la investigacin de los microorganismos objetables que puedan estar presentes en ese producto, mediante tcnicas de siembra en placas. NUMERACIN DE BACTERIAS AEROBIAS MESFILAS. RECUENTO EN PLACAS (MTODO DEL VACIADO EN PLACAS). MATERIALES Muestras de materias primas y medicamentos Placas estriles Pipetas estriles de 1 mL y de 10 mL Propipetas Tubos de agar soya-casena (18-20 mL) fundido y enfriado a 45-50C Frascos de dilucin con buffer fosfato pH 7.2 Bao de Mara a 45-50C Estufa o incubadora Contador de colonias

PROCEDIMIENTO 1. Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la muestra homogeneizada por agitacin, y aadirlos a un frasco de dilucin que contiene 90 mL de buffer fosfato Ph 7,2 estril. Agitar el frasco vigorosamente (25 veces). Rotular 10-1. 2. Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la dilucin 10-1 a un frasco de dilucin con 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estril. Agitar. Rotular 10--2. 3. Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la dilucin 10-2 a un frasco de dilucin con 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estril. Agitar. Rotular 10--3. 4. Con una pipeta estril, transferir porciones de 1 mL de la dilucin 10-1 a cada una de 2 placas de Petri estriles. 5. Con una pipeta estril, transferir porciones de 1 mL de la dilucin 10-2 a cada una de 2 placas de Petri estriles. 6. Con una pipeta estril, transferir porciones de 1 mL de la dilucin 10-3 a cada una de 2 placas de Petri estriles.

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7. Verter en cada una de las placas, 15 mL de agar soya casena, fundido y enfriado a 45C, mezclando cuidadosamente las muestras con el agar. Dejar solidificar e incubar en posicin invertida a 37C por 48 horas.

RESULTADOS Contar el nmero de colonias en las placas usando el contador de colonias. Calcular el nmero de microorganismos viables por mL de muestra, expresado como unidades formadoras de colonias por mL (u.f.c./mL) (ver Anexo de notacin cientfica y diluciones). Anotar los resultados: Nmero promedio de colonias (seleccionar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias por placa): _____________________ Factor de dilucin de las placas seleccionadas: _____________________ Nmero de u.f.c./mL: _____________________
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NUMERACIN DE MOHOS Y LEVADURAS. MATERIALES Muestras de materias primas y medicamentos Placas estriles Pipetas estriles de 1 mL y 10 mL Propipetas Tubos de agar Sabouraud o papa-glucosa (18-20 mL) fundido y enfriado a 4550C. Frascos de dilucin con buffer fosfato pH 7.2 Mechero Bao de Mara a 45-50C Estufa o incubadora Contador de colonias

PROCEDIMIENTO Proceder de la misma forma descrita para la numeracin de bacterias aerobias mesfilas, pero utilizando agar Sabouraud o agar papa-glucosa, en vez de agar soya casena, e incubar las placas (sin invertir) a 20-25C por 5 a 7 das. RESULTADOS Contar el nmero de colonias en las placas usando el contador de colonias. Calcular el nmero de mohos y levaduras por mL de muestra, expresado como unidades formadoras de colonias por mL (u.f.c./mL) (ver Anexo de notacin cientfica y diluciones). Anotar los resultados: Nmero promedio de colonias (seleccionar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias por placa): _____________________ Factor de dilucin de las placas seleccionadas: _____________________ Nmero de u.f.c./mL: _____________________

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INVESTIGACIN DE MICROORGANISMOS PATGENOS OBJETABLES INVESTIGACIN DE Salmonella (GNERO) Y Escherichia Coli. MATERIALES Pipetas de 10 mL y de 1 mL Propipetas Placas estriles Caldo lactosado (90 mL) Caldo tetrationato Caldo selenito cistina Agar verde brillante Agar desoxicolato Agar sulfito bismuto Agar triple azcar hierro (TSI) Agar MacConkey Agar Levine Asa y filamento Mechero Equipo para coloracin de Gram Estufa

PROCEDIMIENTO Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la muestra a un baln que contiene 90 mL de caldo lactosado. Incubar a 30 - 35C por 24 a 48 horas. Aislamiento de Salmonella 1. Agitar la mezcla incubada y transferir 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo selenito-cistina y 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo tetrationato. Incubar a 35C por 12 - 24 horas. 2. Despus del perodo de incubacin, mediante un asa, hacer aislamientos a partir de los caldos selenito-cistina y tetrationato a los agares verde brillante, desoxicolato citrato y sulfito-bismuto. Incubar a 35C por 24 - 48 horas. 3. Notar la presencia de colonias tpicas de Salmonella:

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Agar verde brillante: Pequeas, incoloras, rosadas fucsias, transparentes u opacas, sobre el medio coloreado de rosado a rojo.

Agar desoxicolato- citrato: Pequeas, incoloras, elevadas, opacas; algunas cepas producen colonias con el centro negro.

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Agar sulfito-bismuto: Marrones o negras, algunas veces con brillo metlico alrededor de la colonia (S. typhi). Algunas cepas producen colonias verdes con poco o ningn oscurecimiento del medio.

4. Si no hay colonias tpicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausencia de Salmonella. 5. Si se encuentran colonias tpicas, transferir a agar nutritivo inclinado y a agar hierro tres azcares (TSI, triple sugar iron). Incubar a 35C por 18 - 24 horas. 6. Los cultivos tpicos de Salmonella en agar TSI presentan la parte inferior del medio amarilla (formacin de cido) y el bisel rojo (alcalino), con o sin oscurecimiento, generalmente con formacin de gas.

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7. Hacer una coloracin de Gram: los miembros del gnero Salmonella, son bacilos Gram negativos no esporulados. 8. Confirmar la presencia de Salmonella por pruebas bioqumicas tradicionales AISLAMIENTO DE E. coli. 1. Con un asa, hacer un aislamiento a partir de caldo lactosado, a agar MacConkey. Incubar a 35C por 24 horas. 2. Las colonias de coliformes en agar MacConkey son de color rojo ladrillo, eventualmente rodeadas de zonas de bilis precipitada. 3. Si no hay colonias tpicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausencia de coliformes. 4. Si hay colonias tpicas, transplante una de estas colonias a agar eosina-azul de metileno-lactosa, segn Levine. Incubar a 35C por 24-48 horas. Las colonias de E. coli en este medio, se caracterizan por dar color negro azulado al trasluz y brillo metlico dorado verdoso a la luz incidente.

5. Transferir las colonias tpicas del agar eosina-azul de metileno-lactosa (agar Levine), a agar nutritivo inclinado y a agar TSI. Incubar a 35C por 24 horas. 6. Los cultivos tpicos de E. coli en agar TSI presentan el bisel amarillo, sin oscurecimiento y con formacin de gas.

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7. Hacer una coloracin de Gram: E. coli es un bacilo Gram negativo no esporulado. 8. Confirmar la presencia de E. coli por medio de pruebas bioqumicas adicionales INVESTIGACIN DE Staphylococcus aureus Y Pseudomonas aeruginosa. MATERIALES Pipetas de 10 mL Propipetas Placas estriles Caldo Soya Casena (90 mL) Agar Vogel-Johnson (o Baird Parker o manitol sal) Agar nutritivo inclinado Plasma EDTA (para coagulasa) Caldo cerebro corazn Agar cetrimide Papel de filtro Reactivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruro Asa y filamento Mechero Equipo para coloracin de Gram Estufa

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PROCEDIMIENTO Transferir con una pipeta estril, 10 mL de la muestra a un baln que contiene 90 mL de caldo soya-casena. Incubar a 30 - 35C por 24 - 48 horas. Aislamiento de Staphylococcus aureus. 1. Agitar la mezcla incubada y mediante un asa hacer aislamiento a agar VogelJohnson (o agar Baird-Parker o agar manitol sal). Incubar a 35C por 24-48 horas. 2. Las colonias tpicas de Staphylococcus aureus en agar Vogel-Johnson o en agar Baird-Parker, son pequeas, negras, rodeadas de una zona amarilla. Agar Baird-Parker Agar Vogel-Johnson

3. Si no hay colonias tpicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Staphylococcus aureus. 4. Si hay colonias tpicas, con ayuda de un filamento, transferir un nmero representativo de las colonias sospechosas a tubos de agar nutritivo inclinado. Incubar a 35C por 24 horas. 5. A partir de los tubos de agar nutritivo, hacer coloracin de Gram: el S. aureus es un coco Gram positivo. Transplantar a tubos con caldo cerebro corazn. Incubar a 35C por 24 horas. 6. Efectuar la prueba de coagulasa de la siguiente forma: En un tubo de Wassermann colocar 0,5 mL de Plasma EDTA (para coagulasa) reconstituido; aadir 2 gotas (0,1 mL) del cultivo de 24 horas del microorganismo
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desarrollado en caldo cerebro corazn. Incubar en bao de agua a 37C, durante 3 horas. Examinar al cabo de este tiempo y luego peridicamente durante 24 horas, para comprobar la formacin de cogulos; cualquier grado de coagulacin, por pequeo que sea , se considera positivo. Si no se observa coagulacin, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Staphylococcus aureus. 7. Confirmar la presencia de S. aureus por medio de pruebas bioqumicas.

AISLAMIENTO DE Pseudomonas aeruginosa. 1. Mediante un asa hacer aislamiento del caldo soya casena a agar cetrimide. Incubar a 35C por 24 horas. 2. Las colonias tpicas de Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimide son pequeas, generalmente de color verdoso, con fluorescencia verdosa a la luz ultravioleta. 3. Si no hay colonias tpicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Ps. aeruginosa. 4. Si hay colonias tpicas, transferir a agar nutritivo inclinado. Incubar a 35C por 24 horas. 5. A partir del agar nutritivo hacer una coloracin de Gram: la Ps. aeruginosa es un bacilo Gram negativo no esporulado. 6. Efectuar la prueba de oxidasa: En una placa de Petri colocar un disco de papel de filtro. Impregnar con el reactivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruro y dejarlo secar en la estufa. Con una pipeta Pasteur estril con la punta cerrada, transferir una pequea cantidad del cultivo del tubo de agar inclinado, al papel de filtro. El desarrollo de un color rosado, casi prpura, se considera una prueba de oxidasa positiva.

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7. Si esta ltima es negativa, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Ps. Aeruginosa.

8. Si la prueba de oxidasa es positiva, la presencia de Ps. aeruginosa debe confirmarse por pruebas bioqumicas adicionales. La validez de los resultados de los ensayos descritos (determinacin del tipo de microorganismo), depender de la demostracin de que las muestras bajo ensayo no presentan de por s, efectos inhibidores de la multiplicacin de los microorganismos que pudieran estar presentes. Por consiguiente, para demostrar el efecto inhibidor de las muestras, se realiza un ensayo adicional, preliminar o simultneo considerado como control positivo que consiste en inocular los caldos de enriquecimiento que se utilizan en las tcnicas descritas anteriormente, con 1 mL de una dilucin 10-3 de un cultivo de 24 horas de cada uno de los microorganismos en investigacin, aadir la cantidad apropiada de muestra y proceder de la misma forma como se describi para el ensayo de la muestra sola. RESULTADOS Anotar los resultados:

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ACTIVIDADES ADICIONALES 1. Escoja un medio selectivo de los que Ud. utiliz en el trabajo asignado. Explique porqu fue seleccionado ese medio. 2. Qu significa el test del IMViC y cules microorganismos nos permite identificar. 3. Porqu en el medio agar TSI, se puede observar fermentacin de azcares y la produccin de H2S. 4. En qu caso se considera que una placa proveniente de una numeracin de microorganismos es contable. 5. Seale si existe alguna (s) diferencia (s) entre el mtodo del recuento en placa por incorporacin y el mtodo del recuento en superficie. 6. Cundo se considera que un producto est deteriorado y cules son las causas. BIBLIOGRAFA Brock T.D. Madigan M.T. Martenko J.J. y Parker J. (Eds) (1999). Biologa de los microorganismos. 8 Edicin. Prentice Hall International. Prescott, L.M. (1999) Microbiology. W.C. Brown Publishers. 4 Edicin. (1998). The Official Compendia os Standards USP 24 NF. The United States Pharmacopeia. The National Formulary. Pharmacopeial Convention Inc. Rockville MD

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ANEXO 1

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO A continuacin se presentan las frmulas y los procedimientos para preparar los medios empleados en este anlisis microbiolgico. En caso de disponer de frmulas comerciales deshidratadas se deben seguir las instrucciones del fabricante para su preparacin.

AGAR TRIPTONA-EXTRACTO DE LEVADURA (AGAR PARA CUENTA ESTNDAR).

Reactivo Cantidad Extracto de levadura 2.5 g Triptona 5.0 g Dextrosa 1.0 g Agar 15.0 g Agua 1.0 L Preparacin:

Suspender los componentes del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total disolucin.

Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 ml, cantidades de aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Esterilizar en autoclave a 121 1.0 C, durante 15 minutos. El pH final del medio debe ser 7.0 0.2 a 25C. Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45C 1.0 C en bao de agua y mantenerlo a esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de fundirse ms de una vez.

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En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante. El medio de cultivo anterior es el de uso ms generalizado. Para algunos alimentos en particular se requerir de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la tcnica para ese alimento. AGAR-ROJO- VIOLETA-BILIS-LACTOSA (RVBA).

Reactivo Cantidad Peptona 7.0 g Extracto de levadura 3.0 g Lactosa 10.0 g Sales biliares 1.5 g Cloruro de sodio 5.0 g Rojo neutro 0.03 g Cristal violeta 0.002 g Agar 15.0 g Agua 1.0 L Preparacin: Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos. Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7.4 con cido clorhdrico 0.1N o con hidrxido de sodio 0.1N a 25C, de forma que despus del calentamiento se mantenga en este valor. Calentar con agitacin constante y hervir durante 2 minutos. Enfriar inmediatamente el medio en un bao de agua hasta que llegue a 45C. Evitar el sobrecalentamiento del medio. No debe esterilizarse en autoclave. Usar el medio dentro de las tres primeras horas despus de su preparacin. En el caso de utilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.

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AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)

Preparacin: Seguir instrucciones del fabricante y despus de esterilizar, enfriar en bao de agua a 45 1C, acidificar a un pH de 3.5 0.1 con cido tartrico estril al 10% (aproximadamente 1.4 ml de cido tartrico por 100 ml de medio). Despus de adicionar la solucin, mezclar y medir el pH con potencimetro. Dejar solidificar una porcin del medio. Hacer esto en cada lote de medio preparado. A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar despus de agregar el cido tartrico.

CALDO LACTOSADO

Reactivo Extracto de carne Peptona de gelatina Lactosa Agua destilada

Cantidad 4,5 g 3,0 g 7,5 g 5,0 g 7,5 g 5,0 g 1.0 L 1.0 L

Ingrediente Medio de Medio de concentracin 1,5 concentracin sencilla Preparacin: Disolver los ingredientes en 1 L de agua, calentando si es necesario o el medio completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH final de tal manera que despus de la esterilizacin ste sea de 6.9 0.2 a 25 C. Distribuir en volmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentracin sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentracin 1.5, cada tubo debe tener campana de fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 1.0 C. Enfriar rpidamente para evitar una exposicin excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color beige.
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Se puede utilizar una concentracin doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearn 10 ml del caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de la muestra. CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE

Reactivo Cantidad Peptona 10 g Lactosa 10 g Sales biliares 20.0 g Verde brillante 0.0133 g Agua destilada 1.0 L Preparacin: Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH, de tal manera que despus de la esterilizacin ste sea de 7.2 a 25 C. Distribuir el medio en cantidades de 10 ml en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campana de fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 1.0 C. Las campanas de fermentacin no deben contener burbujas de aire despus de la esterilizacin. CALDO LACTOSADO Reactivo Extracto de carne Peptona Lactosa Agua destilada pH final Preparacin: Cantidad 3.0 g 5.0 g 5.0 g 1.0 L 6.9 0.2

Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65C.

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Distribuir en porciones de 225 ml, en frascos de 500 ml. Esterilizar durante 15 min a 121C 1C. CALDO TETRATIONATO

Reactivo Cantidad Proteosa peptona o triptona 5.0 g Sales biliares 1.0 g Carbonato de calcio 10.0 g Tiodulfato de sodio5H2O 30.0 g Agua destilada 1.0 L pH final 7.0 0.1 Preparacin: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estril. Distribuir, agitando constantemente, en porciones de 10 y 225 ml, en recipientes estriles. Guardar en refrigeracin. Antes de usar el medio, agregar 2 ml de una solucin yodo-yoduro y 1 ml de solucin de verde brillante al 0.1% por cada 100 ml de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe calentarse y debe usarse el mismo da de su preparacin. AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD)

Cantidad Xilosa 3.75 g L-lisina 5.0 g Lactosa 7.5 g Sacarosa 7.5 g Cloruro de sodio 5.0 g Extracto de levadura 3.0 g Rojo de fenol 0.08 g Agar 15.0 g Desoxicolato de sodio 2.5 g Citrato frrico amnico 0.8 g Tiosulfato de sodio 6.8 g Agua destilada 1.0 L pH final 6.9 0.2
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Reactivo

Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar en bao de agua a 55C, agitando frecuentemente, hasta disolucin completa. Ajustar el pH. Enfriar a 50C y verter en cajas de petri estriles. No se esterilice. El sobrecalentamiento produce una precipitacin; la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeas. El aspecto del medio es claro y de color rojo brillante. AGAR VERDE BRILLANTE (VB)

Reactivo Cantidad Extracto de levadura 3.0 g Polipeptona (Proteosa peptona No. 3) 10.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Lactosa 10.0 g Sacarosa 10.0 g Rojo de fenol 0.08 g Agar 20.0 g Verde brillante 0.0125 g Agua destilada 1.0 L pH final 6.9 0.2 Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullicin, hasta disolucin completa. Ajustar el pH. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121C 1C. El sobrecalentamiento del medio disminuye su selectividad. Enfriar el medio a 50C y distribuirlo en cajas de petri estriles. El aspecto del medio es oscuro, de color marrn.

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AGAR CON SULFITO DE BISMUTO Reactivo Cantidad Extracto de carne de res 5.0 g Mezcla de peptonas 10.0 g Glucosa 5.0 g Fosfato disdico anhidro 5.0 g Sulfato ferroso anhidro 0.03 g Sulfito de bismuto 8.0 g Verde brillante 0.025 g Agar 20.0 g Agua destilada 1.0 L Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua. Calentar hasta su disolucin completa, agitando frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45C y verter en cajas de petri estriles, distribuyendo de manera homognea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es opaco, de color verde plido y deben usarse el mismo da de su preparacin. Si la coloracin es parda, no deben utilizarse. El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad. AGAR PARA Salmonella Y Shigella (SS)

Reactivo Cantidad Extracto de carne 5.0 g Polipeptona 5.0 g Lactosa 10.0 g Sales biliares 8.5 g Citrato de sodio dihidratado 8.5 g Tiosulfato de sodio5H2O 8.5 g Citrato frrico 1.0 g Agar 13.5 g Rojo neutro 0.025 g Verde brillante 0.033 mg Agua destilada 1L pH final 7.0 0.2

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Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada estril y calentar a ebullicin hasta disolucin completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave. Enfriar a 50C y distribuir en cajas de petri estriles en condiciones aspticas. El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado.

MEDIOS PARA PRUEBAS BIOQUMICAS AGAR DE TRES AZCARES Y HIERRO (TSI)

Reactivo Cantidad Peptona de carne 1.0 g Peptona de casena 1.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Lactosa 1.0 g Sacarosa 1.0 g Glucosa 0.1 g Agar 1.3 g Rojo de fenol 2.5 mg Sulfato ferroso amnico5H2O 20 mg Tiosulfato de sodio 20 mg Agua destilada 1L pH final 7.3 0.2 Preparacin: Suspender los ingredientes en 100 ml de agua destilada. Calentar a ebullicin, agitando ocasionalmente, hasta disolucin completa. Enfriar a 60C y ajustar el pH. Distribuir en volmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121C 1C durante 15 min. Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo.

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AGAR DE HIERRO Y LISINA (LIA)

Reactivo Cantidad Peptona de gelatina 0.5 g Extracto de levadura 0.3 g Glucosa 0.1 g L-lisina 1.0 g Citrato frrico amnico 50.0 mg Tiosulfato de sodio anhidro 4.0 mg Prpura de bromocresol 2.0 mg Agar 1.5 g Agua destilada 1L pH final 6.7 0.2 Preparacin: Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta ebullicin con agitacin frecuente hasta conseguir la disolucin completa. Ajustar el pH. Distribuir en volmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm, con tapn de rosca. Esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 12 min. Dejar que los tubos se enfren en posicin inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm. El medio ya preparado es de color prpura. MEDIO DE SIM (PARA SULFURO, INDOL Y MOVILIDAD)

Reactivo Cantidad Extracto de carne 3.0 g Peptona 30.0 g Hierro peptonizado 0.2 g Tiosulfato de sodio 0.025 g Agua destilada 1L pH final 7.3 0.2

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Preparacin: Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullicin agitando frecuentemente hasta lograr una disolucin completa. Enfriar a 50C y ajustar el pH. Distribuir el medio en volmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 15 min. Se dejan enfriar los tubos en posicin vertical. AGAR CITRATO DE SIMMONS Reactivo Cantidad Fosfato de amonio 1.0 g Fosfato dipotsico 1.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Citrato de sodio 2.0 g Sulfato de magnesio 0.2 g Azul de bromotimol 0.08 g Agar 15.0 g Agua destilada 1L pH final 6.8 0.2 Preparacin:

Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullicin agitando frecuentemente hasta lograr una disolucin completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 15 min. Dejar enfriar los tubos en posicin inclinada.

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CALDO MR-VP (ROJO DE METILO-VOGES PROSKAUER)

Reactivo Cantidad Peptona 7.0 g Dextrosa 5.0 g Difosfato de potasio 5.0 g Agua destilada 1L pH final 6.9 0.2 Preparacin: Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullicin agitando frecuentemente hasta lograr una disolucin completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 15 min.

CALDO MANITOL

Reactivo Cantidad Extracto de carne 1.0 g Proteosa peptona 10.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Rojo de fenol 0.018 g Manitol 10.0 g Agua destilada 1L pH final 7.4 0.2 Preparacin: Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH. Distribuir en volmenes de 2 a 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121C 1C durante 15 min.

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CALDO MALONATO

Reactivo Cantidad Extracto de levadura 1.0 g Sulfato de amonio 2.0 g Fosfato dipotsico 0.6 g Cloruro de sodio 0.4 g Malonato 2.0 g Glucosa 3.0 g Azul de bromotimol 0.25 g Agua destilada 1L pH final 6.7 0.2 Preparacin: Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en cantidades de 3 ml. Esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 15 min. CALDO UREA Reactivo Cantidad Urea 20.0 g Extracto de levadura 0.1 g Fosfato monopotsico 9.1 g Fosfato disdico 9.5 g Rojo de fenol 0.01 g Agua destilada 1L pH final 6.7 0.2 Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por filtracin a travs de membrana 0.45 m o en autoclave de 5 a 8 lb de presin durante 15 min. Distribuir aspticamente de 1.5 a 3 ml en tubos estriles de 13 x 100 mm.

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MEDIO BASE DE BAIRD-PARKER

Reactivo Cantidad Tristona 10.0 g Extracto de levadura 1.0 g Extracto de carne 5.0 g Glicina 12.0 g Cloruro de litio 5.0 g Piruvato de sodio 10.0 g Agar 20.0 g Agua destilada 1L Preparacin: Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitacin constante y hervir durante 1 min. Esterilizar a 121C 1 durante 15 min. Enfriar y mantener el medio a 45C.

CALDO DE INFUSIN CEREBRO-CORAZN (BHI)

Reactivo Cantidad Infusin de cerebro de ternera 200.0 ml Infusin de corazn de res 250.0 ml Peptona de gelatina 10.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Fosfato disdico12H2O 2.5 g Glucosa 2.0 g Agua destilada 1L Preparacin Disolver los ingredientes en agua y calentar ligeramente si es necesario. Distribuir y esterilizar durante 15 min a 121C 1.

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MEDIO DE CLORURO DE LITIO FENILETANOL -MOXOLACTAM (LMP) Cantidad Agar fenil etanol 35.5 g Glicina anhidra 10.0 g Cloruro de litio 5.0 g Solucin de moxolactam al 1 % en amortiguador de fosfatos pH 6.0 20.0 ml Agua destilada 1L Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave a 121 1C durante 15 min. Enfriar de 48 a 50C y agregar la solucin de moxolactam previamente esterilizada por filtracin. Distribuir volmenes de 12 a 15 ml del medio en cajas de Petri estriles. Las placas delgadas facilitan la observacin de las colonias. MEDIO OXFORD MEDIO BASE OXFORD (OXA) Reactivo Cantidad Base de agar Columbia 39.0 g Esculina 1.0 g Citrato frrico amnico 0.5 g Cloruro de litio 15.0 g Agua destilada 1L Agregar los ingredientes a un litro de agua y llevar a ebullicin hasta disolucin completa. Esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 min. Enfriar a 50C el medio base y en condiciones aspticas agregar los suplementos. Un litro de medio Oxford debe contener los siguientes suplementos: SUPLEMENTOS Reactivo

Reactivo Cantidad Cicloheximida 400.0 mg Sulfato de colistina 20.0 mg Acriflavina 5.0 mg Cefotetn 2.0 mg Fosfomicina 10.0 mg
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Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetn y la fosfomicina en 10 ml de una mezcla 1:1 de etanol: agua. Esterilizar por filtracin antes de agregar al medio base. Mezclar y vaciar en cajas Petri estriles. Las placas del medio Oxford se pueden almacenar como mximo dos semanas.

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SOLUCIONES CIDO TARTRICO Reactivo Cantidad Acido tartrico 10.0 g Agua destilada 100.0 ml Preparacin: Disolver el cido en el agua y esterilizar a 121 1.0 C por 15 minutos o por filtracin a travs de membrana de 0.45 m.

SOLUCIN VERDE BRILLANTE AL 0,1% (1:1000) Reactivo Cantidad Verde brillante 0.1 g Agua destilada estril 100.0 ml

Disolver 0,1 g de verde brillante en agua destilada estril hasta completar 100 ml.

SOLUCIN DE YODO-YODURO Reactivo Cantidad Cristales de yodo 6.0 g Yoduro de potasio 6.0 g Agua destilada 100.0 ml Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100 ml. Conservar en frasco mbar.

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SOLUCIN SALINA AL 0,85% Reactivo Cantidad Cloruro de sodio 0.85 g Agua destilada 100.0 ml Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121C 1C durante 15 min.

SOLUCIN SALINA FORMALIZADA Reactivo Cantidad Solucin de formaldehdo (36-38%) 6.0 ml Cloruro de sodio 8.5 g Agua destilada estril 1L Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada. Esterilizar a 121C 1C durante 15 min. Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 ml de la solucin de formaldehdo. No esterilizar despus de la adicin de formaldehdo.

REACTIVO DE KOVAC Reactivo Cantidad p-dimetil-aminobenzaldehdo 5.0 g Alcohol amlico 75.0 ml cido clorhdrico concentrado 25.0 ml Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehdo en el alcohol amlico y despus agregar el cido clorhdrico lentamente. Conservar en frasco mbar en refrigeracin. SOLUCIN DE ALFA-NAFTOL AL 5% Reactivo Cantidad Alfa-naftol 5.0 g Alcohol 100.0 ml Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta completar 100 ml.

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SOLUCIN DE ROJO DE METILO Reactivo Cantidad Rojo de metilo 0.1 g Alcohol etlico 300.0 ml Agua destilada c.b.p. 500.0 ml Disolver el rojo de metilo en el alcohol etlico y adicionar agua hasta completar 500 ml.

SOLUCIN DE HIDRXIDO DE POTASIO AL 40% Reactivo Cantidad Hidrxido de potasio 40.0 g Agua destilada 100.0 ml Disolver 40 g de hidrxido de potasio en agua hasta completar 100 ml.

SOLUCIN DE GELATINASA AL 5% Reactivo Cantidad Gelatinasa 5.0 g Agua destilada 100 ml Disolver 5 g de gelatinasa en 100 ml de agua destilada. NO CALENTAR.

PLASMA DE CONEJO Emplear plasma de conejo deshidratado o rehidratado siguiendo las instrucciones del fabricante y agregar cido etilendiaminotetractico (EDTA) en solucin al 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma deshidratado diluir con agua estril en proporcin de 1:3. Puede emplearse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe emplearse sangre deshidratada.

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REACTIVOS PARA TINCIN DE GRAM

ALCOHOL-ACETONA Reactivo Cantidad Etanol (95%) 700.0 ml Acetona 300.0 ml Preparacin: Mezclar ambos lquidos.

CRISTAL VIOLETA Solucin A Reactivo Cantidad Cristal violeta 2.0 g Etanol (95%) 20.0 ml Disolver el cristal violeta en el etanol.

Solucin B Reactivo Cantidad Oxalato de amonio 0.8 g Agua 80.0 ml Disolver el oxalato de amonio en el agua. Despus de preparar las soluciones A y B, verter una en la otra y agitar hasta que se mezclen perfectamente.

SOLUCIN DE YODO Reactivo Cantidad Yodo 1.0 g Yoduro de potasio 2.0 g Agua destilada 300.0 ml

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Triturar finamente el yodo y el yoduro de potasio en un mortero, de ser posible en una campana de extraccin. Aadir una pequea cantidad de agua para lavar el material, agregar el resto del agua y agitar. Nota: Evitar el contacto de los reactivos con la piel!

SOLUCIN DE SAFRANINA Reactivo Cantidad Safranina 0.25 g Etanol (95%) 10.0 ml Agua destilada 100.0 ml Disolver la safranina en el etanol, mezclar, agregar el agua y volver a agitar. Filtrar la solucin con papel filtro.

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ANEXO 2

PREPARACIN Y DILUCIN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU ANLISIS MICROBIOLGICO SOLUCIONES Solucin de hidrxido de sodio 1,0 N Hidrxido de sodio 4,0 g Agua 100 mL Disolver el hidrxido de sodio y llevar a 100 mL con agua.

Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada). Fosfato de sodio monobsico 34,0 g Agua 1,0 L Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solucin de hidrxido de sodio 1,0 N. Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante 15 minutos a 121 1,0C. Conservar en refrigeracin (solucin concentrada). Tomar 1,25 mL de la solucin concentrada y llevar a un litro con agua (solucin de trabajo). Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL segn se requiera. Esterilizar a 121 1,0C durante 15 minutos. Despus de la esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la solucin de trabajo debern ser iguales a los iniciales.

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Agua peptonada Peptona 1,0 g Cloruro de sodio 8,5 g Agua 1,0 L Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7 0,1 con hidrxido de sodio 1,0 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen mltiplo de nueve segn se requiera. Esterilizar a 121 1,0C durante 15 minutos. Despus de la esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la solucin de trabajo debern ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composicin.

PREPARACIN DE LA DILUCIN PRIMARIA 1. A PARTIR DE MUESTRAS LQUIDAS:

Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribucin de microorganismos es homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos (agitacin, etc.). Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo en bao de agua de 40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
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a) Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a sta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. b) Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alcuotas mayores, por ejemplo volmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 mL, de la misma forma que se describi anteriormente 2. A PARTIR DE MUESTRAS SLIDAS O SEMISLIDAS Las muestras slidas y semislidas congeladas, deben descongelarse en refrigeracin de 4 a 8 C durante 18 horas y no ms de 24 horas antes de proceder a su anlisis.

a) Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plstica estriles de tamao adecuado. b) Adicionar un volumen de 90 a 99 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra. c) Operar la licuadora o el homogeneizador peristltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensin completa y homognea segn se indique en la tcnica correspondiente para cada alimento. An en los equipos ms lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos. d) Permitir que las partculas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de las capas superiores de la suspensin. e) Cuando la dilucin primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar ms diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresin de resultados. f) El homogeneizador peristltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo, aquellos con partculas agudas o constituyentes que no se dispersen fcilmente). Debe ser utilizado slo cuando exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los
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resultados obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora. PREPARACIN DE LAS DILUCIONES DECIMALES ADICIONALES a) Transferir 1 mL o un mltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL de la dilucin primaria 1 + 9 (10-1), en otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. b) Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se describe en a) para muestras lquidas (dilucin primaria). c) La seleccin de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del nmero esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de anlisis previos y de la informacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado. En ausencia total de informacin, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. d) Utilizar pipetas diferentes para cada dilucin inoculando simultneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta. e) Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de lquido equivalente a su capacidad total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un rea de la caja Petri sin lquido. f) Mientras se afora el lquido de la pipeta, la punta de sta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posicin vertical, para lo cual este ltimo debe inclinarse lo necesario. g) En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 mL o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores. h) El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el nmero de microorganismos esperado es:

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Para la tcnica del nmero ms probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el microorganismo en 10 mL de la dilucin ms alta. Para la tcnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un mnimo de una de tres diluciones en el mtodo de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de otros grupos microbianos, considerar el nmero especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana correspondiente.

Las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del anlisis y stas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparacin.

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ANEXO 3 CRITERIOS PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA a) Despus de la incubacin, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias, usando el contador de colonias y el registrador. Las placas de al menos una de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando slo una dilucin est en el intervalo apropiado, vase el Cuadro 1, ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilucin y reportar. b) Cuando dos diluciones estn en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada por cada dilucin antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro, vase el Cuadro 1, ejemplo 2. c) Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se presentan las siguientes guas: d) Placas con menos de 25 colonias.- Cuando las placas corridas para la menor dilucin muestran cuentas de menos de 25 colonias, contar el nmero de colonias presentes en dicha dilucin, promediar el nmero de colonias y multiplicar por el factor de dilucin para obtener el valor estimado de cuenta en placa. Aclarar en su informe esta situacin agregando la leyenda "valor estimado", vase el Cuadro 1, ejemplo 3. e) Placas con ms de 250 colonias.- Cuando el nmero de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribucin de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del rea de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de dimetro contiene 65 cuadros de la cuadrcula del contador. Aclarar en el informe esta situacin agregando la leyenda "valor estimado", vase el Cuadro 1, ejemplo 4. f) Colonias extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes formas:

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g) Cadenas de colonias no separadas claramente entre s, que parecen ser causadas por la desintegracin de un cmulo de bacterias. h) Colonias que se desarrollan en pelcula entre el agar y el fondo de la caja. i) Colonias que se desarrollan en pelcula en la orilla de la caja sobre la superficie del agar. j) Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompaadas de inhibicin del crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represin del crecimiento que por s mismo excede el 25% de la superficie de la caja. k) Cuando es necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no estn incluidas en j), contar cualquiera de los tipos g), h) e i), como provenientes de una sola fuente. En el caso de las colonias del tipo g), si la caja contiene una sola cadena, contar como una sola colonia, si la caja contiene varias cadenas que parecen originarse de fuentes separadas, contar cada cadena como colonia individual. No contar cada colonia de la cadena individualmente. Las colonias del tipo h) e i) generalmente se observan como crecimiento diferenciable de otras colonias y se cuentan como tales. Los crecimientos tipo j), reportarlos como crecimiento extendido. En caso de que una dilucin se encuentre dentro del rango y otra dilucin presente colonias de crecimiento extendido, reportar la dilucin en la que se pueden contar las colonias, vase el Cuadro 1, ejemplo 5 l) Placas sin colonias.- Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilucin ms baja usada, vase el Cuadro 1, ejemplo 6. m) Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con ms de 250 colonias.- Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado ms de 250 colonias, contar ambas placas incluyendo la que est fuera del intervalo para determinar la cuenta en placa, vase el Cuadro 1, ejemplo 7. n) Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilucin dentro del intervalo de 25 a 250 colonias.- Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el nmero de colonias especificadas en el intervalo, contar el nmero de colonias de las cuatro placas para calcular la cuenta en placa, vase el Cuadro 1, ejemplo 8.

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o) Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilucin dentro del intervalo de 25 a 250 y slo una de la otra dilucin dentro del mismo. Contar las cuatro cajas incluyendo aqulla con menos de 25 o ms de 250 colonias, para calcular la cuenta en placa, vase el Cuadro 1, ejemplo 9. p) Despus de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de la dilucin para obtener el nmero de UFC por mililitro o gramo de la muestra. Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que slo aparezcan dos dgitos significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar el segundo dgito al nmero inmediato superior cuando el tercer dgito de la derecha sea cinco o mayor (por ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer dgito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dgito con cero y el segundo dgito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400): q) Reportar como: Unidades formadoras de colonias,___ UFC/g o mL, de bacterias aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura o agar para cuenta estndar, incubadas ________ horas a _______ C.

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Cuadro 1. Clculo de los valores de la cuenta en placa (Ensayos por duplicado) Ejemplo nmero 1:100 >250 1 >250 2 >250 18 3 14 >250 4 >250 >250 5 >250 6 7 >250 >250 8 >250 >250 >250 9 >250 >250 275 2 25 32 270000 26 262 215 235 42 20 230000 26 268 216 19 23 280000 0 >250 235 0 240 crecimiento extendido 0 24 >250 240 495 34 290000 0 >250 0 512 5000000 238 2 28 0 1600 190 220 17 25 250000 Colonias contadas 1:1000 178 UFC/g o mL 1:10000 16 180000

<100 250000

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ANEXO 4 CLCULO DEL NMP CUADRO 3.- Ejemplos de la seleccin de resultados positivos para el clculo del NMP. Nmero de tubos positivos obtenidos de tres E J E M P L O Otros productos (g) productos 1 10-1 10-2 10-3 10-4 lquido tubos incubados, para las siguientes cantidades de muestra inoculada por tubo2a Producto lquido (ml) 10 1 10-1 10-2 10-3 Producto Otros NMP1b

mayor dilucin = menor concentracin ml-1 1 2 3 3 3 3 2 3 1 0 0 15 24 (5)3* 150 (5)5* 240 g-1 (6)4* (6)6*

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3 4 5

2 3 2

2 3 2

1 0 0

1 0 1

0 0 0

(6)7* 70

(7)8* (5)10* (5)12*

2,4 (4)9* 24 0,21 (4)11*2,1

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CUADRO 4. Indice del NMP y lmites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 10, 1,0 y 0,1 g)13a 3 tubos por dilucin combinacin ndice de positivos 0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-2-1 2-3-0 3-0-0 3-0-1 3-0-2 3-1-0 3-1-1 3-1-2 3-2-0 3-2-1 del NMP por g <0,03 0,03 0,03 -0,04 0,07 0,07 0,11 0,11 0,09 0,14 0,15 0,20 0,21 0,28 -0,23 0,39 0,64 0,43 0,75 1,20 0,93 1,50 95% Lmites de confianza bajo <0,005 <0,005 <0,005 -<0,005 0,01 0,01 0,03 0,03 0,01 0,03 0,03 0,07 0,04 0,10 -0,04 0,07 0,15 0,07 0,14 0,30 0,15 0,30 alto <0,09 <0,09 0,13 -0,20 0,21 0,23 0,36 0,36 0,36 0,37 0,44 0,89 0,47 1,50 -1,20 1,3 3,80 2,1 2,3 3,8 3,80 4,40 5 tubos por dilucin ndice del NMP por g <0,02 0,02 0,02 0,04 0,02 0,04 0,04 0,06 0,06 0,05 0,07 0,07 0,09 0,09 -0,12 0,08 0,11 -0,11 0,14 -0,14 0,17 95% Lmites de confianza bajo <0,005 <0,005 <0,005 <0,005 <0,005 <0,005 <0,005 <0,005 <0,005 <0,005 0,01 0,01 0,02 0,02 -0,03 0,01 0,02 -0,02 0,04 -0,04 0,05 alto <0,07 0,07 0,07 0,11 0,07 0,11 0,11 0,15 0,15 0,13 0,17 0,17 0,21 0,21 -0,28 0,19 0,25 -0,25 0,34 -0,34 0,46

90

3-2-2 3-3-0 3-3-1 3-3-2 3-3-3 4-0-0 4-0-1 4-1-0 4-1-1 4-1-2 4-2-0 4-2-1 4-3-0 4-3-1 4-4-0 5-0-0 5-0-1 5-0-2 5-1-0 5-1-1 5-1-2 5-2-0 5-2-1 5-2-2 5-3-0 5-3-1 5-3-2 5-3-3 5-4-0 5-4-1 5-4-2 5-4-3 5-4-4 5-5-0

2,10 2,40 4,60 11,0 >11,0 ------------------------------

0,35 0,36 0,71 1,50 >1,50

4,70 13,0 24,0 48,0 >48,0

-----0,13 0,17 0,17 0,21 0,26 0,22 0,26 0,27 0,33 0,34 0,23 0,31 0,43 0,33 0,46 0,63 0,49 0,70 0,94 0,79 1,10 1,4 1,80 1,30 1,70 2,20 2,80 3,50 2,40

-----0,03 0,05 0,05 0,07 0,09 0,07 0,09 0,09 0,11 0,12 0,07 0,11 0,15 0,11 0,16 0,21 0,17 0,23 0,28 0,25 0,31 0,37 0,44 0,35 0,43 0,57 0,90 1,20 0,68

-----0,31 0,46 0,46 0,63 0,78 0,67 0,78 0,80 0,93 0,93 0,70 0,89 1,14 0,93 1,2 1,5 1,3 1,70 2,2 1,9 2,5 3,4 5,0 3,0 4,9 7,0 8,5 10,0 7,5
91

5-5-1 5-5-2 5-5-3 5-5-4

-----

3,50 5,40 9,20 16,09

1,60 1,80 3,0 6,40

10,0 14,0 32,0 58,0

CUADRO 5. Indice del NMP y lmites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 1,0, 0,1 y 0,01 g)14a 3 tubos por dilucin combinacin ndice de positivos 0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-2-1 2-3-0 3-0-0 3-0-1 3-0-2 3-1-0 del NMP por g <0,3 0,3 0,3 -0,4 0,7 0,7 1,1 1,1 0,9 1,4 1,5 2,0 2,1 2,8 -2,3 3,9 6,4 4,3 95% Lmites de confianza bajo <0,05 <0,05 <0,05 -<0,05 0,1 0,1 0,3 0,3 0,1 0,3 0,3 0,7 0,4 1,0 -0,4 0,7 1,5 0,7 alto <0,9 <0,9 1,3 -2,0 2,0 2,3 3,6 3,6 3,6 3,7 4,4 8,9 4,7 15,0 -12,0 13,0 38,0 21,0 5 tubos por dilucin ndice del NMP por g <0,2 0,2 0,2 0,4 0,2 0,4 0,4 0,6 0,6 0,5 0,7 0,7 0,9 0,9 -1,2 0,8 1,1 -1,1 95% Lmites de confianza bajo <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 0,1 0,1 0,2 0,2 -0,3 0,1 0,2 -0,2 alto <0,7 0,7 0,7 0,11 0,7 1,1 1,1 1,5 1,5 1,3 1,7 1,7 2,1 2,1 -2,8 1,9 2,5 -2,5

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3-1-1 3-1-2 3-2-0 3-2-1 3-2-2 3-3-0 3-3-1 3-3-2 3-3-3 4-0-0 4-0-1 4-1-0 4-1-1 4-1-2 4-2-0 4-2-1 4-3-0 4-3-1 4-4-0 5-0-0 5-0-1 5-0-2 5-1-0 5-1-1 5-1-2 5-2-0 5-2-1 5-2-2 5-3-0 5-3-1 5-3-2 5-3-3 5-4-0 5-4-1

7,5 12,0 9,3 15,0 21,0 24,0 46,0 110,0 >110,0 --------------------------

1,4 3,0 1,5 3,0 3,5 3,6 7,1 15,0 >15,0

23,0 38,0 38,0 44,0 47,0 130,0 240,0 480,0 >480,0

1,4 -1,4 1,7 -----1,3 1,7 1,7 2,1 2,6 2,2 2,6 2,7 3,3 3,4 2,3 3,1 4,3 3,3 4,6 6,3 4,9 7,0 9,4 7,9 11,0 14,0 18,0 13,0 17,0

0,4 -0,4 0,5 -----0,3 0,5 0,5 0,7 0,9 0,7 0,9 0,9 1,1 1,2 0,7 1,1 1,5 1,1 1,6 2,1 1,7 2,3 2,8 2,5 3,1 3,7 4,4 3,5 4,3

3,4 -3,4 4,6 -----3,1 4,6 4,6 6,3 7,8 6,7 7,8 8,0 9,3 9,3 7,0 8,9 11,4 9,3 12,0 15,0 13,0 17,0 22,0 19,0 25,0 34,0 50,0 30,0 49,0
93

5-4-2 5-4-3 5-4-4 5-5-0 5-5-1 5-5-2 5-5-3 5-5-4

---------

22,0 28,0 35,0 24,0 35,0 54,0 92,0 161,0

5,7 9,0 12,0 6,8 12,0 18,0 30,0 64,0

70,0 85,0 100,0 75,0 100,0 140,0 320,0 580,0

CUADRO 6. Indice del NMP y lmites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 0,1, 0,01 y 0,001 g)15a 3 tubos por dilucin combinacin ndice de positivos 0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-2-1 2-3-0 del NMP por g <3 3 3 -4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 -95% Lmites de confianza bajo <0,5 <0,5 <0,5 -<0,5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 -alto <9 9 13 -20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 150 -5 tubos por dilucin ndice del NMP por g <2 2 2 4 2 4 4 6 6 5 7 7 9 9 -12 95% Lmites de confianza bajo <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 1,0 1,0 2,0 2,0 -3,0 alto <7 7 7 11 7 11 11 15 15 13 17 17 21 21 -28

94

3-0-0 3-0-1 3-0-2 3-1-0 3-1-1 3-1-2 3-2-0 3-2-1 3-2-2 3-3-0 3-3-1 3-3-2 3-3-3 4-0-0 4-0-1 4-1-0 4-1-1 4-1-2 4-2-0 4-2-1 4-3-0 4-3-1 4-4-0 5-0-0 5-0-1 5-0-2 5-1-0 5-1-1 5-1-2 5-2-0 5-2-1 5-2-2 5-3-0 5-3-1

23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 >1100 ----------------------

4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150 >150

120 13 380 210 230 380 380 440 470 130 240 480 >480

8 11 -11 14 -14 17 -----13 17 17 21 26 22 26 27 33 34 23 31 43 33 46 63 49 70 94 79 110

1,0 2,0 -2,0 4,0 -4,0 5,0 -----3,0 5,0 5,0 7,0 9,0 7,0 9,0 9,0 11,0 12,0 7,0 11,0 15,0 11,0 16,0 21,0 17,0 23,0 28,0 25,0 31,0

19 25 -25 34 -34 46 -----31 46 46 63 78 67 78 80 93 93 70 89 114 93 120 150 130 170 220 190 250
95

5-3-2 5-3-3 5-4-0 5-4-1 5-4-2 5-4-3 5-4-4 5-5-0 5-5-1 5-5-2 5-5-3 5-5-4

-------------

140 180 130 170 220 280 350 240 350 540 920 1600

37,0 44,0 35,0 43,0 57,0 90,0 120,0 68,0 120,0 180,0 300,0 640,0

340 500 300 490 700 850 1000 750 1000 1400 3200 5800

CUADRO 7. Indice del NMP y lmites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 0,01, 0,001 y 0,0001 g)16a 3 tubos por dilucin combinacin ndice de positivos 0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 del NMP por g <30 30 30 -40 70 70 110 110 90 140 150 95% Lmites de confianza bajo <5 <5 <5 -<5 10 10 30 30 10 30 30 alto <90 <90 130 -200 210 230 360 360 360 370 440 5 tubos por dilucin ndice del NMP por g <20 20 20 40 20 40 40 60 60 50 70 70 95% Lmites de confianza bajo <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 10 10 alto <70 70 70 110 70 110 110 150 150 130 170 170

96

2-1-1 2-2-0 2-2-1 2-3-0 3-0-0 3-0-1 3-0-2 3-1-0 3-1-1 3-1-2 3-2-0 3-2-1 3-2-2 3-3-0 3-3-1 3-3-2 3-3-3 4-0-0 4-0-1 4-1-0 4-1-1 4-1-2 4-2-0 4-2-1 4-3-0 4-3-1 4-4-0 5-0-0 5-0-1 5-0-2 5-1-0 5-1-1 5-1-2 5-2-0

200 210 280 -230 390 640 430 750 1200 930 1500 2100 2400 4600 11000 >11000 ------------------

70 40 100 -40 70 150 70 140 300 150 300 350

890 470 1500 -1200 1300 3800 2100 2300 3800 3800 4400 4700

90 90 -120 80 110 -110 140 -140 170 -----130 170 170 210 260 220 260 270 330 340 230 310 430 330 460 630 490

20 20 -30 10 20 -20 40 -40 50 -----30 50 50 70 90 70 90 90 110 120 70 110 150 110 160 210 170

210 210 -280 190 250 -250 340 -340 460 -----310 460 460 630 780 670 780 800 930 930 700 890 1140 930 1200 1500 1300
97

360 13000 710 24000 1500 48000 >1500>48000

5-2-1 5-2-2 5-3-0 5-3-1 5-3-2 5-3-3 5-4-0 5-4-1 5-4-2 5-4-3 5-4-4 5-5-0 5-5-1 5-5-2 5-5-3 5-5-4

-----------------

700 940 790 1100 1400 1800 1300 1700 2200 2800 3500 2400 3500 5400 9200 16000

230 280 250 310 370 440 350 430 570 900 680

1700 2200 1900 2500 3400 5000 3000 4900 7000 8500 7500

1200 10000 1200 10000 1800 14000 3000 32000 6400 58000

11. Informe de la prueba Informar "Nmero ms probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra". En caso de muestras de agua informar NMP/100 ml. 12. Concordancia con normas internacionales Esta norma no tiene concordancia con normas internacionales.

98

TRATAMIENTO DE RESIDUOS El tratamiento en el punto de generacin, en el laboratorio, de los residuos qumicos peligrosos es consistente con el fin de minimizar los riesgos para la salud humana y para el medio ambiente. El tratamiento en el laboratorio reduce o elimina las caractersticas que hacen de un residuo qumico, un residuo peligroso. Los pasos del tratamiento que estn incluidos como parte del procedimiento de laboratorio no necesitan ser autorizados, pero a veces se requiere de la supervisin del especialista en manejo de residuos peligrosos. Use los siguientes procedimientos generales para neutralizar cidos minerales concentrados:

Figura 1. Tratamiento de cidos.

Peligro: Calor y vapores son generados durante este procedimiento. Realizar este procedimiento en un campana de vapores con el apropiado equipo de proteccin personal. Varias quemaduras podran resultar si se utiliza inapropiadamente el equipo de proteccin personal. No neutralizar cido fluorhdrico usando este mtodo.

Lentamente diluya el cido mineral concentrado de 1 a 10 con agua fra, adicionando el cido en el agua. Adicione 30 mg/l de fosfato de sodio o 20 mg/l de fosfato hidrgeno de sodio en el cido diluido. Mientras se agita, lentamente adicione hidrxido de sodio 1 N al cido mineral diluido hasta que la solucin obtenga un pH entre 5.5 y 12. Use los siguientes procedimientos generales para neutralizar bases concentradas:

99

Peligro: Calor y vapores son generados durante este procedimiento. Realizar este procedimiento en un campana de vapores con el apropiado equipo de proteccin personal. Varias quemaduras podran resultar si se utiliza inapropiadamente el equipo de proteccin personal.

Lentamente diluya la base concentrada de 1 a 10 con agua fra, adicionando la base en el agua. Adicione 30 mg/l de fosfato de sodio o 20 mg/l de fosfato hidrgeno de sodio en la base diluida. Mientras se agita, lentamente adicione cido clorhdrico 1 M a la base diluida hasta que la solucin obtenga un pH entre 5.5 y 12. Tratamiento de residuos que no se conoce su formulacin. En un frasco de vidrio o de plstico que no sea reactivo almacenar el compuesto. No juntar otras sustancias con el compuesto, siga las instrucciones de la figura 2.

Figura 2. Pasos para tratar un compuesto desconocido. Tratamiento de material biolgico- infeccioso. Se consideran residuos peligrosos biolgico-infecciosos los siguientes:

Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e histolgico, excluyendo orina y excremento. Los recipientes desechables que contengan sangre lquida. Los materiales de curacin, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de los siguientes fluidos corporales: lquido sinovial, lquido pericrdico, lquido pleural, lquido Cfalo- Raqudeo o lquido peritoneal.

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Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier material usado para contener stos. Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a agentes enteropatgenos. Los objetos punzocortantes Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biolgicas durante el diagnstico y tratamiento: o tubos capilares o navajas o lancetas o agujas de jeringas desechables o agujas hipodrmicas o agujas de sutura o agujas de acupuntura o Agujas para tatuaje o Bisturs o estiletes de catter

Particularmente, para el manejo de objetos punzocortantes, se deben tener las siguientes consideraciones:

Debern ser rgidos De polipropileno color rojo, con un contenido de metales pesados de no ms de una parte por milln y libres de cloro Resistentes a fracturas y prdidas de contenido al caerse Destructibles por mtodos fsicos, tener separador de agujas y abertura para depsito, con tapa(s) de ensamble seguro y cierre permanente, debern contar con la leyenda que indique RESIDUOS PELIGROSOS PUNZOCORTANTES BIOLOGICOINFECCIOSOS y marcados con el smbolo universal de riesgo biolgico.

Todo esto, con base en la norma NOM-087/ECOL/SSA1-2002.

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Figura 3. Recipientes para el manejo de materiales punzo-cortantes. En el caso de muestras contaminadas o usadas para anlisis microbiolgico se desecharan en bolsas rojas etiquetadas adecuadamente con el formato de residuos biolgicos proporcionado por el tcnico en turno, el cual tendr que llevar la siguiente informacin: nombre del responsable, fecha, lugar, tipo de contaminante, tipo de muestras, tratamiento preventivo utilizado, patogenicidad del desecho. Las bolsas estarn libres de cristales o metal, solo puede ingresar plstico combustible (cajas Petri) junto con la muestra. Los guantes son recogidos en bolsas amarillas, al igual que otros instrumentos utilizados, tal es el caso de cubre bocas, cofia, etc. En el caso de lquidos es necesario utilizar recipientes con tapa de color rojo con etiquetas que indiquen su contenido.

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