GENMICA

La genmica es el campo de la gentica que intenta comprender el contenido, la organizacin, la funcin y la evolucin de la informacin gentica contenidos en el genoma completo. Su principal objetivo de estudio es la caracterizacin molecular de los genomas completos. La genmica integra las disciplinas tradicionales: citologa, gentica

mendeliana, cuantitativa, molecular, de poblaciones y nuevas disciplinas como la bioinformtica. Para identificar y cartografiar de manera sistemtica todos los genes del genoma de un organismo se procedi a:

Identificar mutaciones espontneas o generar colecciones de mutantes usando agentes qumicos o fsicos. Generar mapas genticos mediante anlisis de ligamiento utilizando las cepas mutantes.

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Figura 1. Organismos modelo utilizados

para identificar mutaciones y generar mapas genticos: 1. Maz, 2. Drosophila,

3. E. coli, 4. Ratn y 5. Levadura.

Durante la dcada de 1980 los genetistas comenzaron a utilizar la tecnologa del ADN recombinante como una segunda aproximacin al anlisis gentico, cartografiando secuencias de ADN clonadas en cromosomas especficos. La mayor parte de estas secuencias no eran genes, sino marcadores como polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin (RFLP), polimorfismo de un nico nucletido (SNP) y otros. Una vez asignados a un cromosoma, estos marcadores se utilizaban en

rboles genealgicos para establecer un ligamiento entre los marcadores y enfermedades genticas. Este mtodo denominado clonacin posicional se utiliz para cartografiar, aislar, clonar y secuenciar los genes de distintas enfermedades. A mediados de 1980 ya se haban asignado ms de 3.500 genes y marcadores a cromosomas humanos. Actualmente se han secuenciado centenares de genomas de procariotas y eucariotas, y hay ms de mil proyectos en ejecucin.

La Genmica incluye diversos campos

Genmica Estructural Genmica Funcional Genmica Comparativa

La Genmica Estructural incluye la construccin de los datos de la secuencia del genoma, el descubrimiento de los genes y su localizacin y la construccin de mapas genticos. La Genmica Funcional estudia la funcin biolgica de los genes, su regulacin y sus productos. La Genmica Comparativa compara secuencias de genes y protenas de diferentes genomas para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas.

La Protemica es una extensin de la Genmica y su objetivo es el estudio de las protenas presentes en una clula, en un tejido, en un fluido en un momento dado bajo determinadas condiciones. Define el conjunto completo de protenas codificadas por un genoma. Incluye: Identificacin de todas las protenas expresadas en una clula bajo determinadas condiciones. La naturaleza y el alcance de cualquier modificacin pos-traduccional de las protenas. Las interacciones protena-protena. La localizacin subcelular de las protenas.

GENMICA ESTRUCTURAL

La Genmica estructural se ocupa de la secuenciacin y la comprensin del contenido del genoma. A menudo, uno de los primeros pasos en la caracterizacin de un genoma es preparar mapas genticos y fsicos de sus cromosomas. Estos mapas proporcionan informacin sobre las localizaciones relativas de genes, los marcadores moleculares y los segmentos cromosmicos, que suelen ser esenciales para posicionar los segmentos cromosmicos y alinear tramos del ADN secuenciado en una secuencia del genoma completo.

MAPAS GENTICOS

Los mapas genticos (mapas de ligamiento) proporcionan una aproximacin a grandes rasgos de las localizaciones de los genes en relacin con las de otros genes conocidos. Estos mapas se basan en la funcin gentica de recombinacin. Para la construccin de los mapas se cruzan individuos heterocigotos en dos o ms loci genticos y se determina la frecuencia de recombinacin mediante el examen de la progenie. Si la frecuencia de recombinacin entre dos loci es del 50%, entonces los loci estn ubicados en cromosomas diferentes o estn muy separados en el mismo cromosoma. Si la frecuencia de recombinacin es menos del 50%, los loci estn localizados muy prximos en el mismo cromosoma (pertenecen al mismo grupo de ligamiento). Para los genes ligados, la frecuencia de recombinacin es proporcional a la distancia fsica entre los loci. Las distancias son de en los mapas en

genticos porcentaje

medidas

recombinacin

(centimorgans, cM) o unidades de mapa (um).

Figura 2. Los mapas genticos se basan en la frecuencia de recombinacin.

Marcadores de ADN

Distancia en un mapa gentico

Durante muchos aos, los genes podan detectarse slo observando su influencia en un rasgo (fenotipo) y la construccin de mapas genticos estaba limitada por la disponibilidad de rasgos de un locus individual que podran examinarse por la evidencia de la recombinacin. Al final, esta limitacin se super con el desarrollo de tcnicas moleculares, como el anlisis de polimorfismos de la longitud del fragmento de restriccin, la reaccin en cadena de la polimerasa y la secuenciacin de ADN, mejorando los mapas genticos. Los mapas genticos tienen varias limitaciones, la primera es la baja resolucin o el detalle. Segundo, no siempre se corresponden con precisin a las distancias fsicas entre los genes. Los mapas genticos se basan en las tasas de

entrecruzamiento, que vara de una parte de un cromosoma a otro, de modo que las distancias de un mapa gentico son slo aproximaciones de distancias fsicas reales a lo largo de un cromosoma. A pesar de estas limitaciones, los mapas genticos han sido fundamentales para el desarrollo de los mapas fsicos y la secuenciacin de genomas completos.

MAPAS CITOGENTICOS

Los

mapas

citogenticos

cromosmicos constituyen una etapa intermedia entre los mapas genticos y los mapas fsicos.

Figura 3. Comparacin del mapa citogentico del cromosoma 1 del bfalo (BBU1) a la izquierda y la alineacin con la secuencia de montaje del

cromosoma 1 y 27 del bovino (BTA1 BTA27) a la derecha. Los marcadores comunes a ambos estn unidos por una lnea roja slida slida de color negro

o una lnea

(circulo). Las

lneas rojas

indican los marcadores que se orientan de forma secuencial pero invertida.

Con el avance de las tcnicas de bandeo cromosmico, la citogentica cuenta con una herramienta de mayor precisin en la individualizacin de los cromosomas, facilitando su agrupamiento y clasificacin morfolgica: la

determinacin de aberraciones cromosmicas de importante incidencia en animales. El estudio citogentico en animales domsticos se ha desarrollado

rpidamente en los ltimos aos. Hoy en da es utilizado como elemento de diagnstico que permiten detectar un gran nmero de patologas. A su vez el bandeo cromosmico, ha permitido precisar la localizacin de genes aportando informacin al mapa gentico. Por otro lado permiten realizar estudios evolutivos de especies relacionadas entre s. La construccin de los mapas citogenticos o cromosmicos se realizan utilizando tcnicas que no incluyen la reproduccin sexual (meiosis) y, por lo tanto, asignan una localizacin segn las regiones citogenticas (adems, estos mapas presentan la ventaja de no requerir del uso de marcadores polimrficos). Esas tcnicas son: Hibridacin in situ, Hbridos de clulas somticas y Hbridos de radiacin.

Hibridacin In Situ.

Cuando una secuencia de ADN, en este caso referida como una sonda de ADN (en ingls, probe), es marcada con istopos radioactivos o fluorescencia, podemos hibridarla con su secuencia complementaria en el ADN genmico de un cromosoma especfico y observar la marca directamente sobre el extendido cromosmico con un microscopio ptico. Las clulas deben estar fijas y los cromosomas esparcidos en un portaobjetos y expuestos a una solucin de pH elevado para romper el apareamiento de bases y permitir el acceso a las sondas. La hibridacin in situ fluorescente (FISH) es una tcnica muy sensible siempre que se cuente con sondas lo suficientemente grandes (y homlogas) y que se suprima la fluorescencia de fondo. La sensibilidad de esta variante de la tcnica de hibridacin in situ permite localizar una secuencia con una precisin de hasta 30 Mb y de detectar anormalidades cariotpicas en cromosomas metafsicos tanto como interfsicos. Los fluorocromos ms empleados son: fluorescena (FITC), rodamina (XRITC) y Texas Red.

Figura 4. Cromosoma 4 que presenta una duplicacin de la banda q21 detectado con la tcnica FISH

La hibridacin in situ es la tcnica de eleccin para la localizacin rpida de los transgenes.

Por ltimo, el pintado de cromosomas (del ingls chromosome painting) es una variante del FISH que emplea una mezcla de sondas de ADN derivada de un cromosoma entero o de una regin cromosmica de inters. Se utiliza para obtener patrones de regiones homlogas entre diferentes especies y es una forma muy directa de evaluar la cantidad de rearreglos que se produjeron entre dos especies en el curso de la evolucin.

Hbridos de Clulas Somticas

Fibroblasto humano
Los fibroblastos humanos y las clulas tumorales de ratn se mezclaron en presencia de polietilenglicol

Clula tumoral del ratn

Para

esta

tcnica

se

utilizan clulas hbridas (viables) derivadas de la fusin in vitro de clulas somticas de especies diferentes de mamferos.

Heterocarion
y dan origen a clulas hbridas denominadas heterocarion

Aunque se desconoce la razn, se observa que los cromosomas que se van perdiendo en las clulas

Clula hbrida con ncleos fusionados Figura 5. La hibridacin de clulas somticas puede utilizarse para determinar cul es el cromosoma que contiene el gen de inters.

hbridas

pertenecen

exclusivamente a uno de los conjuntos parentales. Por ejemplo, los hbridos humano/roedor tienden a perder (a travs de los

Lneas celulares

sucesivos cultivos y en

forma preferencial) los cromosomas humanos y quedarse con una mayora de cromosomas de roedor. Debido a esto, es posible derivar un panel de clulas hbridas que representen cada cromosoma humano en forma nica, sobre un conjunto de cromosomas de roedor. Por lo tanto, todos los genes de origen roedor son retenidos (y se expresan normalmente), mientras que slo los genes presentes en el nico cromosoma humano que qued retenido en ese hbrido podrn ser localizados por medio del uso de sondas moleculares o el anlisis de expresin. De esta manera, detectando patrones de presencia o ausencia de marcadores (o expresin de genes) y correlacionando con los cromosomas presentes en el hbrido, se puede asignar un gen humano a un cromosoma en particular. Los hbridos de clulas somticas humano/ ratn, con un complemento limitado de cromosomas humanos (intactos), han sido muy usados para localizar genes humanos en los ltimos 20 aos, a pesar de ser muy inestables.

Hbridos de Radiacin (HR)

Otra tcnica desarrollada para obtener mapas de alta resolucin son los paneles de hbridos de radiacin (Radiation Hybrid RH), enfoque descripto por Goss y Harris en 1975. Las dos grandes ventajas de este sistema son que pueden mapearse marcadores o genes no polimrficos (ya que se evala slo la presencia o ausencia de un marcador) y que se logra una resolucin mayor que con los mapas de ligamiento, constituyendo un puente entre stos y los mapas fsicos. Estos paneles de clulas hbridas se construyen a partir de clulas donantes (de la especie a ser mapeada) que han sido irradiadas letalmente (ya sea con rayos g o X) para causar la fragmentacin de sus cromosomas (por roturas de doble cadena). Las clulas as irradiadas son fusionadas con lneas celulares receptoras deficientes para un marcador de seleccin, como ser la timidina quinasa (TK) o la hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT). Usando condiciones de seleccin con medios apropiados, sobrevivirn slo aquellas clulas que contengan, por lo menos, algn fragmento cromosmico proveniente de las clulas dadoras. El concepto terico es que aquellos loci que se encuentran muy prximos unos de otros sern retenidos en el mismo fragmento cromosmico despus de la irradiacin. Esta caracterstica es similar al principio de ligamiento gentico que hemos visto en los mapas meiticos. Como en los paneles de ADN obtenidos con cruzas de animales, la informacin de los paneles HR es acumulativa y puede proveer datos para el ordenamiento (de alta resolucin) de regiones no polimrficas o no separables por los mapas de ligamiento.

Figura 6. Hbridos de radiacin. Construccin de clones de hbridos de radiacin (HR) a partir de clulas donantes con un nico cromosoma humano (hbrido mono-cromosmico) y clulas receptoras de hmster. Cada clon (abajo) presenta una coleccin diferente (al azar) de fragmentos del cromosoma humano original. Los 6 loci hipotticos (A a F) se marcan como + (presencia) o - (ausencia), dando una idea del ordenamiento en el cromosoma original

Cuando se evala un marcador (por Southern blot, FISH o PCR), el patrn de presencia (+) o ausencia () a travs del panel, define el emplazamiento del mismo: aquellos marcadores con el mismo patrn de + y estarn localizados en el mismo bin o posicin. Estos estudios se conocen como patrones de retencin de marcadores y nos ayudan a determinar la ubicacin de un gen o marcador. En estos casos, la unidad para medir la distancia en el mapa es el Ray o el centiRay (cR).

MAPAS FSICOS

Los mapas fsicos estn basados en el anlisis directo del ADN y ponen los genes respecto a distancias medidas en el nmero de pares de bases, kilobases o megabases. Un tipo comn de mapa fsico es el que conecta piezas aisladas de ADN genmico que fue clonado en bacterias o levaduras. Una de las ventajas es que, por lo general, los mapas fsicos tienen resolucin mayor y son ms exactos que los mapas genticos. Clones de ADN alineados

Figura mapas

7. fsicos

Los a

menudo se utilizan para ordenar los fragmentos ADN clonados. de

Mapa gentico

Cromosoma

Mapa fsico

Secuencia de ADN

Hay varias tcnicas para crear mapas fsicos, entre las que se incluyen el mapeo de restriccin, que determina las posiciones de sitios de restriccin en el ADN; el mapeo del sitio de secuencia especfica (sequence-tagged site, STS), que localiza las posiciones de secuencias cortas nicas de ADN en un cromosoma; la hibridacin in situ fluorescente (fluorescent in situ hybridization, FISH), por el cual pueden mapearse los marcadores visualmente en sus localizaciones cromosmicas y la secuenciacin de ADN.

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VISUALIZACION DE LOS FRAGMENTOS DE ADN

Para la visualizacin de fragmentos de ADN se encuentran disponibles numerosas tcnicas, entre las que se pueden mencionar: 1. La electroforesis es una tcnica bioqumica estndar para la separacin de molculas sobre la base del tamao y la carga elctrica. Hay varios tipos. Se prepara un gel poroso de agarosa que se funde en una solucin buffer. Al enfriarse se solidifica. En uno de los extremos del gel se realizan indentaciones (pocillos) para contener las soluciones con fragmentos de ADN y se somete a una corriente elctrica que pasa a travs del gel. Dado que el grupo fosfato del ADN tiene carga negativa, los fragmentos de ADN migran hacia el extremo positivo del gel. La distancia que recorre cada fragmento depende de su tamao. Luego se produce la tincin del gel con un colorante especfico como bromuro de etidio. La electroforesis es muy utilizada en la tecnologa de ADN recombinante. 2. Otra tcnica es la Southern blot, sirve para transferir los fragmentos

desnaturalizados monocatenarios provenientes de un gel a un medio slido delgado. Estos fragmentos son cortados por una o ms enzimas de restriccin. Se puede identificar que clones de una biblioteca contienen una determinada secuencia de ADN y para caracterizar el tamao de los fragmentos. Tambin se puede utilizar para determinar si un clon contiene todo un gen o solo parte de el. Los fragmentos se separan por electroforesis en gel, lo que produce una serie de bandas. Se tie el ADN en el gel con bromuro de etidio y se fotografa o escanea para determinar el nmero y peso molecular de los fragmentos. El ADN se debe desnaturalizar en fragmentos de cadena sencilla con un tratamiento alcalino. Se cubre el gel con una membrana de nitrocelulosa. Los fragmentos de ADN del gel se transfieren a la membrana colocando la membrana y el gel sobre un pabilo (esponja) sumergida parcialmente en una solucin tampn. Se colocan varias capas de papel de celulosa secante. La accin capilar arrastra el tampn por el gel y de esta manera se transfieren los fragmentos de ADN del gel al filtro de nitrocelulosa. Despus de la transferencia al gel se coloca en una solucin de hibridacin de una sonda marcada en forma radiactiva o qumica. La sonda se unir a todos los fragmentos de ADN en la membrana que posee secuencias complementarias. Luego se lava la membrana para sacar la sonda no unida y la sonda unida se detecta por autorradiografa u otro mtodo para sondas marcadas.

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Figura 8. Tcnica de Southern blot para transferir los fragmentos

desnaturalizados monocatenarios provenientes de un gel a un medio slido delgado.

3. El Nothern blot es la transferencia de ARN tambin de un gel a un soporte slido mediante un proceso denominado. La hibridacin puede revelar el tamao de una molcula de ARN mensajero particular, su abundancia o los tejidos en los que se transcribe. 4. El Western blot es la transferencia de la protena de un gel a una membrana. La sonda puede ser un anticuerpo, utilizado para determinar el tamao de una protena y el patrn de expresin. 5. Hibridacin in situ (explicada anteriormente) 6. Footprinting del ADN Muchas secuencias del ADN actan como sitios de fijacin para protenas por ej. las secuencias consenso en promotores que son los sitios a menudo sitios de fijacin para los factores de transcripcin. Esta tcnica se utiliza para determinar las secuencias de ADN fijadas a estas protenas. 7. Mutagnesis Una manera muy eficaz para estudiar los genes es provocar mutagnesis y estudiar los efectos en el organismo.

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8. Animales transgnicos En ratones y otros mamferos el ovocito es lo suficientemente grande como para inyectar el ADN de manera directa. En el estado de dos proncleos antes de la fecundacin. Antes de la fecundacin se puede inyectar el ADN en uno de ellos y as unas copias de ADN son inyectadas y se integran al azar mediante un proceso denominado recombinacin no homloga. Los embriones se implantan luego en una hembra seudopreada, madre sustituta.

Figura 9. Animales transgnicos. Los animales alterados son transgnicos y el ADN aportado extrao se denomina transgen.

9. Ratones con desactivacin gnica Knockout Es una variante que consiste en producir ratones en los que se les desactiva un gen normal. Sus fenotipos ratones con desactivacin permiten determinar la funcin de un gen. La manera habitual es insertar un gen neo que confiere resistencia al antibitico G418. La insercin rompe el gen blanco y proporciona un marcador conveniente para el encuentro de copias del gen desactivado. Despus de transferir el gen desactivado a las clulas embrionarias se seleccionan mediante el agregado del antibitico G418. Solo sobrevivirn las clulas con el gen desactivado.

Figura 10. Knock-out. Dentro del ratn la copia normal del gen puede intercambiarse con la desactivada a travs de la recombinacin.

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Reaccin en Cadena de la Polimerasa para amplificar el ADN (PCR)

Permite amplificar los fragmentos de ADN miles a millones de veces en el transcurso de unas pocas horas. Puede utilizarse con cantidades pequeas de ADN original incluso una sola molcula. La PCR ha revolucionado la biologa molecular y es hoy una de las tcnicas moleculares ms utilizadas. La base de la PCR es la replicacin catalizada por una ADN polimerasa, que tiene dos requisitos esenciales: un molde de ADN monocatenario a partir del cual puede copiarse una nueva cadena de ADN y un cebador al que pueden agregarse los nuevos nucletidos. Debido a que una molcula de ADN consta de 2 cadenas de nucletidos cada una puede servir como molde para producir una nueva molcula de ADN, la cantidad de ADN se duplica con cada replicacin. El punto de partida de la sntesis de ADN en el molde es determinado por la eleccin de los cebadores. Los cebadores utilizados en la PCR son los fragmentos cortos de ADN, de manera tpica de 17 a 25 nucletidos de longitud, que son complementarios a las secuencias conocidas en el molde. Para cada cadena se utiliza un cebador diferente.

Para llevar a cabo la PCR se comienza con: una solucin que incluye el ADN blanco (ADN por ser amplificado), la ADN polimerasa, los cuatro desoxirribonuclesidos trifosfatos los cebadores que son complementarios a las secuencias cortas en cada cadena de ADN blanco los iones magnesio y otras sustancias que son necesarias para que se produzca la reaccin. Una reaccin en cadena de la polimerasa incluye 3 pasos: Paso 1: una solucin de ADN se calienta entre 90C y 100C para romper los puentes de hidrgeno entre las dos cadenas de nucletidos y producir as los moldes monocatenarios necesarios. La mezcla de la reaccin se mantiene a esta temperatura durante slo uno o dos minutos. Paso 2: la solucin de ADN se enfra con rapidez a una temperatura entre 30C y 65C y se mantiene as durante un minuto o menos. Los cebadores se adhieren a sus secuencias complementarias en las cadenas molde. Paso 3: la solucin se calienta entre 60C y 70C, temperatura a la cual la ADN polimerasa puede sintetizar cadenas nuevas de ADN mediante el agregado de nucletidos a los cebadores. En el transcurso de unos pocos minutos se producen dos molculas nuevas de ADN bicatenario por cada molcula original de ADN.

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Luego se repite cada ciclo completo. Con cada ciclo, la cantidad de ADN se duplica; de modo que ste aumenta en forma geomtrica. Una molcula de ADN aumenta a ms de 10.000 molculas en 10 ciclos de PCR, a ms de un milln de molculas en 20 ciclos y a ms de mil millones de molculas en 30 ciclos. Cada ciclo se completa en el trmino de unos pocos minutos; por tanto, en unas pocas horas se obtiene una amplificacin grande de ADN.

Figura 11. Pasos de la PCR

Dos innovaciones importantes facilitaron el uso de la PCR: El descubrimiento de la ADN polimerasa que es estable a las temperaturas elevadas (polimerasa Taq). El desarrollo de cicladores trmicos automatizados, es decir, mquinas que provocan los cambios de temperaturas rpidos requeridos para los diferentes pasos de la PCR.

En la actualidad la PCR se utiliza con frecuencia en lugar de la clonacin gnica, pero tiene varias limitaciones. El uso de PCR requiere el conocimiento previo de parte de la secuencia del ADN para permitir la construccin de cebadores. Otra limitacin es que el tamao de los fragmentos que pueden amplificarse por la polimerasa Taq estndar suele ser menor de 2000 pb. A pesar de sus limitaciones la PCR se utiliza habitualmente en una amplia gama de aplicaciones moleculares.

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SECUENCIACION

SECUENCIACIN DEL ADN

En cierto sentido, un ADN clonado o no, no est completamente caracterizado hasta que se conoce su secuencia nucleotdica. La capacidad de secuenciar ADN ha permitido grandes avances en el conocimiento de la organizacin del genoma y de los genes, incluyendo su estructura, funcin y mecanismos de regulacin. Los primeros mtodos para la secuenciacin rpida de ADN se desarrollaron entre 1975 y 1977. Frederick Sanger y col. crearon el mtodo de secuenciacin dideoxi basado en la elongacin del ADN; Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un segundo mtodo basado en la degradacin qumica del ADN. El mtodo de Sanger se convirti con rapidez en el procedimiento estndar para la secuenciacin de cualquier fragmento purificado de ADN.

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

Un fragmento de ADN se marca radioactivamente en sus extremos con gamma 32P gamma 32S dATP por accin de la polinucletido quinasa. La tcnica consiste en romper estas molculas marcadas con reacciones qumicas especficas para cada una de las cuatro bases. Cuatro alcuotas de la misma muestra se tratan bajo condiciones distintas, posteriormente el tratamiento con piperidina rompe la molcula de ADN a nivel de la base modificada. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven en funcin de su tamao en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrn de bandas radioactivas obtenidas. Esta tcnica permite la lectura de unas 100 bases de secuencia.

16

Figura

12.

Mtodo

qumico de Maxam y Gilbert.

Mtodo enzimtico de Sanger

En este mtodo se utilizan pocos reactivos txicos y cantidades menores de radioactividad que en el mtodo de Maxam-Gilbert, y su caracterstica particular es el uso de didesoxinucletidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la
Base nitrogenada

cadena de ADN. Los ddNTPs son desoxinucletidos nucletidos de los 4

diferentes

(dATP,dTTP,

dCTP y dGTP) que carecen de uno de los grupos hidroxilo, de manera que cuando uno de estos nucletidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongndose ya que la enzima ADN polimerasa necesita un extremo 3 OH para aadir el siguiente nucletido, y el ddNTP, marcado en forma radioactiva o qumica, incorporado carece de este grupo hidroxilo. Al terminar

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la elongacin de la cadena, se producen varios fragmentos de ADN de longitud variable, los cuales son desnaturalizados por calor y separados por tamao (con una resolucin de un solo nucletido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida urea. Cada una de las cuatro reacciones de sntesis se corre en calles individuales (A, T, G y C) y se visualizan las bandas de ADN mediante autorradiografa o luz ultravioleta. Las bandas obtenidas en el gel corresponden a los fragmentos de ADN de diferentes longitudes

ADN monocatenario que debe ser secuenciado

Los cuatro ddNTP

Figura didesoxi de

13. de

El

mtodo

de

secuenciacin basa en la

ADN

se

terminacin de la sntesis de ADN.

Autorradiograma de la electroforesis en gel

Secuencia de la cadena obtenida complementaria

Secuencia de la cadena molde original

Una banda en una calle indica un fragmento de ADN que es el resultado de una terminacin de la cadena tras la incorporacin de un didesoxinucletido (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP). El nucletido terminal puede ser identificado de acuerdo al didesoxinucletido que se aadi en la reaccin que dio lugar a esa banda. Las

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posiciones relativas entre las cuatro calles se utilizan entonces para leer la secuencia de ADN.

Secuenciacin automtica de Sander

Durante muchos aos, la secuenciacin del ADN se realiz sobre todo en forma manual y era una tcnica laboriosa y costosa. En la actualidad, la secuenciacin se lleva a cabo mediante aparatos automatizados que utilizan colorantes fluorescente y escneres de lser para los miles de secuencias de pares de bases en unas pocas horas.

Figura 14. Esquema de la secuenciacin por el mtodo automtico de electroforesis capilar con la secuencia obtenida.

Los ddNTP utilizados en la reaccin automatizada se marcan cada uno con un colorante fluorescente distinto. Las cuatro reacciones pueden tener lugar en el mismo tubo de ensayo y pueden colocarse en el mismo pocillo durante la electroforesis, dado que cada dNTP se marca en forma distintiva. Los aparatos de secuenciacin recin desarrollados llevan a cabo la electroforesis en tubos capilares que contienen gel. Los fragmentos de diferentes tamaos producidos por la reaccin de secuenciacin se separan dentro de un tubo y al migrar pasan por delante de un haz de lser y un detector.

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Cuando los fragmentos pasan por el lser, sus colorantes fluorescentes se activan y la fluorescencia resultante se detecta por un escner ptico. Cada colorante emite fluorescencia de una longitud de onda caracterstica que se lee en el escner ptico. Para la interpretacin, la informacin ingresa en una computadora y los resultados se imprimen como un conjunto de picos en un grfico (Fig. 14). Los aparatos de secuenciacin automatizados pueden contener 96 tubos capilares o ms, lo que permite leer secuencias de 50.000 a 60.000 pb en unas pocas horas.

Secuenciacin automtica en geles desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida

La secuenciacin automtica mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel de acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales montados adecuadamente sobre el cassette que sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acoplar en el secuenciador automtico para proceder a la carga de la muestras. El nmero de muestras que podemos cargar en cada gel, viene determinado por el nmero de pocillos que posee el peine (de dientes de tiburn) que utilicemos. Hay peines de cuatro tamaos distintos: de 36, 48, 64 y 96 pocillos. La electroforesis se desarrolla durante 7 horas, y se puede realizar una lectura de unos 700pb aproximadamente, dependiendo siempre de la calidad del ADN, de la correcta cuantificacin del mismo, de la utilizacin del primer adecuado, y de la polimerizacin correcta del gel de acrilamida/bis principalmente. Cuando las muestras a secuenciar tienen una longitud no superior a 400pb, podemos disminuir el tiempo de la electroforesis a 3.5 horas, aumentando la velocidad de barrido del laser, y el resultado es igualmente optimo.

Figura 15. Esquema de los geles desnaturalizantes.

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Secuenciadores automticos capilares

Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan una alternativa clara al sistema basado en geles de acrilamida/bisacrilamida donde este soporte ha sido sustituido por un polmero que se inyecta de forma automtica en un capilar antes de cargar la muestra de secuenciacin; las muestras se van analizando una a una. Este tipo de secuenciadores se utiliza para lecturas no superiores a unos 450pb. El equipo funciona de forma completamente automtica inyectando las muestras (que se preparan exactamente igual que durante la secuenciacin en geles y se colocan en una placa de 96 pocillos), en un capilar previamente cargado con un cierto polmero que funciona como lo hace la matriz de acrilamida-bisacrilamida-urea de los geles de secuencia, permitiendo resolver fragmentos de ADN de cadena sencilla que se diferencian en una nica base. A una altura determinada el laser detecta la fluorescencia emitida por cada cadena sencilla de ADN fluorescente y traduce esta emisin de fluorescencia en la secuencia correspondiente. Una vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra, el capilar se vaca rellenndose nuevamente con polmero fresco. Se inyecta a continuacin una segunda muestra, se procede a desarrollar nuevamente la electroforesis y as sucesivamente.
Figura 16. Secuenciador ABI Prism 310

LAS PRINCIPALES VENTAJAS DE ESTOS NUEVOS EQUIPOS SON: Automatizacin completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera la presencia de un tcnico que cargue las muestras en los diferentes capilares del equipo. Rapidez en el anlisis de cada muestra: dado el pequeo dimetro de los capilares, se pueden aplicar voltajes mayores que en los geles de acrilamida:bisacrilamida:urea, por lo que pueden leerse del orden de 450 nucletidos en el plazo de una hora mientras que esta misma longitud de secuencia necesita unas 2-4 horas en un secuenciador en gel. El tiempo necesario del proceso es, para la polimerizacin del mismo, unas dos horas y para la preelectroforesis, una hora aproximadamente.

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SECUENCIACIN DE TODOS LOS GENES DEL GENOMA

El genoma o secuencia completa de ADN de un organismo constituye la informacin gentica heredable de un organismo. Secuenciar es determinar el orden en que se enlazan las bases de dicha secuencia. Ese trozo de ADN puede corresponder a un gen, un genoma, o a una parte de ellos. Los avances de las tcnicas de secuenciacin del ADN permiten hoy en da leer el ADN a gran velocidad lo que ha llevado a abordar proyectos a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Adems se dispone ya de la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos. Se usan dos mtodos diferentes para secuenciar genomas: A- Mtodo clon a clon B- Mtodo Hierarchical Shotgun Sequencing (secuenciacin de la perdigonada jerrquica) y Shotgun Sequencing (secuenciacin de la perdigonada).

A- Mtodo clon a clon: Se realiza la construccin de una biblioteca con fragmentos clonados que incluyen el ADN de todo el genoma de un organismo, que luego se ensamblan en mapas genticos y fsicos.

Corte de ADN con enzima de restriccin

Figura 17. Estrategia general para clonar un gen. Un trozo de ADN es manipulado con enzimas de restriccin e introducido en un plsmido el cual a su vez es introducido en una bacteria. Al cultivar la bacteria se obtienen mltiples copias del Introduccin del plsmido recombinante a la bacteria ADN de inters.

El distintos

clonado tipos de

se realiza enzimas

con de

restriccin y vectores: Las enzimas de restriccin son protenas aisladas de bacterias cuya funcin es cortar las hebras de ADN. Se podra decir que son tijeras moleculares que cortan ADN. Lo hacen en forma especfica. Esto

significa que cada enzima reconoce un sitio particular del ADN, es decir

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que reconoce una secuencia particular de nucletidos. Esa secuencia especfica se denomina sitio de restriccin. Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se posiciona sobre la molcula de ADN y corta dentro o en torno de esa secuencia.
Cortes con extremos romos Cortes con extremos cohesivos Figura 18. Las enzimas segn clasifican el corte en: se

Enzimas

que generan extremos romos y Enzimas que generan cohesivos. extremos

Los

vectores

son molculas transportadoras

que

transfieren

replican

fragmentos de ADN que llevan insertados. Para que sirva de vector, una molcula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. Tambin tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la insercin del fragmento de ADN a clonar. Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restriccin, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima. Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores recombinantes. Hay muchos vectores de clonacin, que es una molcula de ADN replicante y estable a la cual puede adherirse un fragmento de ADN extrao para la introduccin en una clula. Difieren en la especificidad de la clula husped, el tamao de los insertos que pueden transportar y en el nmero de copias que producen y el nmero y tipo de genes marcadores que contienen.

Tipos de Vectores: Vectores procariotas:

1. Plsmidos: (ADN epismico. Para secuencias cortas de 10.000 bases o 10 Kb). Son circulares y existen naturalmente en las bacterias. Contienen orgenes de replicacin y pueden por eso replicarse independientemente del cromosoma bacteriano.
Figura 19. pUC19 vector plsmido tpico de clonacin.

23

El mtodo de insercin ms sencillo es a travs de las enzimas de restriccin. Otro mtodo para insertar ADN en un plsmido es mediante una cola homopolimrica o tailing donde se crean extremos cohesivos complementarios sobre las piezas del ADN con extremos romos. Primero, se corta el plsmido y el ADN extrao con una enzima de restriccin. Si la enzima de restriccin produce extremos cohesivos, estos se eliminan por una enzima que digiere el ADN monocatenario. De manera alternativa el plsmido y el ADN extrao pueden cortarse por una enzima de restriccin que produce extremos romos. Una vez que el plsmido y el ADN extrao tienen extremos romos, los extremos cohesivos monocatenarios son agregados por una enzima transferasa terminal. Un tercer mtodo de insercin de fragmentos consiste en utilizar la enzima ligasa T4, capaz de conectar dos piezas cualquiera de extremos romos de ADN y se denomina clonacin mediante el uso de conectores. Una vez insertado el plsmido debe introducirse en las clulas bacterianas. Esta tarea suele cumplirse mediante la transformacin y que es la capacidad de las bacterias de captar el ADN del ambiente externo. Muchas veces la transformacin es un proceso natural, y otros deben tratarse en forma qumica o fsica previamente. Los plsmidos dentro de la clula se replican y multiplican.

2. Bacterifagos: (gran capacidad para invadir bacterias. Para ADN complementario y genmico). Ofrecen ciertas ventajas y el ms comn es el bacterifago que infecta E. Coli . Una de sus ventajas es la elevada eficiencia para transferir el ADN a las bacterias. Una segunda ventaja es que cerca de la tercera parte del genoma no es esencial para la infeccin ni para la reproduccin. Estos genes no esenciales que comprenden alrededor de 15 Kb pueden ser reemplazados por hasta 23 Kb de ADN extrao. El ADN extrao cortado con EcoRI tendr extremos cohesivos que son complementarios con los de los extremos de los genes esenciales, a los cuales puede conectarse mediante la ligasa. El cromosoma posee extremos monocatenarios cortos denominados sitios cos, necesarios para empaquetar en ADN dentro de la cabeza de un fago. Los cromosomas del fago recombinante pueden entonces empaquetarse en la cubierta proteica y agregarse a E. coli . Los fagos inyectan su ADN recombinante dentro de la clula, donde se replicar. Slo los fragmentos de ADN de tamao adecuado y que contienen genes esenciales se empaquetarn en las cubiertas del fago.

3. Csmidos: Los csmicos combinan las propiedades de los vectores plsmidos y los fagos. Los fragmentos de ADN grandes de 44 Kb pueden clonarse en csmicos.

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Los csmicos son plsmidos pequeos que contienen los sitios cos del fago ; pueden empaquetarse con las cubiertas virales y transferirse a las bacterias por infeccin viral. Dado que se pierden todos los sitios virales menos los sitios cos, un csmico puede tener ms del doble del ADN extrao que puede transportar el fago vector. El ADN extrao es insertado en los csmicos del mismo modo que se introduce en los plsmidos.

Figura 20. Vector csmido.

4. Vectores de expresin: Muchas veces es interesante no solo replicar el gen si no tambin producir la protena que codifica. Uno de los primeros productos comerciales elaborados por tecnologa recombinante fue la protena insulina. La expresin exitosa es un tema difcil sobre todo las secuencias que regulan la trascripcin y la traduccin son diferentes en las bacterias y en los eucariontes. Para solucionar este problema suele insertarse un gen extrao en un vector de expresin que, adems del origen de replicacin, los marcadores seleccionables y los sitios de restriccin, contienen secuencias requeridas para los procesos mencionados.

Figura 21. Puede insertarse un gen extrao en un vector de expresin; un en vector este de

ejemplo

expresin E. coli.

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Vectores eucariotas:

1. YACs: (cromosoma artificial de levadura, inestable. Para secuencias de hasta 1 Mb (1000 Kb o 1 milln de bases)). Son molculas de ADN con un origen de replicacin de levadura, que permite que se repliquen, un par de telmeros que garantizan estabilidad dentro de la clula y un centrmero.

Figura 22. Vector YAC

2. BAC: Cromosoma artificial de bacterias. Se utilizan para clonar segmentos grandes desde 100 a 500 Kb (100.000 bases a 500.000 bases).

Figura 23. Vector BAC. Cromosoma artificial de bacteria con distintos sitios de corte de enzimas de

restriccin.

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El ADN clonado en los BACs es por lo general ms pequeo que los YACs. Sin embargo, los BACs ofrecen ventajas importantes como por ejemplo, son ms manipulables para ciertos tipos de estudios en el laboratorio. Los BACs se usan a gran escala para construir mapas fsicos de alta resolucin de los cromosomas, con el fin de establecer la secuencia completa del genoma.

PAPEL DE LA CLONACIN GNICA

La manipulacin y el anlisis de los genes con tecnologa de ADN recombinante requiere copias mltiples de las secuencias de ADN utilizadas. La clonacin fue un requisito previo para muchos mtodos moleculares, En la actualidad los mtodos de amplificacin del ADN han obviado la necesidad de la clonacin, aunque sigue siendo muy utilizada para crear secuencias de genes novedosos y para otras manipulaciones. Como encontrar la secuencia de ADN para ser clonada? Dado que en una clula puede haber millones de pares de bases de ADN es necesario clonar para encontrar un gen. Este enfoque clonar primero y buscar despus, se denomina clonacin de fragmentos escogidos al azar (Shotgun). Primero se clona un nmero grande de fragmentos en conocimiento de que uno o ms tienen el ADN de inters y entonces se busca el
Una biblioteca genmica es un conjunto de clones, cada uno de los cuales contiene un fragmento de un genoma de un organismo dado. Las bibliotecas genmicas se consiguen clonando los fragmentos en vectores.

fragmento entre los clones. La coleccin de clones que contiene todos los fragmentos de ADN provenientes de una fuente se

denomina genoteca o biblioteca genmica.

Para crear una genoteca genmica se recolectan las clulas y se rompen. As se produce la liberacin de ADN. Este se puede aislar por diferentes mtodos. Uno de ellos utiliza fenol. Una vez extrado el ADN se corta el ADN con enzimas de restriccin y debido a que los sitios de corte son al azar las molculas de ADN se cortan en lugares diferentes y se producirn fragmentos superpuestos. Estos se unen a vectores que pueden transferirse a las bacterias. Esta tcnica produce un conjunto de clulas bacterianas o bacterifagos que contienen los fragmentos genmicos superpuestos. Una genoteca puede contener un nmero importante de clones para garantizar que todas las secuencias de ADN estn representadas.

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B- Mtodo Hierarchical Shotgun Sequencing (secuenciacin de la perdigonada jerrquica) y Shotgun Sequencing (secuenciacin de la perdigonada)

El mtodo de Hierarchical Shotgun Sequencing fue propuesto por James Watson y Francis Collins, entre otros, contando con la mayor parte de la financiacin pblica. Esta metodologa resulta la ms compleja, con un conocimiento ms exhaustivo del genoma. Bsicamente consiste en secuenciar el genoma completo, cromosoma a cromosoma de un extremo al otro. Se hacen 2 o 3 fragmentos del ADN (fragmentos cortos de 2 Kb, fragmentos de 15-20 Kb y tambin se pueden hacer fragmentos de 200-300 Kb). Luego se construye una biblioteca genmica con cada preparacin con la utilizacin de vectores BAC. Se seleccionan y secuencian clones al azar de estas bibliotecas. Luego se utiliza un programa para ensamblar y superponer largos tramos de secuencia a partir de los fragmentos cortos, usando las secuencias de los clones ms largos como marco de referencia.

Figura 24. Representacin esquemtica de la estrategia de secuenciacin utilizado por 1. El Proyecto Genoma Humano financiado con fondos pblicos y 2. Por Celera genomics.

El mtodo de Shotgun Sequencing desarrollado por Craig Venter bajo la financiacin de Celera Genomics y otras compaas biotecnolgicas privadas, emplearan una segunda tcnica, ms prctica. Consistira en la secuenciacin de genes expresados en las clulas diferenciadas en las que se encuentran activos, partiendo de los ARNm resultantes de su traduccin.

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El mtodo Shotgun Sequencing es ms rpido y menos costoso, pero es ms propenso a los errores debidos a un montaje incorrecto de la secuencia final.

Hasta el momento se han secuenciado 154 eucariotas (13 mamferos, 3 especies de aves, 2 anfibios, 4 especies de peces, 24 especies de insectos, plantas, etc.) y 17 estn en proyecto borrador. Tambin se han secuenciado 1475 bacterias. (Informacin 2012) Fuente http://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html.

Tabla 1. Ejemplos de genomas completos o de borradores de secuencias publicadas.

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NUEVOS MTODOS DE SECUENCIACIN

SECUENCIACIN DE ALTO RENDIMIENTO

La elevada demanda de secuenciacin de bajo costo ha dado lugar a las distintas tecnologas de secuenciacin de alto rendimiento. Estos esfuerzos han sido financiados por instituciones pblicas y privadas as como desarrolladas y

comercializadas dentro de la empresa privada por las compaas de biotecnologa. Se pretende que las tecnologas de secuenciacin de alto rendimiento disminuyan los costos de secuenciacin de las bibliotecas de ADN ms all de lo que se puede hacer con el mtodo corriente del terminador marcado basado en la separacin del ADN por electroforesis capilar. Muchos de los nuevos mtodos de alto rendimiento usan mtodos que paralelizan el proceso de secuenciacin, produciendo miles o millones de secuencias a la vez.

Figura 25. Evolucin de las tecnologas de alto rendimiento. ABI-3730 de Applied Biosystems, posiblemente el ms utilizado en la secuenciacin del genoma Humano, con una capacidad de 1 Mb por da (Un milln de bases). El AB-SOLID actual, en menos de 10 aos ha multiplicado por 1000 la capacidad de secuenciacin.

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Amplificacin clonal in vitro

Ya que los mtodos de deteccin molecular frecuentemente no son lo suficientemente sensibles para la secuenciacin de una sola molcula, la mayora de los mtodos utilizan un paso con clonacin in vitro para generar muchas copias de cada molcula individual. Uno de los mtodos es la PCR de emulsin, en la que se aslan las molculas individuales de ADN junto con microesferas recubiertas con cebadores en burbujas acuosas dentro de una fase oleosa. Posteriormente una PCR recubre cada microesfera con copias clonales de la biblioteca de molculas aisladas y seguidamente se inmovilizan para ser ms tarde secuenciadas. La PCR de emulsin (Fig. 26) se usa en los mtodos publicados por Margulis y colaboradores (comercializado por 454 Life Sciences, adquirido por Roche), Shendure y Porreca et al. (conocido como "secuenciacin polony ", trmino formado por polimerasa "pol" y colonia "colony"), y la secuenciacin SOLiD (desarrollada por Agencourt y adquirida por Applied Biosystems). Otro mtodo para la amplificacin clonal in vitro es la "PCR de puente", en la que los fragmentos se amplifican a partir de los cebadores unidos a una superficie slida, desarrollados y usados por Solexa (de la que ahora es propietaria la empresa Illumina) (Fig. 27). Estos mtodos producen ambos muchas localizaciones fsicamente aisladas que contienen cada una muchas copias de un solo fragmento. El mtodo con una nica molcula desarrollado por el laboratorio de Stephen Quake (y ms tarde comercializado por Helicos) se salta este paso de amplificacin, fijando directamente las molculas de ADN a una superficie.

Figura 26. Emulsin de PCR. Una molcula de ADN por perla. La amplificacin clonal de miles de copias se produce en microrreactores en una emulsin.

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Figura 27. Amplificacin en fase slida. Una molcula de ADN por Cluster.

Secuenciacin paralelizada

Una vez que las secuencias clonales de ADN se localizan fsicamente en posiciones separadas de la superficie, se pueden utilizar varios mtodos de secuenciacin para determinar las secuencias de ADN de todas las localizaciones en paralelo.

Figura 28.Terminacin reversible. 1. Illumina/Solexa; 2. Helicos BioSciences.

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La

"secuenciacin

por

sntesis",

como

en

la

popular

secuenciacin

electrofortica con terminador marcado con colorante, usa el proceso de sntesis de ADN por ADN polimerasa para identificar las bases presentes en la molcula complementaria de ADN. Los mtodos de terminador reversible (usados por Illumina y Helicos) utilizan versiones reversibles de terminadores marcados con colorante, aadiendo un nucletido cada vez, y detectando la fluorescencia correspondiente a esa posicin y removiendo posteriormente el grupo de bloqueo para permitir la polimerizacin de otro nucletido.

La Pirosecuenciacin (utilizada por Roche/454) tambin usa la

polimerizacin del ADN para aadir nucletidos, aadiendo cada vez un tipo diferente y y despus el

detectando

cuantificando

nmero de nucletidos aadidos a una determinada localizacin a travs de la luz emitida por la liberacin de los pirofosfatos unidos a ellos.

Figura 29. Roche/454. Pirosecuenciacin.

La "secuenciacin por ligacin" es otro mtodo enzimtico de secuenciacin que emplea una ADN ligasa en lugar de una polimerasa para identificar la secuencia objetivo. Se usa en el mtodo polony y en la tecnologa SOLiD que ofrece Applied

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Biosystems. Este mtodo utiliza un reservorio de todos los oligonucletidos posibles de una longitud dada, marcados de acuerdo con la posicin secuenciada. Los oligonucletidos se templan y ligan; el ligamiento preferente de las ADN ligasas por su secuencia especfica produce una seal correspondiente a la secuencia

complementaria en esa posicin concreta. Shendure et al., usaron este mtodo para secuenciar el genoma de E. coli MG1655.

Figura 30. Life/APG. Secuenciacin por Ligacin.

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Real Time (Secuenciacin en Tiempo Real)

Es un nuevo mtodo de tecnologa que est llevando adenlante Pacific Biosciences. En esta tcnica los nucletidos no detienen el procesos de sntesis de ADN. La secuenciacin en tiempo real implica una imagen continua de la incorporacin de los nucletidos marcados durante la sntesis de ADN. En la plataforma de Pacific Biosciences molculas individuales de ADN polimerasa estn unidos a la parte inferior de detectores individuales (ZMW detectors) obteniendo informacin mientras los nucletidos son fosforilados mientras el cebador va traduciendo. Otros enfoques han propuesto mejorar la relacin de mediciones seal-ruido en la secuenciacin en tiempo real con esquemas de deteccin ms convencionales. Por ejemplo, Life/Visiten ha diseado ADN polimerasas que se adjunta con un colorante fluorescente para producir una seal mejorada por la energa de resonancia de fluorescencia

Figura 31. Pacific BioSciences. Secuenciacin en Tiempo Real.

Genoma de enriquecimiento

A pesar de las reducciones de costes sustanciales asociados con tecnologas NGS (Next Generation Sequencing) en comparacin con el mtodo automatizado de Sanger, la secuenciacin del genoma completo es todava un esfuerzo costoso. Una solucin provisional a este problema puede ser el uso de plataformas de NGS para apuntar a regiones de inters especficas. Esta estrategia se puede utilizar para examinar todos los exones en el genoma, genes especficos de las familias que

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constituyen dianas farmacolgicas conocidas o las regiones que estn implicados en enfermedades o en efectos farmacogenticos. El concepto de focalizacin de regiones especficas del genoma est bien establecido, con la PCR es el ms ampliamente utilizado, aunque en una escala pequea. PCR acoplado con secuenciacin de Sanger est adecuadamente emparejado para analizar unos cuantos candidatos genes, pero el acoplamiento de la PCR con las plataformas NGS de alto rendimiento no es prctico porque la preparacin de la muestra requerira el manejo de decenas de miles de cebadores de forma individual o en grupos multiplex. Un reciente artculo de Frazer y sus colegas en colaboracin con RainDance Technologies informaron la amplificacin simultnea de 3.976 productos que utilizan tecnologas de microgotas PCR. Aqu, un dispositivo crea gotas acuosas con volumen en picolitros de cebadores dirigidos hacia adelante en una solucin de aceite. Las gotas se dirigen a diferentes regiones de la fusin del genoma con las gotas de picolitros por separado que contienen ADN genmico fragmentado y asociado a reactivos de PCR, y estas gotitas son mezcladas en un ciclo trmico en un tubo La produccin de grandes cantidades a bajo costo hace que las plataformas de NGS descritas anteriormente sean tiles para muchas aplicaciones. Estos incluyen el descubrimiento de la variante por resecuenciacin de regiones especficas de inters o genomas en su totalidad, el asamblado de novo de bacterias y de genomas eucariotas menores, la catalogacin de los transcriptomas de clulas, tejidos y organismos (ARN-seq), los perfiles en todo el genoma de las marcas epigenticas y la estructura de la cromatina usando mtodos basados en la seq (CHIP-seq, metil-seq y ADNsa-seq) y la clasificacion de especies y el descubrimiento de genes pora estudios de la metagenmica. Por ejemplo, las plataformas Illumina/Solexa y LIfe/APG son variantes muy adecuadas para el descubrimiento de resecuenciacin de genomas humanos, porque se producen por ciclo volmenes gigantescos de bases de alta calidad. Adems, la plataforma, Helicos BioSciences es muy adecuado para

aplicaciones que exigen informacin cuantitativa de ARN o ARN seq. El rpido ritmo de los avances tecnolgicos en el campo podra cambiar esta informacin en un futuro prximo.

Genomas individuales

Los estudios del genoma humano tienen por objeto un catlogo de SNVS (variante de un simple nucletido) y la SVS (variantes estructurales) y su asociacin a diferencias fenotpica, con el objetivo final de personalizar la genmica con fines

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mdicos. En 2004, el Consorcio Internacional de Secuenciacin del Genoma Humano public la primera, y todava nica, referencia terminada del genoma humano (actualmente Centro Nacional de Biotecnologa de la Informacin: NCBI). Su costo fue estimado en US $ 300 millones. La genmica individual tambin est siendo aplicada al estudio de la enfermedad. Por ejemplo, Mardis et al., reportaron la secuencia de dos genomas del cncer de leucemia mieloide agudo mediante la plataforma Illumina/Solexa, y ambos estudios, identificaron mutaciones somticas que pueden ser asociada con la

enfermedad. Gibbs et al., describieron recientemente la elucidacin de las dos variantes allicas en una familia con una forma recesiva de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth utilizando la plataforma Life/APG. Varios proyectos destinados a la secuenciacin de ms individuos, incluyendo el Atlas del genoma del cncer y El proyecto de 1000 Genomas, tambin estn utilizando las plataformas Illumina/Solexa y Life/454 para secuenciar genomas enteros. En comparacin con la secuenciacin automatizada de Sanger, las plataformas de NGS han aumentado dramticamente el rendimiento y redujo sustancialmente los gastos, con varios grupos presentando informes de costos de reactivos por debajo de $100.000. Sin embargo, existe una gran variabilidad entre y dentro de plataformas NGS en trminos de tamao del molde y construccin, largo de lectura, rendimiento y la base y la cobertura del genoma, y dicha variabilidad hace que sea difcil evaluar la calidad (es decir, la precisin de la cobertura del genoma y continuidad del genoma) de los genomas basado en consideraciones de costo. En junio de 2009, Illumina anunci la secuenciacin del genoma individual por el precio de US$ 48.000. Complete Genomics ofrece un servicio similar a un precio de US$ 5.000, basado en un modelo de negocio que depende de gran volumen de clientes. Sin embargo, el logro del ahorro de los costos tambin puede venir con una disminucin de la calidad de la informacin. Las tecnologas de NGS tienen una impresionante gama de aplicaciones, y actualmente se estn desarrollando an ms. Adems de las aplicaciones descritas anteriormente, las tecnologas de NGS estn siendo utilizadas para caracterizar las relaciones evolutivas de genomas antiguos y para dilucidar el papel de secuencias no codificantes en la salud y enfermedades. En un futuro no muy lejano, es previsible que las tecnologas de NGS pudieran ser utilizadas para obtener datos de alta calidad a partir de la secuencia un genoma aislado de una sola clula, lo que sera un avance importante, sobre todo para la genmica del cncer. Para que esto ocurra, sern necesarios avances en las tcnicas, para aislar eficazmente largas molculas de ADN intactas, y en los mtodos, para la lectura precisa de la secuencia. El campo del desarrollo de NGS y las aplicaciones es un rea de rpido movimiento de la

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investigacin, que hace de este un momento emocionante para los estudios genmicos.

Anlisis de las secuencias de ADN

Adems de la clonacin y amplificacin las tcnicas moleculares se utilizan para analizar las molculas de ADN mediante la secuenciacin. Secuenciacin del ADN: una tcnica poderosa que surge de la tecnologa del ADN recombinante es la capacidad de secuenciar con rapidez las molculas de ADN. La secuenciacin consiste en determinar la secuencia de bases, permite leer la informacin brindando informacin acerca de la estructura y funcin de los genes.

Aplicaciones de la tecnologa del ADN recombinante

Adems de proporcionar informacin valiosa sobre los genes la Tecnologa del ADN recombnate tiene numerosas aplicaciones como la elaboracin de productos farmacuticos (insulina), y otras sustancias, bacterias especializadas (como

produccin de etanol a partir de plantas), plantas y animales de granja diseados por ingeniera gentica y para corregir defectos genticos humanos. Algunos frmacos oligonucletidos (secuencias cortas de ADN sinttico o de ARN pueden utilizarse para tratar enfermedades (terapia gnica). Los oligonucletidos antisentido son

complementarios a los ARN no deseados, como el ARN viral. Cuando se agrega a una clula, estos ADN antisentido se unen al ARNm viral e inhiben su traduccin. Varios frmacos han sido probados para diferentes tratamientos para el cncer. Tambin ha permitido el desarrollo de sondas para detectar mutaciones causantes de enfermedades. Se dispone de la comprobacin prenatal para varios centenares de enfermedades genticas. Para muchas enfermedades genticas las nicas pruebas diagnsticas disponibles son las que identifican una mutacin predisponerte en el ADN, pero muchas enfermedades genticas son provocadas por varias mutaciones diferentes y derivar en resultados pueden ser falsos Salvo la completa secuenciacin del gen que es costosa no hay manera de identificar a todos los individuos predispuestos. En la terapia gnica deban primero localizarse los genes causantes de enfermedades y desarrollarse vectores. Un mtodo de terapia consiste extraer clulas del cuerpo agregar los virus con los genes recombinantes e reintroducir las clulas en el cuerpo del paciente. En este caso los vectores se introducen directamente. Hasta el momento la terapia gnica se utiliza en clulas somticas.

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Figura 32. Evolucin de proyectos y publicaciones

Generalidades del anlisis genmico

Los proyectos genoma generan grandes cantidades de informacin sobre la secuencia del ADN. Estos datos son tiles slo cuando son analizados. Para identificar y caracterizar las regiones codificantes de los genes de las secuencias annimas de ADN se necesitan diversos tipos de anlisis mediante la utilizacin de programas y bases de datos, como por ejemplo: Asegurar que la secuencia est completa y es precisa. Identificar los genes encontrando las pautas de lectura abiertas (ORF: Open Reading Frames). Empiezan con una secuencia de iniciacin: ATG y terminan con una secuencia de terminacin: TAA, TAG o TGA. Encontrar los sitios promotores de inicio de transcripcin y de traduccin. Encontrar los sitios de empalme, los intrones y los exones. Traducir la secuencia de ADN en una secuencia proteica y compararla con otras protenas conocidas.

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Figura 33. Sitios de empalme, intrones y exones.

Para asegurar que la secuencia nucleotdica de un genoma est completa y no contiene errores, el genoma se secuencia ms de una vez. Este proceso se denomina compilacin. Una vez secuenciado, compilado y comprobado la exactitud de un genoma, se realiza una bsqueda de todos los genes que codifican productos (protenas y ARN) formados por una pauta de lectura abierta, tripletes nucleotdicos que se pueden traducir en la secuencia aminoacdica de una protena. Este es el primer paso de la anotacin, el proceso que identifica los genes, sus secuencias reguladoras y su funcin o funciones. La anotacin tambin identifica los genes que no codifican protenas y encuentra y caracteriza los elementos genticos mviles y las familias de secuencias repetitivas.

El objetivo final del anlisis de la secuencia es obtener una descripcin funcional completa de todos los genes del genoma de un organismo.

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GENMICA FUNCIONAL

La Genmica Funcional clasifica los genes de las secuencias dilucidadas por la Genmica Estructural e identifica sus funciones. Algunos genes pueden tener funciones previamente asignadas mediante los mtodos clsicos de mutagnesis y de cartografa de ligamiento; pero muchos genes no tienen an una funcin asignada. La genmica funcional es el estudio simultneo de todos los genes involucrados en un estado fisiolgico determinado o en un tejido en particular. Permite comprender la organizacin y los mecanismos genticos que en conjunto hacen a la fisiologa de un organismo. La secuencia de nucletidos de un gen puede utilizarse para predecir la secuencia de aminocidos de la protena que codifica. Entonces, la protena puede sintetizarse o aislarse y estudiarse sus propiedades para determinar su funcin. Sin embargo, este enfoque bioqumico para la comprensin de la funcin gnica insume tiempo y es costoso. Un objetivo fundamental de la genmica funcional fue desarrollar mtodos informticos que permitan identificar la funcin gnica a partir de la secuencia de ADN sola, evitando el proceso laborioso de aislar y caracterizar las protenas individuales. Despus de obtener una secuencia genmica, la siguiente tarea es asignar funciones a los genes de la secuencia. Algunos genes pueden tener funciones previamente asignadas mediante los mtodos clsicos de mutagnesis y de cartografa de ligamiento; pero muchos genes no tienen una funcin bien dirigida asignada. Una aproximacin para asignar funciones a estos genes es la utilizacin de bsqueda de homologa. Este anlisis tiene diversos componentes: bsqueda en bases de datos como GenBank para encontrar genes parecidos aislados en otros

organismos, comparar la secuencia de un ORF con la de un gen bien caracterizado de otro organismo, rastrear el ORF en busca de motivos funcionales, regiones del ADN que codifican dominios proteicos como canales de iones, regiones de unin a ADN o seales de secrecin/exportacin.

Aplicaciones de la genmica funcional

Caracterizar transcriptomas especfico de tejidos. Determinar patrones de expresin gnica asociados a procesos celulares tales como diferenciacin, proliferacin y muerte celular.

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Estudiar las alteraciones en los perfiles de expresin asociados a procesos patolgicos (infecciones; carcinognesis, etc.)

Efectuar inferencias funcionales de genes pobremente caracterizados. Predecir redes sociales de genes estrechamente relacionadas con procesos biolgicos especficos.

Desde el advenimiento de la genmica moderna, se han desarrollado diversas tecnologas de gran cantidad de datos que permiten a los investigadores analizar las interacciones genticas de miles de genes simultneamente. Estas tecnologas incluyen de ADN y de expresin proteica, mtodos automatizados para el aislamiento y la diseccin de grandes complejos proteicos y bsquedas de alcance genmico de sitios de interaccin protena-DNA. Dado que estas tcnicas se basan en la abundancia de datos proporcionados por la terminacin de los proyectos de secuenciacin del genoma, a menudo se denominan tcnicas de genmica funcional.

Mtodos de anlisis de la Genmica Funcional o Transcriptmica

Northern Blot PCR cuantitativa Hibridacin substractiva Differential display Microarrays (Microarreglos de ADN) SAGE XX-seq: RNA-Seq, Chl-Seq, CVN-Seq.

Northern Blot

Es una tcnica para transferir fragmentos de ARN desnaturalizados provenientes de un gel a un medio slido. El ARN es separado en un gel de agarosa desnaturalizante y posteriormente transferido a una membrana de nylon. Despus de la transferencia de estos fragmentos de ARN a la membrana, se agrega una sustancia marcada para permitir la visualizacin de los genes.

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Figura 34. Tcnica de Northern Blot.

PCR cuantitativa o PCR en tiempo real

Al igual que la PCR convencional, se utiliza un molde de ADN, cebadores especficos, dNTP y una ADN polimerasa; a esto se le adiciona una sustancia marcada con fluorforo.

Figura 35. PCR en Tiempo Real. A diferencia de la PCR convencional, los

ciclos se observan desde el inicio.

La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorforo excitado.

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Tabla 2. Diferencias entre PCR convencional y PRC en tiempo real. PCR en Tiempo Real Alta Alta Si Fluorescentes especficos Fluorescencia Amplio rango 1 hs No No PCR Baja Baja No Electroforesis en gel de agarosa Pequeo rango 3-5 hs Electroforesis en gel de agarosa Si

Sensibilidad Especificidad Resultados Cuantitativos Mtodo de deteccin Rango de deteccin Tiempo de reaccin Pasos Post-PCR Contaminacin

Hibridacin Substractiva y Differential Display

Tanto la hibridacin substractiva como el Differential Display son tcnicas comparativas que no requieren conocimiento previo de los genes involucrados pero es necesario el clonado y secuenciacin para la identificacin de los genes expresados diferencialmente.

Figura 36. Expresin diferencial de genes. 1-Hibridacin substractiva. 2. Differential Display. Se expresan y comparan como porcentaje muestras de mRNA en el rumen (1) y abomaso (4) a las 3 y 13 semanas de edad y adultos (18 - a 20 meses de edad) en ganado Holstein.

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Microarrays, Microarreglos o microordenaciones de ADN (chips de ADN)

Se utilizan para examinar la expresin de miles de genes simultneamente. Los microarreglos de ADN son simplemente trozos de vidrio (chips) sobre los que se aplican nuestras de ADN siguiendo un patrn ordenado, es decir, una ordenacin. A menudo estas microordenaciones son producidas por mquinas automticas que ponen gotas microscpicas de muestras especficas de ADN en posiciones especficas del chip. Las muestras de ADN que se pueden aplicar pueden ser cualquier tipo de ADN clonado, pero a menudo son oligonucletidos cortos sintetizados in vitro.
1. Se construye o compra un microarray o chip, que contiene el ADN de cadena simple que representa miles de genes diferentes.

2. Se obtienen dos muestras de clulas, luego de aplicar la droga a una muestra y se recogen las molculas de ARNm.

3. Transcribe el ARNm en ADN complementario ms estable y aade etiquetas fluorescentes verde a ADNc derivado de las clulas no tratadas, y de color rojo a los clulas tratadas. 4. Se aplica la etiqueta de ADNc al chip, la unin ocurre cuando se encuentra con una secuencia complementaria de bases del chip.

5. Se pone el chip en un escner y con clculos computacionales se estiman las tasas de rojo a verde.

6. Se determina si algn gen respondi fuertemente a la droga para promover o reflejar los daos.

Figura 37. Microarrays.

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En un microarreglo de ADN se pueden aplicar ms de 30.000 muestras diferentes, lo que representa miles de genes distintos. Tericamente, todos los genes del genoma de un organismo pueden estar presentes en un microarreglo, lo que permite el anlisis de la expresin gentica de todo el genoma. Los microarreglos de ADN se pueden usar para comparar los patrones de expresin gentica en dos o ms tejidos diferentes, en un mismo tejido en dos momentos diferentes del desarrollo, o en clulas normales respecto de enfermas.

Anlisis en Serie de la Expresin Gnica (SAGE)

Permite conocer y cuantificar la expresin de genes en la clula o tejido mediante la medicin de los ARNm que estn presentes en un momento determinado. Esto permite crear perfiles de expresin de cada clula o tejido en determinadas situaciones. De esta manera se pueden comparar estos perfiles y determinar que genes estn siendo apagados o activados y as determinar cual puede ser la causa. La base de esta tcnica esta en el uso de tags de ADNc que son pequeos fragmentos de ARNm que han sido transformadas a ADNc. Se parte de una muestra de ARNm y aprovechando la caracterstica del ARNm de tener una cola de adeninas en el extremo 3 (poli A), se utiliza un soporte con colas de timinas para provocar la unin de los ARNm al soporte. Estas timinas cumplen la funcin de primers para poder sintetizar ADNc a partir del ARNm por medio de una transcriptasa inversa. Se corta el ADNc a una distancia determinada a partir del soporte de timinas por medio de una enzima de restriccin, dejando extremos adhesivos en el sitio de corte. En el extremo adhesivo se une una molcula llamada linker que posee una enzima de restriccin tipo II que corta nuevamente el ADNc, esta vez dejando un extremo romo. Aqu se obtiene por primera vez un tag de ADN (ARNm), unido a las secuencias que han permitido hibridaciones. Dos tag para formar un ditag, es decir, dos tags junto a dos molculas linkers. Posteriormente se procede a amplificar por PCR para obtener mayor cantidad de ditags y favorecer la secuenciacin. Los ditags se cortan con la primer enzima de restriccin para eliminar los linkers y dejar a los ditags puros y con un extremo adhesivo, permitiendo la unin de estos a una gran hebra de ADNc (ditags) o concatenado de ADNc. ste concatenado se pasa luego a un vector de clonamiento para obtener mltiples copias. Por ltimo se procede a secuenciar este concatenado de ditags, identificando cuantos tags hay en total de cada ARNm, y se procede a identificar qu protena codifican, mediante el uso de una base de datos.

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Figura 38. SAGE. Luego de la obtencin de los ditaq se realiza clonado, secuenciacin y anlisis bioinformtico.

Figura 39. Comparacin de las secuencias de los Tag con bases de datos especficas como SAGE Genie donde ya se encuentran mapeados los tags con sus respectivos genes y permite la identificacin y caracterizacin de los transcriptos

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ARN-Seq

El ARN-Seq se refiere al uso de la secuenciacin de ltima generacin aplicada al anlisis de transcriptomas. Puede realizarse utilizando distintas plataformas: Ilumina, Roche, Solid. Independientemente de la plataforma utilizada la informacin obtenida es la misma. Permite obtener informacin, por ejemplo, como lo diferentes alelos de un gen se expresan, detectar mutaciones post-trascriptacional o identificar las funciones de genes. ARN-Seq proporciona una medicin mucho mas precisa de los niveles de transcriptos y sus isoformas que otros mtodos.

Figura 40. ARN-Seq. Secuenciacin de ltima generacin aplicada al anlisis de transcriptomas.

La secuenciacin a gran escala llevada a cabo en los proyectos genoma constituye la base de partida de la genmica funcional, que tiene como objetivo la

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caracterizacin del proteoma, esto es el conjunto completo de genes que determinan protenas en un genoma, y la caracterizacin de los patrones de expresin gnica. En la actualidad se dispone de numerosas estrategias para identificar el conjunto de genes funcionalmente activos como los microarreglos de ADN, SAGE y mas recientemente la secuenciacin de alto rendimiento.

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GENMICA COMPARATIVA

La Genmica Comparativa, un nuevo campo de la biologa que se desarrolla con rapidez, compara directamente la informacin gentica de un organismo con la de otro. Es un campo con muchas aplicaciones tanto en ciencia bsica como aplicada, incluyendo el descubrimiento de genes, el desarrollo de organismos modelo para enfermedades humanas y animales, la elucidacin de la historia evolutiva entre los genes, genomas y especies, y la relacin entre los organismos y su ambiente. La Genmica Comparativa usa una amplia gama de tcnicas y recursos, incluyendo la construccin y utilizacin de bases de datos que contengan secuencias nucleotdicas y aminoacdicas, tcnicas citogenticas de cartografa gnica como hibridacin in situ fluorescente (FISH), y mtodos experimentales, como mutagnesis. La genmica comparativa utiliza estos recursos para identificar las semejanzas y las diferencias genticas entre organismos, para determinar como estas diferencias contribuyen a las diferencias fenotpicas, de ciclo vital, y para verificar la historia evolutiva de estas diferencias genticas. El anlisis de un nmero cada vez mayor de secuencias genmicas confirma que todos los seres vivos estn relacionados y descienden de un ancestro en comn. Todos los organismos utilizan grupos gnicos parecidos para realizar las funciones celulares bsicas, como la replicacin del ADN, la transcripcin y la traduccin. A partir de los organismos modelo se pueden comparar estas funciones bsicas para estudiar enfermedades hereditarias y analizar la interaccin entre los genes. Para estudiar las homologas entre genomas de especies diferentes se usa el pintado cromosmico comparativo que utiliza sondas marcadas con fluorescencia de una especie e hibridando sobre los cromosomas de otra especie.

Figura 41. Los genes ortlogos son aquellos que descienden de un gen ancestral comn que tienen la misma funcin en diferentes especies. Las

protenas que surgen a partir de la duplicacin de un nico gen se denominan parlogas.

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Definir el nmero mnimo de genes para la vida es una tarea que implica mtodos comparativos y experimentales. La aproximacin comparativa se basa en la premisa que es probable que los genes compartidos por organismos alejados sean esenciales para la vida. Comparando los conjuntos de genes compartidos por organismos diferentes sera posible catalogar los compartidos y desarrollar una lista de genes que se consideraran indispensables para la vida. Los genes ortlogos son aquellos que descienden de un gen ancestral comn que tienen la misma funcin en diferentes especies. As por ejemplo Mycoplasma genitalium comparte 240 genes ortlogos con Haemophilus influenzae adems se identificaron 16 genes cuyas secuencias son diferentes pero realizan la misma funcin. Mycoplasma genitalium tiene un genoma con 480 genes que codifican protena, lo que representa el genoma bacteriano mas pequeo de entre los casi 150 genomas secuenciados hasta la fecha. Los genes que pertenecen a familias multignicas comparten secuencias de ADN similares pero no idnticas como resultado de una mutacin en linaje con un nico gen ancestral. Sus productos a menudo son diferentes con funciones parecidas pero sus genes no siempre se encuentran en una misma localizacin del cromosoma.

Figura 42. Mapeo comparativo entre cromosomas de pollo, bovino, humano, ratn y perro.

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Las familias multignicas permiten aportan conocimientos sobre la evolucin del genoma. Las protenas que surgen a partir de la duplicacin de un nico gen se denominan parlogas. La familia de la globina es un ejemplo de familia multignica parloga que surgi por duplicacin y dispersin a diferentes sitios cromosmicos. Las familias multignicas estn presentes en muchos genomas. Adems de las amplias y grandes mutaciones de los genes pequeos bloques de genes pueden duplicarse mediante diversos mecanismos. La filogenia molecular ha trazado el linaje y las relaciones entre los miembros de las familias gnicas. Uno de los ejemplos mejor estudiados de divergencia es la superfamilia gnica de las globinas. En esta familia hace 800 aos se produjo la duplicacin de un gen ancestral que codificaba a una protena de transporte de oxgeno. De los dos genes generados, uno evolucion hasta la mioglobina actual y el otro en el gen de la globina ancestral el que se duplic y form los prototipos de las subfamilias gnicas de la y globina. Otros patrones se observan en otras familias gnicas las que son intensamente estudiadas en el genoma humano.

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LA PROTEMICA
Esta rama se ocupa de Identificar y analizar las protenas de una clula. El Proteoma define el conjunto completo de protenas codificadas por un genoma. En la mayora de los genomas secuenciados se desconoce la funcin de muchos de los genes recin descubiertos. Muchas veces se le asigna una funcin por su homologa con genes conocidos. En E coli y S cerevisiae se desconoce la mayor parte de la funcin de los genes codificados al igual que en humanos. A medida que se dispone de ms datos de las secuencias de los eucariotas se hace evidente que su complejidad no esta necesariamente correlacionada con la cantidad de genes. Por ejemplo Drosophila tiene menos genes que C. elegans pero no es menos complejo que el nemtodo. La relacin entre gen y producto gnico es compleja. Los genes pueden tener sitios mltiples de inicio de la transcripcin que produce varios transcriptos distintos. El corte y empalme alternativo y la edicin de las molculas generan docenas de protenas diferentes a partir de un nico gen. En humanos se estima que el 40 60% producen ms de una protena por ese motivo. El anlisis de la funcin proteica se ve dificultado por el hecho de que muchas protenas trabajan va interacciones protena protena o como parte integrante de un gran complejo molecular. La protemica se utiliza para reconciliar las diferencias entre el nmero de genes de un genoma y el nmero de protenas (producto final) observadas en la clula. Proporciona informacin sobre la funcin de las protenas, su estructura, las modificaciones post-traduccionales, las interacciones protenicas sus variantes y las relaciones con otras protenas del genoma. La protemica utiliza tcnicas para separar e identificar las protenas aisladas. La combinacin de tcnicas implica un gel de electroforesis bidimensional (2DGE) y espectrometra de masas. En la primera las protenas extradas de una clula se cargan en un gel de poliacrilamida y se separa segn su carga elctrica. El gel se rota 90 y las protenas se separan segn su peso molecular. Las modernas tcnicas de espectrometra de masas permiten determinar con precisin la masa de molculas. Uno de estos mtodos se denomina ionizacin por lser asistida por matriz (MALDI). Se pueden identificar cientos de protenas por da y los bancos de espectrmetros pueden procesar cientos de muestras en un solo da. Nuevos instrumentos se estn desarrollando para el procesado de muestras con ms rapidez, sensibilidad y precisin.

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