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MINISTRIO DA EDUCAO E DO DESPORTO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS DEPARTAMENTO DE BOTNICA PS-GRADUAO EM FISIOLOGIA VEGETAL

MAMONA (Ricinus communis L.): CULTURA DE ANTERA, VIABILIDADE E CONSERVAO DE PLEN

DAIANE PEIXOTO VARGAS

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Fisiologia Vegetal da Universidade Federal de Pelotas, como um dos requisitos para obteno do ttulo Mestre Fisiologia Vegetal, sob orientao: Professora e Doutora Vera Lucia Bobrowski

PELOTAS Estado do Rio Grande do Sul Brasil Fevereiro 2006

DAIANE PEIXOTO VARGAS

MAMONA (Ricinus communis L.): CULTURA DE ANTERA, VIABILIDADE E CONSERVAO DE PLEN

Dissertao apresentada Universidade Federal de Pelotas, sob orientao da Profa Vera Lucia Bobrowski, como parte das exigncias do Programa de Ps-Graduao em Fisiologia Vegetal, para obteno do ttulo de Mestre em Fisiologia Vegetal (M.S.).

PELOTAS Estado do Rio Grande do Sul Brasil Fevereiro 2006

Banca examinadora

__________________________ Dr. Jos Antnio Peters

___________________________ Dr. Srgio D. dos A. e Silva

___________________________ Dra. Beatriz H. G.Rocha

__________________________ Dr. Dario M. Moraes

___________________________ Dra. Vera Lucia Bobrowski (Orientadora)

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Dedico este trabalho minha famlia querida que esteve presente em todos os momentos com muito amor.

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AGRADECIMENTOS

Deus por me conceder esta oportunidade de vida e evoluo espiritual pela fora e nimo nas horas mais difceis. Orientadora e Amiga Vera Lucia Bobrowski pelo incentivo, confiana e ensinamentos. Ao Co-orientador Srgio, pelos livros, pela pacincia e apoio que em muito acrescentou minha caminhada. verdadeira amiga Vanessa Stein que mesmo distante esteve presente em todos os momentos. s amigas conquistadas ao longo do tempo, Letcia Cattelan e Rita Aloma, pelo auxlio no desenvolvimento deste trabalho e especial carinho que me dedicaram. Ao amigo Srgio Alessandro pela pergunta, de grande incentivo, feita vrias vezes: Cad a dissertao!? contribuindo desta forma para que ela acontecesse, alm da grande amizade expressada nestas palavras. iv

Ao amigo lvaro Miguel M. Martins pelo auxlio, ensinamentos dirios e ateno dedicada. minha irm e amiga Michele P. Vargas pelo amor e apoio para que eu realizasse todos os meus sonhos e mais este agora. Aos meus pais, Paulo Roberto e Iara, que dedicaram a mim total amor, apoio, e compreenso e que nunca mediram esforos para que eu conquistasse meus sonhos na vida. Ao meu namorado Rafael que mesmo em to pouco tempo se fez presente e trouxe muita paz e felicidade para minha vida neste momento to importante.

NDICE

SUMRIO.........................................................................................................xv xvi SUMARY.............................................................................................................. 1. INTRODUO GERAL................................................................................ 01 2. FITOLOGIA E IMPORTNCIA ECONMICA DA MAMONA....................... 03 2.1 Resumo............................................................................................04 2.2 Abstract............................................................................................ 05 2.3 Introduo........................................................................................ 06 2.4 Consideraes Finais.................................................................... 21 2.5 Referncias Bibliogrficas............................................................... 22 3. VIABILIDADE POLNICA DE CULTIVARES DE MAMONA............................. 26 3.1 Resumo.............................................................................................. 27 3.2 Abstract................................................................................................ 28 3.3 Introduo........................................................................................... 29

3.4 Material e Mtodos....................................................................... 3.5 Resultados e Discusso............................................................... 3.6 Concluses................................................................................... 3.7 Referncias Bibliogrficas............................................................ 4. VIABILIDADE DE PLEN DE MAMONA cv. IAC-80 ARMAZENADO

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SOB BAIXAS TEMPERATURAS.................................................................. 41 4.1 Resumo........................................................................................ 42 4.2 Abstract......................................................................................... 43 4.3 Introduo..................................................................................... 46 4.4 Material e Discusso.................................................................... 48 4.5 Resultados e Discusso............................................................... 52 4.6 Concluses................................................................................... 53 4.7 Referncias Bibliogrficas............................................................ 5. CULTURA DE ANTERAS DE MAMONA.................................................. 56 5.1 Resumo........................................................................................ 5.2 Abstract......................................................................................... 59 55

5.3 Introduo..................................................................................... 60 5.4 Material e Discusso.................................................................... 63 5.5 Resultados e Discusso............................................................... 5.6 Concluses................................................................................... 73 5.7 Referncias Bibliogrficas............................................................ 6.CONSIDERAES FINAIS....................................................................... 74 7. ANEXOS................................................................................................... 77 66

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LISTA DE TABELAS

VIABILIDADE POLNICA DE CULTIVARES DE MAMONA..................... Tabela 1. Percentual de viabilidade polnica de cultivares de mamona Ricinus communis L. IAC80, Cafelista, AL-Preta e ALGuarany 2002, SANEST, UFPel, 2006..................................... VIABILIDADE DO PLEN DE MAMONA CV. IAC-80 ARMAZENADOS SOB BAIXAS TEMPERATURAS..............................................................

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TABELA 1 Percentual de germinao mdia dos gros de polens de mamona cv. IAC-80, submetidos a baixas temperaturas em dois perodos de armazenamento. Pelotas.UFPel/2006................................... 49

CULTURA DE ANTERAS DE MAMONA................................................... 55

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Tabela 1. Diferentes meios de cultura utilizados em anteras de mamona (Ricinus comunnis L.). Pelotas, 64

UFPel/2006.............................................................................. Tabela 2. Comparao das medidas morfolgicas de tamanho de anteras e plen entre trs cultivares de mamona.

SAS/UFPel.2006..................................................................... Tabela 3. Comparao de medidas entre tamanho de boto floral, da anteras e do gro de plen de cultivares de

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mamona.SAS/UFPel,2006...................................................... Tabela 4.Teste preliminar para avaliao do efeito do tamanho de boto floral utilizado e do meio de cultivo na produo de calos aos 15 dias a partir aglomerados de anteras em cultura. UFPel/2006.................................................................

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LISTA DE FIGURAS

FITOLOGIA E IMPORTNCIA ECONMICA DA MAMONA................ Figura 1 Esquema ilustrativo do aspecto geral da planta de mamona adaptado de Beltro (2003).................................. Figura 2 Inflorescncia de duas cultivares de mamona com flores masculinas na regio basal e femininas na poro terminal apresentando maturao diferenciada. (A) cv. Cafelista (B) cv. AL-Guarany 2002. Pelotas-RS. 2006....... Figura 3 Polens corados com carmim-actico 2% em meio a tecidos da parede de antera em Ricinus communis (cv. IAC-80), amplitude 10x. (A) Polens isolados ainda na antera, amplitude 10x. (B) Ttrade de Ricinus communis mostrando polens jovens recm liberados e uma ttrade em boto floral 3mm, amplitude 10x (C) Morfologia externa da antera de mamona, em gua destilada, amplitude 10x. (D) UFPel/2006..........................................

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Figura 4

Aspecto morfolgico do gro de plen de Ricinus communis L. cv. Cafelista corado com carmim actico e amplitude de 40x (A); cv. AL-Preta, amplitude 10x M.O. (B). UFPel/2006................................................................. 18

VIABILIDADE POLNICA DE CULTIVARES DE MAMONA.................. Figura 1 Aspecto do plen vivel (seta branca) e plen invivel (seta preta) com uso da tcnica citogentica (A). Plen vivel corado com carmim actico 2%, observando-se o contorno exina e sexina e a abertura dos poros de forma bem definida (B) UFPel/2006.............................................. VIABILIDADE DO PLEN DE MAMONA CV. IAC-80

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ARMAZENADOS SOB BAIXAS TEMPERATURAS.............................. Figura 1. Gros de plen de mamona Ricinus communis cv. IAC80, em diferentes aspectos (A). Plen rompido ao lado de plen vivel. (B). Polens no germinados com estruturas da exina ou material citoplasmtico. (C) Polens

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mostrando detalhes na exina e germinao. (D). Plen germinado com liberao de exudado................................ CULTURA DE ANTERAS DE MAMONA............................................... Figura 1. Aglomerado de anteras extrados boto floral (5,9-5,0 mm) em meio de cultura (M5) com formao de calos. (A) Aglomerados de anteras com formao de calos retirados de botes florais (6 mm), detalhe mostrando oxidao dos tecidos de formao dos filetes em meio M5. (B) Formao de calo globular a partir de antera retira de boto floral (Classe: 2,9-2,0mm) em meio M6. (C) Formao de calos em anteras em meio M4 a partir de boto floral de 3,03,9mm (D).............................................................................. 68 50 55

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Figura 2

Antera oxidada em meio M5 retirado de boto floral (classe: < 6,0 mm). (A) Anteras oxidando intumescidas em meio M3 retirados de boto floral (4,0- 4,9 mm).(B) UFPel/2006........................................................................ 69

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SUMRIO VARGAS, D.M.S., Universidade Federal de Pelotas, fevereiro de 2006. Mamona (Ricinus communis L.): cultura de antera, viabilidade e conservao de plen. Professora Orientadora: Vera Lucia Bobrowski. Coorientador: Srgio Delmar dos Anjos e Silva A mamona (Ricinus communis L.) apresenta diversas aplicaes econmicas, entre elas, destaca-se a produo do leo indicado como matria prima para produo de Biodiesel. Na tentativa de conservar e caracterizar as variedades de mamona a anlise de fertilidade torna-se de grande importncia para dimensionar a heterogeneidade destas cultivares e com isso, a conservao e manejo do material. Para avaliar a viabilidade polnica de quatro cultivares de mamona (IAC-80 e Cafelista AL-Preta e AL-Guarany 2002) utilizou-se tcnica convencional de colorao com carmim actico 2%. As cultivares de mamona apresentaram alto percentual de viabilidade polnica na antese. Portanto, possvel a utilizao de todas as variedades analisadas na induo de fertilizao em programas de melhoramento. O uso de mtodos de conservao de gros de plen fundamental para a preservao da variabilidade gentica e facilitar o intercmbio de germoplasma. Alm da conservao convencional atravs da semente o uso da criopreservao do plen uma tcnica vivel que ocupa pequeno espao para um grande nmero

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de gentipos. Para avaliar a conservao de plen de mamona utilizou-se gros de plen da cv. IAC-80 que foram armazenados a baixa temperatura atravs do uso de nitrognio lquido (-196C), ultrafreeezer (-80C), freezer (18C) e a viabilidade avaliada aos 15 e 30 dias utilizando-se o mtodo de germinao in vitro. Os resultados indicam que o percentual mdio da viabilidade polnica no foi influenciado pelo perodo de armazenamento. Verificou-se tambm que houve diferenas entre os tratamentos utilizados para a conservao do plen, porm foi baixo o percentual de germinao dos mesmos, sugerindo adequao na tcnica de avaliao. A cultura de anteras uma ferramenta de grande utilidade para a obteno de linhagens homozigticas. Neste trabalho foram avaliados parmetros morfolgicos para correlacionar tamanho de boto floral e cultivo in vitro. Tamanhos diferentes de botes florais de trs cultivares (IAC-80, Cafelista e AL-Guarany 2002) foram avaliados e comparados quanto ao tamanho de antera e plen. Para cultivo in vitro foram utilizados seis meios diferentes e seis classes de tamanho de boto da cv. IAC-80. Verificou-se que houve diferena entre tamanho de boto floral, antera e plen entre as trs cvs. analisadas. Houve formao de calos para todos os tamanhos de anteras utilizados e o uso de carvo ativado e cido ascrbico foi eficiente para evitar a oxidao das anteras. Palavras-chave: viabilidade polnica, Ricinus communis L., haplides, microsporognese, armazenamento de plen, banco de germoplasma

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SUMARY VARGAS, D.M.S., Universidade Federal de Pelotas, February 2006. Castor bean (Ricinus communis l.): cultura de antera, pollen viability and conservation. Adviser:: Vera Lucia Bobrowski. Co-adviser: Srgio Delmar dos Anjos e Silva Castor bean (Ricinus communis L.) presents several economical applications, among them, it is possible to highlight the oil production indicated as raw material for Biodisel production. In an attempt to conserve and characterize the castor bean varieties, the fertility analyses becomes of great importance to measure these cultivars heterogeneity so it is also possible to measure the material conservation and manage. It was used the color conventional technique with acetic carmine at 2% to evaluate the pollen viability of four castor bean cultivars (IAC-80 and Cafelista AL-Preta and AL-Guarany 2002). The castor bean cultivars present high percentage of pollen viability at anthesis. Therefore, it is possible to use all the analyzed varieties in the fertilization induction in improvement programs. The use of conservation methods of pollen grains is fundamental for the genetic variability preservation and to facilitate the germoplasm interchange. Besides the conventional conservation through the seed, the use of pollen cryopreservation is a feasible technique that occupies a small space for a great number of genotypes. The conservation of the castor bean pollen was evaluated through the cv. IAC-80 pollen grains, which were

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stored at low temperatures using liquid nitrogen (196%), ultrafreeezer (-80C), freezer (-18C) and the viability was evaluated after 15 and 30 days, using the in vitro germination method. The results indicate that the average percentage of the pollen viability was not influenced by the storage period. It was observed that there were differences between the used treatments for the pollen conservation, but it was their low germination percentage, suggesting appropriateness into the evaluation technique. The anther culture is a very useful tool to obtain homozygotic yields. In this study the morphological parameters were evaluated to correlate floral bud size and in vitro cultivation. Different sizes of floral buds of three cultivars (IAC-80, Cafelista and ALGuarany 2002) were evaluated and compared concerning the anther size and pollen. Six different mediums and six classes of bud size of cv IAC-80 were used for the in vitro cultivation. Difference among floral bud size, anther and pollen among the three cvs analyzed was observed. There was callus formation for all the sizes of anthers and the use of activated charcoal and ascorbic acid was efficient to avoid the anthers oxidation.

Key words: pollen viability, Ricinus communis L., haploids, microsporogenesis, pollen storage, germoplasm bank

INTRODUO GERAL

Entre as alternativas de plantas oleaginosas visando a produo de biodiesel, a mamona hoje colocada como uma planta de excelente potencial, principalmente nas regies carentes do Brasil. A sustentabilidade de um programa de biodiesel baseado na mamona exigir fortalecimento substancial da base agrcola tecnolgica, de suporte para o desenvolvimento e indicao de novas cultivares. de fundamental importncia disponibilizar informaes atualizadas sobre a mamona e avanos tecnolgicos que contribuam para a melhoria do conhecimento da comunidade cientfica e da sociedade a respeito desta oleaginosa. O leo de mamona ou de rcino, extrado pela prensagem das sementes, contm cerca de 90% de cido graxo ricinolico, o que confere ao leo suas caractersticas singulares, possibilitando ampla gama de utilizao industrial, tornando a cultura da mamoneira de importante potencial econmico e estratgico para o Pas. Alm disso, entre as espcies cultivadas de importncia econmica no Brasil, a mamoneira uma das mais tolerantes aos estresses ambientais. A grande diversidade gentica observada no germoplasma de mamona, possui grande valor para o desenvolvimento dos programas de melhoramento, uma vez que a variabilidade a base para gerao de gentipos superiores. A pesquisa com a cultura da mamona ainda incipiente e todo o trabalho realizado neste sentido trar informao para o desenvolvimento e

aproveitamento do grande potencial que oferece esta cultura, como o caso deste trabalho.

ARTIGO I

FITOLOGIA E IMPORTNCIA ECONMICA DA MAMONA - Reviso Bibliogrfica -

RESUMO

A mamona (Ricinus communis L.) uma dicotilednea pertencente famlia Euphorbiaceae, inclui um grande nmero de espcies nativas da regio tropical, Sendo originria da antiga Abissnia, hoje Etipia, no continente africano. uma planta de hbito arbustivo, com diversas coloraes de caule, folhas e frutos tipo racemos (cachos). Seus frutos, geralmente, possuem espinhos, e suas sementes apresentam diferentes tamanhos, formatos e grande variabilidade de colorao. A biologia floral da mamoneira bastante complexa, pois apresenta inmeras expresses da sexualidade. Mtodos para a conservao da variabilidade gentica nesta espcie bastante relevante, porque a base dos programas de melhoramento gentico. Alm da conservao convencional atravs da semente o uso da criopreservao do plen uma tcnica vivel que ocupa pequeno espao para um grande nmero de gentipos. A conservao de plen muito importante porque facilita a obteno de cruzamentos artificiais nos programas de melhoramento, como tambm servem para caracterizao molecular de gentipos. Para isso, o uso adequado de tcnicas de citogentica e criopreservao fundamental. Alm das diversas aplicaes econmicas do leo de mamona, atualmente indicado como matria prima para produo de Biodiesel. Palavras-chave: Ricinus comunnis L., viabilidade polnica, conservao de plen, banco de germoplasma.

ABSTRACT Castor bean (Ricinus communis L.), dicotyledonous belonging to the Euphorbiaceae family, includes a great number of native species from the tropical region. Its origins are in the old Abyssinia, today known as Ethiopia, in the African continent. Its a plant with shrubby habit and several colors of stem, leaves and fruit racemes type (ringlet). Its fruit usually has thorns and its seeds present different sizes and shapes and great color variability. With several economical applications, castor bean is, nowadays, indicated as an energy source for the Biodiesel production because its an oil plant and with high potential of industrial production, beyond its familiar agriculture application. The floral biology of the castor bean tree is very complex since it presents innumerous sexuality expressions. That is the reason for the need of cultivars characterization so this plant can be feasible in the agricultural production. The methods for the genetic variability conservation in this species are highly relevant because they can help in genetic improvement programs, for instance, the use of biological material cryopreservation. The material can be pollen grains because they are of great importance for the search of better cultivars in crosses that attend the agronomical interests. Therefore, a method that quantifies its application, such as the pollen grain colors use, as well as its in vitro germinative potential. In last analyses, the pollen viability is the result for the fruit attachment and seeds production.

Key words: castor beans, Ricinus comunnis L., pollen viability, pollen conservation, germoplasm bank.

INTRODUO

Importncia econmica A cultura da mamona explorada industrialmente em funo do leo contido em suas sementes. Entre 1980 e 1999 a China e a ndia eram os principais produtores mundiais de mamona, a participao desses pases no total da produo mundial variou de 51%, entre 1980 a 1985, para 92% em 1999 (AZEVEDO & LIMA, 2001). Em 2002 a participao do Brasil na produo mundial de leo representou pouco mais de 7%, com 37.000 toneladas de leo. Enquanto ocorria o declnio da produo no Brasil a produo mundial manteve-se

constante. Atualmente a ndia o principal pas produtor de mamona (respondendo no mercado mundial por 51%), seguido da China (35%) e do Brasil (8%), dados de 2003 conforme FAO 2005, rgo das Naes Unidas. A diminuio do plantio e da produo no Brasil deveu-se principalmente s dificuldades de relacionamento comercial entre a indstria e o agricultor, a falta de tecnologia e incentivo e por carncia de dados cientficos que auxiliem nos sistemas adequados de plantio, aliado s deficincias climticas ocorridas na Bahia neste perodo (SAVY FILHO, 2005). A produo mundial de mamona no perodo de 2000 a 2004 esteve em torno de um milho de toneladas de mamona em gro e cerca de 400 mil toneladas de leo. Em 2004 o maior ndice de produo mundial de mamona foi atribuda ndia com produo total de 805.000 Mt, 650.000 ha de rea plantada e rendimento anual de 1239 kg/ha, seguido da China com produo de 250.000 Mt; 260.000 ha de rea plantada e rendimento de 962 kg/ha, logo aps, ocupando a terceira posio est o Brasil com produo de 145.527 Mt, 164.933 ha de rea plantada e rendimento anual de 882 kg/ha. A produo mundial de leo de mamona chegou a 1.282.807 Mt em 2004, atribuindo em produo o primeiro lugar a ndia seguida da Holanda e dos EUA (FAO, 2005; SAVY FILHO, 2005). Os tradicionais compradores do leo de mamona so: Estados Unidos, Frana, Mercado Comum Europeu, Tailndia, China, Japo entre outros. A Frana o nico fabricante da poliamina 11 ou nylon 11, consumindo cerca de 12% da produo mundial de leo somente para esse fim. A previso de consumo para 2005 foi de 80.000 toneladas de leo pelo Mercado Comum Europeu, de at 55.000 pela Frana e pelos Estados Unidos em torno de 44.000 toneladas de leo (SAVY FILHO, 2005). Com o declnio da produo brasileira houve necessidade de importao de mamona em baga ou o prprio leo para com isso conseguir atender os compromissos assumidos com o mercado internacional. Para 2005 a estimativa de rea plantada com mamona no Brasil foi de 189.000 ha com cerca de 50.000 a 100.000 pessoas envolvidas neste setor. Para o ano agrcola de 2004/2005, a tendncia era de aumento na rea colhida e na produo, em

relao 2002/2003, pela grande demanda por informaes e procura de sementes (SAVY FILHO, 2005) Um importante fator que deve ser considerado com relao mamona sua aplicao como biodiesel. O biodiesel consiste num substituto natural do leo diesel e que pode ser produzido a partir de fontes renovveis, a sua utilizao est associada substituio parcial de combustveis fsseis. Cabe ressaltar que a principal base para produo do biodiesel o leo vegetal, e que este pode ser obtido a partir da mamona bem como da soja, girassol, canola, milho, algodo, dend, babau, pequi (CARNEIRO, 2003). O Programa Nacional de Biodiesel regulamenta e autoriza o uso comercial deste produto em todo o territrio nacional e estabelece os percentuais de mistura do biodiesel ao diesel de petrleo, a forma de utilizao e o regime tributrio (Medidas Provisrias 214, de 13/09/2004 e 227 de 06/12/2004). O regime tributrio regulamentado com diferenas por regio de plantio, por oleaginosa e por categoria de produo a empresarial e a constituda por agricultura familiar - criando o selo social e iseno do IPI. Esses instrumentos autorizam, a partir de 2005, a adio de 2% de biodiesel ao diesel de petrleo, porm ser obrigatrio a partir de 2008 (SAVY FILHO, 2005). Atualmente o Brasil consome por ano 36 milhes de litros de diesel sendo importados j refinado (10%) e para refinar (20%), enquanto a produo de leos vegetais de bilhes de litros, utilizados somente para fins alimentcios. O mercado projetado hoje, portanto, de 800 milhes de litros de biodiesel B2 e para 2010, a utilizao de B5, ou seja, a adio de 5% de biodiesel (SAVY FILHO, 2005). No que se refere ao potencial para a produo de biodiesel, a mamona considerada como excelente, principalmente devido ao seu alto teor de leo em torno de 48 a 50%. Uma tonelada de mamona produz mais biodiesel do que uma tonelada de petrleo produz de diesel. Alm do leo, a mamona tambm produz a torta, resultante da extrao do leo, que dividida em casca, a qual serve como fertilizante, e polpa que rica em protena e carboidrato e utilizada na rao animal. possvel tambm aproveitar a haste (caule) da planta para a

produo de celulose, alm de ser matria-prima para a confeco de tecidos mais rsticos (CARNEIRO, 2003). Segundo dados de Oliveira (2003) o Nordeste possui potencial para cultivar at seis milhes de hectares por ano de mamona, suficientes para a produo de 4,4 bilhes de litros de biodiesel e com uma produo de, aproximadamente, 3,0 milhes de toneladas de torta, que podem beneficiar 1,5 milho de hectares (mdia de 2,0 toneladas por hectare) como fertilizante do solo. Atualmente, a Bahia o principal produtor, com cerca de 95% (82,5 mil toneladas) do total nacional no ano de 2003, com produtividade mdia de 657 kg/ha, conforme dados do IBGE (PIRES, 2004). De acordo com dados do Catlogo Geral Discritivo para sementes e mudas de 1937-38, a regio de Pelotas, na metade sul do RS, tambm historicamente produtora de mamona e toda produo era destinada s fbricas de leo da cidade (CATLOGO GERAL DISCRITIVO, 1937). As empresas esmagadoras do fruto no Brasil tm capacidade para extrao de cerca de 160.000 toneladas/ano do leo de mamona. Porm a capacidade mxima atingida foi em 1990, com 147.000 toneladas. A partir deste perodo houve uma grande retrao no mercado atingindo 14.000 toneladas em 1998 e em 1999 houve a produo de 25.000 toneladas (AZEVEDO & LIMA, 2001). O leo de mamona comercializado na forma de leo hidrogenado, sendo uma commodity com preos regulados pelas cotaes internacionais, sujeitas s oscilaes de plantio e produo nos pases produtores e na expanso do uso industrial. um produto com demanda inelstica, isto , seu consumo mantm-se constante ao longo do tempo, estabilizado em torno de 440 a 450.000 toneladas anuais. As cotaes internacionais se refletem imediatamente naqueles preos pagos internamente ao produtor de mamona (SAVY FILHO, 2005). Para solues dos problemas na produo agrcola desta espcie, com alto potencial de mercado mundial, cabe ressaltar a necessidade de maior

ateno para polticas agrcolas e industrial adequadas, dada a importncia social e econmica deste agronegcio no Brasil (AZEVEDO & LIMA,2001). Alm disto devemos considerar que a mamona uma das fontes para energia renovvel que pode ser suporte de projetos do Mecanismo de Desenvolvimento Limpo (MDL), proposto pelo Protocolo de Kyoto, que trata dos financiamentos pelos crditos de carbono trocados entre os pases poluidores e os em desenvolvimento com empreendimentos ecologicamente sustentveis. O uso desta planta como energia renovvel seria ento destinada fixao do carbono ou reduo da sua emisso e para retirada dos gases poluentes (BRASIL ECODIESEL, 2005). A fixao de CO2 atingiu o valor de 33.590kg CO2/ha, composto pelas folhas + resduos vegetais de 20.156kg CO2/ha e para sementes de 13.435kg CO2/ha. Os nmeros so significativos, representando seqestro de carbono da atmosfera entre 15,29 e 33,74 toneladas/ha, os quais se transportados para a rea sob a cultura da mamona (189,2 mil hectares), existente no Brasil em 2004/05, resultam em valores entre 2,89 a 6,38 milhes de tonelada de CO2/ha, elevando com expanso da rea necessria para a produo do biodiesel (SAVY FILHO, 2005).

Caracterizao Botnica e Fisiolgica

A mamona (Ricinus communis L.), tambm chamada carrapateira, baforeira e baga uma dicotilednea pertencente famlia Euphorbiaceae, que inclui um grande nmero de espcies nativas da regio tropical. possivelmente originria da antiga Abissnia, hoje Etipia, no continente africano. Espcie perene que pode viver mais de 12 anos e atingir at 10 metros de altura. uma planta de hbito arbustivo, com diversas coloraes de caule, folhas e frutos tipo racemos (cachos), podendo possuir cera no caule e pecolo. Os frutos, geralmente, possuem espinhos, podendo as sementes apresentar diferentes tamanhos, formatos e grande variabilidade de colorao (MOREIRA et al, 1996; AZEVEDO et al, 1997a; AZEVEDO et al, 1997b; AMORIM NETO et al, 1999).

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Conforme Mazzani (1983), a mamoneira possui nmero cromossmico igual a 10 (n=10) sendo possivelmente um tetraplide descendente de um progenitor diplide j extinto. Weiss (1983) descreve que todas as cultivares botnicas da mamoneira apresentam suas clulas somticas com 2n=20, considerando tambm que esta espcie seja um poliplide natural com nmero bsico de cromossomos n=5, contudo algumas cultivares botnicas

apresentam barreiras genticas que no permitem o cruzamento. A mamona classificada sistematicamente, segundo Schultz (1963), Vidal & Vidal (1980) e Popova & Moshkin (1986) como: Subdiviso: Fanerogamae ou Espermatophita Filo: Angiospermae Classe: Dicotiledonae Suclasse: Archichlamydae Ordem: Geraniales Famlia: Euphorbiaceae Gnero: Ricinus Espcie: Ricinus communis Conforme descrio botnica de Lorenzi & Matos (2002) esta planta apresentase como arbusto ou arvoreta, com folhas grandes, classificadas como palmatilobadas. Seus frutos so do tipo cpsula tricoca de deiscncia explosiva, com salincias espiniformes, contendo trs sementes oleaginosas de superfcie brilhosa e desenhada com manchas escuras. Esta espcie apresenta uma raiz axial e razes secundrias que podem chegar at 2,0 m de profundidade, seu caule arredondado, liso, esverdeado e recoberto com cera, tambm apresenta folhas grandes de colorao verde-escuro, com 5-11 lbulos, flores agrupadas na pancula terminal (cacho), com flores masculinas (na regio basal da inflorescncia), femininas (regio apical) e hermafroditas (SAVY FILHO, 1999, 2005; AZEVEDO & LIMA, 2001) Atualmente admite-se que o gnero Ricinus seja monotpico com cinco subespcies e 25 variedades botnicas, deste modo tm-se grande diversidade

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entre elas em termos de tamanho, colorao das folhas e do caule, porte, hbito de crescimento, contedo de leo nas sementes, peso das sementes (0,1 a 1,0g/unidade), etc (SAVY FILHO, 1999; BELTRO, 2003). Em coletas realizadas no RS, o peso das sementes variaram (0,11 a 1,3 g/ unidade) (informao pessoal) 1. Segundo Beltro (2003), esta planta apresenta desenvolvimento com a forma juvenil diferente da adulta, em especial com relao s folhas primrias (cotiledonares) e as demais digitalobadas, denticuladas e de pecolos longos com 20 a 50cm de comprimento. Conforme ilustrao (Fig. 1) a haste principal cresce verticalmente sem ramificao at o surgimento da primeira inflorescncia, que tem a denominao aps a fecundao das flores de cacho ou racemo. O n, que aparece no primeiro racemo uma importante caracterstica agronmica que est associado maturao da planta. O ramo lateral surge, cresce e se desenvolve da axila da ltima folha, logo abaixo de cada inflorescncia. semelhana da haste principal (Fig. 1), todos os ramos de 2a, 3a e 4a ordens apresentam crescimento limitado, terminando sempre em uma inflorescncia, formando uma estrutura simpodial (BELTRO, 2003). Nas regies tropicais a mamoneira apresenta ciclo de 250 a 300 dias apresentando florao com apenas 50 a 60 dias da germinao. A organognese da mamoneira envolve 12 diferentes estdios do

desenvolvimento, considerando desde a germinao completa maturidade de cada cacho, e a durao de cada estdio depende da cultivar e do ambiente (BELTRO, 2003).

Srgio Delmar dos Anjos e Silva. Embrapa Clima Temperado/Pelotas, RS.

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Folha digitalobada Haste principal e primeira inflorescncia Ramos laterais com cacho terminal Racemo primrio

FIGURA 1. Esquema ilustrativo do aspecto geral da planta de mamona adaptado de Beltro (2003).

As cultivares atuais de mamoneira utilizadas para a produo so classificadas segundo seu porte e o grau de deiscncia (abertura) do fruto maduro. Quanto ao porte, pode ser baixo com at 1,8m; mdio, entre 1,8-2,5m; e alto, com 2,5 a 5,0m. Quanto deiscncia do fruto so classificadas como deiscente, com abertura total; semideiscente, com abertura parcial e indeiscente, sem abertura do fruto (SOUZA et al, 2004). A mamona apresenta metabolismo fotossinttico C3, reao

fotoperidica a dias longos, acima de 12 horas/dias com vrios estdios na organognese, na sua ecofisologia, bem como na florao no que se refere a sexualidade das flores (AZEVEDO & LIMA, 2001).

Morfologia e biologia floral A mamoneira apresenta inflorescncia do tipo panicular com flores dispostas em grupos sobre racemos terminais com 15 a 50 cm de comprimento, as femininas ocupando a parte superior e as masculinas a parte inferior do eixo da inflorescncia (AZEVEDO & LIMA, 2001; LORENZI, 2002).

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Em algumas cultivares botnicas pode ocorrer distribuio de flores masculinas e femininas em toda a inflorescncia e, ainda, podem aparecer flores andrgenas no racemo. O primeiro racemo o maior e denominado principal, sendo que, devido ao tipo da inflorescncia, em especial da sua conformao e distribuio de flores a polinizao ocorrente do tipo anemfila, podendo a taxa de alogamia chegar a mais de 40%, variando com o seu porte, embora seja considerada autgama. O incio da florao se d no racemo principal e, com 10 a 12 dias, comea a formao dos racemos de segunda ordem (SAVY FILHO, 1999; AZEVEDO & LIMA, 2001). Os racemos podem apresentar forma cnica, cilndrica ou oval atingindo a maturao em pocas diferentes, dependendo da posio na planta . Os botes florais masculinos so de forma cnica aberta ou arredondada, com dimetro variando de 0,4 a 1cm, apresentam clice com cinco lbulos e estames ramificados, cerca de 20 a 40 ramificaes primrias, 40 a 80 secundrias e de 500 a 800 anteras, conforme ilustra a Figura 2. Cada flor chega a ter mais de 60 mil gros de plen (Fig. 3). A flor masculina aps a abertura, o que geralmente acontece duas a trs horas antes do amanhecer, libera gros de plen viveis por um a dois dias e, depois, a camada de absciso formada e a flor cai (AZEVEDO & LIMA, 2001). A flor feminina possui pednculo geralmente no articulado e clice com cinco spalas desiguais, ovrio spero tricarpelar com placentao axial, estilete curto e trifurcado, aps a fertilizao, com 7 a 10 dias, o estigma, que papiloso e avermelhado ou amarelado, seca e cai. O boto floral feminino tem a forma cnica, estreita, com 0,6 a 1,2 cm de comprimento e de 0,2 a 0,4 cm de dimetro (AZEVEDO & LIMA, 2001) (Fig. 2).

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Flores femininas

Flores femininas

Flores masculinas

Flores masculinas

FIGURA 2. Inflorescncia de duas cultivares de mamona com flores masculinas na regio basal e femininas na poro terminal apresentando maturao diferenciada. (A) cv. Cafelista (B) cv. AL-Guarany 2002. PelotasRS. 2005.

A biologia floral da mamoneira bastante complexa, pois apresenta inmeras expresses da sexualidade. Podemos citar os tipo de sexualidade encontrados na espcie: fmea estvel ou Tipo N (flores femininas em todos as inflorescncias) podendo ser tambm denominada de pistiladas ou

ginandiicas ocorrendo como conseqncia da homozigose de alelos recessivos (ff); fmea instvel (com racemo central pistilado e o restante parcial ou totalmente monico); plantas inclinadas para fmea (poucas flores masculinas no mximo 10 na poro basal do racemo); plantas com poucas flores masculinas ou Tipo NES, sendo o gene para o feminismo acompanhado por um gene modificador (s), que pode apresentar modificao em funo da temperatura em que se cultiva a planta (apresentam ao longo da inflorescncia flores masculinas entre as femininas); plantas monicas (normais) e plantas com somente flores masculinas (SAVY FILHO, 1999; AZEVEDO & LIMA, 2001).

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FIGURA 3. Polens corados com carmim-actico 2% em meio a tecidos da parede de antera em Ricinus communis (cv. IAC-80), amplitude 10x. (A) Polens isolados ainda na antera, amplitude 10x. (B) Ttrade de Ricinus communis mostrando polens jovens recm liberados e uma ttrade em boto floral 3mm, amplitude 10x (C) Morfologia externa da antera de mamona, em gua destilada, amplitude 10x. (D) UFPel/2005.

Existem ainda plantas do Tipo S, caracterizadas pela reverso do sexo, inicialmente femininas, para o tipo monico, em qualquer fase do ciclo aps a emisso do racemo primrio. Onde pode ser aplicado uma presso de seleo para que, aps alguns ciclos, obtenha-se de 60 a 95% de plantas inicialmente femininas (SAVY FILHO, 1999)

Formao e aspectos morfolgicos do gro de plen

Nos eucariotos a meiose, apesar de ser um processo longo e mais complexo do que a mitose, ocorre de forma semelhante em quase todas as espcies. De fundamental importncia no processo evolutivo, a meiose permite a recombinao gnica em todas as espcies sexuadas. Nela ocorrem duas divises celulares sem que acontea um perodo S entre elas. Na primeira meiose a chamada Meiose I ocorre a reduo cromossmica e na Meiose II ocorre a conservao do numero cromossmico, porm com uma nica diferena da mitose, neste caso as cromtides irms de cada cromossomo no so exatamente iguais geneticamente entre si. Ocorre neste momento a formao de quatro clulas idnticas entre si, com nmero cromossmico (n=10) idntico a metade do nmero somtico (2n=20) da espcie (GUERRA, 1983; WEISS et al., 1983).

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A formao do gro de plen conseqncia dessas duas divises meiticas. Na fase final deste ciclo, na telfase II, ocorre a formao das clulas me de plen (CM) que formaro as ttrades que daro origem s clulas haplides (micrsporos), formando um tetraedro imaginrio (MENDES, 1994). Nesta formao do gro de plen dois processos podem ser descritos, so eles: a microsporognese e a microgametognese. A microsporognese um evento que se inicia com a meiose e termina com a formao de um micrsporo haplide polarizado jovem, originrio do desenvolvimento das clulas vegetativa e degenerativa. A partir deste ponto, o micrsporo poder seguir sua rota normal de desenvolvimento (via gametoftica) sendo influenciado pelas condies do ambiente. Este processo, aqui apresentado de forma sinttica, ocorre em todas as espcies pela via sexuada (SANTOSKALTCHUK & BODANESE-ZANETTINI, 2002). Segundo Souza & Pereira (2000), o desenvolvimento do plen pode ser classificado em 10 fases: 1, massa esporognica; 2, meiose; 3, dade; 4, ttrade; 5, micrsporo- jovem; 6, micrsporo-intermedirio; 7, micrsporomaduro; 8, gro de plen jovem; 9, gro de plen intermedirio, e 10, gro de plen tardio. O microgametfito possui dois ou trs ncleos de acordo com a espcie, as paredes celulares dos tecidos da antera engrossam e a antera comea a desidratar, causando a abertura e conseqente liberao dos gros de plen. De acordo com Pacini & Franchi (1993) clulas do tapetum possuem papel fisiolgico importante, pois so elas que permitem a chegada dos nutrientes s clulas gamticas. Estas clulas, atravs da liberao e regulao de substncias podem determinar a liberao prematura das clulas masculinas (aborto), caso ocorra a degenerao das clulas do tapetum antes da formao do gro de plen jovem, portanto as fases de desenvolvimento das clulas do tapetum esto relacionadas com o desenvolvimento da antera. Os gros de plen de mamoneira so pequenos, considerados ovais, com 20 a 22m de largura e 29 a 33m de comprimento segundo Azevedo & Lima (2001). No entanto, conforme mostrado na Figura 3 e 4 observou-se que ao final da microgametognese em botes florais maduros, de no mnimo 3mm

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de dimetro, ainda antes da ocorrncia da antese, estes botes j apresentavam polens maduros, arredondados, com trs poros dando aspecto triangular e que variavam entre 12 a 30 m (mdias em escala) (VARGAS et al. -dados no publicados).
Ncleo Poro Exina

Intina

FIGURA 4. Aspecto morfolgico do gro de plen vivel de Ricinus communis L. cv. Cafelista corado com carmim actico e amplitude de 40x (A); cv. AL-Preta, amplitude 10x M.O. (B). UFPel/2005.

Uma das condies ambientais essenciais para disperso do plen a temperatura com a faixa indicada como de melhor eficincia entre 26 a 29C e com umidade relativa do ar de aproximadamente 60%, podendo variar de acordo com a cultivar utilizada. Temperaturas mais elevadas, comprimento do dia curto, favorecem o surgimento de flores masculinas. O plen tambm contm substncias alergnicas proticas semelhantes s encontradas nas sementes desta planta, como ricina, robina, crotina, circina e abrina (AZEVEDO & LIMA, 2001). A viabilidade do gro de plen influenciada tambm por diferenas genotpicas e estgio fisiolgico da planta e da flor. Em geral, na maioria das espcies, temperatura e umidade relativa baixas favorecem a viabilidade e a longevidade do plen. Porm, em gramneas so necessrias baixas temperaturas e alta umidade relativa. Em trigo-mouro foi descrito que a temperatura acima de 30C prejudicial ao desenvolvimento do plen e das flores (ADHIKARI & CAMPBELL, 1998).

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Para determinao da viabilidade polnica utilizam-se vrias tcnicas, entre elas a de colorao ou de germinao in vitro. Na tcnica de colorao so usados diversos corantes, dentre os mais utilizados est o carmim-actico (MENDES, 1994). O qual tem como vantagem a grande praticidade e eficincia comprovada em vrias espcies, porm sempre com ajustes de protocolos. A anlise das fases meiticas e a interpretao dos resultados so relativamente difceis para cromossomos pequenos, como o caso da mamona. Assim como, as tcnicas para anlise mittica, as de anlise meitica podem ser classificadas de duas formas: as tcnicas de colorao seguidas de esmagamento e as de esmagamento seguidos de colorao (GUERRA & SOUZA, 2002). Algumas espcies como, Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener, Allium cepa, Eucalyptus, Ocimum officinalis L., entre outras, foram analisadas quanto as seu ciclo meitico, bem como a viabilidade dos gros de plen atravs da utilizao desta tcnica com colorao de carmim-actico (ALMEIDA, 2004; SOUZA-LANG, 1997; SOUZA, 2002; GOMES et al., 2003). Um mtodo rpido e seguro para testar a viabilidade de plen (Fig. 4A) essencial para analisar o efeito destes fatores ambientais que afetam o desenvolvimento do plen, identificar uma possvel macho-esterilidade, restabelecer linhagens e determinar o perodo timo para polinizao de uma espcie. A viabilidade entre espcies varivel, por exemplo, para o sorgo [Sorgo bicolor (L.) Moench] este tempo de viabilidade no mximo de cinco horas quando so armazenados no escuro, para o milho (Zea mays L.) este tempo trs horas conservados sob luz e a temperatura de 36C e 30 horas quando armazenados no escuro a 30C (ADHIKARI & CAMPBELL, 1998) O armazenamento de gros de plen importante para a preservao de germoplasma bem como para o auxlio de pesquisas que utilizem este material biolgico em estoques, para promover intercmbio de germoplasma e potencializar programas de melhoramento (GOMES et al., 2003), onde a reposio peridica se faz necessria em funo da queda de sua viabilidade (SOUSA et al., 2002). Sendo considerado um das principais alternativas para conservao de gentipos importantes em cruzamentos, pois possibilitaria a

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realizao de cruzamentos sem a necessidade do cultivo alternado dessas linhagens polinizadoras, em campo. O sucesso da preservao do plen, independentemente da durao do perodo de conservao, depende principalmente de fatores como a temperatura e umidade relativa do ambiente de armazenamento e do grau de umidade do plen (GOMES et al., 2003). Inmeras tcnicas so utilizadas para o armazenamento do gro de plen, entre os mtodos de conservao destaca-se a criopreservao pelo uso de nitrognio liquido (-196C). Entretanto, no h nenhum mtodo descrito para avaliar a viabilidade do plen de mamona e, conseqentemente, o efeito de temperatura e perodo de armazenamento deste material biolgico. A viabilidade pode ser avaliada usando mtodos de coloraes nucleares ou vitais, in vivo ou in vitro, ou ainda, analisando a fixao final da semente. O mtodo de germinao considerado como um teste seguro, pois o plen capaz de germinar frtil (ADHIKARI & CAMPBELL, 1998). Programas de melhoramento envolvendo a produo de sementes por polinizao controlada dependem de um eficiente sistema de manipulao de plen. Como principal caracterstica deste sistema, pode-se considerar a manuteno da viabilidade do plen, que dever sempre estar prontamente disponvel quando requerido.

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CONSIDERAES FINAIS

A cultura da mamona constitui-se atualmente em alternativa para a produo agrcola, tanto para agricultores familiares como grandes produtores, socializando o desenvolvimento econmico do pas. O desenvolvimento de pesquisas com a espcie a partir do conhecimento cientfico bsico tem permitido a ampliao da rea de cultivo, atravs da criao de novos gentipos adaptados a diversas regies do pas. No que se refere ao potencial para a produo de biodiesel como fonte de energia renovvel, a mamona considerada como um excelente investimento econmico e devemos levar em considerao o seu potencial de fixao de CO2 contribuindo para o desenvolvimento limpo.

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ARTIGO II

VIABILIDADE POLNICA DE CULTIVARES DE MAMONA

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RESUMO

Na busca pela conservao e caracterizao das cultivares de Riccinus communis a anlise de fertilidade do gro de plen de grande importncia para dimensionar a diversidade destas cultivares e permitir um manejo e uso mais adequado das colees existentes na busca de novas cultivares. Na presente anlise optou-se por usar um processo preditivo baseado no mtodo citogentico de colorao para verificao da viabilidade polnica, j que essa viabilidade incorrer na fertilizao e formao de sementes. Para tanto, utilizou-se tcnica convencional de colorao com carmim actico 2% na anlise da viabilidade dos polens na confeco de lminas provisrias. Para as cultivares IAC-80 e Cafelista os valores obtidos acima de 95% foram considerados de alta viabilidade, e nas cultivares AL-Preta e AL-Guarany 2002 as mdias foram de 88,48 e 86,46% respectivamente, apresentando tambm um bom ndice de viabilidade. Os polens das cultivares de plen de mamona apresentaram alto percentual de viabilidade polnica na antese. Portanto, possvel a utilizao de todas as cultivares analisadas na induo de fertilizao em programas de melhoramento. Palavras-chave: plen, Ricinus communis L., carmin-actico, citogentica, melhoramento gentico.

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ABSTRACT

Searching the conservation and characterization of Riccinus communis varieties, the fertility analyses is of great importance to measure these cultivars diversity and to allow most suitable handling and use of the existent collections searching for new cultivars. In the present analyses a predictive process was chosen based on the color cytogenetic method to verify the pollen viability, since this viability incur in seeds fertilization and formation. A color conventional technique with acetic carmine at 2% was used to analyze the pollen viability in the manufacturing of temporary plates. For the IAC-80 and Cafelista cultivars the values obtained above 95% were considered of high viability, for the ALPreta and AL-Guarany 2002 varieties, the averages were 88.48 and 86.46%, respectively, also presenting a good viability index. The castor bean pollen cultivars presented a high percentage of pollen viability at anthesis. Therefore, it is possible to use all the analyzed varieties in the fertilization induction in improvement programs.

Key words: pollen, Ricinus communis L., acetic carmine, cytogenetic, plant breeding.

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INTRODUO

A mamona (Ricinus communis L.) uma dicotilednea pertence famlia Euphorbiaceae, que inclui um grande nmero de espcies nativas da regio tropical. Tambm chamada carrapateira, baforeira e baga uma planta de hbito arbustivo, com diversas coloraes de caule, folhas e frutos tipo racemos (cachos), podendo possuir cera no caule e pecolo. Os frutos, geralmente, apresentam espinhos. Podendo suas sementes apresentar diferentes tamanhos, formatos e grande variabilidade de colorao (AMORIM NETO et al., 2001; AZEVEDO et al., 1997 e LORENZI, 2002). A mamoneira apresenta inflorescncia do tipo panicular, denominada racemo, com flores dispostas em grupos sobre racemos terminais com 15 a 50cm de comprimento, as femininas ocupando a parte superior e as

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masculinas a parte inferior do eixo da inflorescncia (AZEVEDO et al.,1997; LORENZI, 2002), eventualmente flores hermafroditas, e conforme citao possuem viabilidade polnica por uma semana (SOUSA et al., 2004). A produo mundial de mamona de 2000 a 2004 chegou um milho de toneladas em gro e cerca de 400 mil toneladas de leo de mamona. Os maiores produtores tm sido a ndia, a China, com cerca de 60% a 20% da produo mundial, respectivamente, o que representa uma produo em torno de 600 a 200 mil toneladas (SOUSA et al., 2004; SAVY FILHO, 2005). Em 2002 a participao do Brasil no mercado internacional de produo de leo representou apenas 7,42%. No mesmo perodo em que ocorria o decrscimo da produo no pas a produo mundial manteve-se constante. Baseado na demanda por informaes e procura de sementes a tendncia agrcola para safra 2004/2005 foi de um aumento de rea colhida e produo em relao 2002/2003. A mamona uma planta oleaginosa com considervel potencial para economia do Pas, pois esta planta resiste a longos perodos de seca, alm das questes de mo-de-obra e produo de matria prima para diversas aplicaes na industria (AMORIM-NETO et al., 2001). O leo da mamona utilizado em vrios processos industriais, por exemplo, na fabricao de desinfetantes, leos lubrificantes, tintas e corantes; para a manufatura de fungicidas, inseticidas (como base). Uma das aplicaes de grande valor econmico do leo de mamona a utilizao como combustvel alternativo. A busca por cultivares com excelente produtividade para obteno de biodiesel premente, pois alm da demanda do mercado a agricultura atual exige o uso racional da rea agriculturvel e menores custos de produo. Portanto, para que ocorra o sucesso na seleo de cultivares com maior produtividade do que aquelas atualmente disponveis no mercado de fundamental importncia caracterizao da espcie, incluindo-se o potencial polnico de cada cultivar. Desta maneira, o conhecimento especfico de cada variedade vem auxiliar na escolha do gentipo superior e mais adequado para melhoramento gentico (AZEVEDO & LIMA, 2001).

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A viabilidade polnica considerada uma medida de fertilidade masculina, determinada atravs de vrias metodologias, entre elas a tcnica de colorao. Esta bastante empregada no monitoramento de plen in vitro e in vivo e est baseada na reao de colorao de gros de polens amilceos indicando polens maduros com protoplasma vivo (OLIVEIRA et al., 2001; GUERRA & SOUZA, 2002). Muitas vezes a baixa produtividade de gros em algumas cultivares causada pela ausncia de polens viveis. O objetivo deste trabalho foi estudar o gro de plen de cultivares de mamona com relao a sua viabilidade, a fim de gerar informaes que possam auxiliar a seleo em programas de melhoramento gentico.

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MATERIAL E MTODOS

O trabalho foi realizado no Laboratrio de Gentica, do Departamento de Zoologia e Gentica, IB/UFPel em Pelotas-RS. Foram utilizadas as cultivares IAC-80, Cafelista, AL-Preta e AL-Guarany 2002, provenientes do campo experimental da Embrapa Clima Temperado, localizado em Pelotas, RS, na latitude 3141 Sul e longitude 5221 Oeste e de altitude 60m. As amostras de inflorescncias foram coletadas de maneira aleatria de trs inflorescncias em estdios de desenvolvimento diferentes, colhidas com 50% de antese dos botes florais em fevereiro de 2005. Estas inflorescncias foram levadas ao laboratrio e mantidas em gua destilada temperatura ambiente at a coleta do plen, antes da fixao das inflorescncias. Foram utilizados botes florais com cerca de 6mm de dimetro de flores masculinas, por j apresentarem deiscncia e formao de plen estabelecida. Aps coleta, os botes florais foram fixados em Carnoy 3:1 (lcool etlico: cido actico) por 2 a 24 horas e, posteriormente, transferidos para freezer a 10C. Para preparo das lminas utilizou-se hidrlise das anteras por cerca de 10 minutos em HCl 5N, logo em seguida, as anteras foram maceradas em carmim actico 2%, e o material recoberto com lamnula para posterior anlise.

32

Os

polens

foram

classificados

em

normais/viveis

(corados)

anormais/inviveis (no corados) com base na reao de colorao com carmim actico 2% (GUERRA, 2002). Analisados, pelo mtodo de varredura, em microscopia ptica em dimenso de 40x, com oito repeties de 250 clulas/lmina por cultivar, totalizando 2000 clulas. O clculo da percentagem de viabilidade polnica foi realizado utilizando a seguinte frmula: Viabilidade do plen (%) = N de gros de plen corados x 100 Nde gros plen total A comparao de mdias foi realizada atravs do teste de Duncan a 5% de probabilidade (ZONTA & MACHADO, 1984).

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RESULTADOS E DISCUSSO

A viabilidade polnica das cultivares avaliadas, atravs do mtodo de colorao por carmim-actico foi superior a 86% (Tab. 1), valores estes considerados altos, pois de acordo com Souza (2002) e Domingues et al. (1999) valores acima de 70% so considerados como alta viabilidade, de 31 a 69% como mdio e at 30% baixos. Observa-se tambm que as cultivares IAC-80 e Cafelista (com 96,71 e 95,73%, respectivamente) foram superiores as demais, diferindo das outras cultivares AL-Preta e AL-Guarany 2002, com mdias de 88,48 e 86,46%, respectivamente. Alguns pesquisadores relatam a ocorrncia de diferenas de viabilidade de plen entre diferentes plantas da mesma variedade ou entre diferentes pocas de coleta, porm descrevem que a maior variao ocorre entre gentipos diferentes (LOGUERCIO & BATTISTIN, 2004). Resultados similares foram observados neste experimento considerando que todas apresentaram um alto ndice de viabilidade.

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TABELA 1. Percentual de viabilidade polnica de cultivares de mamona Ricinus communis L. IAC80, Cafelista, AL-Preta e AL-Guarany 2002, SANEST, UFPel, 2006. Cultivares de Ricinus communis IAC-80 Cafelista AL-Preta AL-Guarany 2002 Mdias de Viabilidade Polnica* 96.71 95.73 88.48 86.46 a a b b

*Mdias seguidas pela mesma letra no diferem entre si pelo teste de


Duncan a 5% de probabilidade. C. V.: 5,39%.

De acordo com Loguercio & Battistin (2004) atravs de estudos sobre a viabilidade polnica podemos obter resultados da fertilidade das espcies e/ou cultivares, obtendo-se uma viso prvia da infertilidade das plantas, bem como o conhecimento do potencial de reproduo de uma populao e dos problemas de fertilidade que possam ocorrer. Segundo Loguercio & Battistin (2004) muitas angiospermas produzem elevado percentual de plen vivel, muito embora nem todos possam ser utilizados na fertilizao efetivamente. Considerando-se que a manifestao do gentipo de um indivduo o resultado da contribuio trazida pelos gametas masculino e feminino, quanto maior a viabilidade polnica, maior a possibilidade da formao de diferentes combinaes entre alelos, isto , aumento de variabilidade gentica a qual imprescindvel para a seleo de novos cultivares com caractersticas agronmicas desejveis (SOUZA et al., 2002). Portanto os resultados obtidos neste estudo indicam serem estas cultivares importantes para utilizao em programas de melhoramento (ANEXO 1). Domingues et al. (1999) comparando a tcnica de colorao de plen com carmim actico a 25% com os trabalhos de Moreira & Gurgel (apud LOGUERCIO & BATTISTIN, 2004) que utilizaram carmim actico 40%, descrevem que mesmo em concentraes menores do corante esta

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metodologia permite boas anlises de viabilidade do plen e que as concentraes maiores permitem apenas fotos mais ntidas. Estes dados corroboram aqueles obtidos neste experimento utilizando carmim actico 2% para plen de mamona, pois permitiu uma boa distino entre polens viveis e inviveis considerando esta metodologia adequada para avaliao de viabilidade polnica (Fig. 1).

FIGURA 1 Aspecto do plen vivel (seta branca) e plen invivel (seta preta) com uso da tcnica citogentica (A). Plen vivel corado com carmim actico 2%, observando-se o contorno exina e intina e a abertura dos poros de forma bem definida (seta preta) (B) UFPel/2006. O efeito do ambiente no comportamento meitico, e

conseqentemente na viabilidade dos gros de plen, foi observada por Souza (2002) em Passiflora edulis sugerindo que variaes de temperaturas ambientais podem interferir na viabilidade destes gros, na microsporognese ou na microgametognese, uma vez que para muitas espcies h uma temperatura ambiental tima de germinao do gro sobre o estigma, o que por conseqncia ir diminuir a formao de frutos e sementes. De acordo com estes dados podemos considerar que a alta viabilidade encontrada nestes gentipos indica uma adaptabilidade da mamona as condies ambientais da regio.

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CONCLUSO

Os gros de plen de mamona apresentaram alto percentual de viabilidade polnica na antese, ocorrendo variao neste percentual em relao as cultivares estudadas.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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ZONTA, E.P.; MACHADO, A. A. SANEST Sistema de anlise estatstica para microcomputadores. Pelotas, 1984.

ARTIGO III

VIABILIDADE DO PLEN DE MAMONA cv. IAC-80 ARMAZENADOS SOB BAIXAS TEMPERATURAS

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RESUMO

A conservao de gros de plen importante para a preservao da variabilidade gentica, facilita o intercmbio de germoplasma e contribui muito na gerao de variabilidade obtida atravs de cruzamentos artificiais aumentando a eficincia dos programas de melhoramento. O armazenamento a longo prazo pode assegurar com isso, um aumento da eficincia desta fecundao. Pesquisas recentes vm estabelecendo protocolos para o armazenamento de polens de varias espcies de importncia econmica. A manuteno desta viabilidade fundamental para conservao gentica. Para tanto, utilizou-se botes florais de mamona (Ricinus comunnis L.) para avaliar a viabilidade de gros de plen quando conservados baixa temperatura atravs do uso de nitrognio lquido (-196C), ultrafreeezer (-80C), freezer (-18C) no perodo de 15 e 30 dias, visando a utilizao em programas de melhoramento. Os resultados indicam que o percentual mdio da viabilidade polnica no foi influenciado pelo perodo de armazenamento. Verificou-se tambm que houve diferenas entre os tratamentos utilizados para a conservao do plen, porm foi baixo o percentual de viabilidade dos mesmos, sugerindo adequao na tcnica de avaliao. Palavras-chave: viabilidade polnica; conservao; Ricinus communis L.; criopreservao

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42

ABSTRACT

Pollen grains conservation is important for the genetic variability conservation. It facilitates the germoplasm interchange and contributes much for the generation of variability obtained through artificial crosses increasing the improvement programs efficiency. Based on that the long term storage can assure raise in the efficiency of fecundation. Recent researches have established protocols for the storage of various pollen species of economical importance. The maintenance of this viability is fundamental for the genetic conservation. Floral buds of castor bean (Ricinus comunnis L.) were used to evaluate the pollen viability of the pollen grain when the low temperature was conserved by the use of liquid nitrogen (196%), ultrafreeezer (-80C), freezer (18C), for 15 and 30 days aiming the use in improvement programs. The results indicate that the average percentage of the pollen viability was not influenced by the storage period. It was also observed that there were differences between the used treatments for the pollen conservation, but it was their low viability percentage, suggesting appropriateness into the evaluation technique.

Key words: pollen viability; conservation; Ricinus communis L.;cripreservation

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INTRODUO

A conservao de gros de plen importante para a preservao da variabilidade gentica, facilita o intercmbio de germoplasma e contribui muito na gerao de variabilidade obtida atravs de cruzamentos artificiais aumentando a eficincia dos programas de melhoramento. Uma das alternativas para manuteno de linhagens hbridas em uma cultura pode ser mediante o armazenamento do plen o que acaba por possibilitar cruzamentos de interesse, sem que haja a necessidade de cultivo alternativo destas linhagens polinizadoras em campo (GOMES et al., 2003). O plen pode ser empregado para testes de polinizao controlada, nos testes de procedncia e prognie, a fim de gerar materiais genticos melhorados. Para viabilizar tais cruzamentos, h a necessidade de se dispor,

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prontamente, de plen armazenado com adequada viabilidade (SOUSA-LANG & PINTO, 1997). Juntamente com a qualidade de polens est a longevidade deste, o que influenciar na efetiva polinizao. O armazenamento a longo prazo pode assegurar com isso, um aumento da eficincia desta fecundao. Segundo Roberts (1975), embora exista grande semelhana no comportamento entre plen e semente de uma determinada espcie, s vezes, espcies que tm sementes ortodoxas (ou seja, as que toleram a dessecao e permitem o armazenamento a longo prazo) podem ter plen recalcitrante (no toleram a dessecao). O mtodo de criopreservao deste material biolgico surgiu como o mtodo mais eficiente para esta conservao. Pesquisas recentes vm estabelecendo protocolos para o armazenamento de polens de vrias espcies de importncia econmica (PARTON apud SILVA, et al. 2000). Segundo Aung (1978 apud SILVA et al., 2000) para a germinao de plen e crescimento do tubo polnico necessrio que a temperatura esteja entre 22 a 27C. Em tomateiro so observadas, para alguns gentipos variaes significantes na viabilidade de gros de plen quando expostos a temperaturas mais elevadas. A tcnica da crioconservao, isto , o armazenamento em nitrognio lquido (-196 C) proporciona o potencial para uma preservao sem limites de tempo, com a reduo do metabolismo a nveis to baixos que todos os processos bioqumicos so significativamente reduzidos e a deteriorao biolgica virtualmente paralisada (ALMEIDA et al., 2002). Podemos citar algumas vantagens da crioconservao como o pequeno espao a ser ocupado por um banco de germoplasma, mantido em nitrognio lquido, a simplicidade de manuseio das condies de armazenamento e por fim o baixo custo do processo, uma vez que no exige sistema de refrigerao nem de eletricidade (ALMEIDA et al., 2002). No metabolismo, o movimento molecular a baixas temperaturas super reduzido, no havendo fase lquida na clula. A grande dificuldade do processo a formao de cristais de gelo no interior das clulas, que podem causar

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ruptura das membranas resultando em colapso e morte, como conseqncia da perda da semipermeabilidade e da compartimentao celular (SANTOS et al., 2002; SALOMOM, 2003). A viabilidade do plen pode ser determinada atravs de um grande nmero de tcnicas. Sendo as mais utilizadas a germinao in vitro e a colorao, muito empregada no monitoramento de plen armazenado (OLIVEIRA et al., 2001). O meio bsico estabelecido por Gomes (1998) apresenta 10% de sacarose e 1% de gar, sendo considerado meio bsico inicial para germinao de qualquer espcie. Este trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade dos gros de plen de mamona conservados baixa temperatura, por um perodo de 15 e 30 dias de armazenamento, visando sua utilizao em programas de melhoramento e conservao de germoplasma.

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MATERIAL E MTODOS

O trabalho foi realizado no Laboratrio de Gentica , pertencente ao Departamento de Zoologia e Gentica IB/UFPel em Pelotas-RS. Foi utilizada a cultivar IAC-80, proveniente do campo experimental da Embrapa Clima Temperado, localizado em Pelotas, RS, na latitude 3141 Sul e longitude 5221 Oeste e de altitude 60m. As amostras de inflorescncias foram coletadas em junho de 2005, de maneira aleatria, de trs inflorescncias em estdios de desenvolvimento diferentes, colhidas com 50% de antese. Estas inflorescncias foram levadas ao laboratrio e mantidas em gua destilada temperatura ambiente at a abertura floral. Aps a abertura dos botes estes foram colocados em cone de papel at a deiscncia e liberao do plen. A mistura de plen das inflorescncias era coletada e acondicionada em tubo eppendorf. Os tratamentos de conservao utilizados neste experimento foram nitrognio lquido (-196C); ultrafreezer (-80) e freezer (-18C) durante 15 e 30 dias e germinao direta, ou seja, semeadura dos polens logo aps a coleta, como controle da viabilidade polnica inicial, para todos os tratamentos.

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A avaliao da viabilidade do plen foi feita pelo teste de germinao in vitro, utilizando a metodologia descrita por Gomes et al. (2003). O meio de cultivo foi colocado em lminas escavadas e o plen espalhado sobre o mesmo com auxlio de um pincel. As lminas foram colocadas em de placas de Petri com papel de filtro umedecido e incubadas por 24 horas a 251C. Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado, considerando-se oito repeties, sendo cada repetio constituda por uma lmina, totalizando 2000 gros de plen. A viabilidade do plen foi verificada em funo da porcentagem de germinao, sendo considerados viveis aqueles que haviam emitido tubo polnico. A anlise estatstica foi realizada utilizando-se o pacote estatstico SANEST (ZONTA & MACHADO, 1984). Os dados, expressos em

percentagem, foram transformados segundo arco seno da raiz quadrada de X/100, onde X representa o valor percentual obtido para cada varivel.

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RESULTADOS E DISCUSSO

Verificou-se atravs da anlise de varincia que houve diferena altamente significativa para os tratamentos avaliados, indicados pela diferena na germinao do plen (ANEXO 2). Dentre os tratamentos baixa temperatura avaliados aquele que apresentou melhor ndice de germinao de plen foi onde utilizou-se o ultrafreezer (-80C), podendo ser considerado o mais eficiente entre os sistemas testados, porm houve diferena significativa entre este tratamento e o controle (Tab. 1). No foi verificada diferena significativa quanto viabilidade entre as duas leituras realizadas dentro do mesmo tratamento indicando que os polens, aps o congelamento inicial podero ficar por um longo perodo mantendo a mesma viabilidade (Tab. 1). Diferentemente dos resultados obtidos por Pereira et al. (2002) onde em experimentos com polens de eucalipto (Eucalyptus) evidenciou a perda da viabilidade com o tempo de armazenamento em varias espcies deste gnero.

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Conforme sugere Pereira et al. (2002), quatro meses para estocagem de plen mais do que suficiente para dar maior flexibilidade s atividades de hibridao dos programas de melhoramento.

TABELA 1. Percentual de germinao mdia dos gros de polens de mamona cv. IAC-80, submetidos a baixas temperaturas em dois perodos de armazenamento. Pelotas.UFPel/2006. Tratamentos Controle Ultrafreezer -80C Freezer -18C Nitrognio lquido -196C *Mdias seguidas por letras minsculas distintas na coluna diferem entre si ao nvel de 5%, e letras maisculas nas linhas diferem entre si ao nvel de 1% pelo teste de Duncan. C. V.: 56,30%. 0,04 0,08 c c 0 A 0,19 A 0,07A Mdias* 12,70 a 0,82 b 15 Dias 12,70 A 0,52 A 30 Dias 12,70 A 1,19 A

0,09 A

A reduo do potencial de germinao dos polens submetidos aos tratamentos, pode ter ocorrido devido ao congelamento do lquido celular, causando o rompimento do plen (Fig. 1A) ou a liberao de exudatos do lquido interno (Fig.1B). Porm observou-se que em polens onde

aparentemente ocorreu a liberao de exudatos ocorreu germinao (Fig. 1C). Em cultivares de maracujazeiro o gro de plen parece ser pegajoso, por ser recoberto por uma substncia chamada pollenkit que, dentre outras funes, atua como protetor, minimizando a desidratao do gro de plen e conseqentemente a perda de viabilidade nesta espcie (SOUZA et al., 2002), Na Figura 1D observamos a liberao de uma sustncia que parece exercer a mesma funo. O baixo ndice de viabilidade no controle pode ser em decorrncia da qualidade da amostra (Perodo de coleta: jun. de 2005) ou uma conseqncia

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das anormalidades da prpria meiose nesta espcie, tais como a presena de univalentes, bivalentes, e alteraes como a presena de cromossomos retardatrios na placa metafsica e pontes anafsicas, que so fatores considerados causadores de gros de plen imperfeitos, e conseqentemente, inviveis, ou esta baixa viabilidade pode ser decorrente da tcnica utilizada na anlise.

FIGURA 1. Gros de plen de mamona Ricinus communis var. IAC-80, em diferentes aspectos. (A) Plen rompido ao lado de plen vivel. (B) Polens no germinados com estruturas da exina ou material citoplasmtico. (C) Polens mostrando detalhes na exina e germinao. (D) Plen germinado com liberao de exudado.

Deve-se considerar tambm de acordo com experimentos com diversas espcies e cultivares a variao no tempo de germinao, sugerindo estudos posteriores que estabelea um tempo ideal de germinao para cada cultivar estudada como para a espcie. Pois, espcie como Eucalyptus calmadulensis

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apresenta uma germinao mais rpida que outras espcies do mesmo gnero (PEREIRA et al., 2002). Embora fique evidente a eficincia desta tcnica de armazenamento devido a praticidade e eficcia para outras espcies, os resultados deste trabalho sugerem que o armazenamento de plen para a mamona requer melhoria no processo.

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CONCLUSES

O meio bsico utilizado para avaliao da germinao in vitro de plen de mamona no foi adequado, obtendo-se baixo percentual de germinao em todos os tratamentos. Dentre as diferentes temperaturas de armazenamento testadas o uso de ultrafreezer, a 80C, foi mais eficiente, porem com baixo percentual de germinao.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ALMEIDA, F. DE A. C., MORAIS, A. M.; , CARVALHO, J. M. F. C. & GOUVEIA, J. P. G. Crioconservao de sementes de mamona das variedades nordestina e pernambucana. Rev. Bras. de Eng. Agrc. e Ambiental, v.6, n 2, p.295-302, 2002 FERREIRA SILVA, A. C. T.; LEITE, I. C. E BRAZ, L. T. Avaliao da viabilidade do plen como possvel indicativo de tolerncia a altas temperaturas em gentipos de tomateiro .R. Bras. Fisiol. Veg., v.12, n.2. p.156-165, 2000. GOMES, P. R. Viabilidade e conservao do gro de plen de cebola (Allium cepa L.): 1998.54f. Dissertao (Mestrado em Cincia e tecnologia de sementes) FAEM Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. GOMES, P. R.; RASEIRA, M. DO C. B.; BAUDET, L. L.; PESKE, S. T. Armazenamento do gro de plen de cebola ( Allium cepa L.). Rev. Brasileira de Sementes, v. 25, n1, p 14-17, 2003. OLIVEIRA, M. DO S.; PADILHA,M. M. M.; KALUME, M. A. de. A.Viabilidade de plen in vivo e in vitro em gentipos de aaizeiro. Acta Bot. Bras. v.15. n1, p. 27-33. 2001. PEREIRA, R. C.; DAVIDE, L. C.; PATTO RAMALHO,M. A.; ANDRADE, H. B. Alternativas para aumentar a eficincia dos cruzamentos em programas de melhoramento de Eucalyptus. CERNE, v. 8, n2, p.060-069, 2002 ROBERTS, E.H. Problems of long-term storage of seed and pollen for genetic resources conservation. In: FRANKEL, O.H.; HAWKES, J. Ed. Crop genetic

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ZONTA, E.P.; MACHADO, A. A. SANEST Sistema de anlise estatstica para microcomputadores. Pelotas, 1984.

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ARTIGO IV

CULTURA DE ANTERAS DE MAMONA

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RESUMO

A mamona uma cultura de grande importncia econmica no Brasil por sua aplicao na produo de biodiesel assim como fonte de matria prima para uma srie de produtos com diversas aplicaes que vo da indstria farmacutica at o uso da torta como adubo orgnico. Dentre as tcnicas auxiliares do melhoramento na busca por novas cultivares que atendam os interesses agronmicos, a cultura de anteras apresenta-se como uma ferramenta de grande utilidade, principalmente por reduzir o tempo necessrio para a obteno de linhagens homozigticas. Para tanto, correlacionaram-se tamanhos de boto floral; de antera e de plen, coletados de inflorescncias de espcimes diferentes. Os botes florais, das cvs. IAC-80, Cafelista e ALGuarany 2002, foram separados em classes de acordo com o tamanho: < 2,0; 2,0- 2,9; 3,0-3,9; 4,0 4,9; 5,0 5,9; > 6,0 mm e fixados em Carnoy at a anlise em microscopia ptica dos tamanhos de gro de plen e comprimento longitudinal e transversal das anteras das cultivares. A relao entre as medidas das anteras e tamanho de plen das trs cultivares de mamona apresentaram diferenas significativas, o que evidencia variao morfolgica entre elas. Para a cultura de antera, botes florais de todas as classes da cv. IAC-80 foram desinfestados e colocados em meios de cultivo diferentes, variando adio de carvo ativado, 2,4-D e cido ascrbico. Para seco e

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retirada

das

anteras

foi

utilizada

imerso

em

cido

ascrbico

sob

esteriomicroscpio para que pudessem ser manipulados sem que ocorresse a oxidao durante o procedimento. Ocorreu a formao de calos em todos os meios de cultura e nas diferentes classes de boto floral o que sugere que o estdio de desenvolvimento da microsporognese no influenciou a induo de calos para esta espcie. A adio de carvo ativado e o uso de cido ascrbico atuaram como antioxidantes.

Palavras-chave: cultura de tecidos , mamona, Ricinus communis L., calos.

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ABSTRACT

Castor bean is a culture of great economical importance in Brazil because of its application into the biodiesel production as well as raw material source for many products with several applications, from pharmaceutics industry to oil extraction, which can be used as organic fertilizer. Among the improvement auxiliary techniques searching for new cultivars that attend the agronomical interests, the anthers culture has been presented as a very useful tool, especially because it reduces the time needed to obtain homozygotic yields. So floral bud sizes; of anther and pollen, collected from inflorescences of different specimen were correlated. The IAC-80, Cafelista and AL-Guarany 2002 cvs floral buds were divided into classes according to the size: < 2,0; 2,02,9; 3,0-3,9; 4,0 4,9; 5,0 5,9; > 6,0 mm. and fixed in Carnoy until optical microscopical analyses of the pollen grain sizes and longitudinal and transversal length of the cultivars anther. The relation between the anthers measurements and pollen size of the three castor bean cultivars presented significant differences, what makes evident the morphological variation among them. For the anther culture, floral buds of all classes of cv. IAC-80 were sterilized and put in mediums of different cultivation, varying activated charcoal addition, 2,4-D and ascorbic acid. For anthers cut and withdrawal it was used immersion in ascorbic acid under estereomicroscopy so it was possible to

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handle them without oxidation during the procedure. There was callus formation in all culture mediums and in the different classes of floral buds, which suggests that the microsporogenesis stage of development did not influence the callus induction for this species. The activated charcoal addition and the ascorbic acid use were used as antioxidants.

Key words: tissue culture, castor bean, Ricinus communis, callus.

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INTRODUO

Entre as alternativas de plantas oleaginosas visando a produo de biodiesel, a mamona hoje colocada como uma planta de excelente potencial, principalmente devido ao seu alto teor de leo em torno de 48 a 50%. A busca por variedades com excelente produtividade para obteno de biodiesel premente, sendo assim a variabilidade gentica essencial para qualquer programa de melhoramento que tenha por objetivo selecionar caractersticas desejveis das plantas cultivadas, no caso cultivares com maior produtividade de sementes, precocidade, maior teor de leo, menor teor de ricina e ricinina, resistncia a pragas e doenas entre outros. Dentre as tcnicas auxiliares do melhoramento a cultura de anteras apresenta-se como uma ferramenta de grande utilidade, principalmente por reduzir o tempo necessrio para a obteno de linhagens homozigticas,

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substituindo as inmeras geraes de autofecundao necessrias no processo convencional e permitir o estudo de mutaes recessivas, visto que indivduos haplides, apresentam a metade do patrimnio gentico. Cujo complemento cromossmico pode duplicar espontaneamente ou ser induzido obtendo-se a homozigose rapidamente (SARTORETTO et al.,1999; PAL, 2004). As plantas haplides podem ser obtidas de duas maneiras, por andrognese direta ou por andrognese indireta. Trs pontos so de fundamental importncia na obteno de plantas atravs da cultura de anteras atravs da androgenese indireta: (1) formao de calos a partir de anteras; (2) formao de gemas a partir de calos e (3) obteno de plantas a partir das gemas. A primeira etapa essencial e devemos considerar alguns fatores como o gentipo o meio de cultivo e o estgio de desenvolvimento do gro de plen, que podemos correlacionar com o tamanho do boto floral em muitas espcies (BOBROWSKI et al., 1995; PETERS et al., 1998). Segundo Maheshware (1964 apud TEIXEIRA & TORRES, 1998) a tcnica de cultura de antera j foi empregada em mais de 247 espcies e 34 famlias. Contudo a cultura de inflorescncias, sob condies que permitem seletivamente a proliferao dos micrsporos em calos ou embriides, uma modificao que pode ser til em casos onde o pequeno tamanho das anteras torna o isolamento difcil. Alguns problemas observados em meios semi-slidos podem decorrer da toxicidade de impurezas presentes nos gelificantes, como o gar. O carvo ativado uma das alternativas utilizadas para diminuir esta toxicidade, pois presumivelmente age pela adsoro de produtos deletrios (TEIXEIRA & TORRES, 1998). A influncia dos reguladores de crescimento sobre o desenvolvimento de calos ou embriides haplides tem sido estudada em muitas espcies. Vrios estudos tm revelado que as auxinas so essenciais ou benficas e as citocininas so benficas em alguns casos, porm poucos estudos tm registrado resposta positiva na presena de cido giberlico e cido abscsico. Porm, em muitos casos, o uso destes reguladores no tem sido necessrio,

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os quais, s vezes, podem ter uma ao inibitria. Para a maioria das espcies a auxina mais utilizada o cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) (TEIXEIRA & TORRES, 1998; INGRAM et al., 2000). A maior dificuldade do uso de cultura de antera nas espcies, consiste na adequao do meio de cultura apropriado, para que ocorra a diviso celular, o processo de ativao e desativao dos genes, no momento e local apropriado, VISANDO a diferenciao celular, e conseqentemente, a obteno de uma planta idntica quela de onde a clula ou conjunto de clulas foi retirado (SALOMOM, 2003). As vitaminas so compostos orgnicos que, em baixas concentraes, desempenham funes reguladoras catalticas no metabolismo celular. O uso de vitamina C (cido L-ascrbico) aplicado como catalisador de fosforilao fotossinttica devido ao seu poder de oxidar-se e reduzir-se (TORRES, 2001). muito utilizado para prevenir o escurecimento (oxidao) de tecidos excisados de plantas. termodegradvel e, portanto, a soluo de acido ascrbico no deve ser autoclavada, necessitando de esterilizao por filtro. (JAFFE, 1984 apud TORRES, 2001). Para que haja xito na aplicao de tcnicas de cultura de anteras, um dos pontos chave o estdio de microsporognese, pois para a maioria das espcies necessria a fase gamtica uninucleada (SOUZA et al., 2002). Na tentativa de facilitar a obteno de calos a partir de anteras muitos pesquisadores tentam associar o tamanho do boto floral com as diferentes fases meiticas ou estdios de desenvolvimento do gro de plen (BOBROWSKI et al.,1995). Este experimento foi realizado visando a relacionar o tamanho do boto floral; das anteras e o tamanho dos gros de plen, bem como, o efeito de diferentes meios de cultivo na induo de calos a partir de anteras com diferentes tamanhos.

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MATERIAL E MTODOS

Os botes florais de mamona das cultivares IAC-80, Cafelista e ALGuarany 2002 utilizados neste estudo foram procedentes de uma populao em cultivo no campo experimental da Embrapa Clima Temperado, altitude 60m, latitude 3141 Sul e longitude 5221 Oeste, localizada em Pelotas, RS. Para correlacionar tamanho de boto floral, da antera e do plen foram coletadas trs inflorescncias de espcimes diferentes, em diferentes estgios de desenvolvimento, em coletas ao acaso nas populaes das trs cultivares no ms de junho de 2005. Os botes foram medidos com auxilio de paqumetro e separados em seis classes de acordo com o tamanho: < 2,0; 2,0-2,9; 3,0-3,9; 4,0-4,9; 5,0-5,9; > 6,0 mm. Sendo ento fixados em Carnoy (etanol-cido actico 3:1). A anlise do comprimento das anteras (vista longitudinal e transversal) foi realizada analisando grupos de 10 anteras de cada classe de boto floral medidas ao microscpio ptico em escala com amplitude de 10x. Da mesma forma foram analisados os tamanhos dos gros de plen em amplitude de 40x. Para o clculo foi utilizada lmina milimetrada Olympus e convertidos os valores em micrmetro. A anlise estatstica foi realizada

atravs do programa SAS e as mdias comparadas pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade. Para a cultura in vitro, botes florais das classes acima referidas da cv. IAC 80 foram lavados em gua destilada por 5 minutos, desinfestados por imerso em lcool 70% por 3 segundos e aps, em soluo de 20% de

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hipoclorito comercial por 10 minutos. A seguir, o material foi lavado por trs vezes em gua destilada esterilizada, permanecendo nesta at a transferncia para o meio de cultura. Os botes florais foram transferidos para placas de Petri que continham cido ascrbico (50mg.L-1) para seco das anteras sem que ocorresse a oxidao at a transferncia destas para o meio de cultivo. Todos os procedimentos de desinfestao e transferncia para o meio de cultura foram realizados em cmara assptica de fluxo laminar horizontal. Imediatamente aps a inoculao das anteras as diferentes concentraes de cido ascrbico filtrada foram adicionadas sobre os meios M1; M2; M4 e M5 na quantidade de 2 mL (Tab. 1). O meio mineral bsico utilizado para formao de calos foi o meio MS (MURASCHIGE & SKOOG, 1962), variando os tratamentos pela adio de 2,4D, acido ascrbico (vitamina C) e carvo ativado (C.A.) de acordo com a tabela abaixo: TABELA 1. Meios de cultura utilizados no cultivo de anteras de mamona (Ricinus comunnis L.). Pelotas, UFPel/2006. Meio M1: M2: M3: M4: M5: M6: Composio MS+ 2mg. L-1 2,4-D + 50mg. L-1 vit. C +5g.L-1 C.A. MS+2mg. L-1 2,4-D + 100mg. L-1 vit. C + 5g.L-1 C.A. MS+ 2mg. L-1 2,4-D + 5g.L-1 C.A MS + 2mg. L-1 2,4-D + 100mg. L-1 vit. C MS+2mg. L-1 2,4-D + 50mg. L-1vit. C. MS bsico

Os meios de cultura tiveram o pH ajustado para 5,7 1utilizando NAOH 1N ou HCl 1N e autoclavados a 120C e 1,2 atm. de presso por 20 minutos. Logo aps o meio foi transferido para placas de Petri estreis em cmara de fluxo laminar. Aps inoculao o material foi mantido em cmara de crescimento a 25 1C no escuro por 30 dias.

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RESULTADOS E DISCUSSO

A relao entre as medidas longitudinais e transversais de anteras e tamanho de plen de trs cultivares de mamona apresentada na Tabela 2. Atravs dos resultados apresentados podemos observar que houve diferena significativa entre as trs cultivares para todas as medidas analisadas, estes resultados evidenciam variao morfolgica entre elas.

TABELA 2. Medidas morfolgicas de tamanho de anteras e plen entre trs cultivares de mamona. SAS/UFPel.2006. Cultivar Medida Longitudinal da antera (m) 384,94 a 345,40 b 180,05 c Medida Transversal da antera (m) 293,1 a 244,4 b 247,2 b Medida de plen 19,5 b 21,94 a 22,34 a

IAC 80 Cafelista AL-Guarany


a 5% de probabilidade.

*Mdias seguidas pela mesma letra no diferem entre si pelo teste de Duncan

As medidas do tamanho do plen para as trs cultivares (Tab. 2), demonstraram que a cultivar IAC-80 apresentou anteras maiores mas polens de tamanho menor que as cultivares Cafelista e AL-Guarany 2002, isto pode indicar que esta cultivar apresente um maior percentual de produo de plen,

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o que segundo Azevedo & Lima (2001) em mamona de maneira geral j elevado sendo estimado em 60 mil gros por flor devemos considerar que cada flor desta espcie tem de 500 a 800 anteras. Segundo Sunderland (1974) o uso de critrios morfolgicos como tamanho de boto floral para indicar estgio do desenvolvimento do micrsporo devem ser utilizados com cautela devido a variao que ocorre de boto floral para boto dentro da mesma planta e entre plantas. Os resultados mostrados na Tabela 3 corroboram esta afirmao, pois permitem observar que no h uma linearidade entre o maior tamanho de boto floral e o maior tamanho de antera, mas a linearidade ocorreu apenas em relao ao tamanho do boto e tamanho do plen como podemos observar na Tabela 3. Nas classes < 2mm e 2,0-2,9mm no foram visualizados gros de plen, mas clulas em meiose e ttrades. TABELA 3. Medidas entre tamanho de boto floral, das anteras e dos gros de plen de cultivares de mamona.SAS/UFPel,2006. Classe de boto floral 1 (>6mm) 2 (5,9-5,0 mm) 3 (4,9-4,0 mm) 4 (3,9-3,0mm)
a 5% de probabilidade

Tamanho longitudinal (m) 344,0 a 316,0 b 336,7 a 217,2 c

Tamanho transversal (m) 326,5 a 255,8 c 276,5 b 187,4 d

Tamanho de plen (m) 25,4a 24,2 b 19,7 c 15,8 d

*Mdias seguidas pela mesma letra no diferem entre si pelo teste de Duncan A resposta androgentica pode ser influenciada por diversos fatores mas destaca-se entre eles o estdio de desenvolvimento do micrsporo (ROWNAK AFZA et al., 2000). A associao entre o tamanho do boto floral e o estdio da microsporognese importante para facilitar pesquisas que envolvem a tcnica de cultura de anteras, porm estes critrios devem ser utilizados com cautela, pois de acordo com Lauxen et al. (2003) ao compararem cultivares de soja, observaram que botes florais de mesmo tamanho no apresentavam micrsporos no mesmo estdio. Em vrias espcies houve necessidade de estabelecer o estdio de desenvolvimento do micrsporo mais adequado para a produo de calos (YIN et al, 1982; BOBROWSKI et al., 1995; BRASILEIRO et al., 1999). Entretanto

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neste experimento foi observada a formao de calos em todas as classes de tamanho de boto floral (Fig. 1 e Tab. 4). De acordo com Yin et al. (1982) normalmente o cultivo de anteras de soja contendo micrsporos nos estdios uninucleado tardio ou binucleado sofrem um escurecimento na parede da antera e desintegrao dos micrsporos; porm, segundo Brasileiro et al. (1999) em outras espcies estes estdios produzem maior nmero de calos, portanto a formao de calos nos diferentes tamanhos de anteras observadas neste experimento pode ser devido a variao dos estdios de desenvolvimento da microsporognese nas anteras de um mesmo boto floral (Lauxen et al., 2003) e as diferenas de estdio de desenvolvimento mais indicado para esta espcie.

FIGURA 1. Aglomerado de anteras extrados boto floral (5,9-5,0 mm) em meio de cultura (M5.) com formao de calos. (A) aglomerados de anteras com C formao de calos retirados de botes florais (>6 mm), detalhe mostrando oxidao dos tecidos de formao dos filetes em meio M5. (B) Formao de calo globular a partir de antera retira de boto floral (2,9-2,0mm) em meio M6. (C) Formao de calos em anteras em meio M4 a partir de boto floral (3,03,9mm) (D). UFPel/2006. Segundo Brasileiro et al. (1999) pode haver a formao de calos nos estdios iniciais da meiose, bem como, a partir de ttrades ou micrsporos uninucleados foram considerados, tambm, como melhores para proliferao de calos. Como podemos observar neste experimento que anteras de botes florais com menor tamanho (<2 mm) tambm produziram calos, porm com oxidao em quase todos os meios testados (Tab. 4).

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FIGURA 2. Antera oxidada em meio M5 retirado de boto floral classe: > 6,0 mm. (A) Anteras oxidadas e intumescidas em meio M3 retirados de boto floral com 4,0- 4,9 mm. (B) UFPel, 2006. A avaliao de formao de calos aos 30 dias de cultura no foi possvel devido ao alto ndice de contaminao dos meios de cultura. De acordo com Custdio et al. (2005) as condies de cultivo da planta doadora podem influenciar nos ndices de contaminao, neste experimento as coletas foram realizadas a partir de plantas mantidas a campo, portanto sujeitas a ao de agentes exgenos. Devemos considerar tambm que o uso de substncias desinfestantes em concentraes muito altas podem comprometer a viabilidade dos tecidos. A maior freqncia de anteras oxidadas ocorreu nos meio M3, M4 e M5 quando consideramos todos os tratamentos avaliados. No entanto, o uso de carvo ativado e cido ascrbico nos meios M1 e M2 demonstrou uma menor oxidao quando comparados os resultados com os outros meios de cultura, onde foram avaliados os efeitos do cido ascrbico e carvo ativado independentes, porm no h uma diferena qualitativa quando comparado com do meio M6 (Tab. 4). De acordo com Custdio et al. (2005) a oxidao das anteras pode inibir totalmente a induo de calos podendo este efeito ser minimizado pelo uso de agente antioxidantes ou transferindo a cultura para meio fresco, neste experimento o uso de carvo ativado e soluo de cido ascrbico, a interao destes dois compostos auxiliou prevenindo a oxidao rpida que normalmente ocorre em explantes de mamona. Porm estes autores citam tambm que o

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tipo de auxina pode interferir, sendo o uso de TDZ melhor em relao a oxidao mas para induo de calos o 2,4 D mais eficiente. Isto pode explicar a ausncia de oxidao no meio M6, sem adio de carvo ativado ou cido ascrbico, e tambm sem 2,4D (Tab.1 e 4). TABELA 4. Teste preliminar para avaliao do efeito do tamanho de boto floral utilizado e do meio de cultivo na produo de calos aos 15 dias a partir de aglomerados de anteras em cultura. UFPel/2006.
Meio Classe (mm) Formao de calo oxidao

M1

M2

M3

M4

M5

M6

< 2,0 2,0 2,9 3,0 3,9 4,0 4,9 5,0 5,9 > 6,0 < 2,0 2,0 2,9 3,0 3,9 4,0 4,9 5,0 5,9 > 6,0 < 2,0 2,0 2,9 3,0 3,9 4,0 4,9 5,0 5,9 > 6,0 < 2,0 2,0 2,9 3,0 3,9 4,0 4,9 5,0 5,9 > 6,0 < 2,0 2,0 2,9 3,0 3,9 4,0 4,9 5,0 5,9 > 6,0 < 2,0 2,0 2,9 3,0 3,9 4,0 4,9 5,0 5,9 > 6,0

X* X X

X X X X X X X X X X

X X X X X X X X X X X X X X X X

X X X

X X X X X X X

*X : indica formao de calos ou oxidao a partir de anteras cultivadas em diferentes meios de cultura.

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Podemos visualizar na Tabela 4 que houve formao de calos em quase todos os meios testados e tamanhos de botes florais, sendo as classes extremas (>6mm e < 2,0 mm) as que menos produziram calos. Porm, de acordo com Lannes et al. (2004) outros fatores podem influenciar no desempenho da induo de calos como comprimento do dia, radiao solar e temperaturas noturnas s quais estavam submetidas s plantas doadoras de plen. Quanto a colorao dos calos em meio de cultura, aos 30 dias de cultivo, observou-se que nos meios M1, M5 e M6 apresentavam-se com aspectos

translcido, nos meios M3 e M4 com aspecto amarelo-translucido e no meio M2 a amarelados. Com relao a textura os calos formados apresentavam-se globulosos (Fig. 2B). Ashok-Kumar et al. (2003) observaram que calos com

aspecto amarelado induziam maior regenerao que os demais. H necessidade de maiores estudos quanto ao potencial de regenerao destes calos e a utilizao de outros agentes antioxidantes para evitar a oxidao dos explantes no meio de induo, mas estes resultados preliminares indicam a potencialidade da tcnica para a mamona.

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CONCLUSES

Botes florais das cvs. Cafelista, AL-Guarany 2002 e IAC-80 com mesmo tamanho apresentam anteras e gros de plen de tamanhos diferentes evidenciando variao morfolgica entre elas. Houve formao de calos a partir de anteras de mamona cv. IAC-80 em todos os meios testados e a partir de botes florais com tamanhos diferentes.

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CONSIDERAES FINAIS

A cultura da mamona constitui-se atualmente em alternativa para a produo agrcola, tanto para agricultores familiares como grandes produtores, socializando o desenvolvimento econmico do pas. O desenvolvimento de pesquisas com a espcie a partir do conhecimento cientfico bsico tem permitido a ampliao da rea de cultivo, atravs da criao de novos gentipos adaptados a diversas regies do pas. No que se refere ao potencial para a produo de biodiesel como fonte de energia renovvel a mamona considerada como um excelente investimento econmico e devemos levar em considerao o seu potencial de fixao de CO2 contribuindo para o desenvolvimento limpo. Os gros de plen de mamona apresentaram alto percentual de viabilidade polnica na antese. O maior percentual de gros de polens viveis obtido das cultivares IAC-80 e Cafelista, no entanto, mesmo apresentando diferenas significativas das cultivares AL-Guarany 2002 e AL-Preta, so igualmente consideradas com bom potencial de viabilidade. Sendo, portanto, possvel a utilizao de todas as cultivares analisadas na induo de fertilizao em programas de melhoramento.

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O percentual de germinao dos polens foi baixo mesmo no controle o que sugere que a tcnica de germinao in vitro deve ser ajustada para esta espcie bem como a poca de coleta do plen. Botes florais das cvs. Cafelista, AL-Guarany 2002 e IAC-80 com mesmo tamanho apresentam anteras e gros de plen de tamanhos diferentes evidenciando variao morfolgica entre elas. Para cultura de anteras de mamona da cv. IAC-80 podem ser utilizados diferentes tamanhos de botes florais, em meio contendo de cido ascrbico e carvo ativado, porm a seco de anteras deve ser realizada em soluo de cido ascrbico para diminuir a oxidao das anteras.

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ANEXO 1.Anlise da varincia dos dados para viabilidade polnica atravs do uso de Carmim-actico 2% de Ricinus communis.Pelotas UFPel/2006. Causa da Variao CULTIVAR RESIDUO TOTAL 3 28 31 249.33 15.94 1194.52 15.63 0.00003 G.L. Q.M. Valor de F Prob. >F

Mdia Geral: 74.05 CV= 5.39%

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ANEXO 2: Anlise da varincia dos dados para viabilidade de germinao de plen de Ricinus communis Pelotas UFPel/2006. Causa da Variao Perodo Tratamento Trat./Per. Resduo Total 1 3 3 56 63 19.5893391 1372.820 7.791 16.620 5092.151 1.178 82.599 0.468 0.28202 0.00001 0.700922 G.L. Q.M. Valor de F Prob. >F

Mdia Geral: 7.24 CV= 56.30%