INFORME DE LABORATORIO

1. TTULO: CROMATOGRAFA CAPA FINA DE CARDIOTONICOS DE LA

Digitalis purpurea L.(DIGITAL)

2. RESUMEN:
Los cardenlidos se pueden reconocer en muestras biolgicas mediante tcnicas tradicionales de separacin y purificacin como son la extraccin, filtracin y cromatografa de capa fina, se logr aislar y purificar dos metabolitos secundarios tipo glicsidos cardiotnicos, digitoxigenina, presentes en las hojas de la planta digitalis purpurea. La accin biolgica proviene de sus propiedades cardiotnicas descritas para este tipo de compuestos, lo convierten en una molcula de inters para el tratamiento de la insuficiencia cardaca congestiva.

3. ABSTRACT:
Cardenolidescan be recognizedin biological samplesusing traditional methodsof separation and purificationsuch asextraction, filtration andthin layer chromatography, it was possible to isolate andpurifytwosecondary metabolitestypecardiotonicglycosides, digitoxigenin, present in the leavesof the plantDigitalispurpurea.The biological actionpotentialarecardiotonic propertiesdescribed forthese compounds, make it aninterestingmoleculeforthe treatment ofcongestive heart failure.

4. INTRODUCCIN:
Los digitlicos constituyen un ejemplo de los cardenlicos extraordinariamente rico de la evolucin de la farmacologa y la teraputica de los ltimos 200 aos. Se pueden reconocer en muestras biolgicas mediante ensayos de coloracin con varios reactivos nitrogenados, especficamente con los reactivos de kedde, legal yraymond, tambin dan resultados positivos con el reactivo deliebermann-burchard; por otrolado, los carbohidratos ligados incluyen generalmente a la d-glucosa, l-rhamnosa ydesoxiazcares; estos ltimos pueden reconocerse mediante el ensayo dekeller-kiliani. Desde muy antiguo eran conocidos los efectos de la infusin de las hojas de una flor, la dedalera (Digitalis), tanto con fines medicinales como por sus efectos potencialmente venenosos. En 1785, Withering publica las primeras observaciones cientficas sobre su uso en pacientes que padecan de "hidropesia y otros trastornos". En esta primera publicacin, motivada por el uso popular de la planta y basada en la simple y rigurosa observacin de sus efectos, se establecen sus primeras indicaciones y se advierte de sus riesgos. Ms adelante se logra establecer que sus efectos farmacolgicos se deben al contenido de numerosos compuestos, que se denominan genricamente "glicsidos cardacos". Estos glicsidos tiene una estructura comn esteroidal, unida a una lactona y a una azcar. Se han aislado muchos glicsidos cardacos, todos ellos con propiedades farmacolgicas similares. Los ms utilizados son la digitoxina (obtenida de la Digitalis purpurea) y la digoxina (de la DigitalisLanata). FARMACOGNOSIA II Pgina 1

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GLICSIDOS CARDIOTNICOS Son sustancias constituidas CARDENOLIDOS. Un anillo de -lactona,insaturadaEsteroideGlicosdicaBUFANOLIDOS O ESCILANOLIDOS. Un anillo de -lactona-, insaturada,Actan sobre el msculo cardiaco (Insuficiencia cardiaca). BIOSINTESIS La progesterona formada se condensa con una unidad C2 para dar origen a una cadena lateral de 4 carbonos tpica de los cardenlidos.La posterior oxidacin y deshidratacin origina el anillo lactona,-insaturada.Posteriormente ocurre la glicosilacin. Hidroxilacin C22PregnelononaCOLESTEROLHidroxilacinProgesteronaOxidacinOxidacinReduccinMalonilCo AOxalacetilCoADigitoxigeninHidroxilacin3 ,14 ,21-trihidroxi-5 pregnan-20-one5Pregnan-3,20 dionaBufalin. Digoxina12-hidroxilacinDigitoxigenin16-hidroxilacinGitoxigenina5-hidroxilacin oxidacinBufalinHellebrigenina DISTRIBUCION NATURAL Principalmente en las hojas de plantas de las familias Scrofulariaceae, Apocynaceae, Liliaceae, Ranunculaceae y Moraceae.Los bufanlidos se han encontrado tambin en ranas del gnero Bufus, y en las alas de mariposas monarca, han sido considerados de inters por su potencial anticancergeno. ENSAYOS DE RECONOCIMIENTO Los cardenlidos se pueden reconocer en muestras biolgicas mediante los ensayos de coloracin con varios reactivos nitro, tal como se anot para las sesquiterpenlactonas; especficamente con los reactivos de Kedde, Legal y Raymond. Al igual que las saponinas esteroides, dan resultados positivos con el reactivo de Liebermann-Burchard, lo que permite diferenciarlos de las terpenlactonasy las cumarinas. ENSAYO DE KEDDE (PARA CARDIOTONICOS) Precaucin: La formacin del color violceo no dura sino algunos pocos segundos.Ensayo: Tomar 1 ml de la fase orgnica. Llevar a sequedad. Redisolver en 1 ml dealcohol. Aadir 0.5 ml de reactivo de Kedde recin preparado (Mezcla de partes igualesde las soluciones A y B). Se considera positiva la prueba si aparece una coloracinprpura o violcea. Como referencia se puede comparar con el color producido con 1ml de KOH al 5% en alcohol. HIDRLISIS y C-19

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Los glicsidos cardiotnicos se hidrolizan fcilmente en soluciones cidas liberando la sapogenina y los carbohidratos ligados. En medio alcalino, adems de liberarse la sapogenina ocurre la apertura del anillo lactnico. HECHOS ESTRUCTURALES Los cardiotnicos naturales en su gran mayora, poseen:Un anillo lactnicoa,-insaturado en posicin 17Un grupo hidroxilo o glicosilo en posicin 3Un grupo hidroxilo en posicin 14Configuracin cis entre los anillos A/B y C/DOtros grupos hidroxilo en 1, 5, 12, 16, etc.El grupo metilo 19 algunas veces oxidado hasta alcohol o aldehdo1 a 4 unidades de carbohidrato ligadas al oxgeno del carbono 3Los carbohidratos ligados son principalmente glucosa y desoxiazcarescomo digitoxosa, cimarosa, etc.Los desoxiazcares son una caracterstica importante de los glicsidos cardiotnicos, ya que esta clase de carbohidratos se encuentra prcticamente restringida a estas sustanciasnaturales. EXTRACCION Y AISLAMIENTO Al igual que las saponinas esteroides y otros glicsidosterpenoides, los cardiotnicos pueden aislarse en forma glicosdica o como sapogeninas.En el primer caso se utiliza el mtodo ya descrito para las saponinas esteroides (desengrase, extracto polar, resina de intercambio inico, Sephadexy cromatografa), mientras que en el segundo caso se realiza una hidrlisis cida seguida de particin con un solvente orgnico (generalmente cloroformo) y cromatografa en sus diferentes formas, especialmente con slica gel.Para el fraccionamiento por cromatografa en columna con slica gel pueden utilizarse mezclas de solventes con Diclorometano/Metanol/Agua 91:22:683.Luego de este fraccionamiento e hidrlisis cida, las geninas pueden analizarse y separarse por HPLC-fase reversa4,5,6,7; mientras que los carbohidratos ligados pueden analizarse por cromatografa en papel eluyendo con la mezcla Butanol/Acido Actico/Agua 4:1:58.Recientemente y gracias al avance de las denominadas tcnicas "on-line" y el desarrollo de interfaces HPLC-Espectrometra de masas se pueden analizar extractos crudos que contienen glicsidos cardiotnicos o saponinas, mediante tcnicas combinadas como LC-TMS (HPLC combinada con Espectrometra de masas con interfasetermospray) y LC-CF/FAB (HPLC combinada con Espectrometra de masas FAB de flujo continuo).

5. MATERIALES:
Probeta; se utiliza, sobre todo en anlisis qumico, para contener o medir volmenes de lquidos de una forma aproximada y suelen ser graduadas, es decir, llevan grabada una escala (por la parte exterior) que permite medir un determinado volumen, aunque sin mucha exactitud. Vaso precipitado; Tienen un campo de aplicacin muy extenso: se usan para preparar, disolver o calentar sustancias. Junto con el matraz, la probeta y los tubos de ensayo constituyen lo que se llama en el laboratorio Material de vidrio de uso general. Puede ir aforados o graduados, si bien su exactitud es menor que la de un matraz aforado o una probeta.Cuba de cromatografa;consiste en un recipiente de vidrio con tapa de cierre hermtico. Antes se tapa y se deja que el vapor del solvente sature la atmosfera interne del recipiente antes de introducir la placa cromatografa con la muestra. Estufa;La estufa de secado se emplea para esterilizaro secar el material de vidrio y metal utilizadoen los exmenes o pruebas, que realiza el laboratorioy que proviene de la seccin de lavado,donde se enva luego de ser usado enalgn procedimiento. La esterilizacin que seefecta en la estufa se denomina de calor secoy se realiza a 180 C durante 2 horas; lacristalera, al ser calentada por aire a altatemperatura, absorbe la humedad y eliminala posibilidad de que se FARMACOGNOSIA II Pgina 3

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mantenga cualquieractividad biolgica debido a las elevadastemperaturas y a los tiempos utilizados.Capilares;Tubo capilar, tubo de dimetro muy pequeo en el que se manifiestan fenmenos de capilaridad. Reactivos: Etanol: Es un disolventes polares prticos se caracteriza por tener un grupo funcional capaz de ceder protones (OH, NH, SH) y tiene la capacidad de formar puentes de hidrgenose utiliza ampliamente en muchos sectores industriales y en el sector farmacutico, como excipiente de algunos medicamentos y cosmticos (es el caso del alcohol antisptico 70 GL y en la elaboracin de ambientadores y perfumes). Tienes y tiene una densidad 0,789 g/mlEs un buen disolvente, y puede utilizarse como anticongelante. Tambin es un desinfectante. Su mayor potencial bactericida se obtiene a una concentracin de aproximadamente el 70%.Acetato de etilo: En el laboratorio, el acetato de etilo es comnmente usado en mezclas para cromatografa lquida y extraccin. Es un disolvente aprticos polares que se caracteriza por carecen de grupos funcionales capaces de ceder protones y constante dielctrica alta. El acetato de etilo es muy voltil y tiene un bajo punto de ebullicin. Debido a estas propiedades, puede recuperarse de una muestra por calentamiento de la misma en un bao de agua y ventilando con aire comprimido. Agua: El agua es habitualmente denominada el disolvente universal por la gran cantidad de sustancias sobre las que puede actuar como disolvente.

6. MTODO
Cromatografa de capa fina La separacin de mezclas de molculas mediante la cromatografa de capa fina se basa en el principio del reparto entre dos fases. En general, una cromatografa se realiza permitiendo que la mezcla de molculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase mvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a travs de sta para "lavar" (elur) a las molculas en la muestra. Debido a que las distintas molculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase mvil "lavar" a los distintos componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern eludos ms rpido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria. En la cromatografa de capa fina, la fase estacionaria es una delgada capa de un soporte slido granulado, tal como gel de slica, alumina, cido silcico u otros, que se depositan sobre una placa de vidrio, aluminio u otro soporte inerte. Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la capa de fase estacionaria se aglutina con una pequea cantidad de sulfato de calcio u otro agente cementante. Las muestras se aplican aadiendo pequeas gotas de solucin en un pequeo crculo cerca del extremo inferior de la placa. La gota se deja secar y si se desea poner ms muestra se pueden aplicar ms gotas, cuidando de que la mancha no se haga demasiado grande. La placa seca se sumerge en un pequeo volumen de fase mvil (mezcla de solventes). La polaridad dela mezcla de solventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestos que se desea separar. En cromatografa de capa fina la fase estacionaria est hidratada, por lo que se le considera como la fase polar. Como slo la base de la placa queda sumergida, el solvente comienza a mojar la fase estacionaria y asciende por capilaridad. Al recorrer la placa la fase mvil FARMACOGNOSIA II Pgina 4

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va arrastrando a las substancias apolares y aquellas ms polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar a la separacin. La placa desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tia a las substancias de inters. La movilidad relativa o Rfes la relacin entre la distancia recorrida por la mancha de un compuesto, divididapor la distancia recorrida por el frente de solvente al momento de sacar la placa del solvente. La tcnica de cromatografa en capa fina (TLC), entre otras cosas permite: Determinar el grado de pureza de un compuesto Comparar muestras Realizar el seguimiento de una reaccin Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografa de columna

Cromatografa en columna (por fase inversa): Esta es una cromatografa de interaccin en la que la fase estacionaria, con molculas hidrofbicas, interacta con molculas hidrofbicas en la muestra. La matriz consiste de fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos. Estas atraern a las molculas hidrofbicas de la muestra mientras que las hidroflicas salen con el amortiguador. Las molculas son eludas de la columna lavando con soluciones de distinta concentracin de alcohol o cualquier otro solvente no polar.

7. PROCEDIMIENTO:
Se realiz las mediciones en la placa cromatografa de 11x 5.5 dejando 1cm se marcan en dos separaciones. Luego se realiz la siembra de la extraccin del material vegetal y se deja secar en siembra. Fig. 1. cm cada

FIGURAN 1: Placa cromatografa de slica

Luego se llev a cabo la preparacin de la fase mvil :etanol, acetato de etilo, aguaen concentraciones (81:11:8) en una probeta se mezcla y luego se echa a la cuba cromatografa. Despus se llevo a secar a la estufa. Fig. 2.

FIGURAN 2: A la izquierda la preparacin de la fase mvil y a la derecha la placa cromatografa de slica gel en la cuba.

Revelador

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Obtenida la placa seca luego se procedercon el atomizador dejar expandir la vainillina en etanol y despus el acido sulfrico de la misma forma y se observara la presencia de cardiotnicos. Fig. 3.

FIGURAN 3: Arriba el atomizador con los reveladores y a la abajo la placa cromatografa ya revelada.

8. DISCUSIONE Y RESULTADOS:

En la Digitalis purpurea, la droga se constituye por las hojas desecadas, y los principios activos de esta son una mezcla de glicsidos cardiotnicos denominados purpure aglicsidos, en los cuales la sapogenina es la digitoxigenina. Para verificar la presencia del anillo esteroidal se realiz tambin una cromatografa en capa delgada, esta vez utilizando como revelador Vainillina, en este caso las manchas casi nocorrieron, sin embargo tanto para la D. purpurea como para la muestra patrn se observa un poco de desplazamiento y se obtiene un RF de 0.08, a diferencia de la primera cromatografa, en el revelado de la placa no se observan mas manchas, esto quiere decir que en las molculas del extracto trabajado solo tiene un tipo de anillo esteroidal y que adems este coincide con el del patrn utilizado Que siendo la placa silica polar las mancha obtenida de lanantosido tubo mayor afinidad,y la digoxina y gitoxin tienen mayor afinidad con el solvente.

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10.-RESULTADOS:

DIGOXINA QUE CONSTA DE UN RF =0.8

GITOXIN DE COLOR PURPURA CONSTA DE UN

RF=0.6

DIGITOXIN DE COLOR VIOLETA RF=0.57

GITOXINA DE COLOR VIOLETA TENIENDO UN RF= 0.4

LAANTOSIDE DE COLOR AZUL VILACE TENIENDO UN RF=0.2 DIGOXIN DE COLOR VIOLETA CLARO RF=0.34

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11.-CONCLUSIONES:

concluimos que la placa cromatografia despues de pasar por dicho proceso en el que obtubimos manchas de diferentes colores y asi dando a conocer la prescencia de digitalis por lo cual es un cardenolido muy importante . en el momento de revelar laplaca cromatografiaca con vainillina en acido sulfurico y vainillina en etanol debe ser necesario colocar a estufa para dar las manchas con mayor claridad. 12.-BIBLIOGRAFIA: http://es.scribd.com/doc/86166309/Glicosidos-Cardiotonicos http://farmacia.udea.edu.co/~ff/cardiotonicos.pdf

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