Biologa Celular y Molecular. Gua de TP Nro. 1 Cultivo primario de embrin de pollo.

Introduccin El cultivo de clulas generado a partir de material tomado directamente de un organismo se denomina cultivo primario. Las clulas obtenidas de esta forma son clulas normales adaptadas al crecimiento in vitro. En la actualidad, el cultivo de clulas normales es una poderosa herramienta en el estudio de la biologa celular y molecular. La ventaja de la utilizacin de clulas normales radica en la similitud de stas a las clulas presentes en el organismo, a diferencia de las lneas celulares establecidas o continuas que por sus caractersticas de inmortalidad tienen comportamientos anmalos. Las clulas obtenidas de un cultivo primario no son inmortales por lo que el nmero de divisiones celulares que pueden sufrir en cultivo es limitado y vara dependiendo del origen del cultivo, de las condiciones de cultivo y del tipo celular, entre otras cosas. Las tcnicas de cultivo de clulas normales utilizan principalmente como materia prima organismos que estn en estadios embrionarios o postnatales tempranos. En este prctico se buscar cultivar diferentes clulas totales procedentes de un embrin de pollo. Se obtendr por consiguiente una poblacin heterognea compuesta de distintos tipos celulares. Con el cultivo en marcha se podrn diferenciar distintas morfologa celulares acordes al tipo celular de origen: clulas epiteliales, fibroblastos, miocitos, neuronas, etc.

Desarrollo de la prctica Los alumnos sern divididos en cuatro grupos iguales. A cada grupo se le proveer de un huevo embrionado en condiciones ptimas para la realizacin de la prctica. El protocolo a realizarse en la prctica es el siguiente: 1) Observar el huevo con un ovoscopio para constatar que este vivo. Localizar y marcar sobre la cscara con un marcador la cmara de aire. 2) Desinfectar la cascara del huevo con alcohol 70 en la zona de la cmara de aire. 3) Romper y sacar la cascara de la zona marcada con una pinza. 4) Con otro instrumento, romper la membrana coclear y sacar el embrin de forma estril, tratando de no tocar la yema. Ponerlo en una caja de Petri estril.

5) Lavar con solucin fisiolgica estril al embrin. 6) Descartar, cortando con un bistur, vsceras, pico, ojos y patas. Si es necesario volver a lavar para eliminar todo resto de sangre.

7) Pasar el material limpio a una caja de Petri estril y cortarlo en trozos chicos con una tijera. 8) Agregar tripsina pre-calentada a 37C en un volumen igual a tres veces el volumen estimado del embrin. 9) Transferir esta solucin, usando una pipeta Pasteur de boca ancha, a un Erlenmeyer que contenga un imn estril. 10) Agitar usando el agitador electromagntico a 37C. 11) Se van tomando muestras del tripsinizado a distintos tiempos y se observa al microscopio si van apareciendo clulas libres. 12) Cuando hay desprendimiento de abundantes clulas se filtra por un embudo con gasa estril o por malla metlica. El filtrado se recoge en un tubo de centrifuga con suero para detener la accin de la tripsina. 13) Centrifugar a 800 - 1000 r.p.m. durante 5 min. 14) Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet con 10 ml de medio de cultivo. 15) Diluir con el medio de cultivo adecuado adicionando
6 10 % de suero y sembrar 0,5 x 10 cel/ml.

Las clulas sern monitoreadas para que estn en condiciones de ser observadas en el prctico posterior.

Ejercicios En qu se basa el mtodo enzimatico utilizado para despegar las clulas?

Qu caracteristicas de adhesin al sustrato debe tener una clula para poder ser observada en el cultivo primario de embri? En funcin de esta caracterstica, qu tipos celulares no estn representados en este cultivo?

Observar el cultivo obtenido y determinar segun la forma a que tipo celular podra corresponder la clula observada. Buscar por lo menos tres tipos diferentes de clulas y hacer un esquema.

Qu tipo celular es el mas representado? Cual sera el motivo?