Instituto del Profesorado en Enfermera Padre Luis Tezza (A-691) Carrera de Tcnico en Laboratorio Prcticas I de Laboratorio.

Tcnicas Hematolgicas

Trabajo Prctico N:

Fecha: / / Recuento de Reticulocitos

Alumno:

Objetivos: Adquirir la habilidad tcnica para realizar la tcnica de tincin, reconocer los reticulocitos y cuantificar su presencia en una muestra de sangre venosa. Materiales: Microscopio con objetivos de 10 X, 40 X y 100 X Aceite de Inmersin Portaobjetos de vidrio Sangre Entera recogida sobre EDTA Azul Brillante de cresilo Bao termosttico a 37C Pipeta de Pasteur Tubos de Hemlisis o de Kahn.

Fundamento: Los Reticulocitos son elementos pertenecientes a la serie roja que se encuentran en el estadio de maduracin previo al eritrocito maduro y en una proporcin de cinco a diez por mil hemates en una muestra de sangre venosa correspondiente a un adulto. Su tamao es similar al de los hemates y se caracteriza por contener una pequea cantidad de ARN (ribosomas) formando un retculo granulo-filamentoso, evidenciable mediante el empleo de microscopa ptica, para lo cual se colorea el frotis previamente utilizando azul brillante de cresilo o azul de metileno. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto ms madura es la clula. El recuento de reticulocitos es la tcnica ms simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoytica de la mdula sea. La anemia se acompaa de un elevado nmero de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera que la mdula sea se encuentra regenerativa, mientras que cuando el nmero es normal o disminuido se denomina arregenerativa. En condiciones normales, los reticulocitos permanecen en la mdula durante 2-3 das y terminan su maduracin en un perodo aproximado de 24 horas una vez que se encuentran en la sangre perifrica.

Tcnicas: El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA) y a ser posible, dentro de las 24 primeras horas de la extraccin cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. Si se mantiene a 4 C, el recuento puede realizarse hasta 48 horas despus de la extraccin. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos: 1. Tincin vital y observacin con microscopio ptico. 2. Citometra de flujo.

Recuento manual El mtodo manual carece de exactitud ya que presenta un coeficiente de variacin que vara entre 15% a 20%), lo cual limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a

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teraputicas agresivas y a los errores de ndole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador posee.

Mtodo de tincin supravital con Azul de Metileno (Mtodo de referencia) Este mtodo utiliza como colorante el azul de metileno: 0,5 g de azul de metileno, 1,4 g de oxalato de potasio, 0,8 g de cloruro de sodio y se lleva a volumen final de 100 ml con agua destilada c.s.p Mediante una pipeta Pasteur se aade a un tubo de hemlisis tres gotas de solucin colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada. En caso de valores muy bajos de hematcrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solucin colorante. La suspensin sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transcurrido este tiempo, se toma una pequea gota de la suspensin y se extiende sobre un portaobjetos., una vez seca se observa, al microscopio con objetivo de inmersin de 100x (aumento total 1000x). Es necesario realizar el recuento sobre un mnimo de 1.000 eritrocitos. Para incrementar la precisin del recuento es preferible contar los reticulocitos presentes en 3.000 hemates. El recuento se efecta contando en donde los eritrocitos estn distribuidos homogneamente. Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida, siendo 100-125 el nmero ptimo de hemates por campo de los cuales distinguimos cuales son reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje, siendo el 100 por ciento el nmero total de hemates contado. Este valor ser valido si se trata de una concentracin normal de eritrocitos en sangre total. (Ver en frmula de Ajuste por hematcrito) Para estimar el porcentaje de reticulocitos se aplica el siguiente clculo:

Reticulocitos (%) =

Nmero de reticulocitos ---------------------------------Nmero de eritrocitos

x 100

Para estimar la cantidad absoluta de reticulocitos por mm3 de sangre se aplica el siguiente clculo:

Reticulocitos / mm3 =

Reticulocitos (%) -------------------------100

x Nmero de eritrocitos / mm3

Frmula de Ajuste por hematcrito La disminucin del nmero total de eritrocitos como suele ocurrir en la anemia, el valor porcentual debe corregirse segn el hematcrito empleando la siguiente frmula:

Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x

Hto del paciente Hto normal

En caso de una anemia significativa, el nmero de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneracin eritroblstica. Ello obedece a que la anemia se

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acompaa siempre de un estmulo eritropoytico compensador, que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la mdula a la sangre perifrica, y un acortamiento de su perodo de maduracin intramedular, lo que supone un aumento del perodo de maduracin perifrica. Este fenmeno se caracteriza por la aparicin en el examen morfolgico de la extensin de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y de la tonalidad azulada (policromasia) Existe una relacin inversa, aproximadamente lineal, entre el hematcrito y el perodo de maduracin perifrica de los reticulocitos. De esta forma puede calcularse otra magnitud de inters clnico denominada ndice de produccin reticulocitaria (IPR) tambin denomina ndice de Reticulocitosis, aplicando la frmula siguiente: (En Fisiopatologa I, se abordar nuevamente el concepto en la unidad de Trastornos Hematolgicos, captulo Anemias)

IPR =

Reticulocitos del paciente x Hto del paciente Perodo de maduracin en das x Hto normal

Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoytica medular (anemia regenerativa), mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoytica (anemia arregenerativa)

Relacin entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia se puede realizar mediante la siguiente tabla:

Hematcrito Niveles de Hemoglobina (g/L) Recuento de reticulocitos (%) Recuento de reticulocitos corregido (%) Tiempo de maduracin estimado ndice de reticulocitos

45 150 1 1 1

40 35 133 117 2 5 1,8 4 1 da 2 5

30 110 10 7

25 83 15 8,3 2 das 5 7,5

20 66 20 9 10

15 50 30 10 3 das 10

Mtodo de coloracin supravital con azul brillante de cresilo Utiliza como colorante Azul Brillante de Cresilo en iguales proporciones a las indicadas en el mtodo de referencia. La mezcla sangre/colorante se incubar durante 15 minutos a 37 C. Luego de este tiempo se realizar el extendido y se realiza el recuento de la misma forma indicada.

Recuento automatizado Estos equipos realizan un recuento muy exacto de reticulocitos a partir de sangre total. En los equipos semiautomticos la sangre es previamente incubada con el fluorocromo, mientras que en los totalmente automatizados no es necesaria esta incubacin previa y el anlisis se realiza directamente. El fundamento de estos autoanalizadores es la sustitucin del criterio morfolgico inherente al mtodo visual por el anlisis cuantitativo del contenido eritrocitario en ARN mediante Citometra de Flujo y Luz Lser. Para la tincin del ARN se emplean fluorocromos que pueden ser de dos tipos: naranja de tiazol o Auramina.

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Valores de referencia: Valor relativo (%) 3,2 - 6,0 0,2 - 2,2 Valor absoluto (x109 /L) 110 - 330 25 - 89

Recin nacido (sangre de cordn) Nios y adultos jvenes de 4 a 19 aos Adultos (20-50 aos) Mujeres Hombres

0,2 - 2,5 0,5 - 2,8

25 - 86 32 - 97

Variaciones patolgicas Disminucin de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia) Aplasia medular Anemias carenciales intensas (megaloblstica y ferropnica) Anemias inflamatorias Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis) Perodo neonatal Anemias hemolticas Anemias por prdida de sangre Anemias carenciales en fase de tratamiento Mieloptisis (infiltracin neoplsica en la mdula sea) Mielofibrosis

Bibliografa Davidsohn, Israel; Bernard, Henry John. Diagnstico clnico por el laboratorio. Todd Sanford. Editores Salvat SA. Barcelona 6ta. Edicin.

Sans Sabrafen J. Hematologa clnica. 4 ed. Barcelona: Hartcourt, 2001. Beutler E et al., editors. Williams: Hematology. 6 ed. New York: McGraw-Hill, 2001. Lewis SM, Bain BJ, Bates I. Dacie and Lewis practical haematology. 9 ed. London; New York: Churchill Livingstone, 2001. Ivine-Selva. El laboratorio en la Clnica.Editorial Panamericana. Buenos Aires. 3ra. Edicin.