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Parte III: NUTRICIN Y TRANSPORTE

Las plantas son capaces de tomar el carbono atmosfrico para formar hidratos de carbono. Sin embargo tienen otros requerimientos como el de agua, elemento que es fundamental, incluso para la fotosntesis, u otros elementos minerales muy variados. Todas estas sustancias deben ser captadas del sustrato a travs de la raz, y transportadas hasta los rganos fotosintticos. Existe un transporte a corta distancia, que puede tener lugar entre clulas cercanas a travs de plasmodesmos, o a travs de la pared celular. Existe tambin un transporte a larga distancia, entre rganos distintos. El que se produce a travs del xilema facilita la llegada del agua y los nutrientes minerales desde el sustrato a las hojas. El transporte floemtico permite el suministro de materia orgnica de vuelta hacia los rganos sin capacidad de fotosntesis. El balance de agua es fundamental, no solo para realizar la fotosntesis y aportar un disolvente para el metabolismo, sino que tambin lo es para el soporte fsico de las plantas. Si el gradiente de humedad desde el suelo hasta la atmsfera (en su recorrido raz-estoma en la planta) no es suficientemente acusado, las clulas se deshinchan y pierden su presin de turgor, y entonces los rganos marchitan, y la planta no puede sostenerse en pie.

I/ El Suelo y la Nutricin Mineral:

1.- Composicin Qumica del Suelo: Las plantas superiores tienen determinados requisitos que deben ser cubiertos por los aportes edficos. Existen determinados macronutrientes, como N, S, P o K, y mltiples oligoelementos, que las plantas deben tomar del suelo para que pueda producirse su desarrollo.

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Los criterios de esencialidad determinan el grado en que la concentracin de un micronutriente o macronutriente en el suelo es esencial para el desarrollo de una especie. Una planta no puede permitirse cerrar su ciclo biolgico por ausencia de un elemento. Cada elemento concreto puede ser requerido para un proceso concreto, y es esencial cuando no puede ser sustitudo en ese proceso por otro. La toma de elementos de las races no es selectiva, y no existe criva. La raz toma incluso los elementos txicos, por lo que la presencia de los elementos en el tejido vegetal pueden reflejar su presencia en el suelo. Para analizar la esencialidad de los nutrientes en laboratorio se preparan suelo completos, pero carentes de un nico nutriente. Los macronutrientes son los que son tomados en mayores proporciones, pero tambin destacan por su elevada esencialidad. Por ejemplo el nitrgeno est presente en todas las protenas y pptidos, y no puede ser reemplazado por ninguna otra sustancia.

El nitrgeno es tal vez el macronutriente fundamental, y es limitante para el desarrollo y crecimiento vegetal. En ecologa, para valorar la capacidad limite de carga de desarrollo de la vegetacin en un sistema, debido a los ciclos biogeoqumicos, se utiliza el cociente C ORG/NTOTAL en el sistema. La asimilacin

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de nitratos y nitritos, y la fijacin de nitrgeno en las clulas fotosintticas ha sido visto en la parte anterior. Las leguminosas y algunos rboles como los alisos forman ndulos en sus races por simbiosis con bacterias capaces de fijar el nitrgeno atmosfrico (N2). Estas plantas son capaces de colonizar suelos pobres en nitrgeno. Adems cuando dominan en un sistema enriquecen notablemente el suelo en este elemento y favorecen el desarrollo de plantas nitrfilas. El azufre, al igual que el nitrgeno, es un elemento escaso y fundamental para las plantas. Se encuentra en aminocidos protenas y molculas de valor estructural. Tambin est presente en algunos enzimas reductores como tiorreductasa.

El potasio se encuentra en la planta en forma de catin. No suele ser asimilado en los hidrocarburos. Juega un importante papel en la osmsis y homeostasia de las plantas. El potasio representa alrededor del 50% de las cenizas de las plantas. Los requerimientos varan dependiendo de las especies, y sus adaptaciones a los distintos tipos de suelo. El silicio, o el sodio (en halfitas) son beneficiosos, y pueden incluso cubrir en algunas funciones secundarias a los elementos esenciales.

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2.- Estudios de Esencialidad: En los estudios de esencialidad se controla la concentracin de un nutriente en un suelo completo respecto a los otros elementos requeridos por la planta. Se valora la tasa de produccin o el crecimiento de las plantas a distintas concentraciones del mismo elemento. As se puede determinar el rango de concentraciones a las que ese nutriente es esencial en los tejidos; se trata del intervalo de suficiencia. Por encima de este se encuentra el intervalo de toxicidad, y por debajo el intervalo de deficiencia.

Realizando curvas de produccin vegetal en funcin de las concentraciones de distintos nutrientes, la pendiente de la respuesta del vegetal elevada indica que se trata de un micronutriente. La toxicidad del micronutriente se inicia a bajas concentraciones. Sin embargo la pendiente de la respuesta vegetal moderada, como la del fsforo o la del nitrgeno, indica que estos elementos son macronutrientes.

Los estudios de esencialidad se realizan con medios completos, y suelen realizarse mediante cultivo hidropnico, lo que permite el control de la concentracin de los elementos qumicos disueltos. Para ello se suelen utilizar soluciones preparadas como las de Hoagland y Arnon o de Sachs.

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3.- Estructura, Agua e Iones del Suelo: La meteorizacin de la roca madre y la formacin del suelo viene facilitada por la accin de la meteorologa y de los seres vivos. Las partculas del suelo pueden retener agua por capilaridad, o aire si no llueve; su capacidad de campo (mxima cantidad de agua que puede retener el suelo por capilaridad) depende del tamao de los poros entre partculas del suelo. Los complejos arcillo-hmicos estn formados por partculas de pequeo tamao y necromasa en descomposicin, que forma el humus. La arena se forma por partculas de 2-0,02mm. La arcilla se forma por partculas de dimetros inferiores a 0,002mm. Las partculas de dimetro intermedio forman el limo. Al disminuir el tamao de las partculas aumenta la relacin superficie/peso disponible para retener cationes, y tambin disminuye el tamao de los poros aumentando la capilaridad.

La roca madre aporta materia mineral al suelo, mientras que la necromasa y el humus aportan materia orgnica. La materia del suelo tiende a tener mayormente carga negativa. Los pelos radiculares se extienden entre los intersticios del suelo para absorber mayor cantidad de agua y nutrientes. Se trata de prolongaciones de una clula epidrmica de la raz que incrementa de forma destacable la superficie de intercambio con el medio externo. El suelo puede retener tres tipos de agua. El agua de saturacin o agua gravitacional es el agua en exceso, que supera la capacidad de campo del suelo. El agua capilar es el agua que el suelo puede retener por fuerzas capilares, y puede ser absorbida por las plantas. La mojabilidad de los poros capilares depende de su dimetro y su carga. Cuando el suelo se encuentra en su capacidad de campo, contiene el mximo nivel de agua posible por capilaridad. Cuando se retiene determinada cantidad de agua capilar pero aparece aire, las races facilitan la respiracin. Un suelo sin espacios areos puede ser letal para muchas plantas. El agua molecular est fuertemente unida a las partculas del suelo, y no puede ser absorbida por la vegetacin. Se trata de suelos en condiciones de aridez.

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Dada la carga negativa de las paredes de las partculas del suelo, estas tienden a retener a los cationes. Los aniones, sin embargo, son repelidos del suelo y drenan con el agua gravitacional. Esto supone un problema para la captacin de los aniones necesarios para las plantas, como el fsforo o el cloro. La capacidad intercambiadora de cationes del suelo depende del dimetro de las partculas y su relacin superficie/peso. Las series liotrpicas de los iones del suelo reflejan la afinidad de las partculas del suelo cargadas negativamente por los cationes, y define la fuerza del enlace que forman. La mayor afinidad se produce por el aluminio y el hidrgeno. Los cationes por los que existe mayor afinidad pueden desplazar a los de menor afinidad. Por ello los suelo no litorales son pobres en sodio.

La respiracin de la raz permite su crecimiento en busca de agua y nutrientes. Durante la respiracin el CO 2 liberado se diluye en el agua y se produce acidificacin del agua (HCO3- + H+). Los protones producidos por la respiracin, por su elevada afinidad, pueden desplazar a otros cationes producindose acidificacin del suelo. Esto facilita la liberacin continua de otros nutrientes a la solucin de agua capilar en pequeas cantidades. Esta cantidad es suficiente para cubrir las necesidades de micronutrientes de la planta, no as de macronutrientes (salvo en suelos muy enriquecidos). El calcio se encuentra en elevadas concentraciones en la pared celular, asociado a pectinas, y en orgnulos, pero no en el citosol. Algunas poaceas como trigo o maz tienen poca pared celular primaria y poco calcio.

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4.- Deficiencias Nutricionales: Las deficiencias nutricionales se producen cuando los nutrientes no se encuentran en suficiente concentracin. Las plantas han desarrollado adaptaciones especiales para evitar las deficiencias. As, por ejemplo, el reciclaje tiene lugar cuando las hojas llegan a su punto de marchitez, antes de la abscisin. La planta reabsorbe los nutrientes mviles fundamentales y el agua de los tejidos de la hoja.Las deficiencias nutricionales vienen acompaadas por distintos sntomas visibles en los tejidos, as como necrosis, clorosis o deformaciones en los rganos. Ante excesos de algn nutriente, por otro lado, las plantas presentan los sntomas de toxicidad. Las deficiencias ms graves estn relacionadas con los macronutrientes. HOJAS DE FRESA

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Las simbiosis con hongos fijadores de nitrgeno es una adaptacin para evitar las carencias de nitrgeno en el suelo, y permite el desarrollo de las plantas gracias al N2 atmosfrico fijado por las bacterias y hongos. Las micorrizas son hongos capaces de vivir en simbiosis en las races de algunas plantas, facilitando la fijacin del nitrgeno atmosfrico. Las ectomicorrizas forman una vaina que recubre la raz y puede penetras en la pared celular. Es frecuente en rboles. Las endomicorrizas, ms abundantes, penetran en la pared celular y en las clulas vegetales, por invaginacin (sin romper la membrana. Pueden formar arbustos vesiculares muy ramificados. Los haustorios es el nobre de las hifas formadas por estos hongos, que se benefician de la simbiosis tanto como la planta. Ectomicorrizas Endomicorrizas

Los nutrientes en el suelo estn disponibles en determinados rangos de pH. Por ejemplo a pH neutro el fsforo es inmovilizado en el suelo, pero a pH cido se encuentra disponible para la vegetacin. Algunas plantas pueden tener adaptaciones especiales a suelos alcalinos o bsicos, donde la disponibilidad de algunos macronutrientes es muy limitada. Estas forman races proteoides en ausencia de fosfato, muy ramificadas, y que secretan cidos y acidifican el suelo. Los cidos provienen del ciclo de krebs e implican una inversin de ATP por la planta.

Control

Carencia de P

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II/ Transporte de Nutrientes y Agua:

Las paredes celulares vegetales representan una va de difusin pasiva de las sustancias del suelo. En tejidos areos suele estar impermeabilizada para evitar la desecacin en ambiente terrestre, no as en races. La pared celular conecta toda la planta, desde la base hasta el pice, por una va uniforme y contnua que redibe el nombre de apoplasto. En los pelos radiculares emitidos por las clulas de la raz, la pared celular es la parte ms externa y est expuesta a la solucin edfica acuosa. Estos pelos pueden introducirse entre las partculas del suelo absorbiendo indiscriminadamente el agua, los nutrientes, y los elementos txicos. Estos pueden ser transportados a toda la planta, pero este tipo de transporte es muy lento.Las molculas solubles del metabolismo central tambin pueden difundir por todo el apoplasto. El simplasto es el conjunto de citoplasmas de las clulas de las plantas. Las clulas estn unidas por plasmodesmos, que son conexiones intercitoplasmticas que atraviesan la pared celular. Estos plasmodesmos son poros que conectan los citoplasmas de todas las clulas de la planta formando la va simplstica. El movimiento simplstico est condicionado por la cantidad de plasmodesmos presentes en lor tejidos. El paso de la va apoplstica a la va simplstica implica atravesar la membrana celular. La va transmembrana es la mayor barrera que encuentran las molculas hidroflicas, especialmente las cargadas, en su transporte en las plantas.

A/ Transporte a travs de las Membranas:

1.- Movimiento de Solutos a Travs de la Membrana: Los iones y molculas solubles en el agua se encuentran en distintas concentraciones en el interior y el exterior celular. Esta diferencia es la causante de un potencial elctrico de membrana E M que puede medirse con ayuda de microelectrodos. El interior celular es negativo respecto del exterior.

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El potencial elctrico de la membrana corresponde a la diferencia de potencial entre los medios interno y externo en equilibrio. = Es generada por unas bombas que facilitan el transporte activo de iones a travs de la membrana y en contra de su gradiente electroqumico; las ATPasas de hidrogeniones del plasmalema. Tambien participan otras bombas como las bombas de calcio. La ATPasa de hidrobeniones bombea protones hacia el medio externo eliminndolos del citosol, a expensas de la energa de ATP.

El componente pasivo del transporte de solutos a travs de membranas corresponde a la difusin sin gasto de energa, que debe producirse a favor del gradiente electroqumico del in (i), es decir, desde el medio energticamente superior al inferior. El transporte pasivo de cationes a travs de las membranas es ms fludo que el de aniones, ya que estos son ms escasos en el sustrato y deben ser conservados por la planta. Destaca el potasio, para el cual la membrana presenta muy elevada permeabilidad. Los fertilizantes suelen incluir aniones esenciales y potasio, por su funcin osmtica. El potencial de membrana depende de los procesos de transporte activos y pasivos. El cianuro es un inhibidor del metabolismo (produce H +) y por lo tanto del transporte activo de solutos a travs de la membrana. En laboratorio los experimentos con cianuro (CN-) ponen de manifiesto la magnitud con que ambos componentes del transporte afectan al potencial de membrana;

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Cuando el componente electrognico ya ha sido totalmente inhibido por cianuro, el potencial de membrana se mantiene constante.En las clulas maduras el componente pasivo es cada vez ms importante, al contrario que en las jvenes. Al envejecer los tejidos tienen un potencial de membrana m prximo a 0. Los excesos de cargas negativas en el interior celular (i) afectan al tranporte pasivo. Se debe a los flujos que se establecen debido a los gradientes de potencial electroqumico de cada in, desde donde el potencial es mayor hacia donde es menor. Para un in j (i: inteno, 0;externo) () = +. . ln + . (). (0) = + . . ln 0 + . (0). En equilibrio () = (0) y no existe flujo neto del in. El potencial de Nerst (ENj) es el gradiente de potencial para el in j en condiciones de equilibrio. Se obtiene a partir de los anteriores modelos. EM y ENj representan la fuerza elctrica del gradiente de potencial electroqumico en equilibrio. = () (0) . . ( 0 ) = . . ln 0

0 . 1 . . ln

El potencial de Nerst de un in depende por lo tanto de la fuerza qumica y de la fuerza elctrica. Para un catin la fuerza elctrica siempre se dirige desde el exterior de la membrana al interior cargado negativamente. Para los

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aniones sucede lo contrario, y tienden a salir de las clulas por el efecto de la fuerza elctrica. En el equilibrio ENj siempre es igual a EM (medible con microelectrodos), y se puede calcular as la actividad interna a partir de la externa. Este equilibrio es al que se tiende por todo tipo de flujos pasivos. El transporte activo gasta energa para oponerse al flujo de equilibrio. En el equilibrio la fuerza elctrica sigue favoreciendo la entrada de cationes y salida de aniones de la clula. La carencia de aniones en el suelo representa un problema, y la fuerza elctrica de gradiente de potencial de membrana se opone a su entrada, complicndolo an ms.

Procesos pasivos (flechas punteadas) y activos (flechas slidas)

El potasio es necesario en elevadas concentraciones. Puede ser tomado activamente pero la clula puede adquirir todo el necesario por difusin. El sodio tambin puede ser tomado por difusin, pero su eliminacin requiere de transporte activo.

El transporte activo de expulsin de cationes e introduccin de aniones altera la situacin hipottica de equilibrio pasivo, en el que () = (0) . Sucede para cada tipo de in en el sentido contrario que el propio transporte

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pasivo. El transporte activo requiere energa de ATP. En este caso , y el gradiente de potencial de membrana puede medirse como: 0 = . . ( ) Con esta ecuacin podemos calcular la energa necesaria para movilizar un mol del in en julios (J.mol-1) por transporte activo. Por ejemplo los protones generados por el metabolismo en la clula son exportados por las bombas ATPasas de hidrogeniones hacia la matriz extracelular o pared celular o las vacuolas. Las bombas ATPasas de calcio deben exportar este catin o introducirlo en las vacuolas despus de su expulsin ante mensajes hormonales; se trata de un importante segundo mensajero. Estas bombas se encuentran tanto en el tonoplasto (vacuola) como en el plasmalema (membrana celular). En la mayor parte de los casos, sin embargo, el transporte activo no es facilitado por las bombas ATPasas, sino que se aprovecha la energa del transporte pasivo de unas molculas para el transporte activo de otras. Las protenas de membrana que facilitan estos procesos son los transportadores; cotransportadores (en el mismo sentido) o simportadores (en sentidos opuestos). Bombas y transportadores trabajan a una velocidad muy inferior a los canales, pero las bombas ATPasas son mucho ms abundantes que estos, no tanto los transportadores o carriers.

La relacin entre permeabilidad de la membrana para una molcula y coeficiente de particin en una membrana aceite-agua da la hidrofilia y lipofilia de las molculas. Existe de hecho relacin entre la lipofilia y la permeabilidad de la membrana para una molcula dada. El agua es una excepcin pues

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atraviesa la membrana con dos rdenes de magnitud por encima de lo que le corresponde. Se debe a la formacin de puentes de hidrgeno entre las molculas de agua, y a la presencia de canales para el agua, las acuoporinas. Los canales facilitan la difusin pasiva a favor del gradiente de potencial electroqumico del in. Tiene capacidad para abrirse en momentos clave, y permanecer generalemente cerrado impidiendo el flujo. 2.- Funcionamiento de los Transportadores: Las bombas de hidrogeniones se encuentran en el plasmalema y el tonoplasto, y exportan protones del citosol. Son bombas ATPasas del plasmalema son del tipo P y utilizan fosfato durante su catlisis. Estn reguladas por fosforilacin en un residuo Ser. Ser-OH se pliega cerrando el poro de la bomba e inhibiendo as su actividad. Al rer fosforilado forma Ser-O-P y se activa la bomba. La fusicocina es una toxina fngica que puede sustitur a la fosforilacin en la activacin de la bomba una vez unida a la protena 14-3-3. Las bombas del tonoplasto, sin embargo, son del tipo V.

Las bombas ATPasas de calcio se encuentran en el plasmalema, en el tonoplasto (donde utilizan calmodulina), en el retculo endoplsmico y en la membrana interna del cloroplasto. En el tonoplasto tambin existen antiportadores que introduce calcio a la vacuola sacando protones de la misma. Los canales de calcio tambin se encuentran en todas estas

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membranas, pero est generalemente inactivos. La activacin de los canales est relacionada con la accin del calcio como segundo mensajero. Existen mltiples canales y protenas de la clula muy sensibles a los cambios en las concentraciones de calcio. En el tonoplasto tambin existen bombas de hidrogeniones, adems de antiportadores de protones/calcio. En ausencia de ATP la bomba no funciona, por lo que no es posible introducir el calcio; su entrada depende de los transportadores, que deben utilizar protones del interior de la vacuola. FCCP es un protonforo que facilita la salida de los protones de la vacuola, anulando la toma de calcio y la accin de ATP. El ionforo facilita la salida directa del calcio.

El funcionamiento de los carriers sigue una cintica de Michaelis-Mentel, y ante concentraciones muy elevadas de sustrato a transportar se saturan, y alcanzan una velocidad mxima de transporte. Sucede lo mismo para las bombas y canales, pero no para la difusin pasiva. La velocidad mxima de los carriers (1000 molculas.s-1) es superior a la de las bombas(100 molculas.s -1), pero muy inferior a la de los canales(108 molculas.s-1).

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Si se aade experimentalmente sacarosa en el medio externo de las clulas, se puede observar una despolarizacin y un cambio en el E M. La sacarosa es introducida a las clulas por cotransporte con protones. La sacarosa no presenta potencial elctrico por lo que la entrada de los iones causa la despolarizacin. Los protones anulan el equilibrio transmembrana pues anulan a las cargas del interior, aportando la energa necesaria para la entrada del azcar.

La sacarosa introducida causa acidificacin del citoplasma y esto activa a las bombas de hidrogeniones del plasmalema, ya que su pH ptimo para el funcionamiento es 6,5-6,8, por debajo del pH normal del citosol. Este carrier es muy abundante en clulas que deben tomar sacarosa, as como las clulas acompaantes del floema a nivel foliar. 3.- Transporte de Sulfatos: Los sulfatos son macronutrientes esenciales para todos los vegetales, y deben ser captados del sustrato por la raz. Necesitan sistemas de transporte activo que aseguren sus niveles mnimos necesarios en clulas. Al tratarse de aniones son difciles de tomar en el suelo, y no tienen lugar en la escala liotrpica. Al introducir experimentalmente clulas vegetales en un medio rico en sulfatos, se observa una despolarizacin similar a la que se produce con la sacarosa. Esto se explica por la presencia de cotransportadores que introducen un SO42- junto con tres protones. Esto provoca la acidificacin del lmen, y la despolarizacin de la membrana de la clula. La rpida accin de las bombas ATPasas de protones deben exportar estos iones a expensas de ATP. El trabajo de estas bombas activadas por pH restaura de nuevo el gradiente de potencial de membrana E M y el electroqumico corresponciente al hidrogenin. A diferencia del nitrato, la absorcin de sulfatos no tiene dos cinticas de absorcin que se saturen a distintos rangos de concentracin. Deben existir mltiples transportadores con afinidad y nivel de saturacin distintos,

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adaptados a distintos rangos de concentracin pero de forma gradual (no en dos pasos).

4.- Transporte de Nitratos: Los nitratos, como los sulfatos, son aniones muy difciles de tomar, pero son a la vez macronutrientes esenciales para las plantas. Son tomados en el suelo y transportados como tal hasta las hojas, donde sern reducidos a amonio y posteriormente fijados en glutamato. Se observan dos rangos de concentracin distintos a los que este nutriente es absorbido; el rango M por transportadores de alta afinidad y el mM por transportadores de baja afinidad.

Las clulas vegetales muestran ligeras despolarizaciones en respuesta a la presencia de nitratos en el medio. Estas de nuevo estn relacionadas con el transporte del anin NO3-. Para clulas en reposo el potencial elctrico es normalmente de -240 mV. Al aadir un medio con [NO3-] = 250M el potencial de membrana pasa a -206 mV. Ante [NO3-] = 10mM el potencial alcanza los -118 mV. Se corresponde a un cotransporte con protones, acompaado por

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actividad de las bombas de hidrogeniones. El carrier para nitratos no est siempre presente en las clulas, su sntesis debe ser inducida por la presencia del in en el medio.

El transporte de fosfatos tambin implica a carriers y transportadores, pero su regulacin es contraria. La sntesis y actividad de los carriers de Pi es mayor cuando la concentracin del fosfato es menor y el requerimiento aumenta. Cuando aadimos mucho Pi no se observa despolarizacin, pero si si aadimos bajas concentraciones.

La energa correspondiente a despolarizacin es equiparable a la necesaria para introducir activamente el anin en el interior celular, aunque su potencial electroqumico sea muy bajo. Dada la esencialidad de este nutriente mineral, es conveniente el gasto energtico para acumularlo. 3 0 < 0 + 0 > 0
([NO3-] es superior en el interior, no as [H+])

Estos clculos, como vimos anteriormente, pueden ser utilizados para conocer la cantidad de energa en julios que la clula ha debido emplear para captar un mol de este anin: + 0 . + 3 0 . 3
(en J.mol-1)

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5.- Canales de Potasio: El potasio cumple las funciones osmticas en las clulas, y es requerido en muy altas concentraciones. Este catin representa el 50% de las cenizas de las plantas. Debe ser tomado activamente por las races y las clulas. Su captacin tambin tiene lugar a dos rangos de concentracin; M (mecanismo I de alta afinidad) y mM (mecanismo II de baja afinidad).

Los transportadores de alta afinidad son carriers que cotransportan el potasio con protones hacia el interior celular. Los protones son extrados por bombas. Estos transportadores pueden funcionar a concentraciones externas de potasio muy bajas a las que la fuerza qumica se opone a su entrada. A elevadas concentradiones externas se activan los mecanismos de transporte de baja afinidad; se trata de canales que facilitan el paso del catin a favor de gradiente de potencial electroqumico. Para el estudio de los canales se pueden utilizar tcnicas sencillas como el patch clamp o pinzamiento de un fragmento de membrana de 1 m. Para ello se utiliza una micropipeta especial (patch pipette), cuyo pice queda sellado a la membrana por una unin muy fuerte. En clulas vegetales esta tcnica implica digerir la pared celular vegetal.

El fragmento de membrana sellado a la micropipeta debe romperse y separarse de la clula. Por tirn se obtiene un patch inside-out, es decir, con la regin interna de la membrana hacia el exterior de la pipeta. Por succin o pulso de alto voltaje puede obtenerse un patch outside-out. Gracias a un

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gradiente de potencial electroqumico obtenido experimentalemente entre los medios internos de la micropipeta, y el medio externo de la clula, de picoamperios (pA). Esta simula la diferencia de potencial propia de la membrana. El flujo de iones que se da en la membrana sellada en la pipeta corresponde al transporte de iones a favor de gradiente electroqumico, facilitada mayormente por los canales.

Modificando la diferencia de potencial generada con la micropipeta en el laboratorio permite modificar las fuerzas qumicas y elctricas valorando sus efectos independientemente. El cloro y el potasio se mueven en la membrana a favor del gradiente de potencial hasta que alcanzan el equilibrio, y su potencial de nerst iguala al potencial de membrana. Cuando las concentraciones de KCl se igualan en los medios internos y externos, slo interviene el potencial elctrico. Se produce el potencial de reversin y hay movimiento neto de iones hasta que se alcanza un equilibrio. Se puede aplicar una fuerza elctrica externa (no inica) para analizar su efecto. Aplicando distintos pulsos se pueden obtener salida de potasio o entrada de potasio. En este caso las concentraciones de K + fueron de 115 mM en el interior de la micropipeta y 11 mM en el exterior. En el potencial de reversin hay equilibrio. Las corrientes inducidas superpuestas al movimiento de iones puede modificarse. Las entradas o salidas de cargas positivas o negativas provocan desviaciones de la corriente inducida. Este comportamiento irregular se explica por los procesos de apertura y cierre de los canales de membrana. Las desviaciones hacia arriba corresponden a salida de cationes (+) (aqu potasio) o entrada de aniones (-), y viceversa.

El potencial de reversin es aquel para el cual el potencial de membrana es de 0 mV. Los potenciales tericos (a igual concentracin) son: + = 59,2 = +59,2

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Pueden tambin realizarse mediciones con diferencias de potencial desde -100 mV hasta +100 mV, y realizar una grfica para la determinacin de la selectividad inica mediante tcnica de patch outside-out. Se utilizan para la medicin del potencial de reversin, en equilibrio de Nerst (I = 0 pA).

En condiciones simtricas, es decir con las mismas concentraciones de ambos iones, se obtienen potenciales de reversin para EK = ECl, y EM = 0 mV. En condiciones no simtricas (iones en distintas concentraciones) se obtienen potenciales de reversin para potenciales elctricos de membrana distintos de 0 mV. En condiciones naturales el potencial de membrana es electronegativo en el interior. Cuando el potencial de nerst del potasio ( + = 59,2 ) iguala al potencial de reversin, no hay movimiento de iones y la intensidad es de 0 pA. Al aplicar un potencial negativo de -100 mV se desplaza el equilibrio, y hay entrada de potasio, y desviacin de la intensidad de la corriente hacia abajo. Cuando la fuerza elctrica inducida es igual al potencial de reversin la intensidad es de 0 pA y hay equilibrio. Si se aplica un potencial positivo de 100 mV hay salida de potasio al exterior y desviacin del potencial hacia arriba. El canal de potasio in de baja afinidad es dependiente de voltaje. Se activa para potenciales elctricos de hiperpolarizacin inferiores a -100 mV. Por ello su comportamiento es el de introducir este in a la clula para estos potenciales. Ante escasez de carga negativa en el interior (-10 mV) se activan los canales de potasio out que exportan al catin. El in Ba2+ es un inhibidor de su actividad. Son canales rectificadores del potencial elctrico de membrana, dependientes de voltaje y regulados por calcio.

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Los canales de potasio ms estudiados son los de las races, que deben realizar la toma del sustrato, y de las clulas de guarda del estoma, que regulan el cierre y la apertura del ostiolo por su potencial hdrica, regulado por hormonas (ABA), a travs del potasio de papel osmorregulador. Tambin existen canales en el tonoplasto que expulsan el potasio de las vacuolas. En la membrana externa existen canales tanto para la exportacin como para la importacin de potasio. Todos estos canales son voltaje-dependientes.

El potasio acta como agente osmtico turgente para las clulas vegetales. Los canales de las vaculas FV y VK tienen la funcin de regular los

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niveles de potasio del interior celular, pudiendo controlar la turgencia de las clulas. La turgencia es constante en muchas clulas, salvo en caso de estrs, pero es variable en algunas clulas como las clulas de guarda, donde el papel del potasio es muy importante. A diferencia de los canales de plasmalema, los del tonoplasto no son dependientes de voltaje, sino que dependen de las concentraciones de calcio y del pH. El calcio puede modificar el potencial de membrana activando tambin a los canales del plasmalema. 6.- Canales de Calcio: El calcio debe encontrarse en bajas concentraciones internas, y en condiciones normales es bombeado y cotransportado con protones hacia los orgnulos y el exterior celular. Los canales inicos de calcio suelen estar cerrados y abrirse en respuesta a seales hormonales, desarrollando el papel intracelular de segundo mensajero. El calcio tiende a entrar al citosol, y este flujo es fuertemente favorecido tanto por la fuerza qumica como por la elctrica. La despolarizacin provocada es rpidamente recuperada por la activacin de los canales de salida de potasio (out).

Los canales de calcio pueden abrirse en respuesta a elicitores como respuesta a patgenos, luz azul y roja, concentracin de otros nutrientes, como el potasio, el ABA ante condiciones de estrs, o la succin. Algunos de los que se encuentran en el plasmalema son dependientes de voltaje, activados por despolarizacin o Ca-calmodulina (amplificacin de la seal).

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La mayora de canales de calcio del tonoplasto son activados por metabolitos, y todos facilitan la salida de calcio de la vacuola. La salida del calcio del citosol depende siempre de bombas y carriers. Pueden ser activados por ejemplo por el IP3 que junto con DAG es el producto de PIP 2 durante la transduccin de muchas seales hormonales.

Existe un mecanismo de retroalimentacin negativa de los canales de calcio activados por Ca-calmodulina. La fosfatasa 2B es tambin activada por el calcio del citosol, e inhibe la actividad de este canal. 7.- Canales Aninicos: Los canales aninicos del plasmalema son slo de salida, y se encuentran generalmente cerrados. El transporte de aniones al citosol requiere generalmente la actividad de carriers, ya que su acumulacin es costosa y se produce en contra del gradiente de potencial. Pueden transportar por ejemplo cloro o malato. Los canales aninicos de salida pueden ser de tipo R (activacin rpida) o de tipo S (activacin lenta). Suelen ser activados por fosforilacin y en presencia de calcio.

Cuando la despolarizacin causada por calcio ante determinadas seales es insuficiente, puede facilitarse la apertura de los canales de aniones de tipo R y tipo S amplificndose la despolarizacin (especialmente de tipo R). Colaboran por ejemplo en la prdida de turgencia de las clulas oclusivas durante el cierre del estoma.

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En el tonoplasto de clulas de metabolismo CAM existen canales que permiten la entrada de in divalente malato2- al interior de la vacuola donde el pH es muy cido y el malato puede protonarse. Esto permite el establecimiento de un gradiente de potencial que favorece la entrada contnua del malato 2- (ya que malato-H2 no influye). Algunos canales aninicos activados por despolarizacin (por ejemplo, entrada de calcio) son contrarrestados por los canales rectificadores de hiperpolarizacin por potasio. 8.- El Transporte de Agua y el Potencial Hdrico: El potencial electroqumico para una sustancia en solucin se ha definido anteriormente como; = + . . ln + . . Esto refleja la cantidad de energa libre contenida por un mol de la especie j en un sistema, o energa asociada a un mol de j. Para P, T, E, h y concentracin de otros solutos (nx) constantes: =

La presin hidrosttica (P) en exceso sobre la presin atmosfrica es muy importante para las propiedades mecnicas de las clulas con pared celular. El volumen molal parcial del agua (Vw = 18.10-6 m3.mol-1), es el volumen que ocupa un mol de agua. Este es superior al volumen delimitado por la pared celular, y genera el fenmeno de turgencia gracias a ajustes osmticos relacionados con el potasio. La presin desarrollada por metro cbico de agua contenido influye sobre el potencial o la energa libre de una sustancia. Por ejemplo a una Patm = 0,1.10-6 Pa, una especie j de Vj = 30.10-6 m3.mol-1, la especie j va a desarrollar una presin de 3 Pa.m-3, es decir, 3 J.mol-1. Tambin influye la energa potencial gravitacional, en funcin de la altitud y la masa de la sustancia. As se obtiene para el agua: = +. . ln + . . + . + . . En el caso anterior de la especie j, para que el trmino elctrico sea de 3 E = 0,031 mV, y por lo tanto . es despreciable. No sucede lo mismo

J.mol-1,

para el agua, donde el vector despreciable pasa a ser el elctrico. = +. . ln + . + . . Al aadir sales en un vaso de agua el agua pierde energa que es ganada por las sales al disolverse y adoptar una forma inica. El volumen de la clula es fijo, y viene delimitado por la rigidez de la pared celular. Al entrar agua por ajustes ormticos la clula se hincha, y se crea una sobrepresin sobre la

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pared; la presin de turgor. As la presin hdrica dentro de una clula vegetal, a una misma altitud, es superior a la atmosfrica. Para valorar las fuerzas energticas del agua en fisiologa vegetal no se utiliza el potencial electroqumico, sino el parmetro w o potencial hdrico del agua (en J.m-3), que contempla la presin de turgor: = . . ln + + . .

En el caso de la actividad del agua, dado que este elemento es el disolvente y no tiene concentracin, el clculo es distinto que el utilizado para iones y solutos. Para este caso se utiliza la fraccin molar de agua (N w) que depende del nmero de moles (n) de agua y de los solutos: = +

= . Este parmetro vale 0 para el agua pura, y toma valores negativos para agua con solutos. Ser tanto ms negativo cuanto mayor sea la concentracin de solutos o presin osmolar . La presin osmolar puede determinarse en un osmmetro (es igual a la presin hidrosttica aplicada para neutralizar un flujo) o calculada por la relacin de Van Hoog: = . . ln

En las clulas vegetales existen dos componentes osmticos que deben ser sumados; el componente de presin osmtica de solutos ( S) debido al factor de la actividad del agua, y el componente de presin de la matriz debido a la capacidad absorbente de los coloides () debido a . = . . ln . . ln

Por lo tanto podemos calcular el potencial hdrico en funcin de la presin osmtica como:

= + . .
Aqu la presin osmtica representa la contribucin energtica negativa al potencial, mientras que la presin representa la contribucin positiva. El agua tiende a igualar su energa en dos medios por flujos a travs de la membrana. Pueden tener lugar por difusin gracias a los puentes entre hidrgeno, aunque su transporte puede ser facilitado por protenas

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transmembrana, las acuoporinas, que aumentan la permeabilidad de la membrana al agua.

En el equilibrio = 0 y se anulan los flujos de agua. Para realizar la comparacin entre los potenciales hdricos internos y externos los trminos correspondientes a la presin hidrosttica se anulan pues a corta distancia es la misma (.g.h). Adems P0 = O (es igual a la presin atmosfrica pues no hay turgencia), y 0 = 0 pues nada absorbe agua. Por otro lado Pi mantiene la membrana del plasmalema, por las bandas de Hechtian, pegada a la pared celular, se trata de la presin de turgor: = 0 = 0 Utilizando un medio externo con concentraciones de sacarosa conocidas, y valorando el flujo neto de agua a distintas concentraciones, puede valorarse la diferencia de potencial hdrico. La sacarosa es un impermeante que no es capaz de penetrar a las clulas. La plasmlisis se produce cuando la turgencia de la clula disminuye, y la membrana se separa de la pared celular. Queda unida exclusivamente a travs de las bandas de Hechtian.

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La plasmlisis tiene lugar cuando Pi = 0. El mantenimiento de esta presin hidrosttica interna es responsable de la turgencia de la clula. Cuando S0 aumenta el potencial hdrico externo se hace inferior (siendo negativo aumenta su valor absoluto) y se establece un flujo de agua hacia el exterior responsable de la cada de la presin de turgor. La plasmlisis corresponde a Pi = 0, y se produce cuando S0 = totali (plasmlisis incipiente), y si S0 > totali. La plasmlisis incipiente permite as determinar el totali. En caso contrario se establece un flujo de agua hacia el interior que genera una presin de turgencia. Para sustancias permeantes, al aumentar S0 aumenta tambin totali, y la plasmlisis incipiente se produce a mayor presin osmtica externa.

Plasmlisis

Turgencia

Si 0 = 0 = 0 (agua pura) la clula tiende a equilibrarse con el medio, que contiene una elevadsima energa. Al situarse una clula en una solucin de agua pura se produce una situacin de mxima turgencia. En esta situacin se alcanza el equilibrio ( = 0 ) cuando: = y por lo tanto = 0. Es imposible en ningn caso para la clula alcanzar una presin de turgor superior, y una igual no se alcanza en la naturaleza.

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El coeficiente de reflexin de los solutos muestra en que grado la membrana refleja a los mismos. Permite determinar si son impermeantes (sacarosa) o permeantes (sales difciles de disociar).

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Cuanto mayor es el nmero de solutos externos, ms agua va a salir de la clula. Si los solutos son impermeantes y su coeficiente de reflexin es 1, la fuerza osmtica para atraer agua es mayor, y provocan plasmlisis incipiente a menor concentracin. Por ejemplo para la sacarosa 0,97 < < 1 Los solutos permeantes dependen de su coeficiente de reflexin ( < 1), y este debe ser tenido en cuenta en el clculo del potencial de agua: Para solutos impermeantes: Para solutos permeantes: 0 = . 0 =

El coeficiente de permeabilidad est directamente relacionado con el coeficiente de reflexin. Se trata de la facilidad en m.s-1 con la que la especie atraviesa la membrana estudiada. Para coeficientes de permeabilidad inferiores a 10-9 la sustancia es impermeante. La prdida de agua en las hojas tiene lugar en fase de vapor. Se pueden realizar mediciones del potencial de agua en fase de vapor en cmaras aisladas con un psicrmetro.

Cuando las plantas abren los estomas pueden producirse flujos de agua desde las cmaras areas hacia el exterior o viceversa. Esto depende de la humedad absoluta del aire y de su temperatura. El flujo o equilibrio de agua en una fase lquida hacia una fase gaseosa puede medirse como P wv (presin del vapor), por la ley de Raoult. Esta presin aumenta cuando lo hace la temperatura, y tambin aumenta cuando disminuye la cantidad de solutos en fase lquida. A temperatura constante, es mxima para agua pura y se

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denomina presin de vapor a saturacin P wv* (corresponde a 100% de humedad relativa H.R). Segn la ley de Raoult: = . Para el agua pura = 1 y por lo tanto = . En fase gaseosa la actividad del agua depende slo del trmino . Para calcular se puede utilizar por lo tanto la humedad relativa (H.R.) con valores entre 0 y 1, puesto que: = % . . = 100

As obtenemos: = . % . . . ln + . . 100

B/ Transporte a Larga Distancia:

Una parte fundamental del transporte de nutrientes debe tener lugar desde las races hacia las hojas (sustancias minerales) y de vuelta con los productos fotosintticos (esencialmente sacarosa). Este transporte puede ser llevado a cabo, tericamente, por va simplstica u apoplstica, pero estos mecanismos son a menudo muy lentos, y rboles de 100 metros de altitud como las secuoyas no se lo pueden permitir. Por ello existen sistemas de transporte por vascularizacin de los tejidos. El xilema debe transportar sustancias minerales y agua desde la profundidad del sustrato hasta el pice de la planta en contra de las fuerzas gravitacionales. Para una secuoya este trabajo puede supopner un verdader problema, y debe disponer de mecanismos muy eficaces para asegurarse el suministro. La turgencia y la evaporacin crean una diferencia de presin

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osmtica que favorece el ascenso de agua en contra de gravedad. El dimetro de los haces vasculares tambin contribuye por gravedad. La raz slo tiene capacidad de absorcin en la regin apical donde se desarollan los capilares radiculares. La absorcin es facilitada por la va apoplstica y por la va simplstica (numerosos plasmodesmos). Las bandas de caspari (rojo) pueden impermeabilizar la va apoplstica hasta el haz vascular.

El agua capilar retenida en los poros del suelo es absorbida. Las partculas neutras o con carga negativa tienen afinidad por la pared celular y la va apoplstica. El agua difunde libremente entre el suelo y el apoplasto, segn la ley de Fick (flujo J): = . . .

Por la segunda ley de Fick el tiempo necesario para atravesar una pared que se opone al flujo (lipdica) vara con el grosor de la barrera. 1.- Transporte por el Xilema: El xilema es fundamental pues permite el flujo en masa y el ascenso por capilaridad. Las fuerzas opuestas al flujo son las gravitatorias y las debidas a la viscosidad del fludo. Los gradientes de presin entre hojas y raz deben vencer estas fuerzas. El proceso es anlogo al sistema cardiovascular animal. El miocardio genera una diferencia de presin entre grandes venas y arterias. Al vencer la resistencia de los vasos se establece un flujo de sangre debido a la diferencia de presin. La capilaridad tambin contribuye al ascenso del lquido.

La fuerza gravitacional del lquido es: = . 2 . . .

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La fuerza capilar depende del coeficiente de tensin superficial ( ) y de la temperatura que determina la cohesin de las molculas y su adhesin a la pared del capilar. La adhesin es alta debido a las cargas negativas. La fuerza de ascensin que corresponde a la capilaridad acta a lo largo de todo el permetro de solucin. El ngulo depende de si el fludo moja o no y en que grado. En equilibrio estas fuerzas hacen que el agua alcance determinada altura en el capilar por encima de la superficie. Por la ley de Jurin:

2. . cos . .

En el xilema r = 20 m. En los intersticios del apoplasto r = 5 nm. Por capilaridad el agua puede alcanzar una altura de 3 km por el apoplasto, pero es extremadamente lento. A travs de xilema permite alcanzar 0,75 metros, lo que es insuficiente, especialmente para las secuoyas. La aplicacin de un gradiente de presin hidrosttica en las clulas de las hojas permite ejercer una fuerza ascendente en el xilema. En los espacios areos del mesfilo hay transpiracin y se producen prdidas de agua a travs de los estomas abiertos. La fuerza de evaporacin genera tensiones y presiones hidrostticas negativas en el seno del fludo del capilar. Al perderse agua la osmosis aumenta y se generan flujos netos de agua al interior de las clulas. As la evaporacin en el mesfilo representa una bomba de succin desde el final del capilar, con los estomas abiertos.

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Esto puede suceder cuando se establece un gradiente de potencial hdrico desde el suelo hasta la atmsfera, lo que suele suceder durante el da cuando se eleva la temperatura. Durante la noche el bombeo se produce desde la raz debido a las concentraciones de sales. As se genera una tensin en el xilema por presin radicular. La cavitacin es la generacin de burbujas en el xilema; esto interrumpe definitivamente la circulacin por la elevada tensin que mantiene a la burbuja por fuertes tensiones. Al aumentar el viento disminuye por renovacin la humedad relativa, y aumenta la velocidad de transpiracin y la tensin. Vientos muy fuertes pueden causar cavitacin. En estos casos las puntuaciones laterales entre las traqueidas y vasos xilemticos permiten el transporte lateral del fluido a vasos yuxtapuestos. 2.- Transporte por el Floema: A diferencia del xilema formado por trauqueas y traqueidas de clulas muertas huecas, el floema est formado por clulas vivas. Tiene elementos cribosos acompaantes de elevada actividad metablica. La placa cribosa se encuentra entre las clulas vivas, que cuentan con un elevado nmero de plasmodesmos. El principal elemento movilizado es la sacarosa. A menudo el transporte floemtico no se enfrenta a las fuerzas gravitacionales, pero la viscosidad del fluido transportado es muy superior al del xilemtico.

El modelo de Mnch del mecanismo bsico del flujo en masa puede explicar el flujo xilemtico y floemtico. A y B son clulas osmticas. A contiene una concentracin ms alta de sacarosa que B. Ambos osmmetros se encuentran sumergidos en cubetas con agua y conectados por un tubo de vidrio. El agua entra en A por smosis, incrementando as la presin de turgencia y empujando la solucin de azcar hacia el osmmetro B.

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Representacin de los flujos xilemtico y floemtico, conducidos por gradientes de presin hidrosttica. El agua entra y sale del floema, movindose hacia menores potenciales de agua. Los solutos entran y sales del floema pasiva o activamente generando un gradiente de presin osmtica en el floema, desde 1,7 Mpa en la hoja a 0,7 Mpa en la raz.

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