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XVIII Congreso Argentino de Bioingeniera SABI 2011 - VII Jornadas de Ingeniera Clnica Mar del Plata, 28 al 30 de septiembre de 2011

Sntesis y caracterizacin de hidroxiapatita para implantes biomdicos


A Martinelli 1, M C Novoa 2, C Oldani 3, A Corominas 4 Laboratorio de Materiales y Tecnologa, Facultad de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales, Universidad Nacional de Crdoba, Crdoba, Argentina agnese.martinelli.85@gmail.com, cele_novoa@yahoo.com.ar, coldani@efn.uncor.edu, corobiomat@gmail.com
Resumen. El propsito de este trabajo consiste en el estudio, obtencin y caracterizacin de hidroxiapatita. Este es un cermico de alta biocompatibilidad que posibilita su uso en variadas aplicaciones mdicas. La hidroxiapatita (HA) es un fosfato de calcio con una composicin qumica muy similar a la del hueso humano, lo cual la hace biocompatible con los tejidos vivos. Las fuentes de obtencin de la hidroxiapatita que se van a utilizar son dos de origen natural, y una obtenida qumicamente. A las naturales (hueso de vaca y hueso humano) se le realiz un tratamiento trmico a fin de eliminar el componente orgnico del hueso, aislando una matriz mineral y cristalina. En tanto que, la tercera opcin de obtencin, fue una reaccin qumica a base de nitrato de calcio y fosfato de amonio, que dio como resultado un fosfato de calcio, al cual se someti luego, a tratamientos trmicos para conseguir el grado de cristalinidad requerido. A fin de caracterizar las muestras, y comprobar la cristalinidad de las mismas, se requiri de tcnicas de Difraccin de Rayos X. Las muestras se molieron y se tamizaron para obtener distintas granulometras que luego fueron sometidas a procesos de sinterizado. Se analiz las caractersticas de los poros obtenidos para relacionarlos con la osteointegracin, mediante microfotografa y software de captura digital, con calibracin del orden de magnitud de inters.

Palabras claves: fosfato de calcio, cristalinidad, osteointegracin

1. Introduccin La hidroxiapatita (HA), es un fosfato de calcio cuya frmula corresponde a: Ca10 (PO4)6(OH) 2con una relacin molar (Ca\P)=1.67. Pertenece a una familia de minerales denominados Apatitos. La HA presenta carcter inico, y su estructura cristalina puede describirse como un empaquetamiento hexagonal compacto de tomos de oxigeno con los metales ocupando los huecos tetradricos y octadricos de la red peridica as formada [1].
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Pasante de Laboratorio de Materiales y Tecnologa Pasante de Laboratorio de Materiales y Tecnologa 3 Jefe de Ctedra de Biomateriales, Laboratorio de Materiales y Tecnologa 4 Jefe de Trabajos Prcticos de Ctedra de Biomateriales, Laboratorio de Materiales y Tecnologa

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El inters de la hidroxiapatita como biomaterial viene dado por su similitud con la fase mineral del tejido seo. En principio, sera el material idneo tanto para restauracin como sustitucin sea si no fuera por su baja resistencia mecnica [2], incluso en forma de compactos densos. As, pues, su uso se restringe a todas aquellas aplicaciones donde no se requieran esfuerzos mecnicos, encontrando su ms amplio campo de aplicacin actualmente como recubrimiento de substratos metlicos [3], al objeto de acelerar e incrementar la fijacin de las prtesis al hueso. Otras aplicaciones son: a) recubrimiento en prtesis dentales y maxilofaciales; b) implantes dentales; c) otorrinolaringologa; d) aumento de la cresta alveolar; e) defectos periodentales; f) reconstruccin maxilofacial; g) ciruga espinal: h) recubrimientos pulpares, etc. [4] Existen diferentes formas de obtener hidroxiapatita, puede ser a partir de corales marinos, por calcinacin de huesos o sintticamente [5, 7,13]. Para la produccin sinttica de HA, puede suministrarse la fuente de calcio en forma de soluciones acuosas de: CaCL2, Ca (NO3)2, CaCO3 o Ca (CH3COO)2 y como fuentes de fosfatos pueden emplearse soluciones acuosas de (NH4)2HPO4, NH4H2PO4, KHPO4, N2HPO4, o NaH2PO4. Rodrguez y col. [14], describieron el proceso para producir HA sinttica por el mtodo de precipitacin continua, a travs de la utilizacin de fosfato de amonio y nitrato de calcio altamente purificados, obtenindose un material con caractersticas microestructurales apropiadas y propiedades osteoconductivas. La HA sinttica porosa tiene una estructura compuesta por calcio, fosforo e iones hidroxilo (Ca10 (PO4)6(OH)2) compatible con los tejidos vivos y tiene una estructura similar al hueso; es estril, osteoconductiva (acta como un andamio dirigiendo el crecimiento de capilares, tejido perivascular y clulas desde el hueso y tejidos blandos circundantes hacia el interior del injerto) y posee una excelente osteointegracin. La HA se relaciona con el hueso circundante de una manera estrecha y estable tanto qumica como fsicamente, permitiendo as que los procesos de reparacin se desarrollen como si se tratara de dos tejidos seos en estrecho contacto [5,6,9]. La seguridad y efectividad de la HA han sido confirmadas en experimentos animales y en un amplio rango de campos clnicos, como ya fueron mencionados, la ciruga plstica, la ciruga ortopdica, la neurociruga y la ciruga oral/maxilofacial [8,10 ,13]. Como objetivos del presente trabajo, nos proponemos profundizar los conocimientos en la hidroxiapatita como Biocermico de numerosas aplicaciones mdicas, que van desde el recubrimiento de prtesis metlicas hasta su uso como sustituto seo, por su similitud con la matriz sea humana. Nos interesa definir las fuentes de obtencin de la HA, comparar las propiedades de las muestras obtenidas por los distintos mtodos, analizar la va de acceso ms conveniente en trminos no solo mecnicos sino tambin econmicos y de disponibilidad del biomaterial. 2. Desarrollo Experimental 2.1 Sntesis y caracterizacin de HA sinttica La reaccin base para su obtencin por la va del nitrato de calcio/ fosfato de amonio es: 10 Ca (NO3)2.4H2O + 6 NH4H2PO4 + 14 NH4OH Ca10 (PO4)6(OH)2 +20 NH4NO3 + 52 H2O. Se utilizaron reactivos analticos y de acuerdo con su peso molecular se calcularon las cantidades estequiomtricas. Se utilizaron 23.5 g de nitrato de calcio y 7 g de fosfato de amonio. 2.1.2 Preparacin de la solucin de nitrato de calcio Para la disolucin del nitrato de calcio se utiliz un agitador mecnico a 110 r.p.m de aspas de acero inoxidable, utilizando recipientes de plstico, con el fin de evitar contaminacin metlica, provistos de tapa perforada para evitar contaminacin del ambiente. Se disolvieron 23.5 g de Ca (NO3)2 en 550 ml de H2O destilada. Seguidamente se adicionaron 62.5 ml de NH4OH y por ltimo se agreg H 2O destilada hasta alcanzar un volumen total de 1800 ml [11].

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2.1.3 Preparacin de la solucin de fosfato de amonio Se siguieron los mismos parmetros de agitacin que en el procedimiento anterior, se tomaron 7 g de NH4H2PO4, se diluyeron en 850 ml de H2O destilada. Luego se adicionaron 37.5 ml de amonaco (NH4OH). Se ajustaron 3000 ml de volumen total con H2O destilada. 2.1.4 Procedimiento de reaccin Se adicion el fosfato de amonio sobre el nitrato de calcio a una tasa de 3000 ml/h, por medio de una manguera de caucho, con agitacin por 24 horas y seguida de reposo por el mismo tiempo para una decantacin del sobrenadante. Posterior a ello se realizaron 2 lavados con H2O destilada con agitacin durante 18 horas. Finalmente se le hizo una separacin slido-lquido mediante centrifugacin. 2.1.5 Tratamiento trmico La HA obtenida fue secada a 110C durante 2.5 horas y posteriormente llevada a 1050C durante idntico periodo de tiempo. De este modo con la alta temperatura alcanzada en el proceso, se proporciona cristalinidad a la HA. 2.2 Obtencin de HA de fuentes naturales 2.2.1Materiales Hemos trabajado con vertebras humanas y huesos largos (de pata y ossobuco) de vaca. 2.2.2 Tratamiento trmico El objetivo de someter a las muestras seas de origen animal y humano a un tratamiento trmico es el de eliminar el componente orgnico de las piezas, para de este modo aislar la matriz mineral de inters para el presente estudio. Para el proceso utilizamos un estufa elctrica tipo muffla, con el cual alcanzamos la temperatura de 850 C con una meseta en la rampa de calentamiento de 2.5 horas. 2.3 Caracterizacin de la HA 2.3.1 Difraccin de Rayos X (DRX) Su aplicacin fundamental, es la identificacin cualitativa de la composicin mineralgica de una muestra cristalina. La difraccin est basada en las interferencias pticas que se producen cuando una radiacin monocromtica atraviesa una rendija de espesor comparable a la longitud de onda de la radiacin. Se realiz la correlacin para identificar por DRX los posibles tipos de fosfatos de calcio, asociados a la HA e identificar esas fases mineralgicas en microfotografas tomadas con luz polarizada. La identificacin por DRX (el equipo utilizado fue un Panalytical X'Pert Pro, equipado con tubo de Cu de longitud de onda de 1.5406 angstrom) se realiz con la correlacin de los tres picos principales en el diagrama de la muestra con los estndares internacionales que se encuentran en la Figura 1. La Hidroxiapatita presenta tres picos caractersticos que son de nuestro inters, stos se producen en 2 = 32, 32,5 y 33 correspondientes a los planos (211), (112) y (300) 2 = 26, 46,5 y 49 correspondientes a los planos (002), (222) y (213) 2 = 34 y 39,5 para los planos (202) y (310) respectivamente.

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Figura 1. DRX Estndar Internacional Hidroxiapatita 3. Procesamiento mecnico 3.1 Molienda y tamizado de Hidroxiapatita Para realizar la molienda de la Hidroxiapatita Sinttica, se utiliz un Mortero de gata manual. Para el caso de la Hidroxiapatita obtenida de Vaca, empleamos un Molino de Barras, a velocidad constante de 163 rpm durante el lapso de una hora. Los productos obtenidos, se tamizaron separadamente en un Set de Tamices de abertura en orden decreciente de 177m, 125m, 88m, y 44m. 3.2 Sinterizado Fabricacin de la muestra en verde: Definimos una cantidad de muestra para la fabricacin de las pastillas de 0.5 gr, con el objetivo de obtener una compresin lo ms homognea posible. Utilizamos una Matriz de compresin prismtica con un vstago de seccin 8 mm. Con el objetivo de controlar la porosidad de las muestras, incorporamos bicarbonato de amonio con granulometra de +125 m para generar los poros de inters. Por lo tanto, para las pastillas fabricadas con HA y el agente generador de poros, respetamos los mismos pesos finales, adicionando una proporcin al 20% y al 50% de bicarbonato. Es decir masas de hidroxiapatita de 0.4gr. y 0.25 gr respectivamente. En cuanto a los dimetros adecuados de poro para el crecimiento del tejido, en la literatura existe una diversidad de conceptos. Segn lo reportado por algunos autores los poros deben tener mnimo 50 m, mientras que otros reportan que deben estar entre 250-300 m. Sinha y col. [15] realizaron una clasificacin de la reaccin del tejido segn el tamao del poro del material implantado, as: Poros menores de 10 m evitan el ingreso de clulas, poros entre 10 y 50 m permiten la penetracin de tejido fibrovascular, poros entre 50 y 150 m permiten la penetracin sea y poros mayores de 150 m permiten la penetracin y la formacin sea. Adems, la penetracin de tejido seo slo es posible si los poros se encuentran interconectados, pero si son ciegos esto no es posible. A fin de encontrar una temperatura ptima de sinterizado, fuimos escalando los valores y los tiempos de tratamiento, de 500C, 750, y 1050C, y en cuanto a la duracin desde una hora hasta 2,5 horas. Para examinar las estructuras formadas en las muestras, y verificar su sinterizado, se utiliz una lupa Konus modelo Diamond 5420. Las fotografas fueron tomadas con una cmara digital MOTICAM 2300 de 3.0 mega pixeles, adaptada en la lente del microscopio y de la lupa.

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4. Resultados y Discusin 4.1 Difraccin de RX La grfica de los parmetros obtenidos de la DRX en las tres muestras (de origen humano, animal y sinttico), se muestran a continuacin, en la cual destacamos, la existencia en todas ellas, la presencia de los tres picos esperables de la Hidroxiapatita en los ngulos precisos de la HA de alta pureza. En la Figura 2, se encuentran los picos de HA humana en los ngulos 2 = 26, 33, 40, 47 y 50.

Figura 2. HA Humana En la Figura 3, observamos los picos de HA de vaca en los ngulos 2 = 26, 33, 40, 47 y 49.

Figura 3. HA de vaca

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Por ltimo, en la Figura 4, se hallan los picos de HA sinttica en los ngulos 2 = 26, 33, 40, 47 y 49.

Figura 4. HA Sinttica Hemos indagado en la bibliografa [16] cules son las temperaturas ptimas para obtener los mejores grados de cristalizacin de nuestra muestra sinttica. En la Figura 5. se observan las variaciones de las DRX a diferentes tratamientos trmicos. Las temperaturas en las que se producen los picos mximos son entre 950-1050C.

Figura 5. Difraccin de rayos X para las muestras de HA a diferentes tratamientos trmicos.

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A continuacin, en la Figura 6, se encuentra el diagrama de DRX realizado a la muestra de HA sinttica luego de su secado a 120C, y previo al tratamiento de cristalinizacin a 950C. Es evidente que a la temperatura de secado la muestra an se encuentra amorfa.

Figura 6. HA Sinttica previo al tratamiento trmico de cristalinizacin 4.2 Sinterizado Observamos en la Figura 7, que slo a temperaturas de 1050C obtuvimos el sinterizado completo de las pastillas, con una duracin mnima de 2, 5 horas.

Figura 7. HA sinttica a 1050C . 4.3 Porosidad Con respecto a nuestro anlisis de porosidad, la cual denotamos por su importancia en lo referente a osteoconduccin y osteointegracin, hemos obtenido tamaos de poros del orden de 50 a 200m, los cuales permitiran en principio, el crecimiento celular de los osteocitos y la vascularizacin del

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material implantado, mejorando la fijacin e integracin al cuerpo humano. En la Figura 8, observamos los tamaos de poro en un pastilla de HA sinttica al 50% de dopado.

Figura 8. HA sinttica al 50% de dopado

5. Conclusiones De cara a la dificultad que existe en la actualidad para la obtencin de hidroxiapatita en el mercado nacional, este trabajo intenta ofrecer una solucin de abastecimiento local de buena calidad. Hoy en da la HA se comercializa en Argentina solo a travs de la importacin de otros pases, donde si tiene lugar su sintetizado. Es frecuente el uso de un sustituto seo utilizado para relleno y de origen humano proveniente de un banco de huesos, que se comercializa segn normas de control de calidad y de serologa, en distintas presentaciones. Este ltimo, si es producido en nuestro pas, y nos referimos en nuestro caso en particular al que comercializa el Laboratorio de Hemoderivados de la UNC. No es un dato menor, la cuestin de los altos costos que poseen estos materiales, sean por la procedencia extranjera, o bien por los procesos que se deben aplicar para garantizar la calidad y seguridad higinica que requiere todo producto implantable en el cuerpo humano. Sin olvidar, que la falta de oferta de proveedores de este producto, condiciona tambin su valor. Referencias [1] Williams, R. A. D. y Elliot J. C. Bioqumica dental bsica y aplicada. El Manual Moderno. Mxico. ISBN0-443-03144-4. p. 316.

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[2] Rincn M, Rodrguez A, Londoo M.E, Echevarra A. Fabricacin y caracterizacin de una matriz tridimensional de hidroxiapatita macroporosa para aplicacin en ingeniera de tejidos oseos. Revista EIA 7, p.87-95 .2007. [3] Vallet Reg M, Munuera L. Biomateriales aqu y ahora. Ed Dykinson ,2000. [4] Sastre Roberto; De Aza Salvador; San Roman Julio.CYTED. Biomateriales. Programa Iberoamericano de ciencia y tecnologa para el desarrollo. [5] Ayers R, Simske S, Nunes C, Wolford L. Longterm bone ingrowth and residual microhardness of porous block hydroxyapatite implants in humans. J Oral Maxilofacial Surg, 1998; 56: 297-1301. [6] Cornell C, Lane JM. Newest factors in fracture healing. Clinical Orthop and Related Research. 1992; 277:297 311. [7] Hemmerl J, Cuisinier G, Schultz P, Voegel C. HRTEM Study of biological crystal growth mechanisms in the vicinity of implanted synthetic hydroxyapatite crystals. J Dental Research. 1997; 76(2):682-687. [8] Kitsugi T, Yamamuro T, Takeuchi H, Ono M. Bonding behavior of three types of hydroxyapatite with different sintering temperatures implanted in bone. Clinical Orthop and Related Research. 1988; 234:280-290. [9] Mik T, Imai Y. Osteoinductive potencial of freezed - dried, biodegradable, poly (glicolic acid - colactic acid) disks incorporated with bone morphogenetic protein in skull defects of rats. Int J Oral and Maxilofacial Surgery, 1996; 25: 402 406. [10] Ono Ichiro, Tateshita T, Satou M, Sasaki T, Matsumoto M, et al. Treatment of large complex cranial bone defects by using hydroxyapatite ceramic implants. Plastic and Reconstructive Surgery. 1999; 104(2): 339-349. [11] Riao C, Echevarra A, Ramrez G, Escobar I, Cardona J, et al. Caractersticas osteoconductoras de la hidroxiapatita sinttica y la derivada de corales marinos injertadas en conejos. Anlisis descriptivo. Rev. Col. Cienc. Pec. 1999; 12: 97 107. [12] Teraoka K, Ito A, Maekawa K, Onuma K, Tateishi T, et al. Mechanical properties of hydroxyapatite and OH-Carbonated hydroxyapatite single crystals. J Dent Res. 1998; 77(7): 1560 1568. [13] Yoshida K. Osteoinduction capability of recombinant human bone morphogenetic protein- 2 in intramuscular and subcutaneous sites: an experimental study. J Cranio-Maxillofacial Surg. 1998; 26(2): 112-5. [14] Rodrguez R, Gmez J, Torrent J, Boix T, Fraile J . Precipitation of stoichiometric hydroxyapatite by a continuous method. Cryst Res Technol. 2001; 36(1): 15-26. [15] Sinha D, Basu P. Poruos hydroxyapatite ceramic and its clinical applications. Interceramic. Vol. 49. 2000. pp. 102-105. [16] Londoo M.E, Echevarra A, De La Calle F. Caractersticas cristaloqumicas de la hidroxiapatita sinttica tratada a diferentes temperaturas. Revista EIA 5, p.109-118 .2006.