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ESTUDO DA FERMENTAO SIMULTNEA HIDRLISE, DE SORO DE QUEIJO, UTILIZANDO LACTASE E SACCHAROMYCES CEREVISIAE Souza, K. M.1 , Andrade, A. C.2 e Arajo, E. H.3* Aluno de Graduao (Iniciao Cientfica) FEQUI - UFU 2 Aluno de Ps-Graduao (Mestrado) - FEQUI - UFU 3 Prof. Orientador - FEQUI - UFU Av. Joo Naves de vila, 2160, Bloco 1K, Campus Santa Mnica Tel.: (34) 3239-4189, Fax: (34) 3239-4188, E. Mail: euclides@ufu.br 38408-100 Uberlndia MG - Brasil
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RESUMO - A fermentao do soro de queijo com objetivo de produzir etanol apresenta-se como uma alternativa tecnicamente vivel, pois alm de reduzir o potencial poluidor desse resduo ainda pode gerar um produto de maior valor agregado. Neste trabalho, foram avaliados alguns parmetros visando otimizao na produo de etanol, a saber: temperatura, pH, agitao, nutrientes, concentrao de levedura, concentrao de enzima (lactase) e a concentrao do substrato soro. Os ensaios foram realizados na temperatura de 30 C e pH de 4,5. Para os ensaios conduzidos com 60 g de soro, 0,4 g de enzima e 30 g de inculo, todos por litro de meio, obteve-se uma produtividade de etanol em torno de 2,39 g/L.h e um rendimento de 90,01%. Alterando-se as condies para 90 g de soro, 0,4 g de enzima e 70 g de inculo, a melhor produtividade chegou a 3,66 g/L.h e o rendimento a 93,9%.

INTRODUO Dentre os subprodutos da indstria de laticnios, o soro o constituinte de maior importncia, tanto pelo volume gerado, como pela sua carga poluidora, que lanada em corpos receptores pode causar um grave problema ambiental. Aproximadamente 80% do volume do leite destinado fabricao de queijos se transforma em soro. O soro de queijo contm metade do extrato seco do leite, representado por lactose, protenas solveis e sais (PAOLUCCI, 1991). Por se tratar de um subproduto de baixo valor econmico, o soro era simplesmente lanado nos cursos dgua sem nenhum tratamento prvio (SISO, 1996). O descarte do soro de leite diretamente no solo, conduz a outros problemas ambientais: compromete a

estrutura fsico-qumica do solo e diminui o rendimento da colheita (PONSANO et. al., 1992). Procurando atender s legislaes ambientais, algumas indstrias de laticnios compreenderam ser prefervel o aproveitamento do soro de leite atravs de algum mtodo de recuperao dos nutrientes, ao seu tratamento puro e simples (SCOTT, 1986). Dentre as tecnologias disponveis para aproveitar o soro de queijo, segundo MINAS AMBIENTE (1998) pode-se utilizar na alimentao animal e como substrato para a fermentao. A produo de lcool atravs da fermentao do soro de leite tem sido estimulada pela crescente necessidade mundial de energia, alm de representar uma forma simples de tratamento e disposio de grandes quantidades de

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soro de leite produzido pela indstria (KOSIKOWSKI, 1979). Na sua composio, o soro apresenta um alto teor de lactose, acar diretamente fermentescvel por uma levedura especfica Kluyveromyces marxianus. A lactose, presente no soro de queijo chamada de acar do leite. Quimicamente, a lactose um dissacardeo redutor constituda por um radical D-glicose e outro D-galactose, unidos por uma ligao -1.4 glicosdica (WAKSTRA & JENNESS, 1984; HOLSINGER et al., 1974), mostrada na Figura 1.

Figura 2: Atuao da lactase na reao. A Lactase encontrada em animais, plantas, bactrias, fungos e leveduras. Porm as mais utilizadas so as originrias de leveduras e fungos; as respectivamente mais importantes so: Kluyveromyces fragilis, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae (COUGHLIN & CHARLES, 1980; GEKAS & LOPEZLEIVA, 1985; MACHADO & LINARDI, 1990). A escolha do organismo a ser usado na produo de etanol depende do processo empregado, do substrato em questo e dos objetivos a serem alcanados. Por isso as leveduras produtoras de lcool devem apresentar certos requisitos para que a eficincia do processo seja adequada, tais como o fornecimento de alta taxa de fermentao e alto rendimento do produto (MENEZES, 1980; JONES et. al., 1983; KOSARIC et. al., 1983). Neste trabalho, procurou-se inovar, com um processo de fermentao simultnea hidrlise, utilizando uma levedura bem conhecida, Sacharomyces cerevisiae, juntamente com uma lactase de origem fngica capaz de hidrolisar a lactose em um acar mais facilmente fermentvel, nas condies de pH e temperatura, 4,5 e 30C, utilizadas na fermentao alcolica. MATERIAIS E MTODOS Materiais O soro de queijo em p desnatado foi adquirido junto a Fbrica de Produtos Alimentcios Vigor S/A, localizada na cidade de So Gonalo do Sapucaia

Figura 1: Representao da molcula de lactose. A lactose tem como caractersticas principais: a baixa solubilidade em gua e o baixo poder adoante. A lactose pode ser hidrolisada utilizando-se a enzima Beta-Galactosidase para produzir um acar mais digervel, pois se estima que 70% da populao mundial possua intolerncia lactose, a qual atribuda a baixos nveis de lactase intestinal (HOLSINGER et al., 1974). A enzima Beta-Galactosidase (E.C.3.2.1.23), tambm conhecida como Lactase, classificada como uma hidrolase, com capacidade transferase para grupos galactosil, catalisando a reao da lactose para formar glicose e galactose, representada na Figura 2, alm de enriquecer o produto hidrolisado com galactoligossacardeos (LOPEZLEIVA & GUZMAN, 1985).

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(MG), a sua composio apresentada na Tabela 1: Tabela 1: Composio do soro de queijo fornecido pela Vigor Alimentos S/A. Constituinte Mnimo Mximo (%)* (%)* 11,0 Protenas 72,0 Lactose 5,0 Cloreto 7,0 9,0 Sais minerais *A porcentagem dada em Peso/Peso A enzima utilizada era Galactosidase (-D-Galactoside galactohydrolase; EC 3.2.1.23), da Sigma, obtida pelo cultivo de Aspergillus oryzae. Foi utilizado como inculo, a levedura Saccharomyces cerevisiae, na forma de fermento prensado da Fleischmann. A unidade experimental (Figura 3) utilizada para conduzir a fermentao da marca Biostat B-Braun, sendo este um reator batelada, com controle de pH, temperatura, agitao.

do inculo, cido/base, retirada de amostras e um exaustor. Na tampa do reator havia um motor que promovia a agitao do meio e a outra parte era constituda de um sistema de controle com um display, no qual eram apresentadas as variveis que estavam sendo controladas no processo. Foram utilizados tambm: uma centrfuga da marca Beckmann Coutler, modelo Avanti J-25, com controle de velocidade, tempo e temperatura; um banho termostizado da marca Thermomix, modelo 18BU da B. Braun Biotech International; um espectrofotmetro Genesys, modelo 10UV e uma autoclave da marca Fanem para esterilizao do meio de fermentao. Mtodos Aps o preparo do meio de fermentao e sua esterilizao eram ajustadas, no sistema de controle do fermentador (ver Figura 3), a temperatura, o pH e a agitao. Ajustados as variveis, era adicionado no meio a enzima Galactosidase para realizao da hidrlise do meio e, simultaneamente, o inculo, nas quantidades prdeterminadas, para a realizao da fermentao. Para execuo dos ensaios, foram seguidas algumas metodologias, como o mtodo da Oxidao pelo Dicromato de Potssio (JOSLYN, 1950), para determinao do teor de lcool presente nas amostras; o Mtodo do cido Dinitrossaliclico (DNS) (MILLER, 1959), para avaliar a quantidade de acares redutores presentes no decorrer dos ensaios e o Teste Enzimtico Colorimtrico para determinao de Glicose nas amostras. Para o clculo da produtividade foi empregada a Equao 1. Produtividade (g/L.h) = Etanol produzido tempo (1)

Figura 3: Unidade Experimental Esse reator consiste em duas partes: o tanque cilndrico com um volume til de 1,5 L, onde era colocado o meio de fermentao, esse tanque era fechado com uma tampa de ao inoxidvel com aberturas para a entrada

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RESULTADOS E DISCUSSES O rendimento da fermentao foi calculado atravs da Equao 2. Rendimento (% )= Etanol produzido (2) Substrato consumido * 0,5368 Fixou-se, para a fermentao simultnea, a temperatura 30 C e o pH de 4,5, condies que proporcionam a mxima atividade da enzima (Sigma) e uma boa atuao da levedura na produo de etanol. A faixa recomendada de temperatura, para as leveduras, entre 28 C e 35 C e pH entre 3,5 e 6,0 (KOSARIC et al. 1983). A partir das condies fixadas, foram realizados os ensaios, variando-se alguns parmetros (Tabela 2), afim de que fosse possvel selecionar as condies mais favorveis para a produo de etanol.

O valor de 0,5368 refere-se estequiometria para a converso da lactose a etanol, tal como apresenta a Equao 3.

C12 H 22 O11 4C 2 H 5 OH + 4CO 2

(3)

Tabela 2: Parmetros avaliados durante a fermentao Parmetros Soro de queijo (g/L) Nutrientes* (g/L) Inculo (g/L) Enzima (g/L) Agitao (rpm) Ensaio 1 60,0 1,0 30,0 0,2 300 Ensaio 2 60,0 1,0 50,0 0,2 300 Ensaio 3 60,0 1,0 30,0 0,4 300 Ensaio 4 60,0 1,0 50,0 0,4 500 Ensaio 5 60,0 3,0 30,0 0,2 300 Ensaio 6 90,0 1,0 70,0 0,4 300 Ensaio 7 90,0 3,0 50,0 0,2 300

*Nutrientes: Extrato de Levedura e Sulfato de amnio Na Figura 4 so apresentadas as curvas que representam os teores obtidos de lcool ao longo do tempo de fermentao, para as condies estudadas. Pode-se constatar (Figura 4) que, na maioria dos ensaios estudados, a produo mxima de etanol ficou entre a 8a e a 10a hora. Verifica-se atravs dos resultados obtidos nos Ensaios 6 e 7, que os teores obtidos de etanol foram superiores, conseqncia de uma maior concentrao inicial de soro, 90g por litro de meio. No Ensaio 6, o final da fermentao foi atingido com 8 horas, para uma concentrao inicial de inculo de 70g/L.

Figura 4: Concentrao de Etanol em funo dos tempos de fermentao.

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Da Figura 4 cabe destacar que o Ensaio 1 foi aquele que demandou maior tempo de fermentao, cerca de 13 horas, isto pode ser inicialmente explicado pelas condies de processo, ou seja, utilizouse a um s tempo os valores mais baixos de substrato, enzima, inculo e nutrientes. Observa-se ainda na Figura 4 que a quantidade de enzima determinante na reduo do tempo de fermentao, como indicam os resultados obtidos para os Ensaios 3 e 4, nos quais se obteve um tempo de fermentao de 8 horas para uma quantidade de 0,4 g de enzima por litro de meio. As curvas dos teores de etanol (Figura 4), em funo do tempo de fermentao, indicam claramente, aps quatro horas de ensaio, uma diminuio na velocidade de produo de etanol, que coincide com o esgotamento do teor de glicose (Figura 5), sugerindo um consumo posterior do monossacardeo galactose.

na maioria dos ensaios o teor de substrato era praticamente esgotado em torno de 8 a 10 horas de fermentao. Para a maioria dos ensaios a limitao da velocidade de reao, pelo Substrato, se d a partir das 6 horas de fermentao, e isto pode ser observado na Figura 6 quando a partir das 6 horas de fermentao se d uma reduo no acrscimo dos teores de etanol.

Figura 6: Acares redutores em funo dos tempos de fermentao A Tabela 3 apresenta a produtividade e o rendimento para os ensaios realizados. Conforme j comentado, o Ensaio 1 foi o mais longo, e para este obtiveram-se os menores valores de produtividade e rendimento. Verificou-se que para o Ensaio 3 e 4 uma quantidade de enzima da ordem de 0,4 g/L foi capaz de aumentar as produtividades em torno de 20% em relao ao Ensaio 2. No Ensaio 6 ocorreu comportamento semelhante, com aumento da produtividade em relao ao Ensaio7.

Figura 5: Concentrao de Glicose ao longo das fermentaes Na Figura 6 so apresentados de forma global os valores restantes de Acares Redutores Totais ao longo dos tempos de fermentao para os vrios ensaios. Pode-se notar na Figura 6, que

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Tabela 3: Produtividades e Rendimentos obtidos nos ensaios estudados Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio 4 Ensaio 5 Ensaio 6 Produtividade (g/L.h) Rendimento (%) 1,43 77,35 1,90 84,53 2,39 87,71 2,34 81,12 2,31 90,01 3,66 89,30 Ensaio 7 3,04 93,90

O Ensaio 5 pode ser tambm destacado, pois apesar de ter sido conduzido com teores menores de enzima e inculo, utilizou-se uma maior concentrao de nutrientes, 3,0 g/L e, com isto, obteve-se um maior rendimento em relao aos Ensaios 3 e 4 e um valor de produtividade prximo daqueles. CONCLUSES Com base nos resultados obtidos e nas discusses efetuadas foi possvel, at o momento, enumerar as seguintes concluses: O tempo de fermentao influenciado pela concentrao de nutrientes, e pela quantidade de inculo. A quantidade adicionada de enzima influiu no tempo de fermentao e na produtividade. O menor tempo de fermentao, foi 8 horas. A maior produtividade e o maior rendimento alcanados nos ensaios, foram respectivamente de 3,66 g/L.h e 93,9%. O parmetro agitao, nos nveis estudados, no influenciou nos resultados obtidos. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS COUGHLIN, R. W. & CHARLES, M. (1980). Applications of lactase and immobilized lactase. In Immobilized Enzymes for Food Processing, ed. W. H. Pitcher Jr. CRC Press, Boca Raton, Florida, p. 153-173.

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