Prctica No.4.

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA FORMIATO DESHIDROGENASA Y NITRATO REDUCTASA EN Escherichia coli

LAB. DE FISIOLOGA Y BIOQUMICA MICROBIANA

ALUMNOS: Anselmo Nava David Ricardo Prez Martnez Carmina Guadalupe Prez Torreblanca Misael

PROFESORAS: De Lira Torices Antonia Ericka Fecha de entrega: 25/Marzo/2014

OBJETIVO GENERAL.

DESARROLLO: En esta prctica se busco conocer la actividad de las enzimas formiato deshidrogenasa, nitrato reductasa y el complejo formiato deshidrogenasa nitrato reductasa para ello se llev a cabo el procedimiento: Para iniciar se necesitaba la obtencin del cultivo, de la cepa de nuestro inters, en este caso, Escherichia coli, la cul se sembr en varias asadas a 200 mL de cultivo adicionado de glucosa, se incub a 37C durante 18 horas. Una vez que finaliz el tiempo, se inoculan 1 matraz con 40 mL, el cul ya debe contener 800 mL de medio de cultivo, esto se repite con 2 matraces ms, en un cuarto matraz se inocula con 20 mL del cultivo y 400 mL de medio de cultivo. Al sistema 1 (matraz 1), se agrega adems oligoelementos (FeSO4.7H2O, Na2MoO4 y H2SeO3) los cules sirven como cofactores, 25 mL de aceite mineral estril para asegurar condiciones anaerbicas e incuban a 37C durante 6 horas. Al sistema 2 se agrega KNO3 como aceptor articial de electrones en la cadena respiratoria, oligoelementos y 25 mL de aceite mineral estril, incubndose posteriormente a 37C curante 6 horas. Al sistema 3 se agrega KNO3 y 25 mL de aceite mineral estril, se incuba a37C por 6 horas.

Al sistema 4 se agrega KNO3, oligoelementos y se incuba a 37C en agitacin durante 6 horas. Al trmino de las 6 horas se recuperan las clulas por separado, de cada sistema, y se lavan 3 veces con regulador de fosfatos para regular el pH. Despus se resuspende cada paquete celular (1-4) en un volumen pequeo de regulador TMK-20, al cual se agrega sacarosa al 20% y 2 mg/mL de lisozima, esto para que se lise la clula pero que se mantengan las propiedades del contenido celular que nos interesan. Se deja reposando nuestras suspensiones a temperatura ambiente durante 15 minutos y posteriormente se congelan en bao de hielo seco- etanol y se descongelan a bao mara a 37 C, repitindose este proceso hasta que muestren una consistencia viscosa, este choque trmico sirve para fragmentar las clulas. Se agrega regulador de fosfatos que contenga 10 g/mL de DNasa, esto para mantener nuestro contenido celular de inters a la vez que la enzima DNasa rompe cidos nucleicos, se homogeniza hasta que desaparezca la viscosidad, a esto le llamamos extractos crudos. Determinacin de actividades enzimticas de cada uno de los extractos crudos provenientes de las 4 condiciones de cultivo. Primero se evalu la actividad de la formiato deshidrogenasa mediante un ensayo espectrofotomtrico, utilizando formiato de sodio como donador artificial de electrones, metosulfato de fenazina como acarreador, 2,6.diclorofenol indofenol como aceptor artificial de electrones y las clulas para proporcionar la enzima y se llevara a cabo la actividad y poderse leer a 600 nm. Posteriormente se midi la actividad de la nitrato reductasa mediante el empleo de KNO3 como aceptor de electrones; benzil violgeno aceptor de electrones extracto celular y regulador de fosfatos para regular el pH, adems se paso una corriente de nitrgeno e inmediatamente se tap, para generar las condiciones anaerbicas del medio y activar a la nitrato reductasa. Se preincub 15 minutos e inyect hidrosulfito de sodio como donador artificial de electrones para que se lleve a cabo la reaccin enzimtica, al agregarlo se forma una coloracin azul, si esta desaparece por el consumo de hidrosulfito de sodio,que actua como agente reductor de bencil viologeno se agrega ms. Al finalizar la incubacin se destapa y se agita vigorosamente hasta la desaparicin del color esto para parar la reaccin y se cuantifican los nitritos liberados durante los 15 minutos de incubacin. Se repite dicho proceso con un testigo que no contenga extracto celular para verificar que la cuantificacin sea debida a la reaccin enzimtica. La actividad del complejo formiato deshidrogenasa nitrato reductasa se midi mezclando KNO3, como aceptor de electrones, extracto enzimtico diluido 1:20 para el primer extracto y 1:40 para el resto, llevando a un volumen final de 2.4 mL con regulador de fosfatos, se pasa una corriente de nitrgeno para generar las condiciones anaerbicas del medio; adems de oxidar al oxgeno para la formacin de nitritos, permite la activacin del complejo, se inyeccin de formiato de sodio que acta como donador de electrones. La cuantificacin de nitritos liberados se toman las soluciones de la actividad de nitrato reductasa y del complejo formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa y se agrega en una proporcin 1:1 sulfanilamina al 4% y N-naftil etilendiamina al 0.08%, se mezcla e incuba hasta el desarrollo de

color, se hace por un mtodo espectrofotomtrico a una absorbencia de 520 nm, elaborando a su vez una curva tipo de nitritos. La determinacin de la protena se lleva a cabo por el mtodo de Lowry a cada extracto (1-4), a 0.5 mL de las muestras de concentracin 0-500 g de protena (albumina), NaOH 1N, se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos, se aade Na2CO3 al 2% y 1 mL CuSO4.5H2O, el cul aumenta la sensibilidad en la determinacin de protenas, se incuba por 10 minutos y se agrega 0.5 mL de reactivo de Folin diluido, el cual se reduce en presencia de protenas. Este reactivo es una disolucin de tungstato sdico y molibdato sdico en cido fosfrico y cido clorhdrico. Donde el Cu2+, en medio alcalino, forma un complejo con los enlaces peptdicos de las protenas reducindose a Cu+. Este ion, as como los grupos R de los residuos de tirosina y triptfano de las protenas, reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo inicialmente un producto inestable, que se reduce para formar un compuesto coloreado. Entonces, la intensidad de color producido es proporcional a la cantidad de protena que se encuentre presente. Y por un mtodo espectrofotomtrico (600 nm) se determina la cantidad de protena que est presente.

1.- Contenido de protena en cada extracto Tabla 1.- Curva tipo de protena Tubo No. 1 2 3 4 5 6 g de albumina 0 100 200 300 400 500 Absorbancia a 600 nm 0 0.308 0.442 0.596 0.781 0.945

Grafica 1. Curva tipo de protenas.

absorbancia a 600 nm
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 100 200 300 400 500

Curva tipo de proteina

y = 0.0018x + 0.0621 R = 0.9845

600 g de protena

Tabla 2. Datos de protenas en el los extractos crudos de cultivo. Extracto de los cultivos 1 2 3 4 Alcuota de la dilucin 0.3 0.5 0.3 0.5 0.3 0.5 0.3 0.5 Absorbancia a 600nm 0.303 0.495 0.321 0.514 0.336 0.520 0.268 0.443 g de protena/ml (promedio) 18.54 19.63 18.69 16.08

Para obtener el total de protena/m de los extractos celulares realizamos lo siguiente: Primero interpolamos los valores de la tabla 2 de las absorbancias obtenidas en cada extracto a diferentes alcuotas (0.3 y 0.5) con nuestra grafica o curva tipo de protenas (grafica 1), o bien usamos ecuacin de la recta de esa grfica y obtenemos los g de protena. Ejemplo: Extracto 1 Alcuota de 0.3 Alcuota de 0.5 Pasamos a mg 1 mg -------1000 g 1 mg -------1000 g

X0.3 ---------- 133.88 g X0.5---------- 133.88 g X= 0.1338 mg x= 0.2405 mg

De estos datos obtenemos los mg/ml de la siguiente manera. mg/ml = (mg) (FD) (1/alcuota) para alcuota de 0.3 ml mg/ml = (0.1338) (40) (1/0.3) = 17.84 para alcuota de 0.5 ml mg/ml = (0.2405) (40) (1/0.5) = 19.24 promediamos estos valores mg/ml= (17.84+19.24)/ 2 = 18.54 mg/ml yasi para todos los extractos.

2. Actividad de formiato deshidrogenasa Tabla 3. Valores de absorbancia de la actividad de formiato deshidrogenasa a diferentes tiempos. Tiempo (minutos) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1.356 1.086 0.977 0.924 0.881 0.850 0.785 0.739 0.694 0.654 0.623 2 1.428 1.317 1.255 1.218 1.177 1.146 1.115 1.069 1.069 1.026 0.998 Extractos de cultivos a 600 nm 3 4 1.186 0.987 1.180 0.893 1.175 0.821 1.171 0.774 1.167 0.716 1.156 0.648 1.156 0.588 1.154 0.529 1.151 0.475 1.142 0.413 1.142 0.387 Testigo 1.009 1.005 1.137

Para obtener la actividad enzimtica de formiato deshidrogenasa se realiz lo siguiente: Ejemplo: Para extracto 1 Se obtuvo la diferencia de absorbancias (A), para cada extracto, esto fue restando la absorbancia final menos la absorbancia final. A600 = Ai- Af = 1.356 0.623 = 0.733 Luego lo expresamos en ml de la siguiente manera. A600/ml = (A600) (FD) (1/alcuota) A600/ml = (0.733) (20) (1/.1) = 146.6 A600/ml Despus se les resta el valor del testigo, que tambin se calcula tomando en cuenta el valor de absorbancia inicial menos la absorbancia final, en nuestro caso se considera como 0, ya que la resta nos da un nmero negativo. A600/ml - A600 Testigo = 146.6 0 = 146.6 A600/ml Posteriormente lo dividimos entre el tiempo en minutos sonde se detuvo la reaccin, es decir, donde ya no hubo variacin en el registro de absorbancia. (146.6 A600/ml) / 10 min = 146.6 146.6 A600/ml/min Se realiza as para cada uno de los extractos.

Tabla 4. Actividad de formiato deshidrogenasa Extracto A600/ml/min g de protena/ml (promedio) 1 14.64 18.54 2 8.6 19.63 3 1.76 18.69 4 12.18 16.08 A600/min/mg de protena. 0.7896 0.4381 0.0941 0.7574

Por ultimo estos valores se dividen por los g de protena/ml que se obtuvieron en la tabla 2. Para poder obtener A600/min/mg de protena. 14.64/18.54 =0.7896 A600/min/mg de protena. Se realiza lo mismo para cada extracto. 3. Actividad de nitrato reductasa. Tabla 5. Curva tipo de nitritos Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 Nanomoles de nitrito 0 5 10 20 30 40 50 Absorbancia a 520 nm 0 0.123 0.204 0.400 0.381 0.781 0.945

Grafica 2. Curva tipo de nitritos.

Absorbancia a 520nm
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 40 50 60

Curva tipo de nitritos

y = 0.0188x + 0.0166 R = 0.999

1.2

Nanomoles de nitrito

Tabla 6. Determinacin total de nitrato reductasa. Extractos de clulas 1 2 3 4 Testigo Dilucin 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200 Alcuota 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 Absorbancia a 520nm 0.376 0.227 0.226 0.470 0.160 nmoles de nitrito/ ml /min 4776.54 2769.91 2226.89 6028.30 -

NOTA: se trabaj con los datos del equipo 6, ya que los resultados de equipo no salieron. Para obtener los nmoles de nitrito/ ml para cada extracto, se realiza lo siguiente: Ejemplo Para extracto 1. Primero interpolamos los valores de la tabla 6 de las absorbancias a 520 nm obtenidas en cada extracto con nuestra grafica o curva tipo de nitratos (grafica 2), o bien usamos ecuacin de la recta de esa grfica y obtenemos los nmoles de NO2 Extracto 1 absorbancia a 520 nm = 0.376
2

Expresamos ese valor en nmoles de nitrito/ ml de la siguiente manera: nmoles de NO2/ml = (nmoles de NO2) (FD) (1/alcuota) = (19.11)(200)(10)=

Luego ese valor lo restamos con el valor de nmoles de NO2 del testigo. nmoles de NO2 problema - nmoles de NO2 testigo = 38220-7.627 = 38212.37 de nmoles de NO2 NOTA: los de nmoles de NO2 del testigo se sacaron interpolando y/o usando la ecuacin de la resta de la grfica 2
2

Como siguiente paso tenemos que dividirlo entre los minutos que dur la reaccin. 38212.37 de nmoles de NO2 / 8 min = 4776.54 nmoles de nitrito/ ml / min Lo mismo realizamos para los dems extractos.

Tabla 7. Actividad de nitrato reductasa. Extracto nmoles de NO2/ml/min 1 2 3 4 4776.54 2769.91 2226.89 6028.30 g de protena/ml nmoles de NO2 (promedio) /min/mg de protena. 18.54 257.63 19.63 141.10 18.69 119.14 16.08 374.89

Por ultimo estos valores que obtuvimos de nmoles de NO2/ml/min se dividen por los g de protena/ml que se obtuvieron en la tabla 2. Para poder obtener nmoles de NO2 /min/mg de protena. Ejemplo para extracto 1 4776.54/18.54 =257.63 nmoles de NO2 /min/mg de protena. Se realiza lo mismo para cada extracto. 4. Actividad de complejo formiato deshidrogenasa-nitrito reductasa. Tabla 8. Determinacin del complejo formiato deshidrogenasa-nitrato reductasa. Extractos de clulas 1 Dilucin 1:20 Alcuota 0.1 Absorbancia a 520nm 0.756 nmoles de nitrito/ ml /min 1573

2 3 4 Testigo

1:20 1:20 1:20 1:20

0.1 0.1 0.1 0.1

0.409 0.125 0.730 0.052

115.13 417.258 758.74 -

Para obtener los nmoles de nitrito/ ml para cada extracto, se realiza lo siguiente: Ejemplo Para extracto 1. Primero interpolamos los valores de la tabla 8 de las absorbancias a 520 nm obtenidas en cada extracto con nuestra grafica o curva tipo de nitratos (grafica 2), o bien usamos ecuacin de la recta de esa grfica y obtenemos los nmoles de NO2 Extracto 1 absorbancia a 520 nm = 0.756
2

Expresamos ese valor en nmoles de nitrito/ ml de la siguiente manera: nmoles de NO2 /ml = (nmoles de NO2) (FD) (1/alcuota) = (39.32)(20)(10)(2)*= 15731.391 *se multiplica por 2 porque se realiz una dilucin extra. Luego ese valor lo restamos con el valor de nmoles de NO2 del testigo. nmoles de NO2 problema - nmoles de NO2 testigo = 157319.14-1.88 = 15730.03de nmoles de NO2 NOTA: los de nmoles de NO2 del testigo se sacaron interpolando y/o usando la ecuacin de la resta de la grfica 2
2

Como siguiente paso tenemos que dividirlo entre los minutos que dur la reaccin. 15730.03 de nmoles de NO2 / 10 min = 1573 nmoles de nitrito/ ml / min Lo mismo realizamos para los dems extractos. Tabla 9. Actividad del complejo formiato deshidrogenasa-nitrato reductasa. Extracto nmoles de NO2/ml/min 1 2 3 1573 115.13 417.258 g de protena/ml nmoles de NO2 (promedio) /min/mg de protena. 18.54 84.84 19.63 5.86 18.69 22.32

758.74

16.08

47.18

Por ultimo estos valores que obtuvimos de nmoles de NO2/ml/min se dividen por los g de protena/ml que se obtuvieron en la tabla 2. Para poder obtener nmoles de NO2 /min/mg de protena. Ejemplo para extracto 1 1573/18.54 =84.84nmoles de NO2 /min/mg de protena. Se realiza lo mismo para cada extracto.

Tabla 10. Actividad enzimtica de extractos de E.coli en diferentes condiciones de crecimiento. Contenido de protena y actividad enzimtica Extracto de clulas E.coli nativa crecidas en condiciones: Anaerobias Aerobias 1 2 3 4 Sin NO3 + Con NO3 + Con NO3 Con NO3 + oligoelementos oligoelementos sinoligoelementos oligoelementos 18.54 19.63 18.69 16.08 0.7896 0.4381 0.0941 0.7574 4776.54 2769.91 2226.89 6028.30

mg de protena/ml de extracto Actividad especfica de FoDHasa (A600/min/mg de protena) Actividad especfica de NRasa (nmoles de NO2 /min/mg de protena) Actividad especfica del complejo (nmoles de NO2 /min/mg de protena)

84.84

5.86

22.32

47.18

DISCUSION SOBRE LOS VALORES DE NITRATOS QUE NO OBTUBE!!

Posiblemente no agregue nitritos aunque yo recuerdo que fue lo primero que agregue. Pero el no haber desarrollado color quiere deir que no puse clulas ya que si no habra egregadobenzilbiologeno, no se hubiera dado la coloracin en un principio cuando adicione solucin 3, pero si sedio, pero no se mantuvo el color el tiempo esperado,

Eso creo que pudo haver pasado.. Nos vemos!!!