226LABORATORIODEANATOMIAPATOLOGICA 1.INTRODUCCIONALESTUDIOHISTOOUIMICODELOSHIDRATOS DECARBONO Loshidratosdecarbonooglcidossonpolialcoholesoxidados(polihidroxialdehdosypolihdroxicetonas)queestn compuestosporcarbono,oxgenoehidrgeno,estosdosenidnticaproporcinaladelagua,esdecir2:1.Estaltimacondicin noestotalmenteindispensablepuestoquealgunassustanciasseclasificanhoydacomohidratosdecarbonoenausenciadeeiiay enbaseasuparecidoestructuraiconstos. Lospolisacridossonglcidosdemolculamuyvoluminosa,formadaporlacondensacindemuchasmolculasde monosacridos(msdediez),coniacorrespondienteprdidademolculasdeaguayconstituyenelgrupodehidratosdecarbono demayorintersparaeltcnicodelaboratorio.Entreellos,y ademsdelospolisacrdossimplescomoelglucgeno,destacanlosdoscompleios. 2.POLISACAFIIDOSCOMPLEJOS Sesubdividenentresgrandesgrupos:mucopolisacridos,mucoprotenasymucolpdos. 2.1.

Mucopoiisacridos Losmucopolisacridospuedendividirseendosgrupos: MUCOPOLISACARIDOSNEUTROS Constituidosporunazcar(generalmentegalactosa)yacetilglucosamina,queconfrecuenciasehaHanunidosaunaproteina formandoglucoprotenasomucoprotenas.EstassustanciassonPASpositivasy,porloanteriormenteexpuesto,secomportande manerasemejantealasmucoprotenas. MUCOPOLISCAFIIDOSACIDOS Porhidrlisisoriginansiempre,ademsdemonosacrdos,hexosaminas(glcidosaminados),avecescidournico (monosacridoconungrupocarboxlicoenposicin6:cidogucurnico,cidogalacturnico,etc.)ycasisiemprecidosulfricoo fosfrico,Elmucopolisacrdocidomssimpleese!cidohialurnico(fig.13.1),queconstadeunidadesdedisacrido polimerizadas(cidoDglucurnicoyNacetilglucoamna). Losmucoposacrdoscidos(MPA)seclasifican,asuvez,en:a)MPAsencillos,carboxmucopolisacridoso mucopolisacridosnosulfatados,yb)MPAcomplejososulfatados(sulfomucopoisacridos). a)Mucopolisacridoscidosnosulfatados (carboximucopolisacridos) Entreellosdebendiferenciarse: Carboximucopo/isacrfdosepite/ia/esosia/omucinas,ricasencidoslicocomoradicalencombinacinconlosgrupos carboxlicospropios.Casi todasellas:lahialuron'napH2.5,serentealanl_Carboxr'muepuedenCorrnicoson vos,reaccicdelhierroc Distincinyuaruuxm

ISTOQUIMICADEHIDRATOSDECARBONOOGLUCIDOS227 Figura13.1'.Frmuladelcidohialurnico. todasellassonlbilesfrentea laneuraminidasayresistentesa laaccin dela hialuronidasa.Adems sonPASpositivas,reaccionan conelazulalcinapH2.5,setienconelmtododelhierrocoloidalysonmetacromticasfrentealazuldetoluidina. Carboximucopo/isacridoscon/untivos,ricosencidohexurnicoyque puedencontenercidosilico.PorsuelevadaproporcindecidohialurnicosonIbilesfrentealahialuronidasa.Todosellosson PASnegativos,reaccionanfrentealazulalcinapH2.5,secoloreanconelmtododelhierrocoloidalysonmetacromticosfrente alazuldetoludina. b)Mucopolisacridoscidossulfatados(sulfomucopolisacridos) AIigualqueloscarboximucopolisacridos,puedendividirseen:a)epiteliales(sulfomucinasepiteliales),yb)conjuntivos. _ Mucopo/isacridos cidos su/fatados epite/ia/es. Contienen steressulfav tadosyson resistentes ala accindelahialuronidasa. Selocalizanenlasglndulassalivaressubmandibularesyenlasclulascaliciformesdelcolon. Este grupo de sulfomucopolisacridos es por lo general PAS negativo, reacciona frente al azul alcin a pH 1, se tie con la fucsinaaldehdoyesmetacromticofrentealazuldetoluidina. Mucopo/isacrdos cidos su/fatados con/untivos. Contienen cidos glucurnicos sulfatados como el codrotnsulfato, heparinsulfato y queratosulfato. Los ricos en condrotinsulfato son Ibiles frente a ia hialuronidasa, mientras que losquenolo contienenresistensuaccin. Estegrupodemucopolisacridoseselqueposeeunmayorcarctercidoascomolamselevadaproporcinderadicales sulfatos,localizndoseelectvamenteeneltejidocartilaginoso,vlvulascardacas,aortaypiel.Engeneral.sonPASnegativos, reaccionanconelazulalcinapH0.5,secoloreanconelhierrocoloidalyfucsinaaldehldoysonmetacromticosfrentealazulde toluidina. c)Distincinentresulfomucopolisacridos ycarboximucopolisacridos Puederealizarsegenricamentepormetilacinysaponificacin. Lametilacinconsisteenbloquearlosgruposcidossulfatadosycarboxiladospordesulfatacinyesterificacin, respectivamente,conIacorrespondienteprdidadelatincindelazulalcin. Lasaponificacindeshacelaesterificacinenloscarboximucopolisacridos

228LABORATORIODEANATOMIAPATOLOGICA restaurandoIacoloracinconazulalcin,mientrasquelossulfomucopolisacridosnosecolorean. 2.2.Mucoprotenas Son complejos de proteinas y polisacridos en los que predomina el primer componente. Son similaresalas glucoproteinas, perosediferencianensumayorcontenidodehexosamina(superioraI4por100). Estetipodesustancias,quesuelenasociarse,puedenserhalladasenclulasbetadelahpfisis,membranasbasales,rticulina yfibrasdecolgena.TodasellassonPASpositivasynoexperimentanmetacromasiafrentealazuldetoluidina. 2.3.Mucolipidos Sonunamezcladepolisacridosycidosgrasoscomplejosqueseencuentrannormalmenteenformadecerebrsidosy ganglisidos.SuelenserPASpositivosysetienselectivamenteconciertascoloraconesparagrasas. 3.REACCIONESHISTOQUIMICASBASADASENLA DEMOSTRACIONDEGRUPOSCARBONILOFORMADOSSOBRELOSHIDRATOS_DECARBONOPOR OXIDACIONPREVIA:TECNICASDELPASYDELAPLATAMETENAMINA 3.1.ReaccindePAS(PeriodicAcidSchiff) Eslareaccinmscomnmenteutilizadaendebidoaque: a)Esdeampliaaplicacineneldiagnsticohistopatolgicorutinario. b)Puedecolorearnumerososcomponentesbioqumicos(hidratosdeca'r bonoosustanciasrelacionadasconellos). c)Siendounareaccinpocoespecfica,puedeconvertirseenenorme menteselectivamedianteloscorrespondientescontroles. Estatcnicafuedescubierta,deformaindependienteyprcticamentesimultnea,porHotchkiss.McManusyLillie(1948). FUNDAMENTODELAREACCIONDELPAS Consiste en oxidar los tejidos mediante el cido peridico para incrementar el nmero de grupos carbonilos (aldehdos o cetonas)presentesenellos,deformaquepuedanserdemostradosposteriormentemedianteelreactivodeSchiff. Loshidratosdecarbonocontienengruposcarbonilosrelativamenteaislados.enunaproporcinaproximadadeunopor molculademonosacrido.Precisamenteporelloesnecesariooxidarlosconelfindeincrementardichosgrupos.queslopueden serdetectadosporelreactivodeSchiffsiseencuentransituadosencarbonoscontiguosydelimitadosporgruposalcohlicoso amino.

=ara los grupos aldehdosque aparecenenposicin1,2glicolestascondiciones5ecumplen exclusivamentetras laoxidacin delos correspondientesradicaiesi'::roxi|o. Elagenteoxidanteesgeneralmenteelcidoperidico,aunqueenalgunavariantepuedeutilizarseelcidocrmico. ReactivodeSchiff Se obtiene a partir de la fucsina bsica, la cual es tratada concidosulfuroso. hace desaparecerundobleenlace existenteen el centrodelamolcula,lansformndoseenunasustanciaincoloracidosulfofucsnlcooreactivodeE:hiff(fig.13.2). NH, Figura13.2.FrmuladelreactivpdeSchiff. Cuando el reactivo de Schiff reacciona con dos grupos aldehdicos contiguos Hanqueados por los correspondientesradicales OH,aparecedenuevoeIdobleenlace(grupocromforo)y,conl,lacoloracinrojofucsiacaracteristica. Mediante estudios de espectrofotometra se ha podido concluir que, para un correcto desarrollo de_la reaccin, esnecesario que ambos grupos aldehidos se encuentren a una distancia cifrada entre 1 y 1.1 nm, similar a 1a que separa a los cos radicales bencnicosdeIafucsina. PROCEDIMIENTOTECNICO Fijacin:formoltamponadoal10por100,lquidodeCarnoyuliquidodeBouin. Soluciones: a)Acidoperidicoal0.5por100. b)ReactivodeSchiff: Puedeadquirirsecomercialmenteofabricarsesegnelsiguienteprocedimiento: Fucsinabsica(61.42510)1gnAQuadestila1nda...................................200|'I1L

230LABORATORIODEANATOMlAPATOLOGICA' Llevarhastaebullicin'elaguadestiladayaadirlafucsina.Disolveryenfriara50C,filtraryaadir: Metabisulfatosdicoanhdro......................19Acidoclorhdrco20mL Dejarenreposo24horas(lasolucindebetomaruncolorrosaplido)yfiltraratravsdecarbnactivado,locualdebe decolOrarla. Almacenarenrefrigerador. c)Baodocidosulfuroso: Acidoclorhdrico1NSmLMetabisulfitosdicoal10por100BmLAguadestilada...................................100mL d]HematoxilinadoHarris. Mododeoperar: Desparafinarehidratar, Acidoperydcoal0.5por100,5minutos. Lavadoenaguadestilada. ReactivedeSchiff,15a30minutos. Aclararentrescambiosdebaosulfuroso.2minutosencadauno.Lavarenaguacorrientedurante5minutos. HematoxilinadeHarris,30l60segundos. Lavarenaguacorrientedurante5minutos. Deshidratar,aclararymontar. Resultados _NcleosAzul lMaten'alPASpositivo..........Rojooscuroamagenta{.fucsina) COMPUESTOSPAS(+) Polisacridossimples:glucgeno,celulosa,etc. 2.Mucopolisacridosneutros(fig.13.3,veasepginasencolor):pre sentessobretodoenglndulasdeBrunnerdelduodeno,epiteliogstricoycpsulasbacterianas.l. 3.Mucoprotenas,queincluyen:ciertasmucinasdeltubodigestivoydel rbolrespiratorioobronquial,tiroglobulina,TSH,gonadotrofi'nas,cuerposdeRusselldelasclulasplasmticasy megacarioctos. 4.Glucoprotenasdelsuero,membranabasal(fig.13.4, nasenyfibrasderetiulina. 5.Glucolipidoscomoganglisidosycerebrsidos.l 6*Determnadospigmentos,comopigmentoceroideyciertasIipofuc SInaS. COMPUESTOSPAS()'OUE,SINEMBARGO,SONHIDRATOSDECARBONO Mucopolisacridoscidos:quetienenbloqueadoslosenlaces1ly2glicolporgruposo*COOHynopuedenseroxidadospor elcidoperidico.

IISTOOUIMICADEHIDRATOSDECARBONOOGLUCIDOS231 COLORACIONESDECONTRASTE Sondiversas: 1.Siseesperaunresultadodbilmentepositivodelatcnica,seutilizar uncontrastecitoplsmcoconamarillodeMarsobienelsimplecontrastenuclearconhematoxilinadeHarris. 2.Siseesperaunresultadofuertementepositivo,podrcolorearsecon azuldetoluidina,picrocarmndendigooverdedemetilo. CONTROLESDELATECNICADELPAS ComopuedecomprobarseenlosresultadosdelatcnicadelPAS,suespecilcidadesrelativay,portanto,esimprescindible realizarpreparacionestestigoo:iecontrolqueconfirmenlosresultadosobtenidos.Paraellosuelensermuytileslastcnicasde bloqueo,talescomoladelbloqueodegruposaldehidosengeneralyladeacetilacinespecificaparagrupos12glicol. a)Tcryiadebloqueoparagruposaldehdosengeneral Serealizatratandolosgruposaldehdospresenteseneltejido,traslaoxidacinconcidoperydico,conunasol'ucnal5por 100decidoacticosaturadocondimedona(5,5'dimetil1,3ciclohexadona)entre1y16horasa60QC,paraseguirconlavadode lapreparacinconaguadestiladaycontinuarconeIPASnormal.UnicamenteseteirelmaterialPASpositivoformadoa expensasdegruposaldehdossituadosenposicin12glicol. b)Tcnicadebloqueomedianteacetilacinparagrupos1.2glicol Se fundamenta en Ia negatividad de la reaccin del PAS despus de la acetiiacin de los grupos 1,2 glicol presentes en los hidratosdecarbono. Esteproceso es totaloparcialmentereversibleporsaponificacinulterior mediante tratamientocon hidrxido potsico. Si no se ha realizadoelbloqueo delosgrupoaldehldospreexistentes comohabitualmenteocurreenlaprcticadiaria,elprimer problema que Se plantea en esta tcnica es la posibilidad de reacciones falsamente positivas debidas a la existencia de dichos grupos. Entalcasodeberealizarseuncontrolnooxidandoeltejidotodolocoloredoenestapreparacinnosernenlaces1.2glicol oxidados,sinogruposaldehdosqueyaestabanpresentesantesdelaoxidacin.DespusserealizaunPASoxldandoyse comparanlosresultadosdeambaspreparaciones. ElsegundoproblemaenlatcnicadelPASseplanteacuandosetratadedilerenciarsilosgruposaldehdosaparecidostrasla oxidacinlohanhechosobregruposalcohlicossituadosenposicin1,2glicolosilosoxidadoshansidogruposhidroxiamino primarios,hidroxiaminosecundarioseinclusohidroxicetonasnopresenteshabitualmenteenloshidratosdecarbonoquesonPAS positivos.Estadistincinpuederealizarsemedianteacetilacinreversibleysaponificacin. O IIAcetilaresintroducirunradicalacetiloCH3CCenuncompuesto orgnico.Elanhdridoacticoesunreactivoquetienegranaplicacinparaacetilar,

232LABORATORIODEANATOMIAPATOLOGICA deformaqueconestereactivosebloqueantodoslosgruposalcohlicosengeneralexistenteseneltejido. La reaccin se lleva a cabo frecuentemente en piridina, por lo que la mezcla ms usada para acetilaein contiene ambas sustancias(anhdridoacticoypiridinaanhidra). Saponificaresromperunenlacedetiposterdeformaqueencondicionesidneasreaparezcaelgrupoqumicoqueexista antesdelaacetilacin. Deloexpuestosededucequelaacetilacinestotalmentereversibletrassaponificacinparalosgruposalcohlicosen posicin1,2glicol,totalmenteirreversibleparalosgruposhidroxiaminosecundariosymoderadamentereversiparalos hidroxiaminoprimarios. 'IETILACIONSAPONIFICACION PROCEDIMIENTOTECNICO 1.Mezclaparalaacetilacin:_ Anhdridoaclco13mLPiridinaanhidra..................................20mL 2.Mezclaparalasaponificacn.' Hidrxdopotsco1Nensolucinacuosaoenalcoholde30".obien: Alcoholde95'IGmLAmonaco20mLAguadeslilada...........................'........10mL Mododeoperar: a]Aceti/:cin: 1.Desparafinar.introducirloscortesenalcoholabsoluto,secarosypasarlos alapridina. 2.Tratarcon1amezcladeacetilacin.a3758C.duranteuntiempoque dependedelmateria!biolgico(30minutosa24horas). 3.Pasarloscortesalapridinadespus,alalcoholabsoluto. 4.Hdrmar. b)Acetiacinsaponficacin: 1a4.Igualqueenelcasoanterior.

*STOQUIMICADEHIDRATOSDECARBONOOGLUCIDOS233 LotesdepreparacionesyresultadosenloscontrolesdelatcnicadelPAS 1.PreparacinenlaqueserealizaunPASnormal. 2. Preparacin en la que se hace un PAS sin oxidar para deteccin de grupos aldehdos preexistentes o un mtodo de boqueo especificoparadichosgrupos. 3.Unlotedeconesquellevasloacetilacin(negatividaddeloscompuestos PAS[+1), 4.Unlotedecortesquellevaacetilacinmssaponifcacin. Resultados: Alaceti/ardesaparecentodoslosgruposPASmenoslosa/dehdospreexistentes. Alacetilerysapam'fcar,losgruposalcohlicosenposicin1,2glicofquedancomo,agotan(recuperanlaPASpositividad). loshidroxiaminoprimariosreaparecenIuchomsdebi/menteylossecundariaspermanecenbloqueadosalsersu acetilacnirreversible. 3,2.Tcnicadeiaplatametenamina Radica reduccin que sobre las sales complejas de plata realizan los radicales carboniloformadosporoxidacin previa delos hidratosdecarbono,deformaquelaplatametlicaobtenidaprecipitasobreiasestructurasquesevanateir. Comoagentesoxidantesseempleanelcidocrmicoyelcidoperydicoque,comoessabido,oxidanexclusivamentelos enaces1,2ysimilares. La sal de plata para reducir es ei complejo metenamina argntica, que es inestable yslos'emantienecomotalapHalcalino entre8.3y9.2fueradestesedisociaensusdoscomponentes:hexametilenotetraminaeionesdeplata. Portodoello,latcnicadeberealizarseconuncontrolcontinuodepH,demodoquelaprecipitacindelaplatamtalicano ocurraanticipadamente. Por sus caractersticas especiales, est tcnica se emplea para visualizar membranas basa/es, sobre todo en el rin {glomeru|onefritis),compuestasen granmedidaporhidratosdecarbonodel tipoglucoprotenasyque,portanto,sonademsPAS positivas.

234 LABORATORIODEANATOMIAPATOLOGICA PROCEDIMIENTOTECNICO 1.2. Fillcin:formo!tamponadoal1l)por100. Soiuciones: Acidoperydicodel0.5al1por100enaguadestilada.Solucindeplatametonamina(frmuladeGomori): a)Hexametilenotetraminaal3por100enaguadestiada.b)Nitratodeplataal5por100enaguadestilada.c)Boratodesodioal5 por100enaguadestilada. Solucnconcentrdadeplatametenamna: :sta solucin debe preparano en este orden para evitar iaformacinde precipitados.Cuando se mezcla lasolucinA conla B seformaunprecipitadoquedesaparecefcilmenteporagitacin. _Solucindiluidaodettabalodeplatametenarnina: Solucinconcentrada25mLAguadest|ada..............._................25mL ElpHdelasolucindebeseralcalino,de8.5aproximadamente` Clorurodeoroal0.2por100enaguadestilada.Timulfatosdicoai2por100enaguadestada. Mododaoperar: 1.Desparainarehidratarloscorteshastaelaguadestilada. 2.concidoperydicodurante20minutos. 3.Laval'conaguadestilada,tresbaosconsecutivosde2minutoscadauno.4.incubalenlasolucindiiuidadeplatametenamina, durante2horasa60C,hastaqueloscortestenganuncolorpardoamarillento.Sedebencontroiaralmicroscopioloscortescada 15minutospasadalaprimeramediahoradeincubacin.5.Lavarconaguadesiiiada,tresbaosconsecutivosde2minutoscada uno.6.Tratarloscortesconclorurodeorode20segundosa1minuto.7.Lavarenaguadestilada.B.Fijarcontiosulfatosdicode 3a5minutos.9.Lavarenaguadestilada. 10.Realizarcontrastenuclear. 11.Lavarenaguadestilada.12.Deshidratar,aclararymontar. Resultados GmcgenmmucnasNegro_HongosNegraMembranasbasatesffig735)Negra Fr'brasdereticufinayelsticasNegra

ISTOQUIMICADEH\DRATOSDECARBONOOGLUClDOS235 Figura13.5.Identificacindemembranasbasalesaniveilubulalyencapilaresglomeruiaresrenalesmediantelatcnicadeplata metenamina 4.TECNICASPARADETERMINARMUCOPOUSACAFIIDOSACIDOS Losmucopolisacridoscidos(MPSA)sonunavariantedepolisacridosquenocontienengruposalcohlicosenposicin1,2 giicol,sinogruposcidoscarboxlicososulfatados.Estehecholosdiferenciadelosmucopolisacridosneutros(MPSN)con gruposhidroxiloenposicin1,2glicolyque,porconsiguiente,sonPAS(+). REACCIONESGENERALESPARADETERMINARMPSACIDOS Sonprincipalmentetres: a)TcnicadelhidratodehierrocoloidaldeHale.b)Tcnicadeazulalcin.c)Reaccinmetacromtca. 4.1.TcnicadelhidratadehierrocoloidadeHale Es una tcnica hstoqumica ntroducida por Hale en 1946. En su pnmera parte, especfica de esta tcnica, se liga el hierro frrico alosmucopolisacridoscidosmedianteunmecanismo deatraccinelectrosttica.Lasegundaparte,histoqumca,consiste enlarealizacinsucesivadelatcnicadelazuldePerlsparaelreveladodelosdepsitosfrrcos. El reactivo principal de la tcnica es el hidrato de hierro coloidal, que puede adquirirse en el comercio o ser preparado enel laboratorioapartirdesolucindeclorurofrricoal29por100.' Estereactivoesuncolodericoenmolculasdeagualigadaquehidratana losionesferrcos(Fe+++)envirtuddelcarcterligeramentedipolardelaprimera.