Cuantificacin Microbiana

MEDICIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

AGM 2014-I

Antecedentes
Manejo de operaciones con exponentes y diluciones Conceptos como: soluto, disolucin, dilucin, solucin, inoculacin, crecimiento. Caractersticas nutrimentales de los microorganismos. Medios de cultivo: Clasificacin y uso Condiciones de desarrollo.

Muestras
Puras o mixtas (benficos nocivos). SIN microorganismos. Ej. productos estriles Pocos microorganismos. Ej. Agua embotellada Muchos microorganismos. Ej. Yogurt

Muchos microorganismos. Ej. Agua contaminada

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Cuantificacin de microorganismos
Cuantificar : Conocer el nmero de microorganismos en una muestra.

Medidas de crecimiento microbiano

Clulas viables
1. Recuento en caja Petri (placa)
Vertido

Clulas totales
1.

en placa
2.

Conteo microscpico: Breed Turbidimetra: Espectrofotometro.

Extensin superficial Miles-Misra

2. Nmero ms probable(NMP)

3. Filtracin

3.

Contadores Electrnicos
Biomasa

4.

Medidas de crecimiento microbiano

Recuento Indirecto (Clulas viables)
1. Recuento en caja Petri

(placa) Diluciones y vertido en placa Extensin superficial Miles-Misra 2. Nmero ms probable(NMP) 3. Filtracin

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Mtodos para el conteo de microorganismos viables

Estos mtodos se basan en poner en evidencia la presencia de los microorganismos vivos.

Requieren al menos 24 horas para el cultivo y la interpretacin de resultados.

Se emplean medios de cultivo generales, enriquecidos selectivos y diferenciales dependiendo de los microorganismos a cuantificar.

Cuenta en medios slidos en caja Petri

Se determina el nmero de microorganismos en una muestra en relacin a las colonias que forman, las UFC (Unidades Formadoras de Colonias). Se emplean soluciones diluidas o diluciones de una muestra concentrada para que cada colonia formada provenga de un solo microorganismo aunque algunas agrupaciones no pueden ser separadas por las diluciones. Se utilizan principalmente para la cuantificacin de bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Se reporta como: UFC ****/unidad de volumen o peso

Tcnica de dilucin y vertido en placa: conteo de colonias

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Diluciones y cuenta en placa

Cuenta de colonias

Criterio: 25 a 200 UFC por placa

Comentarios acerca del mtodo No usar para muestras con pocos microorganismos.

Las diluciones mal hechas, el medio de cultivo muy caliente, la mala homogenizacin, error al contar y en los clculos, pueden ser
PUNTOS CRTICOS

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Conteo en placas

Cajas Agar Nutritivo

Dilucin

No. colonias (UFC)

UFC/100 ml

UFC/ml

1:100000

132

1.32107

1.32108

1:10000

706

7.06106

7.06107

1:1000

1200

1.2106

1.2107

Recordar:
La tcnica de siembra por agotamiento NO sirve para cuantificar microorganismos.

Tcnica de vertido

Tcnica de extensin

Variaciones del recuento en placa

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Vaciado en placa y extendido en placa

VARIACIONES DEL RECUENTO EN PLACA (Extensin superficial)

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Cuantificacin fngica

Contador automtico de colonias de alta resolucin

Contador de colonias automtico

Se pueden contar todo tipo de colonias en cualquier tipo de medio, no importa qu tipo de colonias se cuenten, el instrumento est equipado con una cmara de alta resolucin que detecta colonias de 1/15 mm aproximadamente. El medio no es un problema, con un sistema de iluminacin patentado los medios con agar transparentes/opacos no tienen dificultad. Recuento de colonias, realizar medidas de zonas de inhibicin de antibiticos o conectar al Plate Handler (muestreador de placas Petri automtico).

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Miles y Misra
Involucra la preparacin de diluciones seriadas de una suspensin bacteriana. Las placas son divididas en sectores separados. Se inocula cada sector una gota empleando una Pipeta Pasteur calibrada o bien micropipetas inoculando 0.02mL.

Miles y Misra
Las placas se incuban de 18 a 24 horas a la temperatura adecuada (37C). Se toman en cuenta los sectores donde hay menos de 20 UFC. El nmero de bacterias viables se obtiene calculando la media de cada dilucin en las repeticiones realizadas.

Miles y Misra

Integracin.

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Mtodo de Miles y Misra

No se emplea para gran cantidad de microorganimos en muestras. Ventaja Duplicado o triplicado en la misma caja. Muestras lquidas y slidas.

Asa calibrada
La utilizacin de agujas o asas calibradas permite tomar volmenes pequeos, que son inoculados en la superficie del agar mediante la tcnica de siembra masiva. Las colonias son contadas y se multiplican por el factor de dilucin del asa empleada. El uso ms frecuente de est mtodo es en el urocultivo. Se determinan las UFC/g o mL de muestra.

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Nmero Ms Probable (NMP)

Nmero Ms Probable (NMP)

Tambin llamada tcnica de dilucin en tubo, proporciona una estimacin estadstica de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.

Mtodo del NMP

Tres series de 5 tubos
Nmero de tubos positivos

Volumen de muestra

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Mtodo del NMP

Tabla de NMP

Anlisis Microbiolgico del Agua

10-19-95 NORM A Oficial M exicana NOM -112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable.

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NMP

Filtracin

La membrana de celulosa retiene a los microorganismos en su malla con poros de 0.250.45mm. Esta membrana se transfiere a un medio de cultivo para el desarrollo de colonias.

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Cuantificacin mediante Filtracin a travs de un filtro membrana

Filtracin
USOS Sirve para muestras: lquidas sin slidos Con baja cantidad de microorganismos

12 UFC/100 ml

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Medidas de crecimiento microbiano

Clulas viables
1. Recuento en caja Petri (placa)
Vertido

Clulas totales
1.

en placa
2.

Conteo microscpico: Breed Turbidimetra: Espectrofotometro. Contadores Electrnicos Biomasa

Extensin superficial Miles-Misra

2. Nmero ms probable(NMP) 3. Filtracin

3.

4.

Mtodos para el conteo de microorganismos totales

Estos mtodos se basan en poner en evidencia la presencia de los microorganismos vivos y muertos los cuales no se pueden distinguir. Son rpidos pero se requiere contar en algunos casos con curvas de calibracin.

Medidas de crecimiento microbiano

Clulas totales
1.

Conteo microscpico: Breed Turbidimetra: Espectrofotometro. Contadores Electrnicos Biomasa

2.

3.

4.

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Nefelometra (Turbidimetra)

La turbidez producida por el crecimiento microbiano de microorganismos unicelulares puede ser medida de acuerdo a la capacidad de absorber la luz. La muestras a determinar son generalmente translcidas cuando no presentan crecimiento microbiano.

Longitud de onda (l) Bacterias 540nm Protozoarios 580nm Levaduras 600nm

Turbidez

La turbidez se determina por la densidad ptica (DO) que puede ser expresada como Absorbancia, % de Transmitancia o Unidades Klett (UK).

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Turbidimetric
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Turbidimetric measurements as indicators of bacterial growth. The greater the turbidity the larger the population density.

Escala de Mc Farland
Tubo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Vol (mL) H2SO4 1% 10 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0 Vol (mL) BaCl 2 1% 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 # de celulas /mL 0 3x108 6x108 9x108 12x108 15x108 18x108 21x108 24x108 27x108 30x108

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Recuento microscpico
Recuentos Directos:
Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos.

Recuento microscpico

Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley, la de Petroff-Hausser y la de Neubauer. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos

Uso del equipo micromtrico

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Cuenta de Breed

Cuenta de Breed
A
10mL
2 cm 1cm

Teir

rea de la muestra = bxh y convertir a mm2

Observar 10 campos, contar las bacterias de cada uno de ellos y obtener el promedio X

B C D
Factor= Am/Ac

Calcular el nmero de bacterias por mL X x Factor x 100 = bacterias_____ /mL 100 es la dilucin inicial al tomar 0.01mL
1mL = 1000mL 1cm = 10 000mm

Determinar el rea del campo: A= pxr2 (mm2)

Cuenta de Breed
Muestra a evaluar (directa o diluida) Microscopio Objetivo micromtrico Asa calibrada o micropipeta Portaobjetos Colorantes de Gram u otros colorantes.

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Cmaras de Petroff-Hausser y de Neubauer

Limitaciones: Es muy tedioso, no es prctico para un gran nmero de muestras. No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que sean observadas al microscopio. No distinguen clulas vivas de muertas.

Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa: la sntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la sntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento

Determinacin de peso hmedo Determinacin de peso seco Determinacin de nitrgeno total Determinacin qumica de un cido nucleico

Peso seco y determinacin de protena

El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105 C hasta peso constante. Es til para grandes volmenes. La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

La protena se relaciona al crecimiento, por lo que un incremento en la cantidad de protena en el paquete celular indica que hay mayo concentracin de clulas.
Curva patrn para la determinacion de protenas por el mtodo de Lowry

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Curva de crecimiento Viables vs Totales

CRECIMIENTO MICROBIANO DETERMINACION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Mtodo Microorganismos para los que se utiliza Tipo de recuento Usos / Limitaciones

Indirecto Turbidez La mayora de las bacterias y levaduras Cualquier microorganismo viable Cualquier microorganismo unicelular viable Cualquier microorganismo viable Cualquier microorganismo viable Cualquier microorganismo Total Determina la turbidez con un espectrofotmetro; rpido y reproducible; la suspensin debe contener ms de unos l0 millones de clulas por ml; se requiere una curva patrn Utilizado para microorganismos que son difciles de cultivar en medio slido y para determinar contaminacin por Escherichia coli en aguas; requiere un cierto tiempo Muy sensible ,puede detectar incluso una clula; lento y tedioso; para evitar el error debido al muestreo, se debe recontar un gran nmero de colonias Se concentra una muestra, de manera que se puede recontar un pequeo nmero de clulas a partir de grandes volmenes de un lquido o de un gas Requiere un cierto tiempo y puede ser impreciso; puede utilizarse con materiales complejos Tedioso y requiere un cierto tiempo, pero preciso y reproducible

Numero ms probable Recuento en placa Filtracin

Viables

Viables

Viables

Actividad metablica Peso seco Directo Recuento microscpico Recuento electrnico

Viables

Total

Cualquier microorganismo unicelular Cualquier microorganismo unicelular

Total

Muy til para el recuento de un tipo de clulas de una mezcla; requiere un cierto tiempo; no es adecuado para cultivos diluidos Muy til para el recuento de clulas de un cultivo axnico; rpido y preciso; no debe estar presente material extrao

Total

Bibliografa
http://www.univie.ac.at/chromogenic/ http://www.idexx.com/Water/Products/colilert/science.cfm

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