UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCINCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

DETERMINAO DA ATIVIDADE DA GLICOSE 6-FOSFATO DESIDROGENASE (G6PD) Teste da Reduo da Metahemoglobina (Teste de Brewer). I. OBJETIVOS 1. Compreender o papel das vias das pentoses no metabolismo. 2. Compreender as repercusses existentes na clula devido deficincia da G6PD. 3. Justificar a propenso hemlise em pessoas com deficincia de G6PD. 4. Compreender o mecanismo da herana ligada deficincia de G6PD. II. CONSIDERAES A hemcia uma clula cujo metabolismo energtico depende da utilizao de glicose, seja na via glicoltica ou na via das pentoses.. Na via glicoltica, h formao de ATP, a nvel de substrato, reduo de NAD (NADH) e cido pirvico; enquanto na via das pentoses, h formao de intermedirios de acares incluindo pentoses, tetroses, trioses ou mesmo recuperao de uma hexose, alm de formao de NADPH. O metabolismo da glicose, para formao de pentoses, pode ser considerado como sendo uma via ou um ciclo. No caso do ciclo, deve ser considerado como se ocorresse a entrada de 6 molculas de glicose, com liberao de 6 molculas de carbono e recuperao de 5 molculas de glicose, ao final do ciclo. As vias glicoltica e das pentoses compartilham intermedirios comuns, e a interao entre as duas varia de clula para clula, dependendo da necessidade metablica e da expresso dos genes. Por exemplo, nas hemcias o NADPH fundamental como agente protetor de membrana (via glutationa reduzida), enquanto nas clulas adiposas e nos hepatcitos o NADPH o agente redutor na biossntese de cidos graxos, alm do seu papel como agente protetor dos lipdios de membranas. A enzima G6PD codificada por um gene que sofreu mutaes ao longo do tempo. Essas mutaes resultaram em presena de mais de 300 variantes no mundo, portanto comum a existncia de pessoas com protenas com diferentes graus de atividade enzimtica devido a estas mudanas. III. A PRTICA Esta prtica tem como objetivo principal avaliar atividade da glicose 6 fosfato desidrogenase (G6PD), utilizando sangue perifrico de voluntrios. O sangue ser incubado em condies descritas abaixo. Ser avaliada a capacidade da G6PD de reverter o estado de oxidao da hemoglobina em presena de nitrito de sdio. Este teste foi baseado em trabalhos realizados por Dr. Brewer, durante a primeira guerra mundial, quando este mdico observou que alguns militares americanos, em uso de primaquina, desenvolviam anemia hemoltica. A investigao clnica demonstrou que essas pessoas apresentavam deficincia de G6PD. A qualidade do exame depende de rigor tcnico na sua execuo. A tcnica que avalia a atividade da G6PD depende de fatores diretamente relacionados com a ao enzimtica, incluindo temperatura, pH, substrato, tempo de incubao. O tempo mnimo de incubao do sangue deve ser de 3 horas, mantendo-se os tubos em temperatura a 37 C. IV. PRINCPIO A hemoglobina oxidada metahemoglobina pelo nitrito de sdio, em condio experimental. Em presena do corante azul de metileno, ocorre a reduo da metahemoglobina em hemoglobina, tendo o NADPH como o agente redutor. Eritrcitos maduros apresentam a via das Pentoses funcionante, com produo de NADPH. As clulas deficientes em G6PD produzem quantidades inadequadas de NADPH e a metahemoglobina no reduzida hemoglobina. V. EXECUO DA PRTICA E REAGENTES 1. Sangue: Colher com anticoagulante (tubo com EDTA, Heparina). 2. Soluo oxidante: 0,18 M de nitrito de sdio e 0,28 M de glicose. 3. Corante: Azul de metileno 0,0004 M. V. PROCEDIMENTO: Tubo 1 2 3 1. 2. 3. Sangue 2 mL 2 mL 2 mL Soluo oxidante 0 0,1 mL 0,1 mL Corante 0 0 0,1 mL

Aps adicionar os reagentes inverter os tubos 15 vezes. Incubar em banho-maria por 3 horas a 37C. Aps o perodo de incubao, transferir 0,1 mL de cada tubo incubado para um novo tubo de ensaio contendo 10 mL de gua destilada. Anotao dos resultados das coloraes

Atividade da glicose 6-fosfato desidrogenase 1 de 2_revisado por Selma M. B. Jeronimo 09-09-13

Tubo 1 2 3

Colorao

VI. INTERPRETAO 1. Pessoas com deficincia de G6PD apresentam 70% da hemoglobina como metahemoglobina aps incubao, enquanto pessoas sem alterao apresentam menos de 5%. Observar colorao. 2. Pessoas sem deficincia apresentam colorao vermelho-clara. 3. Pessoas heterozigotas para a mutao que resulta em deficincia da protena apresenta a colorao que varia de vermelho a marrom de acordo com o grau do defeito. VII. GUIA DE ESTUDO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Entender o papel do nitrito no teste realizado; Compreender o processo de hemlise aguda em pessoas que fazem uso de dapsona; Identificar os principais sintomas observados em pessoas com hemlise aguda como tambm em hemlise crnica; Entender a inter-relao entre as vias das pentoses e glicoltica, intermedirios comuns e diferenas na expresso de partes destas vias de acordo com as clulas em questo; Entender as principais vias metablicas na hemcia; Definir Herana ligada ao sexo; Compreender o significado de polimorfismo gentico e de expresso gnica. Compreender as tcnicas bioqumicas que podem identificar a existncia de polimorfismo gentico. Identificar as Inter-relaes entre as vias das pentoses e glicoltica (diagramas copiados do Lehninger, 4 edio).

Via Glicoltica

Via das pentoses

Atividade da glicose 6-fosfato desidrogenase 2 de 2_revisado por Selma M. B. Jeronimo 09-09-13