COMPARACIN DE LOS PASOS ENTRE LA REPLICACIN IN VIVO DEL ADN Y LA REPLICACIN IN VITRO DE LA PCR.

REPLICACIN IN VIVO INICIACIN Mediante consumo de ATP en direccin 5'-3', la Helicasa acta rompiendo los puentes de hidrgeno que mantienen unida la doble hlice. Las protenas SSB (single-stranded DNA binding proteins, protenas ligantes de ADN monocatenario) son las encargadas de la estabilizacin del ADN monocatenario generado por la accin de las Helicasas, impidiendo as que el ADN forme de nuevo la doble hlice, de manera que pueda servir de molde. Por otro lado, las Topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los superenrollamientos que generan las Helicasas. ELONGACIN La ADN Polimerasa III cataliza la sntesis de las nuevas cadenas, aadiendo nucletidos sobre el molde. Puesto que la holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que una ARN primasa catalice la formacin de un fragmento corto especfico de ARN llamado cebador, que determinar el punto por donde la ADN polimerasa comienza a aadir nucletidos. La replicacin en la hebra adelantada es continua. REPLICACIN IN VITRO ( PCR) DESNATURALIZACIN Desnaturalizacin del ADN a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN bicatenario en ADN monocatenario. Para obtener la desnaturalizacin del ADN, la temperatura suele aumentarse hasta unos 93 - 96C. De esta manera se rompen los puentes de H y aumenta el nmero de bases desapareadas. La reaccin se completa cuando todo el ADN bicatenario se convierte en monocatenario.

TERMINACIN La replicacin en la hebra retardada es discontinua, dando lugar a la unin de los fragmentos de Okazaki. Cuando la ADN Pol III hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de ste es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recin sintetizado son unidos. En la eliminacin del fragmento de Okazaki intervienen dos enzimas: por un lado la ADN Pol III, que va eliminando el ARN con su actividad exonucleasa 5'-3' y simultneamente rellenando con ADN mediante su actividad polimerasa 5'-3' (proceso denominado nick-traslation). Al final queda rotura el extremo 3'OH libre y el fosfato 5' de la cadena sintetizada; por ltimo, la ADN ligasa sella esa rotura catalizando la reaccin de condensacin entre el grupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del nucletido contiguo, completando el enlace fosfodister; para ello, es preciso hidrolizar una molcula de ATP. El final de la replicacin se produce cuando la ADN polimerasa III se encuentra con una secuencia de terminacin. Se produce entonces el desacople de todo el replisoma y la finalizacin de la replicacin.

ANILLAMIENTO. Unin (anillamiento) de dos oligonucletidos, utilizados como cebadores, al ADN diana. La unin o rehibridacin de las hebras de ADN se efecta a una temperatura inferior (generalmente, entre 55 y 65 C). De esta forma, hebras complementarias de ADN monocatenario tienden a formar de nuevo una molcula de ADN bicatenario. En esta fase, los cebadores se mueven libremente y es continua la formacin y la ruptura de puentes de hidrgeno entre el cebador monocatenario y el ADN molde tambin monocatenaria. En ese pequeo fragmento de ADN bicatenario (ADN molde con cebador) puede fijarse la polimerasa y empezar a copiar el ADN molde. EXTENCION Extensin de la cadena de ADN por adicin de nucletidos a partir de los cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg2+. Los cebadores se extienden a lo largo de la secuencia diana utilizando una ADN polimerasa termoestable (frecuentemente se trata de la ADN Taq polimerasa) en presencia de dNTP, lo que produce la duplicacin del material diana inicial a una temperatura de 72C.