CAPTULO VII

CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES BOVINOS VITRIFICACION

Autores: Prof. Clara larocca. DMV, MSC. Prof. Alvaro Fernndez Area de Biotecnologa de la Reproduccin Animal Facultad de Veterinaria Universidad de la Repblica Uruguay

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INTRODUCCIN

La criopreservacin, mal llamada congelacin de embriones, es un simple paso de la fase lquida a slida que ha adquirido importancia por tres motivos: 12El hecho de que no hay siempre disponibilidad de receptoras. La posibilidad de comercializar embriones congelados a grandes distancias.

3- La libre importacin de embriones que se ha establecido en el Uruguay. Existen dos elementos importantes a tener en cuenta en el metabolismo del embrin: 1) El embrin tiene un contenido de agua del 80%. 2) Su membrana semipermeable, permite que reaccione a las diferencias de las concentraciones osmticas en el medio que el embrin se encuentra. Por ejemplo tenemos un blastocisto excelente y lo sometemos a un proceso de congelacin ultrarpido (de temperatura de laboratorio directamente a nitrgeno lquido), debido al alto contenido de agua en su interior, hay cristalizacin y muerte de la unidad embrionaria como tal. Si lo sometemos a un proceso ultralento (con una disminucin lenta de temperatura hasta -40 o -50 C, tambin se produce muerte celular debido al llamado EFECTO SOLUCION, cuando el embrin se congela lentamente en el medio extracelular hay cristalizacin. El cristal de hielo se comporta como secuestro de agua, en el medio extracelular aumenta la concentracin del mismo y el embrin reacciona perdiendo agua para equilibrar, como esta deshidratacin es tan brusca, se produce la muerte embrionaria. Hay sustancias o agentes en la naturaleza, que tienen la propiedad de disminuir (no eliminar), la accin deletrea del efecto solucin cuando sometemos al embrin a una disminucin lenta de temperatura; son los llamados agentes crioprotectores. Habitualmente los embriones congelados son descongelados y evaluados luego de la remocin de la sustancia crioprotectora antes de ser transferidos. Debemos tener en cuenta que para someter a los embriones a las diferentes tcnicas de criopreservacin estos deben ser mrulas compactas o blastocistos de buena o excelente calidad (entre los das 6 y 8).

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Foto 1a: Mrula compacta calidad excelente.

Foto 1b: Blastocisto expandido de calidad buena. En los ltimos aos se han desarrollado sistemas ms simples que permiten la transferencia directa de los embriones descongelados sin extraerlos de la pajuela en la que han sido congelados, en forma similar al procedimiento de inseminacin artificial (Leibo 1984, 1986; Massip y Van der Zwalmen, 1984; Massip y col., 1987; Suzuki y col.; 1990;

154 Voelkel y Hu, 1992; Dochi y col. 1995). Por otro lado, el mtodo de vitrificacin, an en experimentacin, permite la preservacin de los embriones a travs de una extrema elevacin de la viscosidad con altas concentraciones de sustancias crioprotectoras que solidifican sin permitir la formacin de cristales de hielo intracelular. Este mtodo tiene la ventaja de que no es necesario utilizar congeladores automticos programables (Ishimori, H. Y col. 1992). Se pueden esperar altas tasas de gestacin cuando los embriones bovinos son mantenidos a temperatura de laboratorio durante 12 a 18 horas antes de ser transferidos; no as cuando los embriones son mantenidos a temperatura de laboratorio durante 4 a 6 horas antes de la congelacin, debido a que luego de la descongelacin las tasas de sobrevivencia disminuyen notablemente. Si los embriones son recuperados para ser sometidos a la criopreservacin, estos tienen que ser procesados lo ms temprano posible posterior a la coleccin, o refrigerados hasta que sea posible congelarlos. (Manual IETS, 1998)

AGENTES CRIO - PROTECTORES

Los agentes crioprotectores se dividen en: A) Permeables: Glicerol - DMSO - Etilenglicol, son los ms utilizados en rumiantes. El glicerol y el DMSO deben ser removidos de los embriones antes de ser transferidos (Jackowsky y col.,1980 ;Schneider y col,1983). Szll y col. (1989) comunicaron que para embriones bovinos y ovinos el etilenglicol tiene un coeficiente de permeabilidad mayor que el glicerol. Voelkel y Hu (1992) encontraron que la viabilidad en cultivo luego de la descongelacin fue mayor para embriones congelados por etilenglicol 1,5M y rehidratados directamente en PBS suplementado con albmina srica bovina, fraccin V respecto a embriones congelados con glicerol 1,4 M, y DMSO 1,5M. Accin: - Reducen el efecto solucin. - Reducen la cristalizacin intracelular. Condiciones: para actuar deben permanecer en fase lquida cuando la temperatura disminuye. No deben cristalizar cuando se formen los primeros cristales de hielo en el medio extracelular. B) No permeables: Sucrosa (sacarosa), el ms utilizado en rumiantes. Modifican el balance osmtico del embrin. (Leibo,1984)

155 Condiciones: La concentracin est en el rango de 0,5 a 2 M. Son efectivos en congelacin lenta controlada. Son efectivos en la congelacin rpida. La utilizacin de agentes crioprotectores es una condicin imprescindible para el xito de la tcnica. Otro factor clave es la deshidratacin, la cual no es completa. En funcin de los diferentes grados de deshidratacin, se clasifican las tcnicas de criopreservacin: 1) Mtodo Convencional - Impide la cristalizacin extracelular mediante un proceso de enfriamiento lento y controlado. - Una vez que el embrin est parcialmente deshidratado se sumerge en N2 lquido. Metodologa: Se realiza en varios pasos con distintas concentraciones de glicerol (G). Protocolo: CONGELACION 1- Adicin a una solucin de Dulbecco buffer modificado (PBS) de G a 1,36M, durante 15 minutos a temperatura ambiente de laboratorio. 2- Aspiracin de cada embrin en pajuelas de 0.25 ml (IMV; Francia). El embrin est en la columna central de solucin de PBS - G. La pajuela tendr tres columnas separadas por burbujas de aire, 2 solamente de solucin y la central con el embrin en la solucin crioprotectora. 3- Se enfran las pajuelas a 7C. 4- Induccin manual de cristales de hielo, en el medio extracelular (seeding, tocando la pajuela con un forceps previamente enfriado en nitrgeno lquido); esta operacin se realiza a -7C, manteniendo las pajuelas 10 minutos a esa temperatura para permitir el equilibrio de las soluciones.

Foto2. Seeding

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5- Se desciende la temperatura a una velocidad de 0,3C/min. hasta llegar a 35 C. 6- Luego las pajuelas se sumergen directamente en N2 lquido. Curva Programada de Congelacin de Embriones Seeding

20C -7C

-0.3C/min. hasta 30C

-30C

-196C

10 minutos

92 minutos

Otra forma de congelar embriones es el mtodo manual, que consiste en procurar imitar la curva de descenso de temperatura mediante dispositivos manuales (no automticos). Los mtodos pueden basarse en el descenso de un dispositivo especial en la boca del termo, o en el ascenso controlado de un recipiente con N2 lquido.

Foto 3.

Mtodo manual de congelacin en boca de bistato.

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Foto 4. Sistema manual de congelacin de embriones

DESCONGELACION 1) Se descongelan las pajuelas al aire a la temperatura de laboratorio, pero no menor de 25C. 2) Se extrae el glicerol pipeteando con pipeta Pasteur afinada, los embriones en una solucin de PBS con Sucrosa 1M durante 15 minutos. 3) Se efectan 3 lavados de los embriones en PBS ms 10% de suero fetal bovino (FCS,Gibco-Ontario, CANADA) con penicilina y estreptomicina (100.000 U.I.100mg respectivamente; SIGMA, USA). 4) Con un microscopio estereoscpico se realiza la evaluacin y clasificacin de los embriones. 5) Se aspira cada embrin transferible en una pajuela en la columna central de solucin crioprotectora, separada de las otras por pequeas burbujas de aire (3-4 mm) y se deja pronta para el implante. 6) Se realiza el implante no quirrgico en hembras receptoras sincronizadas respecto al estado de desarrollo del embrin.

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2) Mtodo de Leibo

Es un mtodo de transferencia directa, similar al del etilenglicol. A travs de este mtodo se evita toda tcnica de manipulacin del embrin en el laboratorio. Su objetivo final es transferir la pajuela directamente despus de su descongelacin. Se realiza la extraccin del glicerol dentro de la propia pajuela mezclando las columnas mediante un pequeo golpe con los dedos en las burbujas de aire o agitndolas, por lo tanto no se usa lupa y ponemos la pajuela directamente en la pistola para implantar. Tiene la desventaja de disminuir los porcentajes de gestacin a un 30%, en tanto que con el otro sistema es del 45 al 50%.

Ventajas: - no utiliza lupa. - transferencia similar a la inseminacin artificial. - practicable a condiciones de campo. Tcnica: Se carga la pajuela con una gran columna de PBS - Sucrosa 1,08 M, luego una pequea columna de aire seguida de otra columna de con PBS - Glicerol con el embrin, burbuja de aire y una pequea de PBS - Glicerol 1,5 M.

Disposicin de las columnas en mtodo de Leibo

Tapn

PBS-Sucrosa 1.08

PBS-Glic.

PBS-Glic.

Cuando la pajuela est descongelada, la sacudimos para mezclar las columnas y la ponemos boca abajo (tapn hacia abajo) para que el embrin descienda. Abajo queda la sucrosa y arriba el glicerol, el embrin queda en contacto con PBS - Sucrosa y pierde el

159 glicerol que tiene en su interior. Se debe dejar 20 minutos para que se realice el proceso. La rehidratacin se da directamente en el tero, que le aporta agua.

3) Mtodo con Etilenglicol (EG)

La utilizacin del etilenglicol como crioprotector es una alternativa prctica. Este posee un alto coeficiente de permeabilidad celular de tal forma que los embriones despus de descongelada la pajuela se implantan directamente, por tanto no existe la expansin por sobrehidratacin con posterior muerte embrionaria que se observa en el caso del glicerol o del DMSO. La posibilidad de estandarizar un mtodo de criopreservacin con una tasa aceptable de gestacin, que permita transferir los embriones congelados directamente a las receptoras luego de la descongelacin constituira sin duda alguna en el mtodo de eleccin universal.

Protocolo CONGELACION 1- Se coloca el embrin en una solucin de PBS - EG1,5 M directamente con 10 minutos de equilibracin a temperatura de laboratorio. 2- Incorporacin de los embriones en pajuelas de 0,25 ml de manera que quede una columna de PBS - EG separada de 2 columnas de PBS isotnico a travs de 2 pequeas burbujas de aire. Aire PBS Isotnico Aire PBS - Isotnico

Algodn

Embrin en PBS - EG

Sellado A.P.

3- Inmersin de las pajuelas directamente a 7C utilizando un congelador de embriones programable automtica con metanol como medio refrigerante. 4- Induccin manual de cristales de hielo en el medio extracelular (seeding) a -7C

160 manteniendo 10 minutos a esa temperatura para permitir el equilibrio de las soluciones. 5- Descenso de la temperatura a una velocidad de 0,3C/min hasta alcanzar los 30C. 6- Se equilibra 15 minutos. 7- Se sumerge la pajuela en N2 lquido. DESCONGELACION A) se descongela la pajuela a bao mara a 30C durante 20 segundos. B) Se realiza la transferencia por el mtodo no quirrgico inmediatamente en receptoras sincronizadas al estado del desarrollo del embrin a implantar. No deben pasar ms de 10 minutos entre la descongelacin de la pajuela y el implante en la receptora. El mximo es 20 minutos, debido a que el Etilenglicol es ms txico que el Glicerol. Son de destacar los resultados de nuestro laboratorio (Larocca y col., 1997).

4) Mtodo de Vitrificacin

Es un mtodo que todava se encuentra en fase de investigacin a pesar de que se han reportado algunos resultados aceptables en la tasa de gestacin en el bovino. En nuestro laboratorio el Dr. Ignacio Lago logr en 1998 la primera gestacin con un embrin bovino obtenido in vivo y vitrificado - descongelado. Este mtodo tiene como ventajas: la transferencia directa sin remocin del crioprotector as como la vitrificacin, han abierto grandes posibilidades de expansin de la transferencia de embriones en condiciones de campo. permite as mismo la utilizacin racional de las receptoras, independizando el momento de la colecta de los embriones del momento de la transferencia. desarrollar un sistema de criopreservacin alternativo, simple, de bajo costo y aplicable en nuestras condiciones de campo, adquiere la mayor importancia.

Expondremos algunos posibles protocolos de vitrificacin (V):

161 PROTOCOLO 1

Se utilizar una solucin de vitrificacin (SV) que consiste en un 25% (v/v) etilenglicol y 25% (v/v) de DMSO en mPBS, suplementada con 4 mg/ml de albmina srica bovina (BSA),(Ishimori y col., 1992). Los embriones sern equilibrados en una dilucin al 5% de SV en mPBS durante 1 minuto y luego estarn en la solucin SV en una pajuela (un embrin por pajuela) por 30 segundos a temperatura ambiente (20 a 25 C). Las pajuelas luego sern colocadas en vapores de N2 lquido, del lado del algodn, durante dos minutos y despus sumergidas en N2 lquido. Para la descongelacin en este mtodo las pajuelas se colocarn en agua a 20C por 20 segundos. Se cortarn los extremos de la pajuela y el embrin ser colocado en una caja de petri que contiene una solucin de sucrosa 0,5M en PBS por 5 minutos. Luego sern lavados al menos tres veces en PBS y sern transferidos a las receptoras cuyos celos fueron sincronizados con el estado de desarrollo del embrin.

PROTOCOLO 2

Este mtodo pretende combinar los beneficios de la vitrificacin con los de la transferencia directa. La pajuela debe ser preparada previo a cargar el embrin: Se carga con una columna de PBS y se congela colocando la pajuela en el congelador programable con metanol a 25C. Luego 10 l de la solucin de vitrificacin, conteniendo el embrin, ser inyectada con una pipeta de vidrio afinada en el espacio que dejamos al final de la pajuela, el cual fue equilibrado en una dilucin al 50% de la solucin de vitrificacin en PBS por uno a dos minutos., La pajuela se sella con un tapn plstico y se enfra en vapor de N2 lquido otros 2 minutos y luego es sumergida en N2 lquido. Para la descongelacin las pajuelas se pondrn en agua a 20C durante 15 segundos, luego se mantiene en forma vertical en aire durante 5 minutos con el tapn de plstico hacia arriba permitiendo que se unan las soluciones. La pajuelas sern transferidas directamente a las vacas receptoras.

PROTOCOLO 3

Se utilizan 3 soluciones (SV1, SV2 y SV3):

162 Glicerol 10% 10% 20% Etilenglicol 10% 20% Sucrosa 0.1 M 0.2 M 0.3 M Xylosa 0.1 M 0.2 M 0.3 M PEG(w/v) 1% 2% 3%

VS1 VS2 VS3

PEG: Polietilenglicol M.W. = 8,000 Diluido en D-PBS

Las manipulaciones se realizan a temperatura ambiente ( 20C). En la solucin SV1 los embriones se equilibran durante 5 minutos, 5 minutos en la SV2 y 1 minuto en la SV3.

VS1 5 min.

VS2 5 min.

VS3 1 min.

N2L

Cargado de la pajuela: Antes de la equilibracin la pajuela debe ser preparada con una columna de 1cm de solucin de sucrosa en solucin de PBS separada por una pequea burbuja de aire de otra columna de 5 a 6 mm de la solucin anterior, separada a su vez por otra pequea burbuja de aire de una columna de 5mm de la solucin de vitrificacin. Aire Algodn Introducido 5 mm Sucrosa 0,5 M Aire VS3

Sucrosa 0,5 M

Despus de la equilibracin del embrin, en la pajuela se aspira una columna de 10 a 15 mm de la SV3 conteniendo al embrin, la cual est separada por otra pequea burbuja de aire de 5mm de SV3, despus se dejan 7mm de aire y se sella la pajuela al calor.

Cargando al embrin: Embrin Sucrosa 0,5 M Sellado con calor Algodn Introducido 5 mm Sucrosa 0,5 M VS3 VS3

Aire 7 mm

Sellado con calor

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La pajuela se sumerge lentamente en N2 lquido del lado del algodn, cuando se ve que la columna de sucrosa en PBS est congelada, se sumerge ntegramente. Despus se transfieren las pajuelas a N2 Lquido.

Este es el mtodo de Osaito y Imai (NLBC, 1997).

DESCONGELACION Los embriones vitrificados almacenados en N2 lquido se depositan en bao mara a 20C durante 20 segundos. Despus que la columna con solucin de sucrosa se descongel, todo el contenido de la pajuela es descargado en una caja de petri; de esta manera el embrin queda automticamente expuesto a la solucin de sucrosa. La dilucin de los crioprotectores se realiza a temperatura de laboratorio (20 25C); en un primer paso se coloca el embrin en una solucin de sucrosa 0,5M en PBS + CS al 20% + Penicilina/estreptomicina ( SIGMA, USA), equilibrndose durante 5 minutos. En una segunda etapa el embrin se deposita en una solucin de sucrosa 0,25M en PBS + CS al 20%. Luego de esta operacin el embrin es lavado 2 o 3 veces en PBS + CS al 10%, se aspira en una pajuela y se transfiere a una receptora.

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ANEXO: VITRIFICACIN DE EMBRIONES

Ignacio Lago, DMV

INTRODUCCIN La criopreservacin de embriones y gametos ha recibido durante la segunda mitad del siglo XX considerable atencin. Desde el descubrimiento de las propiedades crioprotectoras del glicerol (Polge y col, 1952), se han producido notables avances en criobiologa (Rall,W.F. 1992). Para el caso concreto de la criopreservacin de embriones la historia es an ms reciente empezando hace unos 30 aos con la comunicacin por parte de Whittingham y col.(1972) de la primera congelacin exitosa de embriones mamferos en nitrgeno lquido con la produccin del primer nacimiento. A travs del manejo de la temperatura de almacenamiento (-196C para el nitrgeno lquido) los investigadores se planteaban la posibilidad de reducir el metabolismo a un punto de suspensin reversible que posibilitaba la conservacin de material gentico. (Kasai M., 1997). A partir de esta comunicacin se sucedieron muchos protocolos diferentes pero que compartan una estrategia comn, la congelacin de embriones se haba convertido en un proceso de deshidratacin controlada del embrin que evitaba la formacin de grandes cristales de hielo. Asimismo se ensayaron muchos crioprotectores diferentes, permeables y no permeables que en solucin acuosa colaboraban de una manera, que hasta el da de hoy no esta completamente aclarada, con la supervivencia del embrin. Formacin de cristales de hielo, efecto solucin, dao osmtico, dao por enfriamiento, toxicidad, son algunas de las dificultades que enfrenta la criobiologa cuando pretende congelar embriones por el mtodo tradicional o tambin conocido como slow freezing. En 1985 Rall y Fahy rompen con la hegemona del mtodo de slow freezing presentndole a la comunidad cientfica una nueva forma de plantearse el tema. Efectivamente estos autores comunican el empleo por primera vez en embriones de un mtodo conocido como VITRIFICACIN. Con este mtodo de buscaba conservar los embriones ya no controlando la formacin de los cristales de hielo grandes, sino directamente evitando la formacin de los mismos.

165 Representacin Esquemtica de los diferentes mtodos de criopreservacin.

equilibration +20C seeding -5-7C

a c
-25C

b
-40C

a
d d

a
-80C

-196C

et al. 1989

Esta comunicacin es sin lugar a dudas la comunicacin cientfica ms importante de este tema en los ltimos 15 aos, posiblemente junto con el empleo del Etilenglicol 1.5M (Voekel y Hu,1992) para la congelacin y transferencia directa de embriones. La vitrificacin puede ser definida como la solidificacin de una solucin por medio de un incremento extremo de la viscosidad sin cristalizacin. (Kasai M., 1997) En una solucin acuosa, vitrificacin significa solidificacin sin formacin de cristales de hielo, en tanto que congelacin significa formacin de hielo. En el cuadro 1 vemos de manera esquemtica las grandes fuentes de dao celular durante la criopreservacin de embriones y como se comportan cada uno de los dos mtodos mencionados. Cuadro 1. Riesgo de dao mayor durante la congelacin, la vitrificacin.
(Gabor Vajta, 1997)

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Dao Formacin de cristales de hielo Dao osmtico Dao Txico Dao por fractura Dao por enfriamiento +++= alto riesgo; += bajo riesgo. Congelacin +++ + + ++ +++ Vitrificacin +++ +++ ++ +

Queda claro que la Vitrificacin tiene la enorme ventaja de evitar completamente la formacin de cristales de hielo, sin embargo esto se logra cuando trabajamos con soluciones acuosas de crioprotectores de muy alta molaridad y esto trae como consecuencia que las posibilidades de dao osmtico y dao txico van a ser mayores con este mtodo. Esto ltimo ha influido poderosamente en la investigacin que sigui a la comunicacin de Rall y Fahy en 1985. Efectivamente si repasamos la bibliografa nos encontramos numerosos trabajos focalizados primero en encontrar la mezcla de crioprotectores ptima por su toxicidad (Ali y Shelton 1993,etc.) y en segundo lugar diferentes procedimientos, temperaturas etc. (Kasai et al, 1992) para agregar los embriones tratando de minimizar el dao osmtico. Como ejemplo, en muchos protocolos de vitrificacin los embriones se agregan a temperaturas de 4C tratando de manejar el coeficiente de permeabilidad y de esa forma controlar el flujo de lquido a travs de la membrana. Asimismo se utilizan mezclas de crioprotectores y de esa forma se reduce la concentracin de cada uno de ellos tratando de controlar la toxicidad. METODOLOGA. La vitrificacin tiene como una de sus caractersticas fundamentales el bajo costo del equipo empleado, bsicamente una lupa, una conservadora y nitrgeno lquido.(ver foto 1) A diferencia de esto la congelacin de embriones requiere el empleo de sistemas ms elaborados, computarizados muchos de ellos, y por ello ms costosos para controlar el descenso de la temperatura. Numerosos protocolos de vitrificacin han sido desarrollados en los pasados aos. Casi todos los grupos de investigacin en la materia tienen el suyo propio. Este hecho indica claramente que todava existen muchas dudas acerca de cmo opera esta metodologa.

Criopreservacin de Embriones por Vitrificacin

Dr. Ignacio Lago. Laboratorio de Transp. de Embriones y Biotecnologa.

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Foto 1

De todas formas existen algunos puntos cardinales en los que hay acuerdo a la hora de preparar una solucin de vitrificacin. Todas ellas deben al menos contener tres elementos: 1- Crioprotectores permeables ( EG, GLY, DMSO, etc), 2-Macromolculas (Ficoll 70, BSA, PEG, Percoll,etc) y 3- Pequeos Sacridos (Sucrosa, Trehalosa,etc) (M. Kasai 1997). Todas estas sustancias se agregan a una solucin salina bsica formando as la solucin de vitrificacin. Nuestro laboratorio de la Facultad de Veterinaria cuando incursion en este tema lo hizo con algunas premisas bsicas que nos orientaron en la eleccin del mtodo que pensbamos probar. Cualquier mtodo de criopreservacin de embriones que pretenda tener un lugar en produccin animal debe ser SIMPLE Esta caracterstica tiene que ver con la UNIVERSALIDAD del mtodo, entendiendo por esto que lo pueda aplicar la mayor cantidad de colegas posibles sin que para esto se requiera de un gran entrenamiento. Debe adems ser de BAJO COSTO, dado que la estructura de costos de nuestra pecuaria no soporta tecnologas muy onerosas mxime cuando los retornos no son rpidos. Por todo esto es que de los muchos protocolos disponibles y que escapan al objetivo de este material describirlos a cada uno de ellos, seleccionamos uno que se ajusta a las premisas que detallamos. Este mtodo es el mtodo desarrollado por el Dr. Massa Kuwayama de Japn (1997), que se caracteriza por ser un mtodo que permite la transferencia directa, es decir que una vez descongelado el embrin es transferido directamente a la receptora en el envase original.

METODO KUWAYAMA

Se utiliza una solucin de vitrificacin (SV) que consiste en 30% de Etilenglicol en TCM 199 suplementada con 20% CS, ATB y Sucrosa 1M. La pajuela en la que se cargar el embrin se prepara como se detalla a continuacin. Primero, cargar con las pajuelas con 1 1,5 ml de diluyente ( yema de huevo y sucrosa en TCM 199), luego 1 ml de aire y posteriormente 7ml de diluyente, para finalmente cargar sin separacin de aire 5 ml de solucin de vitrificacin. Una vez equilibrado el embrin por un pasaje de 10 minutos en la solucin de equilibracin ( 10% v/v de glicerol + 20% de CS (Suero de ternero) en TCM 199), el embrin es trasladado a la solucin de vitrificacin donde en menos de 1 minuto se carga en el extremo de la

168 pajuela se sella y arroja a Nitrgeno lquido en una conservadora. (ver figura 1)

Equilibration Sol. 10% Gly 10 min

Vitrification Sol.

Loading 30% EG + 1M Suc. Diluent 1 min 10% EY + 0.5M Suc.

LN 2

Warming Culture or ET
In StrawDilution
30 sec. RT air 8 sec. 37C water 8 sec

169 M. Kuwayama, 1997

Figura 1

El calentamiento ser a temperatura ambiente primero en aire por 8 seg. Y luego en agua a 37C por otros 6-8 segundos , para luego mantenerla verticalmente con el extremo del algodn hacia abajo durante 30 seg diluyendo de esta manera la SV. Finalmente se coloca en posicin horizontal y se carga la pistola de transferencia segn el procedimiento de rutina. (Ver figura 2)

Plug

VS

VS

After Warming In Straw Dilution

Figura 2

M. Kuwayama, 1997

Con este mtodo se obtuvo en 1999 el primer nacimiento por vitrificacin y transferencia directa en

170 el Uruguay. No conocemos de otra experiencia en Latinoamrica de combinacin de estas dos tecnologas con embriones bovinos que hallan dado lugar a nacimientos de terneros viables. (Ver foto 2)
Foto 2

OTROS METODOS DE VITRIFICACIN Como dijimos una de las caractersticas y a la vez de los requerimientos de la vitrificacin es el empleo de altas tasas de enfriamiento. Este punto tiene mucho que ver con el volumen de medio que acompaa al embrin en el momento de la vitrificacin y tambin con el tipo de envase que utilicemos. Hasta hace muy poco la mayora de los laboratorios empleaban la pajuela de 0.25 ml, lo que puede traducirse en tasas de enfriamiento de 2500 C/ min (Palasz and Mapletoft, 1996; Gabor Vajta, 1997). La velocidad de enfriamiento tiene que ver con la toxicidad del procedimiento, con el dao por enfriamiento, y la vitrificacin de la solucin. Un grupo de investigadores han buscado alternativas para el empleo de la pajuela francesa y han desarrollado tcnicas conocidas como Goteo Directo en Nitrgeno Lquido (Riha et al (1991) obteniendo resultados de preez con embriones bovinos in vivo de un 57.8%. En la misma lnea de trabajo Martino et al (1996) y Arav y Zeron (1997) utilizando gradillas de microscopios electrnicos en las que colocaban muy poco medio de vitrificacin junto con ovocitos obtuvieron tasas de enfriamiento de 11000 a 14000 y hasta 24000 grados centgrados por minuto. Gabor Vajta y col (1997) desarrollaron el mtodo de Open Pulled Straw (OPS) en el que estirando una pajuela de 0,25 obtenan dos medias pajuelas con uno de sus extremos afinados de manera que se reduce el volumen de medio de vitrificacin, mejorando la relacin superficie/volumen lo que favorece el intercambio de temperatura y adems se afina la pared del recipiente. Existe una experiencia de campo muy interesante con embriones bovinos desarrollada por el equipo del Dr. A.M. van Wagtendonk-de Leeuw. El protocolo se detalla en la Figura 3. Los resultados

171 obtenidos por este investigador indican que esta tecnologa esta ya en condiciones de ser aplicada comercialmente.

SLOW FREEZING (Gly 1.5M) vs VITRIFICACIN(SV3a, 6.5MGly+6%BSA (w/v) en PBS1 150 ESTABLECIMIENTOS %Preez Vitrificados: 44.5% (n=393) 6 TCNICOS %Preez Slow freezing 45.1% n=335) 728 EMBRIONES (morulas, blastocistos), G1-2

Figura 3

PROTOCOLO DE VITRIFICACIN.
0.5cm

SUC 1M
7.5cm

AI

VS3a

1 cm

PB1+6%BSA(w/v) PB1+1.625MGly+BSA 6%(w/v) 10-20 min, RT (20-25C)

PB1+4.2MGly+6%BSA (w/v) 1-1.25 min

N2 -196C N N

-170C,

A.M. van Wagtendonk-de Leeuw et al. Theriogenology, 1997

172 CALENTAMIENTO
AIR 10, 20-25C

WATER 20C

WATER 36C, 3 min

WATER 20C, 1 min

WATER 20C, 3-5 min

VITRIFICACIN DE EMBRIONES IN VITRO, BIOPSIADOS, CLONADOS Y OVOCITOS. Los mtodos convencionales de congelacin no han dado buenos resultados con los embriones producidos in vitro, lo mismo ha ocurrido con embriones in vivo de determinadas especies como los cerdos. La causa estara en un mayor contenido lipidico de estos embriones, as como tambin un macizo celular interno ms pequeo (Gabor Vajta, 1997; Iwasaki et al., 1990; Greve et al, 1993; Leibo and Loskutoff, 1993). Si bien los resultados in Vitro con vitrificacin han sido muy buenos, los porcentajes de preez una vez transferidos los embriones no han diferido entre los mtodos convencionales y la vitrificacin. (Hasler et al, 1995; Agca et al, 1996; Kuwayama et al, 1996). Ms investigacin se requiere para mejorar los protocolos de vitrificacin de manera que las ventajas obtenidas in vitro (tasas de reexpansin de hasta un 80 90%, y de eclosin muy buenas) se puedan ver reflejadas en todo el desarrollo del embrin. Muy buenos resultados in vitro se han obtenido con embriones micromanipulados (biopsiados clonados). (Vajta et al , 1997; Agca et al, 1995 ). Otra rea interesante de aplicacin para la vitrificacin es en la criopreservacin de estadios embrionarios tempranos en bovinos donde el dao por enfriamiento juega un papel muy importante. Finalmente debemos mencionar los gametos femeninos, los ovocitos. Este gameto representa uno de los mayores desafos para los criobilogos. Estos son particularmente difciles de criopreservar debido a: Una gran relacin volumen /superficie. Dao por enfriamiento Alteracin de la zona pelucida

173 Remocin de las clulas del cumulus El primer blastocisto , y el primer nacimiento obtenido de un ovocito criopreservado lo fue de uno congelado por los mtodos tradicionales (Lim et al, 1991,1992). Aunque inmediatamente despus le siguieron los reportes de suceso por vitrificacin (Hamano et al, 1992; Hamano and Kuwayama, 1992). Recientemente Rayos,-A.A y col. (1999) obtuvieron con una solucin de vitrificacin conteniendo solamente etilenglicol como crioprotector en una concentracin de 7.5 M un desarrollo a blastocistos de un 10 % que si bien fue inferior al grupo control es imortante. De todas formas no se ha podido hasta el momento obtener resultados consistentes con este tipo de material biolgico.

CONCLUSIONES La vitrificacin es la nica alternativa sostenible que ha aparecido para la congelacin de embriones y gametos. En primera instancia su bajo costo impulso a los investigadores a impulsarla llegando a obtener para los embriones in vivo resultados comparables a los obtenidos por congelacin (van Wagtendonk-de Leeuw et al, 1997). Esto no parece ser suficiente para una industria de embriones animales reacia a cambios que no reproten claros benecifios. Paralelamente los equipos de congelacin que aos atrs eran prohibitivos han ido bajando sus precios hasta dejar de convertirse en una limitante seria para los equipos de transferencia de embriones medianamente establecidos. Esto ha determinado que no haya habido un acompaamiento de la industria con la investigacin en el terreno de la vitrificacin. Sin embargo en la criopreservacin de gametas femeninas, as como de embriones micromanipulados de alguna forma (clonados, biopsiados, microinyectados) la congelacin tradicional no parece tener mucho ms para ofrecer y es ah tal vez donde la vitrificacin alienta al menos una esperanza de mejores resultados. Los resultados de embriones in vitro y micromanipulados muy buenos de cerca del 90% de sobrevivencia, (Gabor Vajta, 1997) parecen estar indicando esto.

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