VALIDACION DE UN METODO POR ESPECTROFOTOMETRA UV-VIS PARA LA DETERMINACION DE TRAZAS DE RANITIDINA Y AMLODIPINO DESPUES DE LA SANITACIN DE REAS O EQUIPOS

Laura Echeverry1, Fabricio Castrilln2, Sebastin Lpez3, Juan Bustamante4 1, 2, 3,4 Estudiantes de la Facultad de Qumica Farmacutica Universidad de Antioquia

INFORMACION DEL ARTICULO

Historia del artculo: Elaborado en febrero de 2014 Palabras claves Espectrofotometra UV-VIS Ranitidina Amlodipino Trazas Linealidad Exactitud Sensibilidad Recuperabilidad

R E SU M E N En este artculo se presenta los resultados del desarrollo y la validacin de los mtodos analticos, los cuales se realizaron mediante la evaluacin de diferentes parmetros como la linealidad, exactitud, sensibilidad y recuperabilidad, para el principio activo de ranitidina e igualmente para el principio activo del amlodipino. Cada parmetro fue evaluado mediante diferentes criterios de aceptacin por medio de

pruebas estadsticas aplicables. En el caso de la linealidad los criterios de aceptacin fueron; coeficiente de correlacin (r), coeficiente de determinacin (r2) y la comparacin de lneas de regresin; en cuanto a la exactitud, se tiene el porcentaje de recuperacin (%R), coeficiente de variacin (CV) y el anlisis de varianza; con la sensibilidad, el lmite de deteccin (LD) y el lmite de cuantificacin (LC) y con la recuperabilidad, el porcentaje de recuperacin (%R), colector, agitacin y factor de recuperacin. Con los datos obtenidos en las diferentes pruebas y cumpliendo con los rangos de aceptacin esperados se concluye que los mtodos validados por espectrofotometra UVVIS son adecuados y confiables para la determinacin de trazas de ranitidina y amlodipino luego de los lavados en las diferentes reas y equipos donde son manipulados; adems, debido a la escasez de datos asociados con el estudio, este trabajo produce una base de datos til para el campo farmacutico.

Introduccin Las trazas en el campo de la produccin farmacutica son residuos o restos de principios activos de un medicamento o producto terminado que quedan sobre una superficie o equipo despus de haberse sometido a un proceso de limpieza. Estas se pueden encontrar en una variedad de concentraciones, sin embargo lo ideal es que sea mnima, pero que la cantidad que est presente pueda ser detectable cuantificable

con un mtodo analtico eficaz y con alta recuperabilidad (1). La importancia de su determinacin radica en que permite identificar si el proceso de limpieza del producto farmacutico se estn realizando de una forma adecuada, de tal manera que proporcione un alto grado de confianza y seguridad en los resultados del proceso de limpieza y garantice la menor posibilidad de una contaminacin cruzada; la

cual conlleva a la perdida de dinero, tiempo, insumos y dems recursos de la industria (2). Los medicamentos trabajados en este anlisis fueron la Ranitidina; antihistamnico H2, la cual tiene como presentacin comercial en tabletas de 150mg y 300mg y el Amlodipino que es un calcioantagonista y su presentacin comerciales tabletas de 10mg y 5mg. El inters en el campo industrial con estos dos medicamentos es evitar principalmente contaminaciones que se puedan afectar la calidad del producto terminado, o problemas de salud debido a la alteracin de los medicamentos. RANITIDINA

La validacin de un procedimiento analtico es la confirmacin y evidencia documentada que se establece por medio de estudios en un laboratorio, que producen datos que demuestran cientficamente que el mtodo analtico tiene las caractersticas de desempeo adecuadas de seguridad y confiabilidad para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analticas pretendidas. Validar es necesario cuando se est desarrollando o implementando una metodologa nueva, o sea necesario comparar dos tcnicas (4). La validacin implica la demostracin de varios parmetros de desempeo del mtodo, en los culs se encuentran: la linealidad; habilidad del mtodo para obtener resultados directamente proporcionales a la concentracin de analito en la muestra, exactitud; cercana entre el valor que es aceptado o de referencia y el valor encontrado experimentalmente, selectividad; habilidad para diferenciar entre varias sustancias e interferencias en la muestra al analito de inters, lmite de deteccin; cantidad mnima de analito en una muestra que puede ser detectada, lmite de cuantificacin; cantidad mnima del analito en una muestra que puede ser determinado cuantitativamente con exactitud, porcentaje de recuperabilidad; capacidad del mtodo para determinar una concentracin conocida de analito (5). La Espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales de anlisis ptico muy utilizado para la deteccin especfica de molculas. Se caracteriza por su precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomolculas, etc). Esta tcnica aprovecha la

AMLODIPINO

La Ranitidina Clorhidrato presenta por espectrofotometra UV-VIS un mximo de absorcin en solucin acuosa a 313 nm, mientras que el Amlodipino presenta un mximo de absorcin en 239nm usando metanol como solvente (3).

propiedad que tienen las molculas para absorber energa, lo cual permite la deteccin de la cantidad de luz que absorbe una molcula en una longitud de onda determinada, produciendo un espectro de absorcin que le proporciona identidad a cada sustancia o molcula. La cantidad de sustancia presente en la muestra que se analiza es determinada a travs de la ley de beer o ley de Lambert a travs de la absorbancia o la transmitancia. La espectrofotometra ultravioleta-visible (UV/VIS) se utiliza para identificar algunos grupos funcionales de molculas, adems permite determinar el contenido y fuerza de una sustancia, cuantificar los componentes de soluciones y determinar pequeas cantidades de cierta sustancia, como las trazas (6). 2. Mtodos y materiales

Tabla1. Curva de calibracin para linealidad y Exactitud Selectividad

2.3. Preparacin de la muestra de Placebo (tableta de 150mg y 300 mg) cargado con Ranitidina HCL Debido a que el peso obtenido de placebo equivalente a la tableta de 150 mg y 300 mg era muy similar se decidi trabajar con un solo peso equivalente de placebo, en este caso 83 mg promedio de ambos. Luego se prepar de igual forma una solucin madre de placebo equivalente a 200 ppm (mg/L) de principio activo, de la cual se parti para preparar las dems concentraciones requeridas usando los mismos volmenes de la solucin madre principio activo (200 ppm) y de placebo (equivalente a 200 ppm) para cada concentracin y luego aforando con agua purifica. 2.4. Preparacin de la muestra de Placebo (tabletas 10mg y 5mg) cargado con Amlodipino. Para la preparacin del placebo cargado primero se calcul el peso equivalente de placebo para una concentracin de 200 ppm (mg/L) del principio activo de Amlodipino (92 mg) y del placebo tabletas (368.0 mg) se prepar la solucin madre, de la cual se

2.1. Reactivos Qumicos Agua purificada (MiliporeDirect-Q), Metanol GR (Merck), Ranitidina HCL (lote 241203942001, potencia 100%, FR 08/2014, FV06/2017, suministrada por Laboratorios LAPROFF), Amlodipino (lote 241209471003, potencia 99.1%, FR 09/2013, FV 08/2017 suministrado por Laboratorios LAPROFF). 2.2. Preparacin de la muestra de Ranitidina HCL y Amlodipino Se prepar 250 ml de una solucin madre de ambos principios activos en agua destilada a una concentracin de 200 ppm (mg/L), de la cual se parti para preparar las concentraciones necesarias para la evaluacin de los diversos parmetros para la validacin de la tcnica analtica (Tabla1).

prepararon necesarias.

las

dems

concentraciones

curva y determinar su exactitud. Se calcul el %R, CV y un anlisis de varianza mediante la prueba G. (Tabla 1). 2.9. Sensibilidad Con los datos obtenidos en el parmetro de exactitud y las ecuaciones de la recta halladas en la linealidad para cada principio activo, se procedi a determinar los lmites de cuantificacin y de deteccin del mtodo para cada analito de inters. 2.10. Recuperabilidad Para la evaluacin del parmetro recuperabilidad en una superficie limpia y desinfectada se realizan 8 cuadros 10cm x 10 cm. Sobre cada cuadricula se adiciona 1ml de solucin madre y se recolectaron con: colector- gaza 1,2 y blanco y colectoraplicador 1,2 y blanco, el cual se introducen en un frasco con 19 ml de solvente para obtener una concentracin final de 10ppm. Luego se someten a agitacin mecnica y agitacin manual por 1 minuto y se procede a leer la absorbancia. 2.11. Anlisis estadstico Los diferentes criterios de aceptacin aplicados a los parmetros estadsticos evaluados, fueron comparados con los valores de referencia establecido por Laboratorios Laproff para la aceptacin de mtodos de anlisis de sus producto y procesos (tablas 2 y 3).

Las concentraciones para realizar la prueba de linealidad y exactitud selectividad se realiz tomando volmenes iguales tanto de la solucin madre de principio activo como de la solucin madre de placebo (Tabla 1). 2.5. Solubilidad La prueba de solubilidad de ambos principios activos se realiz de acuerdo a lo establecido en la farmacopea 32, en 5 solventes de inters (agua, etanol, metanol, HCl y NaOH). 2.6. Determinacin de interferencias (pruebas de barrido) Se realizaron barridos espectrofotomtricos (Genesys 10S UV-Vis) a las soluciones de principio activo, placebo y placebo cargado de ambos principios activos a una concentracin de 10 ppm entre un rango de 200 y 400 nm, con el fin de determinar posibles interferencias entre el analito y el placebo. 2.7. Linealidad Para determinar la linealidad del mtodo, se prepararon a partir de la solucin madre de 200 ppm (mg/L) 6 concentraciones (2, 6, 8, 10, 16 y 20 ppm) del principio activo de Ranitidina HCL y de placebo cargado de Amlodipino, esto se hizo por triplicado, luego se realiz una regresin lineal a ambos principios activos y se les calculo el r y el r2. 2.8. Exactitud Teniendo como referencia la ecuacin de la recta obtenida en el parmetro de linealidad, se prepararon 3 nuevas concentraciones de principio activo de Ranitidina HCL y de placebo cargado de Amlodipino (6, 10 y 16 ppm) por triplicado, con las cuales se ret la

Tabla 2. Anlisis de varianza Ranitidina

Grafico 1. Solubilidad de la Ranitidina en agua

Tabla 3. Anlisis de varianza Amlodipino

3. Resultados y discusin El mtodo analtico utilizado para La determinacin de trazas de Ranitidina HCL y Amlodipino fue la Espectrofotometra UV-VIS ya que este tipo de anlisis necesita resultados en un corto tiempo, pues de ellos dependen decisiones como: liberacin de reas y equipos liberar el producto y as continuar con la siguiente produccin. Esta tcnica analtica ha demostrado ser apropiada para la evaluacin de trazas de estos productos porque al evaluar parmetros como la exactitud, linealidad, sensibilidad, lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y recuperabilidad donde se obtuvieron resultados esperados dentro de las especificaciones establecidas por el laboratorio Laproff donde se realiz este trabajo. Los resultados obtenidos en la evaluacin de cada parmetro para la Ranitidina son los siguientes: en la realizacin de la prueba de solubilidad en la cual se busca el mejor solvente para este principio activo se realiz lo establecido en la farmacopea 32, donde utilizan cinco solventes que fueron agua, HCL, metanol y etanol, el mejor solvente fue el agua donde se estuvieron dos picos, el primero con una = 229nm y una absorbancia de 0.454 y el segundo con una = 313nm y una absorbancia de 0.454 (grficos 3 y 4).

Grafico 2. Solubilidad de la Ranitidina en metanol

En la determinacin de interferencias entre el principio activo y el placebo, se realiz un barrido de tres soluciones en el cual se determin que entre el placebo y la ranitidina no haba interferencias significativas, por lo tanto durante el proceso solo se trabaj con principio activo (grafico 3).

Grafico 3. Interferencia entre ranitidina y placebo.

Grafico 4. Linealidad Ranitidina HCL

La linealidad es la capacidad de un mtodo de anlisis, dentro de un determinado intervalo, de dar una respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad del analito que se habr de determinar en la muestra de laboratorio. En la evaluacin de la linealidad de la ranitidina se observ una gran correlacin entre las concentraciones de esta y la respuesta del equipo, ya que nos arroj un coeficiente de determinacin de 0.9992 y esto nos garantiza una buena calidad del modelo para replicar los resultados (tabla 4) (grafico 4).
Tabla 4. Linealidad Ranitidina HCL

En la prueba de sensibilidad se determinaron los lmites de deteccin y de cuantificacin donde se obtuvieron valores para la Ranitidina de LD 0.04ppm y LC 0.04 ppm estando estos dentro de los criterios establecidos donde estos valores deben estar por debajo de 10ppm En la prueba de recuperabilidad se vio una similitud en los resultados tanto usando como colector el aplicador como con gasa, y adems tambin usando la agitacin mecnica como la manual, aunque el mtodo en el cual se present una mayor recuperabilidad fue la agitacin manual utilizando como colector el aplicador. (Tabla 5).
Tabla 5. Test de Recuperabilidad de Ranitidina
Absorbancia Absorbancia Corregida Concentracin Terica Concentracin Experimental % Recuperacin %R promedio

Blanco Ap Ap / Ma 1 Ap / Ma 2 Ap / Me 1 Ap / Me 2 Blanco Ga Ga / Ma 1 Ga / Ma 2 Ga / Me 1 Ga / Me 2

0,007 0,416 0,441 0,393 0,343 0,001 0,407 0,435 0,380 0,391

0,409 0,434 0,386 0,336 0,406 0,434 0,379 0,39

10,10 10,10 10,10 10,10 10,10 10,10 10,10 10,10

9,33 9,91 8,81 7,67 9,27 9,91 8,65 8,90

92,42 98,07 87,22 75,92 91,74 98,07 85,64 88,13

95,25 81,57

94,91 86,88

En cuanto a los resultados para el amlodipino durante la prueba de solubilidad se realiz el mtodo anteriormente mencionado y fue

evaluado en los cinco solventes de inters, como resultado se encontr que el solvente donde se presentaba una mejor solubilidad era el metanol donde se obtuvieron tres picos, el primero con una = 213nm y una A=0.375, el segundo con una = 238nm y una A= 0.345 y el tercero a con una = 359nm y una A= 0.131. (Graficos 5, 6 y 7).

Grafico 7. Solubilidad del amlodipino en HCL

Grafico 5. Solubilidad del amlodipino en metanol.

En la evaluacin de las posibles interferencias entre el principio activo y el placebo se realizaron barridos espectrofotometricos donde se encontr que entre el amlodipino y el placebo si haba interferencia, con este resultado se decide trabajar durante los siguientes anlisis con placebo cargado (Grafico 8).
Grafico 8. Interferencias entre Amlodipino y placebo.

Grafico 6. Solubilidad del amlodipino en etanol.

Aunque en la linealidad del amlodipino no se obtuvo un coeficiente de determinacin tan alto como con la ranitidina, cabe resaltar que el que nos dio es ms que aceptable, (0.9974 fcilmente podra predecir futuros resultados) y adems recordar la interferencia que presentaron los excipientes a la hora de hacer las lecturas (tabla 6) (grafico 9).

Tabla 6. Linealidad Amlodipino Tabla 7. Test de Recuperabilidad de Amlodipino

Absorbancia Absorbancia Corregida Concentracin Terica Concentracin Experimental % Recuperacin %R promedio

Blanco Ap Ap / Ma 1 Ap / Ma 2 Ap / Me 1 Ap / Me 2 Blanco Ga Ga / Ma 1 Ga / Ma 2 Ga / Me 1 Ga / Me 2

0,023 0,199 0,134 0,164 0,170 0,123 0,456 0,468 0,433 0,433

0,176 0,111 0,141 0,147 0,333 0,345 0,31 0,31

9,76 9,76 9,76 9,76 9,76 9,76 9,76 9,76

5,29 3,64 4,40 4,56 9,28 9,59 8,70 8,70

54,22 37,29 45,11 46,67 95,10 98,22 89,11 89,11

45,76 45,89

96,66 89,11

Grafico 9. Linealidad Amlodipino

Al evaluar la sensibilidad del mtodo con el amlodipino se determinaron los lmites de deteccin y de cuantificacin y se obtuvieron como resultado un LD de 0.25ppm y un LC de 0.73 ppm, estos resultados cumplen con el criterio de aceptacin donde se establece que los valores deben ser menores a 10ppm. Durante la prueba de recuperabilidad del amlodipino se vio una clara superioridad en la recuperacin por el mtodo de agitacin manual utilizando como colector una gasa, debido a que se hizo muy difcil realizar la coleccin con el aplicador (tabla 7).

4. Conclusiones Se logr validar los diferentes parmetros para la determinacin de trazas de Ranitidina y Amlodipino por Espectrofotometra UV-VIS, para esto fue fundamental la utilizacin de solventes donde se solubilizaran dichos productos. Durante la misma etapa con base a los resultados obtenidos la metodologa demostr ser precisa, lineal, exacta, sensible, recuperable frente a la comparacin de la muestra original con los placebos cargados, tanto Ranitidina como de Amlodipino. La metodologa demostr adems, que es sencilla en su realizacin sin incurrir en costos excesivos y logr generar un modelo base gracias a los resultados obtenidos para validar trazas de otros productos farmacuticos; sirviendo como una alternativa para el control de trazas y la obtencin de un resultado ptimo en cuanto a la sanitacin de los equipos y lugares de manipulacin de ranitidina y amlodipino. Agradecimientos Los autores agradecen al Asesor Carlo Magno Director de Calidad de Laboratorios Laproff S.A, Alejandra Colorado Analista de Calidad de Laboratorios Laproff S.A

Referencias 1. F. Pino Prez, D. Prez Bendito. Anlisis de elementos traza por espectrofotometra de absorcin molecular uv visible.[Sitio en Internet] Acceso Abril 15 de 2013. Disponible en: http://books.google.com.co/ 2. U.S Food and drug administration.Validacin de los Procesos de Limpieza: [Sitio en Internet] Acceso Abril 15 de 2013. Disponible en:http://www.fda.gov/ICECI/Inspections /InspectionGuides/ucm074922.htm 3. Clarke's analysis of drugs and poisons. Pharmaceuticalpress 2005 tercera edicin

4. Fourman GL, Mullen MV. Determining cleaning validation acceptance limits for pharmaceutical manufacturing operations. PharmTechnol 1993. 17(4) p.54-60. 5. Colegio federado de qumicos y de ingenieros qumicos de Costa Rica, Ingeniera y ciencia qumica, Gua de validacin de mtodos analticos, Camalen Editores, S.A. 1998: http://www.ministeriodesalud.go.cr/emp resas/protocolos/guiavalidacionmetodosa naliticos.pdf 6. Espectrofotometra: http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis /docencia/quimbiotec/FQpractica4.pdf visitado el 1 noviembre de 2013.