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OFICINA ESPAOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Nmero de publicacin: 51 Int. Cl.7: C12N

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ESPAA

15/82 C07K 14/415 C12N 15/29 C12N 5/14 A01H 5/10

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TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA

86 Nmero de solicitud europea: 01949376 .6 86 Fecha de presentacin : 31.05.2001 87 Nmero de publicacin de la solicitud: 1294915 87 Fecha de publicacin de la solicitud: 26.03.2003

T3

54 Ttulo: Expresin de un gen heterlogo en plantas.

30 Prioridad: 29.06.2000 EP 00202278

73 Titular/es: Vlaams Interuniversitair Instituut voor

Biotechnologie vzw. Rijvisschestraat 120 9052 Zwijnaarde, BE

45 Fecha de publicacin de la mencin BOPI:

72 Inventor/es: Angenon, Geert;

01.04.2006

De Jaeger, Geert; Goossens, Alain y Depicker, Anna

45 Fecha de la publicacin del folleto de la patente:

74 Agente: Arias Sanz, Juan

01.04.2006

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Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Boletn europeo de patentes, de
la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Ocina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar motivada; slo se considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicin (art. 99.1 del Convenio sobre concesin de Patentes Europeas).
Venta de fascculos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. C/Panam, 1 28036 Madrid

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DESCRIPCIN Expresin de un gen heterlogo en plantas.
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La presente invencin se reere a la expresin de un gen heterlogo en plantas. Ms especcamente, la invencin se reere a la expresin elevada de protenas heterlogas en semillas, incorporando el gen entre secuencias especcas de la semilla. Preferiblemente, dicha protena heterloga es un fragmento variable de anticuerpo de cadena nica (scFv). La capacidad para clonar y producir una amplia gama de protenas a partir de diversas fuentes result posible con la llegada de la tecnologa recombinante. La seleccin de hospedadores de expresin para la produccin comercial de protenas heterlogas se basa en los aspectos econmicos de la tcnica de produccin, tales como el coste de la fermentacin, el coste de la puricacin y la capacidad del hospedador para efectuar las modicaciones postraduccionales necesarias para la actividad biolgica completa de la protena recombinante. Aunque en muchos casos las clulas hospedadoras elegidas son clulas procariotas, tales como Escherichia coli o clulas eucariotas simples tales como la levadura Saccharomyces cerevisiae, estos sistemas no son sucientes en todos los casos y pueden encontrarse problemas tanto en el rendimiento como en la actividad de la protena producida. El problema de la actividad biolgica puede resolverse mediante sistemas alternativos tales como clulas vegetales, clulas de mamfero y clulas de insecto, pero se resienten de un alto coste de fermentacin y un bajo rendimiento. Las plantas transgnicas pueden producir varios tipos de polipptidos heterlogos, incluyendo anticuerpos (ac) y fragmentos de anticuerpo (Whitelam y col., 1993; Goddijn y Pen, 1995; Hemming, 1995). Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo son interesantes desde un punto de vista industrial: pueden producirse contra prcticamente cada tipo de molcula orgnica y se unen a este antgeno de forma muy especca. Sin embargo, el principal inconveniente es el coste de produccin. Las plantas y las clulas vegetales son una alternativa interesante para la produccin de estas molculas y de otros polipptidos que son difciles de producir en otras clulas procariticas o eucariticas. El documento US5804694 describe la produccin comercial de la -glucuronidasa en plantas colocando el gen de la -glucuronidasa detrs de un promotor de ubiquitina. Con esta construccin, el 0,1% de la protena total extrada es -glucuronidasa. Puede mejorarse la acumulacin, especialmente para ac y fragmentos de ac, dirigiendo la protena heterloga al retculo endoplsmico. El uso del promotor 35S del virus del mosaico de la colior da lugar a un nivel de expresin de Fv de anticuerpos de cadena nica (scFv) de hasta el 4-6,8% de la protena soluble total en hojas (Fiedler y col., 1997). Gran nmero de esfuerzos se han centrado en las semillas para la produccin de protenas en plantas. De hecho, las semillas, especialmente de legumbres y cereales, contienen grandes cantidades de protenas; stas son principalmente protenas de almacenamiento, que pueden constituir hasta el 7-15% del peso en seco de los cereales y hasta el 2040% de las legumbres. Adems, las protenas de almacenamiento son limitadas en nmero y algunas de ellas pueden ser responsables de hasta el 20% del contenido total de protena de la semilla (Vitale y Bollini, 1995), lo que puede tener importantes ventajas para el procedimiento de puricacin. A este respecto, se consider que los promotores que codican las protenas de almacenamiento son herramientas ideales para obtener niveles elevados de expresin de protenas en semilla (Fiedler y col., 1997). El documento US5504200 describe el uso del promotor de la faseolina para la expresin de genes heterlogos en plantas y clulas vegetales. El documento WO9113993 describe la expresin de genes animales o del gen de la protena de almacenamiento 2S del coco de brasil, usando un promotor seleccionado entre el grupo compuesto por el promotor de la faseolina, la subunidad del promotor de la -conglicinina y el promotor de la -zeina El gen se une a una seal poli-A seleccionada del grupo compuesto por la seal poli-A de la faseolina y la seal poli-A animal. Sin embargo, ninguno de estos sistemas conduce a una expresin elevada de protena heterloga. El documento WO9729200 describe un nivel de expresin especco de semillas del 1,9% de protena heterloga en la protena soluble total, usando el promotor especco de la legumina B4. Las mejoras adicionales de los casetes de expresin llevan a una expresin del 3-4% de anticuerpos scFv en semillas maduras de tabaco (Fiedler y col., 1997).

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Recientemente, se aisl y clon el gen de la arcelina 5I (arc5I) de Phaseolus vulgaris. Este gen es responsable de la produccin de la protena de almacenamiento de semillas Arcelina 5a (ARC5a) que se acumula en plantas de tipo silvestre hasta el 24-32% del contenido de protena total de la semilla (Goossens y col. 1994; Goossens y col., 1995). La expresin del gen en Arabidopsis thaliana y Phaseolus acutifolius indicaba que la protena de almacenamiento de semillas ARC5a puede expresarse hasta el 15%, respectivamente el 25% de la protena soluble total (Goossens y col., 1999), cuando se usaban las propias seales promotoras y de expresin. Sin embargo, no se mostraban evidencias de que el promotor pudiera dar una expresin ecaz con otras protenas. De forma sorprendente, encontramos que el uso del promotor de arcelina 5I o del promotor de faseolina, en combinacin con la secuencia lder de arcelina 5I o el lder omega del virus del mosaico del tabaco (TMV) y la secuencia 3 de arcelina 5I, poda dar lugar a un nivel de expresin de protena heterloga de hasta el 12% de la protena total de la semilla, que es mucho ms alta que las conocidas en la tcnica anterior.

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Un primer aspecto de la presente invencin es proporcionar un casete de expresin preferida en semillas que tiene elementos reguladores del gen que comprenden - el promotor de la arcelina que comprende la secuencia mostrada en la ID SEC N 1
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- el lder de arcelina 5I mostrado en la ID SEC N 2 - el pptido seal de almacenamiento de albmina 2S2 mostrado en la ID SEC N 4.
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- el extremo 3 de arcelina 5I que comprende la secuencia mostrada en la ID SEC N 3, en el que dicho gen heterlogo de inters se sita entre dicha secuencia lder y dicha secuencia 3 de arcelina 5I.

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Preferiblemente, dicho gen de inters se fusiona con la secuencia que codica el pptido seal de almacenamiento de albmina 2S2. En una realizacin preferida, el gen de inters es un gen que codica un anticuerpo scFv. Otro aspecto de la invencin es proporcionar un procedimiento para obtener la expresin preferida en semillas de una protena heterloga usando el casete de expresin preferida de semillas de la invencin, a un nivel de al menos el 10%, preferiblemente a un nivel de al menos el 15%, 20%, 25%, 30%, 35% o 40% de la protena total soluble de la semilla, a condicin de que dicha protena heterloga no sea una protena de almacenamiento de semilla sin modicar tal como Arcelina 5a. Preferiblemente, dicha protena heterloga no es una Arcelina, Faseolina o Zeina sin modicar. Otra realizacin preferida es un procedimiento segn la invencin, por el cual dicha protena heterloga es un scFv. An otro aspecto de la invencin es una clula vegetal, transformada con un casete de expresin segn la invencin o una planta transgnica que comprende un casete de expresin de acuerdo con la invencin. De hecho, el casete de expresin puede incorporarse y transformarse en una clula vegetal o en una planta, usando procedimientos conocidos por el experto en la materia. Dichos procedimientos incluyen, pero no de forma limitante, la transformacin mediada por ADN-T de Agrobacterium, bombardeo de partculas, electroporacin y captacin directa de ADN. Deniciones Las deniciones siguientes se exponen para ilustrar y denir el signicado y el alcance de los diversos trminos usados para describir la presente invencin.

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Expresin preferida en semillas signica que la expresin preferiblemente tiene lugar en la semilla, pero no excluye la expresin en otros rganos de la planta. Gen de inters como se usa aqu signica la secuencia codicadora de un gen del cual se quiere obtener la expresin preferida en semillas.

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Lder como se usa aqu signica la secuencia sin traducir del extremo 5. Pptido seal indica la funcin inicial del pptido en la protena de almacenamiento de albmina 2S2 pero no implica necesariamente que el pptido tenga la misma funcin y sea procesado de la misma forma cuando se fusiona con el gen de inters. Protena heterloga se reere a cualquier protena que puede expresarse en semillas pero que no es una protena de almacenamiento de semilla sin modicar. Por el contrario, las protenas de almacenamiento de semillas modicadas (mutantes especcos, protenas de fusin, protenas de almacenamiento de semillas mejoradas...) son parte de la presente invencin y, de ese modo, se incluyen en dicha denicin. Breve descripcin de las guras
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Figura 1: Visin general de los vectores de ADN-T para la evaluacin de produccin de scFv en semillas de Arabidopsis thaliana. LB y RB = lmite izquierdo y lmite derecho del ADN-T.

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pVS1 = insercin plasmdica de Pseudomonas aeruginosa para la estabilidad y replicacin del vector en Agrobacterium tumefaciens. pBR = origen de replicacin en Escherichia coli.

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NptII = marcador de seleccin neomicina fosfotransferasa II bajo el control del promotor nos y de las seales de terminacin 3 ocs y de poliadenilacin. SmISpR = gen de resistencia bacteriana a espectinomicina y estreptomicina.
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Figura 2: Construccin de pBluescript (2S2-G4). Figura 3: Construccin de patag5 (3-arc5I).
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Figura 4: Construccin de pSP72 (Parc5I/ARC5acs ). Figura 5: Amplicacin de fragmentos de ADN para la construccin del vector.

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Figura 6: Construccin de pParc5I-G4. Este vector, de acuerdo con el Tratado de Budapest, se ha depositado en las Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCMTM Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie (LMPB), Universidad de Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Blgica por la Dra. Ann Depicker, Molenstraat 61, 9820 Merelbeke, Blgica (direccin de trabajo: K.L. Ledeganckstraat 35, 9000 Gent, Blgica) y tiene el nmero de acceso: LMBP 4128. Figura 7: Construccin de pParc5I--G4. Figura 8: Construccin de pP35S-G4. Figura 9: Construccin de pP-phas-G4.

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Figura 10: Resultados de la cuanticacin de scFv-G4 en los extractos de semillas por inmunotransferencia cuantitativa. Se cargaron 500 ng de protena de extractos de semillas A, P y y 2,5 g de protena de extractos 35S y Col O en un gel SDS-PAGE al 10%. Las protenas G4 se detectaron con anticuerpos monoclonales anti-c-myc y anti-ratn conjugados con fosfatasa alcalina. ColO = control negativo.
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Figura 11: Cuanticacin de scFv-G4 en extractos de semillas de transformantes por inmersin oral por inmunotransferencia cuantitativa. Se muestran los resultados de 10 variedades de semillas T2 segregadas transformadas con pParc5I-G4 (transferencia superior) y 4 variedades de semillas T2 segregadas transformadas con pP-phas-G4 (transferencia inferior). Cargamos 1 microgramo de protenas de semillas de A1, A7, F28, F31, F38 y F39, 1,5 microgramos de A3, A5, A8, A15, A22 y A42 y 2 microgramos de A14 y A16 en un gel SDS-PAGE al 10%. Las protenas G4 se detectaron con anticuerpos monoclonales anti-c-myc y anti-ratn conjugados con fosfatasa alcalina. M = marcadores de peso molecular. Figura 12: Gel SDS-PAGE teido con azul de Coomassie que muestra las protenas separadas de semillas de Arabidopsis de transgnicos F28 (carriles 3 y 7), F31 (carriles 4 y 8), F38 (carriles 5 y 9), F39 (carriles 6 y 10), transformados con pP-phas-G4 y de una planta de control no transformada (carril 2). Los carriles 3, 4, 5 y 6 contienen 30 microgramos de protena y los carriles 7, 8, 9 y 10 contienen 20 microgramos de protena. La echa indica la banda de la protena scFv recombinante. El carril 1 contiene el marcador de peso molecular. En base a las bandas de protena teidas con Coomassie en carriles separados, el software ImageMaster VDS midi los siguientes contenidos de G4 para cada carril: 9,9% para F28 (11,3% por inmunotransferencia), 15,4% para F31 (20,0% por inmunotransferencia), 16,0% para F38 (19,0% por inmunotransferencia) y 9,6% para F39 (12,0% por inmunotransferencia). Figura 13: Representacin esquemtica del ensayo de ELISA usado para analizar la actividad de unin al antgeno de las protenas scFv extradas ex planta y extradas de E. coli. (1) Recubrimiento de pocillo de microvaloracin con anticuerpo monoclonal 9E10 unido a la etiqueta c-myc del scFv; (2) incubacin conjunta de varias cantidades de scFv de semillas o de E. coli con un exceso del antgeno dihidroavonol-4-reductasa (DFR) de Petunia hybrida; deteccin de la DFR unida con (3) antisuero policlonal de ratn contra DFR y (4) suero policlonal anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina (FA). Figura 14: Resultados del anlisis por ELISA de la actividad de unin al antgeno de protenas scFv extradas de semillas y de E. coli. El ensayo de ELISA (gura 12) se realiz con diferentes concentraciones de G4 (eje X) en presencia o ausencia (controles) del antgeno DFR. El eje Y representa la seal del ELISA (UF/min). Figura 15: Construccin de patag6 (3-arc5I).

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Figura 16: Construccin de pParc5I-G4bis. Figura 17: Cuanticacin de scFv-G4 en semillas diferentes (3/2, 3/3, 3/4 y 3/5) de una nica planta de Phaseolus acutifolius transgnica. Cargamos 3 (carriles a) o 4 (carriles b) microgramos de protenas de semillas de cada extracto de semillas en un gel SDS-PAGE al 10%. Las protenas G4 se detectaron con anticuerpos monoclonales anti-c-myc y anti-ratn conjugados con fosfatasa alcalina. M = marcador de peso molecular.

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Ejemplos Ejemplo 1
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Clonacin de los vectores de ADN-T para la evaluacin de la produccin de scFv en Arabidopsis thaliana bajo el control de las seales de expresin de arc5I de Phaseolus vulgaris Se construyeron cuatro vectores de ADN-T para evaluar y comparar la produccin de scFv bajo el control de las seales de expresin de arc5I (vectores pParc5I y pParc5I--G4), el promotor 35S del virus del mosaico de la colior (vector pP35S-G4) y el promotor del gen de la faseolina de Phaseolus vulgaris (vector pP-phas-G4)(gura 1). Una primera etapa en el procedimiento de clonacin consisti en la construccin de tres vectores piloto: pBluescript (2S2G4) (gura 2), patag5 (3-arc5I)(gura 3) y pSP72 (Parc5I/ARC5acs )(gura 4). Construccin de pBluescript(2S2-G4)(gura 2)

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La secuencia codicadora del fragmento G4 de scFv, fusionada en su extremo 3 con la secuencia codicadora de la etiqueta c-myc (Evan y col., 1985) y la seal KDEL de retencin de RE (Denecke y col., 1992), se cort a partir del vector pG4ER de ADN-T (De Jaeger y col., 1999) por los sitios de restriccin NcoI y XbaI. Adems, se cre un oligonucletido que codica la secuencia seal de almacenamiento de protenas de semillas 2S2 de Arabidopsis thaliana (Krebbers y col., 1988). Este oligonucletido estaba anqueado en su extremo 3 por el extremo cohesivo del sitio de restriccin NcoI y estaba anqueado en su extremo 5 por un extremo cohesivo que complementa el sitio de restriccin XbaI pero lo destruye tras el ligamiento, seguido de los sitios de restriccin EcoRI, BglII y HindIII. El fragmento G4 y el oligonucletido se clonaron conjuntamente en el vector pBluescriptKS (Stratagene, La Jolla, CA), tras cortar con HindIII y XbaI. Se analiz la secuencia de la insercin y se seleccion un clon que contena una insercin correcta para etapas de clonacin adicionales. De este modo, obtuvimos el vector piloto pBluescript (2S2-G4), que contena la secuencia codicadora de G4, precedida de una serie de sitios de restriccin nicos que podran usarse para la insercin de los diferentes promotores en combinacin con una secuencia lder de ARNm. Construccin de patag5(3-arc5I)(gura 3) Se cre un oligonucletido para insertar algunos sitios de restriccin nicos en el vector de ADN-T patag4 (Goossens y col., 1999). El oligonucletido contena los siguientes sitios de restriccin desde su extremo 5 a su extremo 3: el extremo 5 cohesivo de EcoRI, los sitios de restriccin XbaI, XhoI y BglII y un extremo 3 cohesivo que complementa a XbaI pero que lo destruye tras el ligamiento. El oligonucletido se lig en patag4, tras cortar con EcoRI y XbaI. Esto da lugar al vector patag5. Se analiz la secuencia del oligonucletido insertado y se seleccion un clon con la insercin correcta para etapas de clonacin adicionales. Usando XbaI y EcoRI, cortamos las seales 3 de expresin de arc5I(3-arc5I) a partir del vector pBluescript(arc5I) (Goossens y col., 1995), que contena la secuencia genmica del gen arc5I. El fragmento 3 de arc5I se lig en patag5, tras cortar con XbaI y EcoRI. Esto dio lugar al vector de ADN-T patag5(3-arc5I). Construccin de pSP72(Parc5I/ARC5acs )(gura 4)

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El promotor arc5I y la secuencia codicadora de la protena ARC5a (ARC5acs ) se cortaron de pBluescript(arc5I). Este fragmento se lig en el vector de clonacin pSP72 (Promega, Madison, WI) tras cortar con EcoRI y XbaI. Esto dio lugar al vector pSP72 (Parc5I/ARC5acs ), que contena el promotor arc5I precedido de los sitios de restriccin EcoRI y BglII. Adems de estos tres vectores piloto, se amplicaron mediante PCR cuatro fragmentos de ADN. Estos fragmentos se denominaron PCR1, PCR2, PCR3 y PCR4 (gura 5). Los fragmentos PCR1 y PCR2 se amplicaron a partir de los extremos 3 del promotor 5 de arc5I (Parc5I) en pBluescript (arc5I). PCR1 contena el extremo 3 del Parc5I seguido de la secuencia lder de arc5I y el extremo 5 de la secuencia seal 2S2. PCR2 contena el mismo extremo 3 de Parc5I, pero seguido de la secuencia lder y el extremo 5 de la secuencia seal 2S2. Ambos fragmentos estaban anqueados por los sitios de restriccin SacI y HindIII. PCR3 se obtuvo amplicando el promotor 35S del virus del mosaico de la colior del vector pGEJAE1 (De Jaeger y col., 1999). En el extremo 3 del promotor 35S, incorporamos el lder de arc5I, seguido del extremo 5 de la secuencia seal 2S2. PCR3 est anqueado por los sitios de restriccin BglII y HindIII. PCR4 contena el promotor del gen de la faseolina de Phaseolus vulgaris, amplicado a partir del vector pBluescript (P-phas) (van der Geest y col., 1994). En el extremo 3 de PCR4, incorporamos el lder de arc5I seguido del extremo 5 de la secuencia seal 2S2. Este fragmento estaba anqueado por los sitios de restriccin XhoI y HindIII. Los vectores pilotos y los cuatro fragmentos de PCR se usaron para clonar los cuatro vectores de ADN-T de la gura 1. Construccin de pParc5I-G4 (gura 6)

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Primero se cort el extremo 5 del promotor de arc5I a partir del vector pSP72 (Parc5I/ARC5acs ) usando las enzimas BglII y SacI. Este fragmento promotor, junto con el fragmento PCR1, se lig en el vector pBluescript (2S2G4), tras la digestin de restriccin con BglII y HindIII. Esto dio lugar al vector pBluescript (Parc5I- lder arc5I2S2-G4). Se analiz la secuencia del fragmento PCR1 insertado y se seleccion un clon con insercin correcta para
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etapas de clonacin adicionales. Finalmente, el promotor arc5I con el lder arc5I y la secuencia que codica G4, se cort de la construccin anterior por los sitios de restriccin BglII y XbaI y se lig en el vector patag5(3-arc5I), tras la digestin con BglII y XbaI. Esto dio lugar al vector de ADN-T pParc5I-G4. Este plsmido transformado en E. coli MC1061 se deposit en el BCCM con el nmero de depsito LMBP 4128. El plsmido contiene el promotor arc5I completo y el extremo 3 de arc5I completo, como se usa en los casetes de expresin que comprenden el promotor arc5I y el extremo 3 de arc5I. Construccin de pParc5I--G4 (gura 7)
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Primero se cort el extremo 5 del promotor arc5I a partir del vector pSP72 (Parc5I/ARC5acs ) por digestin de restriccin con BglII y SacI. Este fragmento promotor, junto con el fragmento PCR2, se lig en el vector pBluescript (2S2-G4), tras la digestin de restriccin con BglII y HindIII. Esto dio lugar al vector pBluescript (Parc5I-lder 2S2-G4). Se analiz la secuencia del fragmento PCR2 insertado y se seleccion un clon con insercin correcta para etapas de clonacin adicionales. Finalmente, se cort el promotor arc5I con el lder y la secuencia que codica G4 a partir de la construccin anterior en los sitios de restriccin BglII y XbaI y se lig en el vector patag5 (3-arc5I), tras la digestin con BglII y XbaI. Esto dio lugar al vector de ADN-T pParc5I--G4. Construccin de pP35S-G4 (gura 8)

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El fragmento PCR3 se lig en el vector pBluescript (2S2-G4), tras la digestin de restriccin con BglII y HindIII. Esto dio lugar al vector pBluescript (P35S-lder arc5I-2S2-G4). Se analiz la secuencia del fragmento PCR3 insertado y se seleccion un clon con la insercin correcta para etapas de clonacin adicionales. Finalmente, con el promotor 35S con el lder de arc5I y la secuencia codicadora de G4 se cort de la construccin anterior en los sitios de BglII y XBaI y se ligaron al vector patag5 (3 arc5I), tras la digestin con BglII y XbaI. Esto dio lugar al vector de ADN-T pP35S-G4. Construccin de pP-phas-G4 (gura 9)

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El fragmento PCR4 se lig en el vector pBluescript (2S2-G4), tras la digestin de restriccin con XhoI y HindIII. Esto dio lugar al vector pBluescript (Pphas-lder de arc5I-2S2-G4). Tras analizar la secuencia de ADN del fragmento PCR4 insertado, encontramos en el promotor de faseolina algunos pares de bases que diferan de la secuencia original (Bustos y col., 1991; nmero de acceso del Genbank J01263). Sin embargo, el extremo 3 de la secuencia promotora clonada, empezando desde el sitio NdeI, era exactamente igual a la secuencia dada. Por tanto, se cort este fragmento, junto con la secuencia codicadora del scFv G4, a partir del vector pBluescript (Pphas-lder arc5I-2S2G4) usando los sitios de restriccin NdeI y XbaI. Adems, se cort el extremo 5 del promotor de la faseolina a partir de pBluescript (P-phas) por los sitios de restriccin XhoI y NdeI. Se ligaron ambos fragmentos de ADN en patag5(3-arc5I), tras la digestin de restriccin con XhoI y XbaI. Esto dio lugar al vector nal pP-phas-G4. Una vez ms analizamos la secuencia del promotor de la faseolina y encontramos las mismas diferencias con la secuencia original. La secuencia entre el sitio XhoI y el sitio NdeI, como se usa en la construccin se describe en la ID SEC N 5. Los cuatro vectores de ADN-T se puricaron a partir de Escherichia coli y se electroporaron en Agrobacterium tumefaciens C58C1RifR (pMP90). Tras la puricacin de la colonia, se puricaron los plsmidos a partir de Agrobacterium y se analizaron. En la transformacin de Arabidopsis se usaron cepas de Agrobacterium.

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Ejemplo 2 Transformacin de Arabidopsis thaliana y regeneracin de plantas transgnicas

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Se transform Arabidopsis thaliana (genotipo O de Columbia) por transformacin de races (Valvekens y col., 1988) con las construcciones pParc5I-G4, pParc5I--G4, pP35S-G4 y pP-phas-G4. Tras la seleccin de los callos transformados en medio selectivo con kanamicina, se transrieron 150 callos a medio inductor de la germinacin. Finalmente, los brotes se transrieron a medio inductor de enraizamiento. Tras la formacin de las races, las plantas se transrieron al semillero y se recogieron las semillas de los siguientes nmeros de plantas de Arabidopsis transgnicas: 36 para pParc5I-G4, 4 para pP35S-G4, 18 para pP-phas-G4 y 13 para pParc5I--G4. En paralelo, se usaron las mismas construcciones para la transformacin de Arabidopsis por inmersin oral (Clough y Bent, 1998). Se seleccionaron plantas T1 transformadas en medio selectivo que contiene kanamicina, se transrieron al semillero y se recogieron las semillas.

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Ejemplo 3 Acumulacin de scFv en semillas de Arabidopsis transgnicas

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Extraccin de semillas y cuanticacin de protena Los extractos crudos de protenas de semillas se obtuvieron siguiendo una modicacin del protocolo de extraccin de van der Klei y col. (1995) (Goossens y col., 1999). Las semillas molidas se extrajeron dos veces con hexano para
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eliminar los lpidos. El residuo se lioliz y posteriormente se extrajo dos veces con Tris/HCl 50 mM, NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, Tween 20 al 0,1%, pH 8 (Fiedler y col., 1997) durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitacin continua. Para prevenir la degradacin de las protenas, se aadi al tampn de extraccin una mezcla de inhibidores de proteasas (2xCmpleteTM , Roche Molecular Biochemicals, Alemania). Se retir el sedimento por centrifugacin a 20.000 x g y se combinaron los sobrenadantes. La cantidad de protena total en los extractos crudos se determin por el procedimiento de Lowry usando el ensayo de la protena DC (BioRad, Hercules, EE.UU.) con BSA como patrn (Tabla 1). La abilidad de la cuanticacin de protena en semillas de Arabidopsis por este procedimiento se veric segn describen Goossens y col., 1999. TABLA 1 Concentracin de protena total en extractos de semillas transgnicas (500 microlitros) a partir de 10 mg de semillas de Arabidopsis transgnicas. A1
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A 105 3.395 g/l P5 4.028 g/l 33 3.527 g/l 35S 101 3.837 g/l

A 140 3.042 g/l P 15 3.623 g/l 65C 3.184 g/l 35S 116 3.879 g/l

A 143 3.708 g/l P 22A 3.151 g/l 98A 3.754 g/l 35S 131A 3.906 g/l

A 165A 3.675 g/l P 102B 3.339 g/l 130 3.517 g/l Col O 3.215 g/l

3.665 g/l P 3A

25

2.852 g/l 7A

30

3.873 g/l 35S 93

35

3.945 g/l

40

Col O = genotipo 0 de Columbia no transformada como control. A = lnea de Arabidopsis transformada con pParc5I-G4 P = lnea de Arabidopsis transformada con pP-phas-G4 35S = lnea de Arabidopsis transformada con pP35S-G4 = lnea de Arabidopsis transformada con pParc5I--G4

45

3.2 Cuanticacin de la acumulacin de scFv-G4 Las protenas se separaron en SDS-PAGE y se determinaron los niveles de acumulacin de scFv-G4 por anlisis por Western-blot cuantitativo usando el anticuerpo monoclonal anti-c-myc 9E10 (Evan y col., 1995) seguido de IgG antiratn conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), segn De Jaeger y col., 1999 (gura 10). Se usaron como patrones diferentes cantidades de protenas scFv-G4 puricadas a partir de Escherichia coli (De Jaeger y col., 1999). Las construcciones pParc5I-G4, pParc5I--G4 y pP-phas-G4 dan niveles elevados de acumulacin de scFv-G4 en semillas de Arabidopsis, en el intervalo del 10% de protena total soluble de la semilla. Estos son los niveles ms elevados de protenas scFv producidas en plantas que se han documentado. Adems, se encontraron fcilmente lneas con estos elevados niveles a pesar de que slo se analizaron 5 lneas para cada construccin, lo cual es un indicio de que los casetes de expresin no son muy sensibles al silenciamiento.

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ES 2 249 452 T3
TABLA 2 Niveles de acumulacin de scFv-G4 en semillas de Arabidopsis transgnicas.
5

pParc5I-G4 Lnea Nivel de G4 (*) A1 A 105 < 4% 10% 6% 8% 8% P 3A P5 P 15

pP-phas-G4 Lnea Nivel de G4 (*) 10% 10% < 4% 12% 12% 7A 33

pParc5I--G4 Lnea Nivel de G4 (*) 12% < 4% 6% < 4% < 4% 35S93 35S 101 35S 116 35S 131A

pP35S-G4 Lnea Nivel de G4 (*) <0,8% 3% <0,8% <0,8%

10

15

A 140 A 143

65C 98A 130

P 22A P 102B

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A 165A

(*) nivel de acumulacin como % del contenido de protena total soluble de semillas transgnicas
25

Ejemplo 4 Transformacin de Arabidopsis thaliana por inmersin oral y regeneracin de plantas transgnicas
30

Arabidopsis thaliana (genotipo O de Columbia) se transform por inmersin oral) (Clough y Bent, 1998) con los construcciones pParc5I-G4, pParc5I--G4, pP35S-G4 y pP-phas-G4. Se seleccionaron plantas T1 transformadas en medio selectivo que contena kanamicina, se transrieron al semillero y se recogieron las variedades de semillas segregadas T2. Acumulacin de scFv en variedades de semillas segregadas T2 Extraccin de semillas y cuanticacin de protena La extraccin de semillas y la cuanticacin de protena se determinaron como se describe en el ejemplo 3.

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Cuanticacin de la acumulacin de scFv-G4 Las protenas se separaron en SDS-PAGE y se determinaron los niveles de acumulacin de protenas scFv-G4 por anlisis por Western-blot cuantitativo usando el anticuerpo monoclonal anti-c-myc 9E10 (Evan y col., 1995) seguido de IgG anti-ratn conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), segn describen De Jaeger y col., 1999 (gura 11). Se usaron como patrones diferentes cantidades de protenas scFv-G4KDEL puricadas a partir de Escherichia coli. La mayora de las variedades de semillas se analizaron al menos dos veces. Las construcciones pParc5I-G4 y pP-phas-G4 dieron niveles de acumulacin de scFv-G4 muy elevados en semillas de Arabidopsis, en el intervalo de 5-10% y 10%-20% de protena total soluble de la semilla, respectivamente (tabla 3). El uso del lder no traducido de arc5I en pParc5I-G4 o el lder del TMV(omega) en pParc5I--G4 daban niveles de acumulacin similares (tabla 3), mostrando que ambos lderes permiten un inicio de la traduccin ecaz en semillas. Adems, la variacin intertransgnica es baja para las cuatro construcciones, lo cual es una indicacin de que los casetes de expresin no son muy sensibles al silenciamiento. Los extractos de semillas de cuatros lneas de plantas pP-phas-G4 con la acumulacin ms elevada de G4 mayor se analizaron adicionalmente por SDS-PAGE y tincin con azul de Coomassie (gura 12). Pudo identicarse una banda de protena scFv clara del tamao esperado, que estaba ausente en la lnea control sin transformar. Usando el software ImageMaster VDS (Pharmacia, Uppsala, Suecia) se midi el porcentaje de scFv en la protena total soluble de la semilla en cada carril. Se obtuvieron niveles de acumulacin de scFv similares en los carriles que los obtenidos con el anlisis por inmunotransferencia cuantitativa.

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TABLA 3 Niveles de acumulacin de scFv-G4 en variedades de semillas segregadas T2 de Arabidopsis transgnicas . Se analizaron 20 variedades de semillas independientes, los niveles de scFv se clasicaron de mayor a menor. pParc5I-G4 (*)
10

Pp-phas-G4 (*) 20,0 0,0 19,0 1,4 12,0 0,0 11,3 1,8 7,2 0,2 5,4 0,9 5,0 0,0 4,5 0,7 4,4 0,5 4,0 1,0 3,9 0,2 3,8 0,3 1,8 0,4 1,8 0,3 1,6 1,3 1,2 0,8 <0,4 n.d.

pParc5I--G4 (*) 5,8 0,4 4,9 0,2 4,5 0,7 4,0 0,0 3,9 0,2 3,9 0,2 3,5 0,2 3,2 0,2 3,1 0,6 3,0 0,0 3,0 0,0 2,7 0,4 1,6 0,4 1,5 1,4 0,1 0,7 0,0 0,6 0,1 0,3 0,2 0,1

pP35S-G4 (*) 1,1 0,1 1,1 0,1 1,1 0,1 1,0 0,0 1,0 0,0 0,8 0,1 0,7 0,1 0,7 0,1 0,7 0,1 0,7 0,0 0,7 0,1 0,7 0,1 0,6 0,0 0,5 0,1 0,5 0,0 0,4 0,0 0,3 0,0 0,2 0,1 0,1 n.d.

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8,0 1,4 7,8 0,4 6,7 0,1 6,4 0,5 5,3 1,8 4,7 0,5 4,5 0,7 3,9 0,2 3,8 0,4 3,7 0,5 2,4 0,5 1,7 0,5 1,3 0,4 0,9 0,2 0,8 0,0 0,5 0,1 0,5 0,1 0,4 0,1 <0,3 <0,3

35

(*) nivel de acumulacin de scFv como % del contenido de protena soluble en semillas transgnicas, con desviacin tpica. n.d. = no se detecta.

40

Acumulacin de scFv en variedades de semillas homocigotas transgnicas T3 Para cada construccin, se analizaron genticamente 10 variedades de semillas T2 que contenan los niveles de G4 ms elevados por anlisis de segregacin. Se germinaron 72 semillas de cada variedad de semilla en medio selectivo, que contena kanamicina e identicamos por anlisis estadstico lneas vegetales que contenan un emplazamiento de ADN-T nico. Para las construcciones pParc5I-G4 y pP-phas-G4, se eligieron 4 lneas que contena un emplazamiento de ADN-T nico para cultivar y seleccionar variedades de semillas homocigotas. Se cultivaron 10 plantas T2 por lnea, se recogieron semillas T3 y se seleccionaron variedades de semillas T3 homocigotas cultivando las plantas en medios selectivos que contenan kanamicina. No se encontraron semillas homocigotas de una de las cuatro lneas que contenan la construccin pParc5I-G4. La acumulacin de G4 se midi por inmunotransferencia cuantitativa en variedades de semillas T3 segregadas y T3 homocigotas. La mayora de las variedades de semillas homocigotas de pParc5I-G4 y todas las de pP-phas-G4 daban niveles de G4 mayores que las correspondientes variedades T3 segregadas (tabla 4). Se obtuvieron variedades de semillas homocigotas tanto para la construccin pParc5I-G4 como para la pP-phas-G4 que contenan G4 a ms del 10% de la protena total soluble de la semilla. La variedad de semilla homocigota, transformada con pP-phas-G4, contena niveles de G4 extraordinariamente elevados, hasta el 36,5% de la PTS en semillas. Este es el nivel de protena heterloga ms alto jams documentado para plantas.

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TABLA 4 Niveles de acumulacin de scFv-G4 en variedades de semillas T3 segregadas y homocigotas de Arabidopsis
5

Lnea vegetal A1

Variedades de semillas T2 segregadas (*) 8,0 1,4 4,7 0,5 4,5 0,7 4,5 0,7 5,0 0,0 11,3 1,8 19,0 1,4

Variedades de semillas T3 segregadas (*) 8,2 1,0 6,7 0,7 5,6 1,0 4,7 0,0 3,8 0,7 5,1 1,4 5,8 7,0 1,4 4,9 0,2 13,0 1,4 10,5 0,7 17,5 0,7 17,5 3,5

Variedades de semillas T3 homocigotas (*) 4,4 0,8 12,5 1,9 6,4 1,4 7,7 1,4 6,0 1,0 3,5 0,4 18,0 13,5 2,1 15,0 1,4 21,0 4,2 18,5 0,7 36,5 3,4

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A15
15

A16 F3

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F24 F28

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F38
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(*) Nivel de acumulacin de scFv como % del contenido de protena soluble total en semillas transgnicas, con desviacin tpica. n.d. = no se detecta. Se analiz para la mayora de las lneas ms de una variedad de T3 segregada y homocigota. A1, A15 y A16 son lneas vegetales transformadas con la construccin pParc5I-G4. Las lneas F3, F28 y F38 se transformaron con pP phas G4 . Anlisis de la calidad de scFv en extractos de semillas Se midi la actividad de unin al antgeno de las protenas G4 extradas de semillas y se compar por ELISA con G4 extrada de E. coli. Usamos extracto de semillas de la variedad de semilla Phas que contena G4 al 36,5% (tabla 4). Se incubaron diferentes cantidades de scFv con el antgeno dihidroavonol-4-reductasa en exceso y se midi el antgeno unido por ELISA de tipo sndwich (gura 13). Se establecieron curvas de seal de ELISA tanto para la scFv bacteriana como para la vegetal y se compararon. Las curvas se superponan entre s (gura 14), lo que indicaba que la scFv producida en planta tena similar actividad de unin al antgeno que la scFv bacteriana. Ejemplo 5 Transformacin de Phaseolus acutifolius y acumulacin de scFv en semillas de juda segregada transgnica

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Phaseolus acutifolius TB1 se transform con pParc5I-G4bis (gura 16). pParc5I-G4bis contiene el mismo ADN-T que pParc5I-G4, excepto en que ste contiene una construccin P35S-GUS adicional para el anlisis de la segregacin de las plantas transgnicas. Para la construccin de este vector de ADN-T, primero hicimos la construccin piloto patag6(3-arc5I) (gura 15) segn el procedimiento de la etapa de clonacin usado para patag5(3-arc5I) (gura 3). Se cre un oligonucletido para insertar algunos sitios de restriccin nicos en el vector de ADN-T patag3 (Goossens y col., 1999). El oligonucletido contena los siguientes sitios de restriccin desde su extremo 5 a su extremo 3: el extremo 5 cohesivo de EcoRI, los sitios de restriccin XbaI, XhoI y BglII y un extremo 3 cohesivo que complementa a XbaI pero que lo destruye tras el ligamiento. El oligonucletido se lig en patag3, tras cortar con EcoRI y XbaI. Esto dio lugar al vector patag6. Se analiz la secuencia del oligonucletido insertado y se seleccion un clon con la insercin correcta para etapas de clonacin adicionales. A partir del vector pBluescript (arc5I) (Goossens y col., 1995), que contena la secuencia genmica del gen arc5I, cortamos las seales de expresin 3 de arc5I (3-arc5I) usando XbaI y EcoRI. El fragmento 3 de arc5I se lig en patag6, tras cortar con XbaI y EcoRI. Esto dio lugar al vector patag6 (3-arc5I). Esta construccin piloto se us para hacer pParc5I-G4bis (gura 16). La secuencia lder de arc5I y la secuencia codicadora de G4 se cortaron a partir del vector pBluescript (Parc5I-lder de arc5I-2S2-G4) (gura 6) por los sitios de restriccin BglII y XbaI y se ligaron en el vector patag6 (3-arc5I) tras la digestin con BglII y XbaI. Esto dio lugar al vector de ADN-T pParc5I-G4bis.

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Se obtuvieron tres plantas transgnicas usando el protocolo de Dillen y col. (1997). Como las tres plantas se regeneraron a partir del mismo callo, se esperaba que fueran clones del mismo suceso de transformacin. Se recogieron semillas y se hicieron extractos proteicos de estas semillas separadas en el mismo tampn que para la extraccin de semillas de Arabidopsis y segn describen Goossens y col. (1999). La concentracin de protena total soluble se midi espectrofotomtricamente a 280 nm y se determin la acumulacin de G4 por inmunotransferencia cuantitativa. Se detect G4 como una banda nica de protena (gura 17) en, por trmino medio, 3 de 4 semillas de las tres variedades de semillas segregadas. Por tanto, los ms probable es que estos transformantes contengan un nico emplazamiento de ADN-T. Todas las semillas que acumulaban G4 analizadas contenan G4 al 2-2,5% de la protena total soluble o 2-2,5 miligramos de scFv por gramo de peso fresco de semillas. Hasta ahora, slo una publicacin informaba de la produccin de scFv en una especie de leguminosas. Perrin y col. (2000) obtuvieron 9 microgramos de scFv por gramo de peso fresco de semillas de guisantes con el promotor legA. De este modo, la acumulacin con la construccin con el promotor arc5I es de 200 a 300 veces mayor que los niveles informados con el promotor legA. Puesto que nosotros slo obtuvimos una lnea vegetal transgnica, lo ms probable es que puedan obtenerse lneas vegetales con niveles de scFv incluso mayores. Goossens y col. (1999) ya obtuvieron niveles 4 veces ms elevados de protena ARC5I en variedades de semillas homocigotas comparadas con variedades de semillas segregadas y esto bajo el control del mismo promotor arc5I. Por tanto, tras obtener ms lneas transgnicas y seleccionar lneas homocigotas, esperamos alcanzar niveles de scFv del 10% en Phaseolus acutifolius, usando esta construccin con el promotor arc5I. Referencias Bustos, M.M., Begum, D., Kalkan, F.A., Battraw, M.J. y Hall, T.C. (1991). Positive and negative cis-acting DNA domains are required for spatial and temporal regulation of gene expression by a seed storage promotor. EMBO 10(6), 1469-1479.
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REIVINDICACIONES 1. Un casete de expresin preferida en semillas que tiene los elementos gnicos reguladores que comprende:
5

- el promotor de la arcelina que comprende la secuencia mostrada en la ID SEC N 1, - el lder de arcelina 5I mostrado en la ID SEC N 2,

10

- el pptido seal de almacenamiento de albmina 2S2 mostrado en la ID SEC N 4, - un gen heterlogo de inters, y - el extremo 3 de arcelina 5I que comprende la secuencia mostrada en la ID SEC N 3, en el que dicho gen heterlogo de inters se coloca entre dicha secuencia lder y dicha secuencia 3 de arcelina 5I. 2. Un casete de expresin preferida en semillas segn la reivindicacin 1, por medio del cual dicho gen de inters se fusiona con la secuencia que codica el pptido seal de almacenamiento de albmina 2S2.

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3. Un casete de expresin preferida en semillas segn la reivindicacin 1 2, por medio del cual el gen heterlogo de inters codica un fragmento de Fv de cadena nica. 4. Un procedimiento para obtener la expresin preferida en semillas de una protena heterloga, usando un casete de expresin segn cualquiera de las reivindicaciones 1-3, a un nivel de al menos el 10% de la protena total soluble de la semilla, a condicin de que dicha protena heterloga no sea una protena de almacenamiento de semillas sin modicar. 5. Un procedimiento segn la reivindicacin 4 en el que dicho nivel es de al menos el 15% de la protena total soluble de la semilla.

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6. Una clula vegetal transformada con un casete de expresin segn cualquiera de las reivindicaciones 1-3. 7. Una planta transgnica que comprende un casete de expresin segn cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

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LISTA DE SECUENCIAS <110> Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnol <120> Expresin de un gen heterlogo en plantas <130> GAN/ARC/V064 <140> <141> <150> 00202278.8 <151> 2000-06-29 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1821 <212> ADN <213> Phaseolus vulgaris <400> 1

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<210> 2 <211> 13 <212> ADN

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<213> Phaseolus vulgaris <400> 2
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tgaatgcatg atc <210> 3 <211> 1280 <212> ADN <213> Phaseolus vulgaris <400> 3

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<210> 4 <211> 63 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 4

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<210> 5 <211> 1415 <212> ADN <213> Phaseolus vulgaris

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<400> 5

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