12 ACTIVACIN CLULAS NK

M.Lpez-Botet y J.Pea
Las clulas NK participan activamente en la defensa del organismo frente a infecciones, principalmente de tipo viral y frente al crecimiento de clalas tumorales. Estas clulas participan tanto en la defensa innata y como en los mecanismos de defensa adquirida o adaptativa. La funcin esencial de estas clulas es identificar y destruir clulas blanco. Tambin es importante su funcin reguladora del sistema inmune debido a su capacidad secretora tanto de citocinas como de quimiocinas. Las clulas NK constituyen la tercera estirpe de clulas de tipo linfoide. Carecen de TCR y de Igm y, en su mayora, expresan en superficie las molculas FcgammaR-III (CD16) y CD56 que junto con otros marcadores definen a este grupo celular (Tabla 12.1). La deteccin de algunos de estos marcadores puede ser variable, definindose varias subpoblaciones NK, tales como clulas muy positivas para CD56 (CD56 bright), muy poco positivas para este marcador (CD56dim), o clulas CD16+ CD56+ o CD16-CD56+, etc. Las clulas NK se encuentran en sangre, bazo y mdula sea y en muy baja proporcin en ganglios linfticos. FUNCIN CITOTXICA DE LAS CLULAS NK La funcin citotxica de las clulas NK fue la primera accin asignada a estas clulas y el motivo de su descubrimiento (Tabla 12.2). TABLA 12.1 Fenotipo predominante en clulas NK Carcter Molcula Presentes en NK CD16, CD56, CD57 y CD94. Compartidos con T y B CD2,CD3(z),CD7,Cd11a, CD11b, CD26, CD27, CD43 y CD45 Ausentes CD3,CD4,CD14,CD19,CD20 y CD31 Asociados a activacin CD69 y CD25 Para que las clulas NK ejerzan su funcin citotxica se requiere la identificacin, a travs de los receptores implicados, de las clulas blanco. Entre estos receptores destacan receptores de activacin y otro grupo recientemente descrito de receptores que tienen como ligando molculas de histocompatibilidad clase I y que pueden ser de tipo inhibidor o activador (Figura 12.1). En este fenmeno adems intervienen ciertas citocinas y molculas de adherencia facilitadoras de la interaccin celular.
Fig: 12.1

Mediante la accin citoltica, las clulas NK pueden destruir un amplio espectro de clulas, tanto anormales (infectadas por virus o tumorales) como incluso normales (alognicas). Esta lisis se realiza de manera directa, lisis natural, o bien mediante la participacin de anticuerpo, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o ADCC (Figura 12.2).
Fig.:12.2

La citotoxicidad natural consiste en lisis de una gran variedad de clulas de manera espontnea y sin necesidad de un periodo de sensibilizacin previa. De ah la denominacin dada de NK (de natural killer) debido a que la capacidad citoltica que presentan lo hacen, a diferencia de las clulas T citotxicas, de una manera natural, esto es sin necesidad de un aprendizaje preliminar. Esto implica que estas clulas no requieren un proceso de preparatorio de activacin para destruir clulas en los trminos que lo hacen los linfocitos T citotxicos, pero sin duda la activacin por clulas blanco o por citocinas hace que esta funcin sea mas eficiente. Krre y cols. observaron que variantes de una misma lnea celular tumoral manifestaban distinto grado de sensibilidad a la lisis NK, que se correlacionaba inversamente con la expresin de molculas de clase I del MHC (Figura 12.3). Por otra parte, la transfeccin de clulas diana con molculas del MHC-I les confera resistencia. Los autores propusieron la teora de missing self para explicar los fenmenos de citotoxicidad natural. As hoy se considera que pese a que las clulas NK son responsables de mecanismos de citolisis inespecfica no restringida por el MHC, se sabe que la funcin de las clulas NK est regulada en parte por el reconocimiento de molculas MHC de clase I (MHC-I) en la clula diana.
Fig.:12.3

La citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC), implica la presencia de anticuerpos que son reconocidos por su extremo Fc por los receptores CD16 presentes en las clulas NK y tambin en otras clulas, como son los macrfagos. Cuando el CD16 reconoce su ligando activa la maquinaria ltica de la clula NK. FUNCIN SECRETORA DE LAS CLULAS NK Adems de la accin citotxica, las clulas NK tienen la propiedad de sintetizar y liberar diversos tipos de citocinas de gran importancia en la regulacin del sistema inmunitario, en la accin de las propias clulas NK y en otras funciones como es la hematopoyesis (Figura 12.4 y Tabla 12.2). Fig.:12.4

Las principales citocinas producidas por las clulas NK son TNF-alfa, IFN-gamma, IL-3, GM-CFS y M-GSF. Estos inmunomoduladores se producen como consecuencia de la activacin de clulas NK como consecuencia de su interaccin con la clula blanco, por la accin de diferentes citocinas como son IL-2 y IL-12 o por activacin directa, por ejemplo por anticuerpos frente a las molculas CD16, CD69, CD80 y otras. TABLA 12.2 Funcin de las clulas NK Funcin Significado Citotxica Lisis clulas tumorales, infectadas por virus y otras Secretora Citocinas: TNF-alfa, IFN-gamma, IL-3, GM-CFS y M-GSF Quimiocinas: MIP-1alfa, MIP-1beta y RANTES

Tambin las clulas NK producen cuando son estimuladas ciertas quimiocinas, tales como MIP-1alfa, MIP-1beta y RANTES de gran importancia en los fenmenos inflamatorios. En la tabla 12.3 se recogen las principales diferencias funcionales entre las clulas NK y los linfocitos T.

TABLA 12.3 Diferencias funcionales entre clulas NK y linfocitos T Carcter Accin en el tiempo Tipo de especificidad Clonalidad Memoria Frente a lo propio Capacidad de lisar NK inmediata inespecfico no clonal no posee memoria se inhibe lo no propio Linfocitos T retardada especfico clonal posee memoria se activa lo propio

Hoy se sabe que las clulas NK mas positivas para el CD56 (CD56bright) poseen mayor capacidad para producir citocinas que las clulas mas dbiles para esta molcula (CD56dim). A su vez las clulas NK CD56dim poseen mayor capacidad citotxica que las CD56 bright. RECEPTORES ACTIVADORES DE CLULAS NK Para que las clulas NK desarrollen su funcin tienen que identificar a la clula blanco. Para ello las clulas NK poseen diferentes tipos de receptores con funcin de reconocimiento de molculas en las clulas blanco y en consecuencia de activar la maquinaria citoltica y/o secretora de estas clulas. Despus veremos como junto a estos receptores de tipo activador existen otros cuya funcin es inhibidora. En consecuencia hoy se conoce que la accin final de las clulas NK depende del equilibrio entre las seales inhibidoras y activadoras procedentes de sus receptores de superficie. Entre los receptores de activacin de las clulas NK destacan el CD16, CD80, CD43 y los recin descritos receptores de citotoxicidad natural (NCKs) y entre los inhibidores destacan ciertos receptores presentes en las clulas NK con capacidad de reconocer molcula de histocompatibilidad (Receptores NK de HLA) (Tabla 12.4). TABLA 12.4 Receptores de tipo activante en clulas NK Tipo Ligando CD16 (FcR) FcR de IgG CD43 ---CD69 ---NCKs* ---CD80 (B7.1) CD28 CD2 LFA-3 CD40L CD40 *Receptores de citotoxicidad natural (NKp46, NKp44 y NKp30).

Receptor CD16. La va de activacin a travs de CD16 es, al menos parcialmente, comparable a la del CD3/TCR. Ambos receptores se asocian a ciertas cadenas del complejo CD3, implicadas en la transduccin de seales. Por otra parte, la estimulacin va CD16, determina tambin la activacin de ciertas cinasas y PLC-gamma, y se ha demostrado su asociacin molecular con p56lck.

Receptores de citotoxicidad natural. Los receptores de citotoxicidad natural (NCKs), han sido descritos recientemente y de manera mayoritaria por el grupo de Moretta, mediante el empleo de anticuerpos monoclonales en ensayos en donde lo que se ha analizado es la capacidad de inhibir la lisis de determinadas lneas celulares tras el uso de los mencionados anticuerpos. Entre estos receptores destacan tres conocidos como: NKp46, NKp44 y NKp30.

Tambin recientemente se han descrito receptores de tipo activante que se caracterizan por reconocer especficamente molculas de histocompatibilidad y que trataremos a continuacin. RECEPTORES NK ESPECIFICOS DE ANTGENOS HLA. El reciente descubrimiento de receptores presentes en clulas NK que reconocen molculas de histocompatibilidad y que tienen funciones reguladoras de la funcin de estas clulas ha abierto una importante puerta para entender la biologa de estas clulas. Los sistemas experimentales convencionales para estudiar estos fenmenos analizan la actividad de clones/subpoblaciones NK frente a lneas tumorales deficientes en la expresin de MHC-I, transfectadas selectivamente con diferentes molculas de clase I. Los receptores NK especficos de antgenos HLA clase I son un grupo heterogneo de glicoprotenas que pertenecen a distintas familias de molculas y se expresan en clulas NK pero tambin en ciertos linfocitos T (Figura 12.5 y Tabla 12.5).
Fig.:12.5

1. La primera familia incluye receptores de antgenos HLA-I pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Originariamente estos receptores se conocieron por su accin inhibidora de la citotoxicidad y se denominaron como KIRs (killer cell Ig-like receptors).

2. Otro grupo de estos receptores pertenece tambin a la superfamilia de las inmunogbubulinas y son conocidos como ILTs (immunogloobulin like transcripts). 3. Adems existe otro grupo de receptores que son heterodmeros formados por la asociacin de dos molculas diferentes con dominio lectina tipo C como es el CD94 que se puede unir a miembros de las superfamilia de molculas NKG2. Estos receptores pueden tener accin inhibidora, que es como originariamente se descubrieron, pero pueden poseer tambin accin activante de acuerdo con la estructura de la parte citoplasmtica de sus molculas

TABLA 12.5 Receptores NK especficos de antgenos HLA clase I Superfamilia Igs Tipo KIR ILT Lectina CD94 Denominacin Receptor de clulas NK asociado a superfamilia de las Igs. Trascrito asociado a inmunoglobulinas Receptor NK de tipo lectina.

NKG2
Receptores NK tipo KIR.

Receptor NK de tipo lectina

Se trata de receptores que pertenecen a la familia de las inmunoglobulinas. Originariamente estos receptores fueron descubiertos porque estaban implicados en la inhibicin de la lisis al interaccionar especficamente con determinadas molculas HLA de clase I de la clula blanco (Figura 12.6). En primer lugar, se observ cierta correlacin entre la expresin de estos receptores por distintos clones NK y el reconocimiento de diferentes grupos de alelos de HLA-C. Por otra parte, se observ que anticuerpos monoclonales frente a estos receptores restablecan la citotoxicidad de los clones NK frente a dianas protegidas especficamente por la expresin de molculas HLA. En la tabla 12.6 se recoge una lista de estos receptores y las molculas que reconocen (Figura 12.6).

Fig.:12.6

Segn el nmero de dominios presentes en la molcula del receptor a la palabra KIR, se aaden los sufijos 2D y 3D que indican el nmero de los dominios de inmunoglobulina que poseen y la letra L (long) o S (short) segn que la cola citoplasmtica de estas molculas sea larga o corta respectivamente (Tabla 12.6). Estos receptores pueden ser de tipo inhibidor o de tipo activante. En este ltimo caso estos receptores se asocian de manera covalente con la molcula DAP-12. La distribucin de estos receptores en las clulas NK no es homognea y cada clon NK puede expresar uno o varios tipos de estos receptores. Se aprecian claras diferencias en la expresin de cada receptor cuando se estudian distintos individuos, y hay indicios en los que el repertorio de receptores est regulado durante el desarrollo por factores genticos, incluyendo presumiblemente la influencia del propio MHC. A estos receptores recientemente se les ha dado la denominacin de CD158 seguido de una letra (ente a y k) segn el tipo de receptor. En la Figura 12.7, se recogen los distintos tipos de receptores y las molculas que reconocen y en la Figura 12.8 se recoge un modelo de la estructura tridimensional de esta molcula unida a un antgeno de histocompatibilidad. TABLA 12.6 Receptores de tipo KIR inhibidores y activadores Forma Denominacin Ligando HLA-Cw HLA-Bw4 HLA-Cw HLA-Bw4

Antigua Nueva Inhibidora p58 KIR2DL p70 KIR3DL* Activadora p50 KIR2DS p70 KIR3DS *Se puede presentar en forma de dmero (p140)

Los genes que codifican estos receptores se encuentran localizados en el cromosoma 19 en humanos en una en donde se codifican tambin los receptores ILTs, Fca y NKp46 (Figura 12.9).

Fig.:12.7

Receptores NK tipo ILT Otro grupo de receptores, que tambin pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, se conocen como ILTs (immunogloobulin like transcripts) o como LIR (leukocyte Ig-like receptor). Alguno de estos receptores reconocen molculas HLA-G y la protena UL18 (LIR1 y LIR2) del citomegalovirus humano y tiene una distribucin muy extensa en diferentes tipos de clulas incluyendo no solo clulas NK sino tambin monocitos y ciertas clulas de tipo polimorfonuclear (Tabla 12.7). A estos receptores recientemente se le ha dado la denominacin de CD85 seguido de una letra (a-m) para definir el tipo de receptor.
Fig.:12.8

Receptores NK tipo lectina.

La tercera familia de estos receptores de HLA esta formada por un grupo heterodmero compuesto por molculas de tipo C-lectina que comprende la molcula CD94 unida covalentemente de manera alternativa a diferentes molculas pertenecientes a la familia NKG2 (A, B, C, E y H). La molcula CD94, fue identificada originalmente por uno de nosotros (M. LpezBotet) en el laboratorio del Hospital de la Princesa. Este receptor reconoce molculas de HLA-E en asociacin con pptidos derivados de la secuencia lder de otros antgenos HLA-I (Figura 12.10). Fig.:12.9

Las molculas de la familia NKG2 pueden ser de distinto tipo: A, B, C, E y H. Resultan as que de la combinacin del receptor CD94 con los distintos miembros de NKG2, resultan los dmeros CD94/NKG2A, CD94/NKG2C, etc. Esta posibilidad de unirse el CD94 a diferentes miembros de la familia NKG2 justifica la accin unas veces, inhibidora (por ejemplo CD94/NKG2A) y otras activante (por ejemplo CD94/NKG2C) descritas originariamente para este receptor (Tabla 12.8). TABLA 12.8 Receptores tipo lectina inhibidores y activadores Forma Tipo LIR1(ILT) LIR-2 (ILT) Ligando HLA-G otros HLA-G otros y Distribucin NK monocitos Monocitos y Activadora Inhibidora Denominacin CD94/NKG2A CD94/NKG2B CD94/NKG2C CD94/NKG2E NKG2D Ligando HLA-E HLA-E HLA-E HLA-E MICA

TABLA 12.7 Receptores inhibidores leucocitarios (LIR)*

Consideramos a este receptor de especial importancia en los procesos de regulacin de la accin de clulas NK in vivo, debido a la extensa distribucin de las molculas de histocompatibilidad HLA-E que reconoce y sobre todo por el hecho de encontrarse presente en un amplio numero de clulas NK (60-80 %) y ciertos linfocitos T, mientras que por ejemplo los recetores KIRs lo estn en una proporcin de clulas mucho ms baja. La expresin de CD94 es regulada por ciertas citocinas tales como IL-15 IL-10 y TGF-beta.

Fig.:12.10

Recientemente se ha visto que los receptores de tipo activante poseen adems del CD94 y un miembro de NKG2 (C, E y H), la molcula DAP-12 que posee motivos ITAM, y por tanto se caracteriza por la transmisin de seales de activacin. En la Figura 12.11 se recoge un modelo tridimensional de CD94 unido a una molcula de HLA-E que es su ligando natural. Los genes que codifican tanto los receptores CD94 como los de la familia NKG2 se encuentran localizados en el cromosoma 12 en humanos en una zona conocida como complejo gnico NK ( Figura 12.9). Receptores NK de molculas HLA en otras clulas Los receptores NK especficos de molculas HLA se encuentran tambin en otras estirpes celulares no NK, aunque en una menor proporcin y densidad. Este es el caso de una poblacin especial de clulas NK se encuentran en la decidua y que son conocidas como clulas NK deciduales y cuya funcin no esta completamente esclarecida.
Fig.:12.11

Otra poblacin conocida que expresa estos receptores corresponde a las clulas NKT cuya funcin tampoco esta totalmente esclarecida. Estas clulas se caracterizan por poseer el

fenotipo T con ciertos marcadores de clulas NK y que se encuentran en gran proporcin en el hgado. Estas clulas son TCR alfa/beta positivas y expresan Va14/Ja18 y tienen la capacidad de reconocer molculas de histocompatibilidad no clsicas, CD1. Estas clulas poseen capacidad citoltica, producen ciertas citocinas y su proliferacin es activada por IL-12. Algunos de estos receptores se encuentran tambin en linfocitos T, principalmente del tipo citotxico (Tc) pero tambin en linfocitos Th, lo que hace pensar que adems de su intervencin en la regulacin de los procesos citotxicos de las clulas intervengan tambin en su regulacin funcional, principalmente en la secrecin de citocinas. TRANSDUCCION DE SEALES Tal como se ha indicado con anterioridad, tanto los receptores KIR, ILT como el homodmero de CD94 con distintos miembros de la familia de NKG2, pueden ejercer acciones inhibidoras como activantes. El que ejerza una u otra accin depende de la cola citoplasmtica de dichas molculas y de las cinasas con las cuales se asocien.

Fig.:12.12

Mecanismos de inhibicin. Los receptores inhibidores se caracterizan por poseer en sus dominios intracitoplasmticos los motivos YxxL-26-YxxL, denominados ITIM (immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motifs) (Figura 12.12). Estos motivos tienen la propiedad de unirse al dominio SH2 que contiene las tirosin fosfatasas, SHP-1 y SHP-2, y as producir inhibicin de la citotoxicidad. En la figura 12.13 se representan un ejemplo de cada uno de los dos tipos de receptores, inhibidores y activadores.

Fig.:12.13

Es de destacar que esta accin inhibidora ejercida por los receptores inhibidores despus de reconocer a su ligando (HLA clase I) en la clulas tiene una gran importancia fisiolgica, pues esto previene la destruccin de las clula normales del husped. Esto se debe a que, como se sabe, la mayora de las clulas del organismo expresan molculas de histocompatibilidad clase, incluidas las molculas HLA-E. Precisamente cuando una clula deja de expresar molculas de histocompatibilidad, entones pude ser destruida por las clulas NK al no ser frenada su actividad por no actuar los receptores de tipo inhibidos (Figura 12.14),
Fig.:12.14

Estos mismos fenmenos han sido descritos para linfocitos T, en los que el efecto activador mediado por el TCR-CD3, puede ser bloqueado por accin de un receptor de tipo inhibidor (Figura 12.15). Los receptores de este grupo son KIR2DL, KIR3DL, ILT-2, NKG2A y NKG2B.

Fig.:12.15

Mecanismos de activacin. Aunque los receptores de antgenos HLA se describieron primero como receptores de tipo inhibidor por su capacidad de bloquear la citotoxicidad dependiente de clulas NK, posteriormente se han encontrado receptores muy homlogos, que diferan solo en los dominios intracelulares y que funcionaban induciendo seales de tipo activador. Estos receptores poseen una parte citoplasmtica muy corta, carecen de la secuencias ITIMs y tienen la propiedad de asociarse a las molcula DAP-12. Estos receptores son KIRD2S, NKG2C, NKG2E y NKG2H.
Fig.:12.16

El DAP-12 es un homodmero conocido tambin como KARAP (Killer activating receptor associated protein), gracias al cual se lleva a cabo la transmisin de seales en el citoplasma de la clula. La molcula DAP12 se caracteriza por contener en su parte citoplasmtica un dominio conocido como ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activating motif) y tiene la capacidad de unir las cinasas ZAP-70 y Syk.

ACTIVACION NK Y RESPUESTA INMUNE INNATA. Las clulas NK forman parte de la primera barrera defensiva del individuo junto con macrfagos y polimorfonucleares (Figura 12.16). Constituyen as parte de la respuesta inmune innata. Ciertas citocinas que potencian el efecto de estas clulas son producidas precisamente por macrfagos en las primeras fases de la infeccin (Tabla 12.9). Las clulas NK actan destruyendo clulas (por ejemplo infectadas por virus) y produciendo citocinas y quimiocinas, que intervienen regulando el sistema inmune y el proceso inflamatorio (Figura 12.17). TABLA 12.9 Accin de citocinas sobre clulas NK Citosina Efecto sobre clulas NK IFN / Aumenta actividad citotxica y proliferacin IL-12 Aumenta actividad citotxica i.e.-15 Activa maduracin, crecimiento y actividad citoltica. i.e.-10 Inhibe la produccin de IL-12 INMUNOPATOLOGIA DE LAS CLULAS NK. Las clulas NK son de especial importancia en las primeras fases de la infeccin, especialmente frente a virus, de ah que cuando estas clulas no actan correctamente, el individuo se hace ms vulnerable a las infecciones virales. Por ejemplo en individuos infectados por HIV-1, se ha podido comprobar que las clulas NK han disminuido su capacidad citoltica, lo que puede explicar que el virus HIV-1 se desarrolle con ms facilidad. De igual manera ha podido ser comprobado que las clulas NK infiltrantes de tumores poseen menor capacidad citoltica que las clulas NK normales, probablemente por un aumento de expresin de receptores de tipo inhibidor.
Fig.:12.17

Por otra parte una excesiva capacidad citotxica de las clulas NK puede inducir estados de prdida de la tolerancia normal y contribuir al desarrollo de enfermedades de tipo autoinmune. Recientemente se ha visto que las clulas NK, pueden ser utilizadas en terapia antitumoral. Para ello despus de su extraccin del individuo y cultivo con i.e.-2, IL-12 o IL-15, son

posteriormente reinyectadas en el enfermo en forma de clulas LAK (citokyne activated lymphocytes). En enfermos con SIDA, tambin se esta tratando de potenciar la respuesta inmune innata y en especial estas clulas NK, mediante la administracin de IL-2, con resultados que son prometedores.

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