Introduccin Los aceites y grasas son sustancias de orgenes vegetales o animales, insolubles en agua y solubles en solventes orgnicos.

La primera distincin entre un aceite y una grasa es su apariencia fsica. De un modo general, los aceites son definidos como sustancias lquidas a temperatura ambiente (21 C), en tanto que las grasas se caracterizan como sustancias slidas a dicha temperatura. Las grasas de origen vegetal resultan de procesos de hidrogenacin de aceites vegetales. Los aceites y grasas son formadas, principalmente, por triglicridos o triacilgliceroles (Figura 1), resultante de la combinacin entre tres molculas de cidos grasos y una molcula de glicerol (Dantas, 2006).

Figura 1. Estructura de un triglicrido Los cidos grasos presentes en los aceites y grasas estn constituidos, por cidos carboxlicos que contienen de 4 a 30 tomos de carbono en su cadena molecular, estos pueden ser saturados o insaturados en diferentes concentraciones para diferentes aceites vegetales (Figura 2). El nmero de insaturaciones puede variar de 1 a 6, siendo tres insaturaciones comunes y prevaleciendo mayor cantidad de ismeros CIS, especialmente en los aceites y grasas naturales (Dantas, 2006). Los cidos grasos saturados se organizan con facilidad en cristales y debido a que las atracciones de Van der Waals son fuertes, estos poseen puntos de fusin relativamente elevados. La configuracin CIS de los enlaces dobles de un cido graso insaturado impone una curva rgida a la cadena de carbono que interfiere con la organizacin cristalina, causando la reduccin de las atracciones de Van der Waals entre las molculas. Consecuentemente, cidos grasos insaturados poseen puntos de fusin ms bajos (Solomons, 2002, citado por Coneiao y Candeia, 2007).

Materiales y metodos DETERMINACIN DEL GRADO DE ACIDEZ 1. OBJETO Determinar los cidos libres en los aceites de oliva. El contenido en cidos grasos libres se expresa mediante la acidez calculada segn el mtodo convencional. 1.1. Principio Disolucin de la muestra en una mezcla de disolventes y valoracin de los cidos grasos libres mediante una solucin etanlica de hidrxido potsico. 1.2. Reactivos Todos los reactivos deben ser de calidad analtica reconocida y el agua utilizada debe ser agua destilada o de una pureza equivalente. 1.2.1. Mezcla de ter dietlico y etanol de 95% (V/V), en proporcin de volumen 1:1. Nota: El ter dietlico es muy inflamable y puede formar perxidos explosivos. Debe utilizarse tomando especiales precauciones. Debe neutralizarse exactamente en el momento de su utilizacin con la solucin de hidrxido potsico (1.2.2) en presencia de 0,3 ml de la solucin de fenolftalena (1.2.3) por cada 100 ml de mezcla.

Nota: Si no es posible utilizar ter dietlico, puede sustituirse por una mezcla de disolventes formada por etanol y tolueno. Si fuera necesario, el etanol podra sustituirse, a su vez, por 2-propanol. 1.2.2. Solucin etanlica valorada de hidrxido potsico, = 0,1M o, en caso necesario, = 0,5M. Nota 1. Debe conocerse, y comprobarse inmediatamente antes de su utilizacin, la concentracin exacta de la solucin etanlica de hidrxido potsico. Debe utilizarse una solucin que haya sido preparada por lo menos cinco das antes y decantada en un frasco de vidrio marrn cerrado con tapn de goma. La solucin debe ser incolora o de color amarillo paja. Nota: Se puede preparar una solucin incolora y estable de hidrxido potsico de la manera siguiente: Llevar a ebullicin, y mantener sta a reflujo durante una hora, 1000 ml de etanol con 8 g de hidrxido potsico y 0,5 g de virutas de aluminio. Destilar inmediatamente. Disolver en el destilado la cantidad requerida de hidrxido potsico. Dejar reposar durante varios das y decantar el lquido claro sobrenadante, separndolo del precipitado de carbonato potsico. La solucin tambin puede prepararse de la manera siguiente sin efectuar la destilacin: aadir 4 ml de butilato de aluminio a 1000 ml de etanol y dejar reposar la mezcla durante algunos das. Decantar el lquido sobrenadante y disolver en l la cantidad necesaria de hidrxido potsico. La solucin est lista para ser utilizada. 1.2.3. Solucin de 10 g/l de fenolftalena en etanol de 95-96% (V/V) o solucin de 20 g/l de azul alcalino (en caso de aceites de oliva muy coloreados) en etanol de 95-96% (V/V). Reactivo Etanol de 95% (v/v) Etanol Etanol de 95-96% (v/v) ter dietilico Recomendacin PANREAC DENOMINACION Etanol 96% v/v PA

ter dietilico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS-ISO Hidrxido potasico Potasio hidrxido 85% lentejas PA 2-propanol 2- propanol PA-ACS-ISO Solucin de 10 gr/l de fenolftalena en Fenolftalena solucin 1% RV etanol de 95-96 % (v/v) Solucin etanlica valorada de hidrxido Potasio hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) potsico, = 0,1 M etanlica SV Solucin etanlica valorada de hidrxido Potasio hidrxido 0,5 mol/l (0,5 N) potsico, =0,5 M etanlica SV Tolueno Tolueno PA-ACS-ISO Virutas de aluminio Aluminio, virutas, 99+%

1.3. Material Material habitual de laboratorio, y en particular: 1.3.1. Balanza analtica 1.3.2. Matraz erlenmeyer de 250 ml de capacidad 1.3.3. Bureta de 10 ml de capacidad, con graduacin de 0,05 ml 1.4. Procedimiento 1.4.1. Preparacin de la muestra para la prueba La determinacin se efectuar en una muestra filtrada. Si el contenido global de humedad e impurezas es inferior al 1%, se utilizar la muestra tal cual. 1.4.2. Muestra para la prueba Tomar la muestra, segn el grado de acidez previsto, de acuerdo con el cuadro siguiente: Grado de acidez previsto <1 1a4 4 a 15 15 a 75 >75 Peso de la muestra (en g) 20 10 2,5 0,5 0,1 Precisin de la pesada de la muestra (en g) 0,05 0,02 0,01 0,001 0,0002

Pesar la muestra en el matraz erlenmeyer (1.3.2) 1.4.3. Determinacin Disolver la muestra (1.4.2) en 50 a 150 ml de la mezcla de ter dietlico y etanol (1.2.1), previamente neutralizada. Valorar, agitando, con la solucin de hidrxido potsico de 0,1M (1.2.2) (vase nota 2) hasta el viraje del indicador (la coloracin rosa de la fenolftalena debe permanecer al menos durante 10 segundos). Nota 1: La solucin etanlica valorada de hidrxido potsico (1.2.2) puede sustituirse por una solucin acuosa de hidrxido potsico o sdico siempre que el volumen de agua aadido no provoque una separacin de las fases. Nota 2: Si la cantidad necesaria de la solucin de hidrxido potsico de 0,1M supera los 10 ml, debe utilizarse una solucin de 0,5M. Nota 3: Si la solucin se enturbia durante la valoracin, aadir una cantidad suficiente de la mezcla de disolventes (1.2.1) para que la solucin se aclare. 1.5 Expresin de la acidez en porcentaje de cido oleico La acidez, expresada en porcentaje de cido oleico es igual a:

VxCx siendo:

V : volumen en ml de la solucin valorada de hidrxido potsico utilizada. c : concentracin exacta, en moles por litro, de la solucin de hidrxido potsico utilizada. M: peso molecular del cido en que se expresa el resultado (cido oleico = 282). P: peso en gramos de la muestra utilizada. Se tomar como resultado la media aritmtica de dos determinaciones.

DETERMINACIN DEL NDICE DE PERXIDOS . OBJETO La presente norma describe un mtodo para la determinacin del ndice de perxidos de los aceites y grasas. . PRINCIPIO La muestra problema, disuelta en cido actico y cloroformo, se trata con solucin de yoduro potsico. El yodo liberado se valora con solucin valorada de tiosulfato sdico. 5. APARATOS Todo el material utilizado estar exento de sustancias reductoras u oxidantes. Nota: No engrasar las superficies esmeriladas. 5.1. Navecilla de vidrio de 3 ml 5.2. Matraces con cuello y tapn esmerilados, de 250 ml de capacidad aproximadamente, previamente secados y llenos de gas inerte puro y seco (nitrgeno o, preferiblemente, dixido de carbono). 5.3. Bureta de 25 o 50 ml, graduada en 0,1 ml. 6. REACTIVOS 6.1. Cloroformo para anlisis, exento de oxgeno por borboteo de una corriente de gas inerte puro y seco. 6.2. cido actico glacial para anlisis, exento de oxgeno por borboteo de una corriente de gas inerte puro y seco. 6.3. Solucin acuosa saturada de yoduro potsico, recin preparada, exenta de yodo y yodatos.

6.4. Solucin acuosa de tiosulfato sdico 0,01N o 0,002N valorada exactamente; la valoracin se efectuar inmediatamente antes del uso. 6.5. Solucin de almidn, en solucin acuosa de 10 g/l, recin preparada con almidn soluble. Reactivo Recomendacin PANREAC Denominacin cido actico glacial para anlisis Acido Actico glacial PA-ACS-ISO Almidon soluble Almidn de Patata soluble PA Cloroformo para anlisis Triclorometano estabilizado con etanol PA-ACS-ISO Solucin acuosa de tiosulfato sdico Prepararlo a partir de sodio tiosulfato 0,1 0,01 N mol/l (0,1N) SV diluido convenientemente con agua Solucin acuosa de tiosulfato sdico Prepararlo a partir de sodio tiosulfato 0,1 0,002 N mol/l (0,1 N) SV diluido convenientemente con agua Solucin de almidon en solucin acuosa Almidon solucin 1% RV de 10g/l Yoduro potasico Potasio Yoduro PA-ACS-ISO 7. MUESTRA La muestra se tomar y almacenar al abrigo de la luz, y se mantendr refrigerada dentro de envases de vidrio totalmente llenos y hermticamente cerrados con tapones de vidrio esmerilado o de corcho. 8. PROCEDIMIENTO El ensayo se realizar con luz natural difusa o con luz artificial. Pesar con precisin de 0,001 g en una navecilla de vidrio (5.1) o, en su defecto, en un matraz (5.2) una cantidad de muestra en funcin del ndice de perxidos que se presuponga, con arreglo al cuadro siguiente: ndice de perxidos que se supone (meq Peso de la muestra problema ( en g) de /Kg) De 0 a 12 De 5,0 a 2,0 De 12 a 20 De 2,0 a 1,2 De 20 a 30 De 1,2 a 0,8 De 30 a 50 De 0,8 a 0,5 De 50 a 90 De 0,5 a 0,3

Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de vidrio que contenga la muestra problema. Aadir 10 ml de cloroformo (6.1). Disolver rpidamente la muestra problema mediante agitacin. Aadir 15 ml de cido actico (6.2) y, a continuacin, 1 ml de solucin de yoduro potsico (6.3). Cerrar rpidamente el matraz, agitar durante 1 minuto y mantenerlo en la oscuridad durante 5 minutos exactamente, a una temperatura comprendida entre 15 y 25C. Aadir 75 ml aproximadamente de agua destilada. Valorar (agitando al mismo tiempo vigorosamente) el yodo liberado con la solucin de tiosulfato sdico (6.4) (solucin

0,002N si se presuponen valores inferiores a 12 y solucin 0,01N si se presuponen valores superiores a 12), utilizando la solucin de almidn (6.5) como indicador. Efectuar dos determinaciones por muestra. Realizar simultneamente un ensayo en blanco. Si el resultado del ensayo en blanco sobrepasa 0,05 ml de la solucin de tiosulfato sdico 0,01N (6.4), sustituir los reactivos. 9. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS El ndice de perxidos (I.P.), expresado en miliequivalentes de oxgeno activo por kg de grasa se calcula mediante la frmula siguiente: IP= siendo: V: ml de solucin valorada de tiosulfato sdico (6.4) empleados en el ensayo, convenientemente corregidos para tener en cuenta el ensayo en blanco. N: normalidad exacta de la solucin de tiosulfato sdico (6.4) empleada. P: peso, en gramos de la muestra problema. El resultado ser la media aritmtica de las dos determinaciones efectuadas. Indice de saponificacion 1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION Esta Norma Mexicana establece el procedimiento para determinar el ndice de saponificacin en los aceites y grasas vegetales o animales y es aplicable a todos los aceites y grasas normales. 2 DEFINICIN ndice de Saponificacin: Es la cantidad de hidrxido de potasio expresado en miligramos, necesario para saponificar un gramo de aceite o grasa. 3 FUNDAMENTO Este mtodo se basa en la reaccin qumica de los tri-acilgliceroles o triglicridos con un lcali, formndose jabones o sales alcalinas de los cidos grasos y glicerina. La reaccin qumica es la siguiente: 4 REACTIVOS, MATERIALES Y APARATOS 4.1 Reactivos 4.1.1 Los reactivos que a continuacin se mencionan, deben ser grado analtico, cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada. 4.1.1.1 Acido clorhdrico 0,5 N.- Cuidadosamente valorado. 4.1.1.2 Hidrxido de potasio en solucin alcohlica (KOH).- Preparado colocando 5 g 10 g de grnulos de KOH (ver inciso 7.1.1) en un matraz de 2 L y agregndole 1 L-1,5

L de alcohol etlico al 95 % (ver inciso 7.1.2) e hirviendo a reflujo en un bao de agua por 30 min - 60 min. Destile y colecte el alcohol en un frasco o matraz de vidrio con tapn esmerilado. Disuelva 40 g de KOH, bajo en carbonatos, en un 1 L del alcohol destilado (ver inciso 7.1.2) y enfri para conservar la temperatura 15C. La solucin debe de permanecer clara y transparente. 4.1.1.3 Solucin indicadora de fenolftalena 1,0 % en alcohol etlico al 95 %. 4.2 Materiales y equipos. 4.2.1 Matraces Erlenmeyer resistentes a lcalis, de 250 ml - 300ml, de cuello esmerilado, con tapn esmerilado, T24/40.. 4.2.2 Tubos de condensacin largo mnimo 65 cm, con junta esmerilada T 24/40 para conectar con los matraces Erlenmeyer. 4.2.3 Bao de agua o parrilla caliente con control de calentamiento variable. 4.2.4 Matraz de destilacin 2L, con juntas esmeriladas T24/40, con conexin a un condensador con enfriamiento de agua, para destilacin con reflujo y destilar alcohol etlico al 95 % de acuerdo a lo anotado en el inciso 4.1.1.2 4.2.5 Pipetas volumtricas de 50 ml 4.2.6 Material comn de laboratorio. 5 PROCEDIMIENTO 5.1 Funda la muestra si no est ya lquida y fltrela a travs de un papel filtro de poro fino para remover cualquier impureza presente y humedad. La muestra debe de estar totalmente seca. 5.2 Pese una cantidad de muestra en un matraz Erlenmeyer de tamao tal que la titulacin sea equivalente al 45%-55% del blanco. Normalmente esto requiere una muestra de 4 g 5 g. Agregue 50 mL de la potasa (KOH) alcohlica con una pipeta volumtrica de 50 mL y permita que la pipeta escurra por un perodo definido de tiempo (ver inciso 7.2.1). 5.3 Prepare y conduzca determinaciones en blanco simultneamente con la muestra y similares en todos aspectos, excepto por omitir la grasa o el aceite. 5.4 Conecte el condensador y lleve a ebullicin lenta pero constante hasta que la muestra est completamente saponificada. Esto normalmente requiere de 1 h para muestras normales (ver inciso 7.2.2). Asegrese que el anillo de sello de vapor en el condensador no se levanta hasta el tope del condensador, o que alguna prdida pueda ocurrir. 5.5 Despus de que el matraz y el condensador se han enfriado bien pero no lo suficiente para formar un gel, lave el interior del condensador con una pequea cantidad de agua destilada. Desconecte el condensador, agregue aproximadamente 1 mL del indicador de fenolftalena y titule con la solucin 0,5 N de HCl. Registre el volumen de la solucin requerida para la titulacin. Expresion de los resultados:

ndice de saponificacin: Donde:

B es el volumen, ml 0,5 N HCl requeridos para titular el blanco M es el volumen, ml 0,5 N HCl requeridos para titular la muestra N es la normalidad de la solucin de HCl P es el peso de la muestra en gramos, y 56,1 es el equivalente del hidrxido de potasio. 7 NOTAS 7.1 Notas de Precaucin 7.1.1 El hidrxido de potasio (KOH), al igual que todos los lcalis, puede quemar la piel, los ojos y el tracto respiratorio severamente. Use guantes de hule gruesos y careta de proteccin para protegerse de los lcalis lquidos concentrados. Use un extractor de humos efectivo o mascara para gases para protegerse el tracto respiratorio contra los polvos o vapores. Trabaje en una campana adecuada de ser ello posible. Cuando trabaje con materiales extremamente custicos tal como el hidrxido de potasio, siempre agregue los grnulos al agua y no al contrario. Los lcalis son extremadamente exotrmicos cuando se mezclan con agua. Tome precauciones para contener la solucin custica en el caso que el recipiente que la contenga se rompa por el calor extremo generado. Se recomienda usar la solucin alcohlica de KOH recientemente preparada. 7.1.2 El alcohol etlico (etanol) es inflamable. Use una campana cuando se caliente o evapore este solvente.

7.1.3 El cido clorhdrico es un cido fuerte y puede causar quemadas severas. Ropa de proteccin adecuada deber usarse cuando se trabaje con este cido. El cido es txico por ingestin e inhalacin y es un fuerte irritante para los ojos y la piel. Se recomienda el uso de una campana adecuadamente operada. Cuando se diluya el cido, siempre agregue el cido al agua y nunca al contrario. 7.2 Otras notas 7.2.1 Para resultados consistentes, se debe de utilizar siempre una pipeta volumtrica de 50 mL clase A calibrada para dosificar. Al usar la pipeta deber de permitirse el tiempo especificado de drenado. 7.2.2 Algunas muestras, particularmente aquellas que sean difciles de saponificar, pueden requerir ms de 1 h de reflujo. Esto solo puede determinarse por pruebas. La claridad y homogeneidad de la solucin de prueba son indicadores parciales de la saponificacin completa, pero no representan necesariamente un criterio absoluto. 8 REPETIBILIDAD

La diferencia entre resultados sucesivos, obtenidos con cl mismo mtodo sobre materiales de prueba idnticos y bajo las mismas condiciones (mismo operador, mismos aparatos, mismo laboratorio y al mismo tiempo); no debe ser mayor de 0,5% con respecto al promedio de los resultados sucesivos de una misma muestra.

RESULTADOS Y DISCUSION ndice de saponificacin Estandarizacin de NaOH 0.5 N con patrn primario ftalato acido de potasio (KHP) Se procedi a preparar una solucin de NaOH 0.5 N, pesando 20 g de NaOH en la balanza analtica y se procedi a aforar en un baln de aforo de 1000 ml. Para la determinacin del ndice de saponificacin en muestras de aceite comestible (AMBAR) primeramente se procedi a estandarizar el NaOH 0.5 N recin preparado con un patrn primario como lo es el ftalato acido de potasio (KHP). El peso de la muestra de ftalato acido de potasio se encontr mediante la siguiente relacin estequiometrica: NaOH + KHP O + NaKP

Teniendo en cuenta que 1 mmol (milimol) de hidrxido de sodio reacciona con 1 mmol de ftalato acido de potasio se obtiene la siguiente relacin: 1 mmol de NaOH = 1mmol de KHP = meq ( ) = =( ) KHP ( )

Teniendo en cuenta para un volmen terico gastado de 10 ml de NaOH 0.5 N en la estandarizacin, 204.2 mg/mmol peso formula del ftalato acido de potasio, se obtuvieron 1,02 mg los cuales se pesaron en una balanza analtica y se disolvieron en 25 ml de agua destilada con una pipeta volumtrica. La concentracin del NaOH se dilucido mediante la relacin estequiometrica por medio de la siguiente ecuacin: =(
)( )

Se valoraron 5 replicas, los resultados se resumen en la siguiente tabla: Peso de muestra de KHP (en g) 1) 1.0255 g 2) 1.0298 g 3) 1.0299 g Volumen de NaOH 0.5 N, empleado para estandarizar (L) 0.0099 L 0.0101 L 0.01 L Concentracin de NaOH encontrada (moles/litros) 0.5073 M 0.4993 M 0.5043 M

4) 1.0243 g 0.0101 L 5) 1.0221 g 0.01 L Media de las 5 concentraciones

0.4966 M 0.5005 M 0.5016 M

Habiendo finalizado la estandarizacin del NaOH 0.5 N se procedi a preparar una solucin de HCl 0,5 N, teniendo en cuenta que el HCl empleado no presentaba la concentracin terica, se procedi a encontrar su verdadera concentracin empleando la siguiente ecuacin: M= Siendo: : densidad del HCl en la botella %: porcentaje de HCl presente en la botella PM: peso molecular del HCl Obteniendo una concentracin calculada de 10.32 moles/litros. FALTA =

Despejando se obtiene: = Siendo: : Volumen de HCl empleado para aforar en un baln de 1000 ml : Concentracin de NaOH encontrada mediante la estandarizacin (0.5016 M) : Volumen de NaOH empleado : Concentracin de HCl encontrada Se calculo un valor de 48.45 ml de HCl el cual se procedi a medir en una probeta graduada y posteriormente a aforar en un baln de 1000 ml para la preparacin de la solucin de HCl 0.5 N. Valoracin de HCl 0.5 N con NaOH 0.5 N Se procedi a valorar 5 replicas de 25 ml de HCl con 4 gotas de fenolftalena con una solucin de NaOH 0.5 N obteniendo los siguientes resultados: Volmenes de HCl (L) 0.025 Volumen de NaOH (L) Concentracin de HCl encontrada (M) 0.5658 0.5718 0.5637 0.5671

0.0282 0.025 0.0285 0.025 0.0281 Media de las 3 concentraciones encontradas

La concentracin de HCl se encontr utilizando la siguiente relacin: =

Despejando se obtiene: = Siendo: : Volumen de HCl medidos (en nuestro caso fueron 25 ml) : Concentracin de NaOH encontrada mediante la estandarizacin (0.5016 M) : Volumen de NaOH empleado : Concentracin de HCl encontrada Determinacin del ndice de saponificacin Se procedi a preparar la solucin etanlica KOH/ETOH 0.5 N colocando de 5- 10 g de grnulos de KOH en un matraz de 100 ml y aforando con etanol al 95 %. En la siguiente tabla se muestran el peso de las 5 replicas de aceite pesadas en la balanza analtica teniendo en cuenta que para la muestra 2 y 3 se empleo el doble del peso original (muestra 1) y para las muestras 4 y 5 se empleo el triple del peso original. replicas 1 2 3 4 5 Peso de cada replica (g) 1.84 3.65 3.64 5.40 5.45

Posteriormente se procedi a diluir las 5 muestras en balones de 100 ml de tapn esmerilado con 25 ml de la solucin etanlica de KOH/ETOH y a preparar un blanco conteniendo solamente los 25 ml de KOH/ETOH, luego se monto un sistema de reflujo el cual consista de 6 refrigerantes,6 soportes, 6 mangueras, 6 baos de mara, y 6 mecheros bunsen. Luego se colocaron las 5 muestras y el blanco a reflujo en bao de mara por 1 hora, el cual es el tiempo necesario para que la grasa este saponificada. Despus del tiempo requerido se procedi a valorar la muestra con HCl 0.5 N aadindole 3 gotas de fenolftalena etanlica obteniendo un cambio de color (rojo intenso) en la muestra lo que nos indicaba la saponificacin de esta. En la siguiente tabla se muestra la cantidad de volumen de valorante empleado para valorar al analito y su ndice de saponificacin para cada muestra: replicas blanco 1 Volumen de HCl 0.5 N (ml) 18.1 7.4 ndice de saponificacin

2 3 4 5

1 1 0.5 0.5

Se calculo el ndice de saponificacin de cada muestra con la siguiente ecuacin: ndice de saponificacin: Donde: B es el volumen, ml 0,5 N HCl requeridos para titular el blanco M es el volumen, ml 0,5 N HCl requeridos para titular la muestra N es la normalidad de la solucin de HCl P es el peso de la muestra en gramos, y 56,1 es el equivalente del hidrxido de potasio.
( )

Posteriormente se procedio