1 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2. 2.! 2.$ 2.% 2.

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INTRODUCCIN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA MICROBIOLOGA DESARROLLO HISTRICO DE LA MICROBIOLOGA PERIODO PREVIO AL DESCUBRIMIENTO DEL MICROSCOPIO EL PERIODO DE LOS PRIMEROS MICROSCOPISTAS EL DEBATE SOBRE LA GENERACIN ESPONTNEA EL DEBATE SOBRE LOS FERMENTOS LOS AVANCES TCNICOS EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS ENFERMEDADES DESARROLLO DE LA ASEPSIA" #UIMIOTERAPIA Y ANTIBIOTERAPIA AUGE DE LA MICROBIOLOGA GENERAL DESARROLLO DE LA INMUNOLOGA ORIGEN Y DESARROLLO DE LA VIROLOGA

2.11 RELACIONES ENTRE LA MICROBIOLOGA Y OTRAS CIENCIAS BIOLGICAS 3 3.1 3.1.1 3.1.2 3.2 4 5. OB'ETO DE ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGA OB'ETO MATERIAL( LOS MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS CELULARES VIRUS Y PARTICULAS SUBVIRASICAS OB'ETO FORMAL IMPORTANCIA DE LA MICROBIOLOGA UBICACIN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL MUNDO VIVO

BIBLIOGRAFA

SITIOS )EBS RECOMENDADOS

1 INTRODUCCIN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA MICROBIOLOGA

La Microbiologa se puede definir, sobre la base de su etimologa, como la ciencia que trata de los seres vivos muy pequeos, concretamente de aquellos cuyo tamao se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga determinado por la metodologa apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los microorganismos. Precisamente, el origen tardo de la Microbiologa con relaci n a otras ciencias biol gicas, y el reconocimiento de las m!ltiples actividades desplegadas por los microorganismos, hay que atribuirlos a la carencia, durante mucho tiempo, de los instrumentos y t"cnicas pertinentes. #on la invenci n del microscopio en el siglo $%&& comien'a el lento despegue de una nueva rama del conocimiento, ine(istente hasta entonces. )urante los siguientes *+, aos su progreso se limit casi a una mera descripci n de tipos morfol gicos microbianos, y a los primeros intentos ta(on micos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los -sistemas naturales. de los /einos 0nimal y %egetal. El asentamiento de la Microbiologa como ciencia est1 estrechamente ligado a una serie de controversias seculares 2con sus numerosas filtraciones de la filosofa e incluso de la religi n de la "poca3, que se prolongaron hasta finales del siglo $&$. La resoluci n de estas pol"micas dependi del desarrollo de una serie de estrategias e(perimentales fiables 2esterili'aci n, cultivos puros, perfeccionamiento de las t"cnicas microsc picas, etc.3, que a su ve' dieron nacimiento a un cuerpo coherente de conocimientos que constitituy el n!cleo aglutinador de la ciencia microbiol gica. El reconocimiento del origen microbiano de las fermentaciones, el definitivo abandono de la idea de la generaci n espont1nea, y el triunfo de la teora germinal de la enfermedad, representan las conquistas definitivas que dan carta de naturale'a a la joven Microbiologa en el cambio de siglo. 4ras la Edad de 5ro de la 6acteriologa, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y 7och, la Microbiologa qued durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada, estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la 8umica, que le aportara varios avances metodol gicos fundamentales. 9in embargo, una corriente, en principio minoritaria, dedicada a los estudios b1sicos centrados con ciertas bacterias del suelo poseedoras de capacidades metab licas especiales, incluyendo el descubrimiento de las que afectan a la nutrici n de las plantas, logr hacer ver la ubicuidad ecol gica y la e(trema diversidad fisiol gica de los microorganismos. )e esta forma, se estableca una cabe'a de puente entre la Microbiologa y otras ciencias biol gicas, que lleg a su momento decisivo cuando se comprob la unidad qumica de todo el mundo vivo, y se demostr , con material y t"cnicas microbiol gicas que la mol"cula de la herencia era el 0):. #on ello se asiste a un ntimo y f"rtil intercambio entre la

Microbiologa, la ;en"tica y la 6ioqumica, que se plasma en el nacimiento de la 6iologa Molecular, base del espectacular auge de la 6iologa desde mediados del siglo $$. Por otro lado, el -programa. inicial de la Microbiologa 2b!squeda de agentes infectivos, desentraamiento y aprovechamiento de los mecanismos de defensa del hospedador3 condujeron a la creaci n de ciencias subsidiarias 2%irologa, &nmunologa3 que finalmente adquirieron su mayora de edad y una acentuada autonoma. Por !ltimo, la vertiente aplicada que estuvo en la base de la creaci n de la Microbiologa, mantuvo su vigencia, enriquecida por continuos aportes de la investigaci n b1sica, y hoy muestra una impresionante -hoja de servicios. y una no menos prometedora perspectiva de e(pansi n a m!ltiples campos de la actividad humana, desde el control de enfermedades infecciosas 2higiene, vacunaci n, quimioterapia, antibioterapia3 hasta el aprovechamiento econ mico racional de los m!ltiples procesos en los que se hallan implicados los microorganismos 2biotecnologas3. 0s pues, la sencilla definici n con la que se abri este apartado, esconda todo un c!mulo de contenidos y objetos de indagaci n, todos emanados de una peculiar manera de apro(imarse a la porci n de realidad que la Microbiologa tiene encomendada. En las pr (imas p1ginas ampliaremos y concretaremos el concepto al que hemos hecho r1pida referencia. /eali'aremos un recorrido por el desarrollo de la Microbiologa a lo largo de su historia, que nos permitir1 una visi n concreta de algunos de sus caractersticos modos de abordar su objeto de estudio< finalmente, estaremos en disposici n de definir este !ltimo, desglosado como objeto material y formal.

2 DESARROLLO HISTRICO DE LA MICROBIOLOGA.

La Microbiologa, considerada como una ciencia especiali'ada, no aparece hasta finales del siglo $&$, como consecuencia de la confluencia de una serie de progresos metodol gicos que se haban empe'ado a incubar lentamente en los siglos anteriores, y que obligaron a una revisi n de ideas y prejuicios seculares sobre la din1mica del mundo vivo. 9iguiendo el ya cl1sico esquema de #ollard 2l=>?3, podemos distinguir cuatro etapas o periodos en el desarrollo de la Microbiologa@ Primer periodo, eminentemente especulativo, que se e(tiende desde la antigAedad hasta llegar a los primeros microscopistas. 9egundo periodo, de lenta acumulaci n de observaciones 2desde l?>+ apro(imadamente hasta la mitad del siglo $&$3, que arranca con el descubrimiento de los microorganismos por LeeuBenhoeC 2l?>+3. 4ercer periodo, de cultivo de microorganismos, que llega hasta finales del siglo $&$, donde las figuras de Pasteur y 7och encabe'an el logro de cristali'ar a la Microbiologa como ciencia e(perimental bien asentada. #uarto periodo 2desde principios del siglo $$ hasta nuestros das3, en el que los

microorganismos se estudian en toda su complejidad fisiol gica, bioqumica, gen"tica, ecol gica, etc., y que supone un e(traordinario crecimiento de la Microbiologa, el surgimiento de disciplinas microbiol gicas especiali'adas 2%irologa, &nmunologa, etc3, y la estrecha imbricaci n de las ciencias microbiol gicas en el marco general de las #iencias 6iol gicas. 0 continuaci n se reali'a un breve recorrido hist rico de la disciplina microbiol gica, desglosando los perodos DE y FE en varios apartados tem1ticos.

2.1 PERIODO PREVIO AL DESCUBRIMIENTO DEL MICROSCOPIO

9i bien el descubrimiento efectivo de seres vivos no visibles a simple vista debi aguardar hasta el !ltimo tercio del siglo $%&&, sus actividades son conocidas por la humanidad desde muy antiguo, tanto las beneficiosas, representadas por las fermentaciones implicadas en la producci n de bebidas alcoh licas, pan y derivados l1cteos, como las perjudiciales, en forma de enfermedades infecciosas. )iversas fuentes escritas de la antigAedad griega y romana hablan de g"rmenes invisibles que transmiten enfermedades contagiosas. Lucrecio 2=?G++ a.#.3, en su -De rerum natura. hace varias alusiones a -semillas de enfermedad.. En el /enacimiento europeo, ;irolamo Hrascatorius, en su libro -De contagione et contagionis 2*+F?3 dice que las enfermedades contagiosas se deben a -g"rmenes vivos. que pasan de diversas maneras de un individuo a otro. Estos inicios de e(plicaci n que renunciaban a invocar causas sobrenaturales fueron probablemente catali'ados por la introducci n en Europa de la sfilis, una enfermedad en la que estaba clara la necesidad de contacto para su contagio. Pero la -cosa. que se transmite en la enfermedad sigui siendo objeto de conjeturas durante mucho tiempo.

2.2 EL PERIODO DE LOS PRIMEROS MICROSCOPISTAS.

Ia en el siglo $&%, con la invenci n de las primeras lentes para corregir la visi n, surgi una cierta curiosidad sobre su capacidad de aumentar el tamao aparente de los objetos. En el siglo $%& surgieron algunas ideas sobre aspectos de la fsica ptica de las lentes de aumento, pero no encontraron una aplicaci n inmediata. 9e dice que ;alileo hi'o algunas observaciones -microsc picas. invirtiendo su telescopio a partir de lentes montadas en un tubo, pero en cualquier caso est1 claro que no tuvieron ninguna repercusi n. La primera referencia segura sobre el microscopio 2*?J*3 se debe a #onstantijn Kuygens, quien relata que el ingl"s #ornelis )rebbel tena en su taller un instrumento magnificador, que recibi el nombre de microscopium en l?J+, en la 0ccademia dei Lincei, de /oma.

A*+,*-. /0* L..12.*3,.4

El descubrimiento de los microorganismos fue obra de un comerciante holand"s de tejidos, 0ntonie van LeeuBenhoeC 2*?DJG*>JD3, quien en su pasi n por pulir y montar lentes casi esf"ricas sobre placas de oro, plata o cobre, casi lleg a descuidar sus negocios. Habric unos cuatrocientos microscopios simples, con los que lleg a obtener aumentos de casi D,, di1metros. En *?>+ descubri que en una gota de agua de estanque pululaba una asombrosa variedad de pequeas criaturas a las que denomin -anim1lculos.. En *?LD descubre las bacterias, por lo que se considera el -padre de la Microbiologa.. )urante varias d"cadas LeeuBenhoeC fue comunicando sus descubrimientos a la /oyal 9ociety de Londres a trav"s de una serie de cartas que se difundieron, en traducci n inglesa, en las -Philosophical 4ransactions.. 9us magnficas dotes de observador le llevaron asimismo a describir proto'oos 2como Giardia, que encontr en sus propias heces3, la estructura estriada del m!sculo, la circulaci n capilar, a descubrir los espermato'oides y los gl bulos rojos 2por lo que tambi"n se le considera el fundador de la Kistologa animal3, as como a detallar diversos aspectos estructurales de las semillas y embriones de plantas. LeeuBenhoeC se percat de la abundancia y ubicuidad de sus anim1lculos, observ1ndolos en vinagre, placa dental, etc.

M-56,75,8-, 7-98:. ;. L..12.*3,.4

M-56,75,8-, 5,981.7+, ;. H,,4.

0unque los descubrimientos de LeeuBenhoeC despertaron inter"s al ser comunicados, pocos intentaron o pudieron reproducirlos seriamente. 0dem1s, la

fabricaci n de lentes sencillas de gran aumento era difcil y el manejo de los microscopios simples, bastante engorroso. 9imult1neamente el ingl"s /obert KooCe 2*?D+G*>,D3 usando microscopios compuestos, describi los hongos filamentosos 2*??>3, y descubri la estructura celular de las plantas 2Micrographia, *??+3, acuando el t"rmino c"lula. Pero el trabajo con microscopios compuestos aplicados al estudio de los -anim1lculosM languideci durante casi J,, aos, debido a sus imperfecciones pticas, hasta que hacia *LD, se desarrollaron las lentes acrom1ticas.

2.3 EL DEBATE SOBRE LA GENERACIN ESPONTNEA.

La autoridad intelectual de 0rist teles por un lado, y la autoridad moral representada por la 6iblia, por otro, junto con las opiniones de escritores cl1sicos como ;aleno, Plinio y Lucrecio, a los que se citaba como referencias incontrovertibles en la literatura m"dica en la Edad Media y /enacimiento, dieron carta de naturale'a a la idea de que algunos seres vivos podan originarse a partir de materia inanimada, o bien a partir del aire o de materiales en putrefacci n. Esta doctrina de la -generatio spontanea o abiog"nesis, fue puesta en entredicho por los e(perimentos de Hrancesco /edi 2*?J*G*?=>3, quien haba acuado la e(presi n -Omne vivum ex ovo 2*??L3, tras comprobar que los insectos y nematodos procedan de huevos puestos por animales adultos de su misma especie. )emostr que si un tro'o de carne era cubierto con gasa de forma que las moscas no podan depositar all sus huevos, no aparecan -gusanos., que "l correctamente identific como fases larvarias del insecto. Los descubrimientos de /edi tuvieron el efecto de desacreditar la teora de la generaci n espont1nea para los animales y plantas, pero la reavivaron respecto de los reci"n descubiertos -anim1lculos., de modo que aunque se acept la continuidad de la vida en cuanto a sus formas superiores, no todos estaban dispuestos a admitir el m1s amplio -Omne vivum ex vivo aplicado a los microorganismos. Kubo que esperar un siglo m1s hasta que una serie de naturalistas recomen'aran el ataque a la teora preformacionista. La''aro 9pallan'ani 2*>J=G*>==3 sostuvo una disputa con N.4. :eedham 2*>*DG*>L*3 en la que el primero demostr que los -infusorios. no aparecan en muestras de maceraciones animales o vegetales sometidas durante tiempo suficiente a ebullici n en frascos herm"ticamente cerrados, pero volvan a aparecer si se practicaban agujeros en el recipiente. 9in embargo los preformacionistas no se daban por vencidos< el mismo :eedham, recogiendo una idea ya e(presada por Kuygens, amigo de LeeuBenhoeC, replic Gcon argumentos vitalistas muy propios de la "pocaG que el calor haba destruido la -fuer'a vegetativa. de las infusiones y haba cambiado la -cualidad. del aire dentro de los frascos. )urante el primer tercio del siglo $&$ la doctrina de la arqueg"nesis o generaci n espont1nea recibi un !ltimo refuer'o antes de morir, debido por un lado a ra'ones e(tracientficas 2el auge del concepto de transmutaci n producido por la escuela de la filosofa de la naturale'a3, y por otro al descubrimiento del o(geno y de su importancia para la vida, de modo que los e(perimentos de 9pallan'ani se interpretaron como que al

calentarse las infusiones, el o(geno del aire se destrua, y por lo tanto desapareca la -fuer'a vegetativa. que originaba la aparici n de microorganismos. 4heodor 9chBann 2*L*,G*LLJ3 present en *LD? un m"todo seguro para refutar la teora abiog"nica@ calent maceraciones en frascos a los que se haba eliminado previamente el aire, pero no continu trabajando en esta lnea. Para complicar m1s las cosas, la publicaci n de -Sobre el origen de las especies por )arBin en *L+=, fue utili'ada por algunos preformacionistas para apoyar sus argumentos. El mismo KaecCel, en una fecha tan tarda como *L??, se mostraba esc"ptico ante las pruebas aportadas por Pasteur. F1." .<.5+-/09.*+. L,1-7 P07+.16 =1$22>1$%5? .: @1. 07.7+A .: B,:8. ;.<-*-+-/, C D0*EA :0 51.7+-A* 0 <0/,6 ;. :0 +.,6F0 G-,BH*-50. E* 1* -*<,69. 0 :0 A50;H9-. ;.7 S5-.*5.7 ;. P06F7" .* 1$ & =I Expriences rlatives aux gnrations dites spontanes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En *L?* Pasteur publica otro informe en el que e(plica c mo se pueden capturar los -cuerpos organi'ados. del aire con ayuda de un tubo provisto de un tap n de algod n como filtro, y la manera de recuperarlos para su observaci n microsc pica. )e esta forma quedaba definitivamente aclarado el origen de los microorganismos, y se abra la Edad de 5ro del estudio cientfico de las formas de vida no observables a simple vista. Los !ltimos esc"pticos quedaron silenciados cuando en *L>> Nohn 4yndall 2*LJ,G *L=D3 aplic su sistema de esterili'aci n por calentamiento discontinuo 2hoy conocida precisamente como tindali'aci n3, que evidenci la e(istencia de formas microbianas de

reposo muy resistentes al calor, lo cual fue confirmado poco m1s tarde por Herdinand #ohn al descubrir las esporas bacterianas.

2.4 EL DEBATE SOBRE LOS FERMENTOS

On segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia microbiol gica fue el establecimiento de la relaci n que une ciertas transformaciones qumicas que se dan en las infusiones con el crecimiento de los g"rmenes en ellas e(istentes. #agniardGLatour en *LD?, y 9chBann y 7At'ing en *LD> haban sugerido que las levaduras eran las causantes de la fermentaci n alcoh lica por la que el a'!car pasa a alcohol etlico y di (ido de carbono, pero se encontraron con la crtica adversa de los grandes qumicos de la "poca 26er'elius, Pohler y Liebig3. Liebig, hacia *LF,, haba reali'ado importantes confirmaciones a la -teora mineral. sobre la nutrici n de las plantas, enfrent1ndose a la -teora del humus. sostenida por 4haer, asestando un golpe a las ideas vitalistas heredadas de Leibni'. Puesto que se consideraba a las levaduras como plantas microsc picas, se supona que los procesos de fermentaci n y putrefacci n se deban a fen menos qumicos de descomposici n y muerte encuadrables en el marco de la teora mineral de la fisiologa vegetal. 9u convencimiento de que toda actividad vital se poda e(plicar en t"rminos de qumica y fsica retras por alg!n tiempo la adscripci n de estos fen menos a c"lulas vivas. Hue Pasteur 2que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades pticas de los cristales de tartrato, vena suponiendo que estos compuestos tenan un orgen org1nico3 quien de nuevo intervino en el debate de forma decisiva. En *L+> demostr que los agentes de la fermentaci n l1ctica eran microorganismos, trabajando sobre un problema que haba surgido entre los destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentaci n alcoh lica se vio sustituida por una indeseable fermentaci n l1ctica. Este fue el inicio de una larga serie de estudios que habra de durar hasta *L>?, en los que Pasteur identific distintos microorganismos responsables de diferentes clases de procesos fermentativos. 0s, en *L?, adscribe inequvocamente la fermentaci n alcoh lica a ciertos tipos de levaduras, y en *L??, en sus tudes sur le vin resume sus halla'gos al respecto, inaugurando la Microbiologa 0plicada, una de las primeras derivaciones pr1cticas no empricas emanadas de la 6iologa. 0 finales del siglo $&$ eminentes bi logos como Kansen, en #openhague, y 6eijerinC, en )elft, desarrollaban su actividad en industrias y destileras. 4rabajando sobre los agentes de la fermentaci n butrica, Pasteur descubri la presencia de microorganismos que se desarrollaban en ausencia de o(geno, lo cual desmenta la creencia de que todas las formas de vida necesitan aire para crecer. 0cu los t"rminos aerobiosis y anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la vida en presencia y en ausencia de o(geno. 4ras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendi las distintas implicaciones energ"ticas subyacentes a la utili'aci n de sustratos org1nicos en presencia y en ausencia de o(geno, demostrando que, en el segundo caso el rendimiento 2medido como crecimiento microbiano3 era siempre menor, al no poder reali'arse la degradaci n total de las correspondientes sustancias.

Ona profundi'aci n en los fen menos de fermentaci n lleg cuando en *L=> 6uchner obtuvo, a partir de levaduras, una preparaci n en'im1tica 2'imasa3 que era capa' de reali'ar la misma transformaci n de -fermentaci n. que las c"lulas vivas. Este descubrimiento, que evocaba las propuestas de 6er'elius y Liebig, supuso en realidad la confluencia de los enfoques qumico y biol gico@ las fermentaciones eran procesos qumicos catali'ados por en'imas presentes dentro de c"lulas vivas, que podan ser estudiados e(tracelularmente. )e esta forma, la 6ioqumica, nacida como una rama de la qumica fisiol gica, que se vena especiali'ando en la en'imologa, encontr una alian'a fructfera y duradera con la joven Microbiologa.

2.5 LOS AVANCES TCNICOS

La doctrina del pleomorfismo, vigente durante buena parte del siglo $&$, mantena que los microorganismos adoptaban formas y funciones cambiantes dependiendo de las condiciones ambientales. 0 estas ideas se oponan frontalmente investigadores como 7och, Pasteur y #ohn, que estaban convencidos de la especificidad y constancia morfol gica y fisiol gica de cada tipo de microorganismo 2monomorfismo3. El pleomorfismo haba surgido como una e(plicaci n a la gran variedad de formas y actividades que aparecan en un simple frasco de infusi n, pero ya Pasteur, en sus estudios sobre la fermentaci n, se haba percatado de que los cultivos que aparecan podan considerarse como una sucesi n de distintas poblaciones de microorganismos predominantes, que, a resultas de sus actividades, condicionaban la ulterior composici n de la comunidad microbiana. La soluci n definitiva a esta cuesti n dependa, de nuevo, de un desarrollo t"cnico, que a su ve' iba a suministrar una de las herramientas caractersticas de la nueva ciencia@ los m"todos de cultivo puro. Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el mic logo 6refeld, quien logr aislar esporas de hongos y cultivarlas sobre medios s lidos a base de gelatina. Por su menor tamao, este m"todo se haca inviable para las bacterias, por lo que se recurri a un m"todo basado en diluciones@ Lister, en *L>L reali' diluciones secuenciales de cultivos mi(tos, hasta lograr muestras en las que e(ista una sola c"lula. Pero la t"cnica era larga y tediosa y, adem1s, normalmente s lo se lograban aislar c"lulas del tipo bacteriano m1s abundante en el cultivo original< sin embargo, el e(perimento sirvi para confirmar la naturale'a -particulada. de los agentes de las fermentaciones.

R,G.6+ O,53

P,6 0@1.::0 H8,50 O,53 G1750G0 5,* 03F*5, 9H+,;,7 9K7 7.*5-::,7 ;. 51:+-/, 816," -*;-78.*70G:.7 8060 86,7.B1-6 717 -*/.7+-B05-,*.7 7,G6. G05+.6-07 80+AB.*07. P6-9.6, =C @1-DK ;. <,690 1* +0*+, 50710:? .98:.A 6,;0E07 ;. 80+0+0 5,9, 717+60+, 7A:-;, *1+6-+-/, 7,G6. .: @1. 7. 8,;F0* ;.7066,::06 5,:,*-07 9056,75A8-507 ;. G05+.6-07 @1. 86.7.*+0G0* 9,6<,:,BF0 50605+.6F7+-50" @1. O,53 -*+.686.+A 5,9, 6.71:+0*+.7 ;.: 56.5-9-.*+, 0 806+-6 ;. 5H:1:07 -*;-/-;10:.7. P.6, .*7.B1-;0 6.5166-A 0 5,9805+06 .: +F8-5, 50:;, ;. 51:+-/, 0 G07. ;. 506*. =;-7.P0;, 8,6 L,.<<:.6? 0P0;-H*;,:. B.:0+-*0 =1$$1?. E: 9.;-, 7A:-;, 07F :,B60;, .60 +60*7806.*+." :, @1. 8.69-+F0 /-710:-D06 <K5-:9.*+. :,7 607B,7 5,:,*-0:.7" C 5,*+.*F0 :,7 *1+6-.*+.7 0;.510;,7 8060 .: 56.5-9-.*+, ;. 1*0 098:-0 B090 ;. G05+.6-07. 7+07 .60* -*,51:0;07 .* :0 718.6<-5-. ;.: 9.;-, 5,* 1* 3-:, ;. 8:0+-*, 8070;, 86./-09.*+. 8,6 :0 ::090" 8,6 :0 +H5*-50 ;. 7-.9G60 .* .7+6F0. S-* .9G06B," :0 B.:0+-*0 86.7.*+0G0 :,7 -*5,*/.*-.*+.7 ;. 7.6 0+050;0 8,6 ;.+.69-*0;,7 9-56,,6B0*-79,7" C ;. +.*.6 1* G0E, 81*+, ;. <17-A*L 09G,7 86,G:.907 7. 7,:/.*+06,* 510*;, .* 1$$2 .: 9H;-5, 0:.9K* )0:+.6 H.77." 7-B1-.*;, 1*0 71B.6.*5-0 ;. 71 91E.6 F0**C" -*+6,;1E, .: 0B06>0B06 =8,:-705K6-;, .J+60F;, ;. 0:B07 6,E07? 5,9, *1./, 0B.*+. 7,:-;-<-50*+.. E: +60G0E, ;. O,53 C0 5-+0;, +1/, :0 +6075.*;.*+0: 5,*7.51.*5-0 ;. ;.66-G06 :07 -;.07 8:.,9,6<-7+07" C 71817, :0 86-9.60 86,81.7+0 ;.: 5,*5.8+, ;. .78.5-. ;.*+6, ;.: 91*;, G05+.6-0*,. E* 1$$! P.+6-" 1* 0C1;0*+. ;. O,53" 717+-+1CA :07 .*B,66,707 G0*;.E07 ;. /-;6-, 51G-.6+07 5,* 50980*07" 170;07 307+0 .*+,*5.7 8060 :,7 51:+-/,7 7A:-;,7" 8,6 1* 7-7+.90 90*.E0G:. ;. 8:0507 ;. 56-7+0: 8:0*07" @1. 7. 5,*,5. 5,9, 50E07 ;. P.+6-.

El desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento fue una consecuencia de las investigaciones llevadas a cabo por 6eijerincC y PinogradsCy entre *LLL y los primeros aos del siglo $$, sobre bacterias implicadas en procesos biogeoqumicos y poseedoras de caractersticas fisiol gicas distintivas 2quimioaut trofas, fijadoras de nitr geno, etc.3. Estos medios, donde se aplica a pequea escala el principio de selecci n natural, se disean de forma que su composici n qumica definida favore'ca s lo el crecimiento de ciertos tipos fisiol gicos de microorganismos, !nicos capaces de usar ciertos nutrientes del medio. 5tra importante aportaci n a este -perodo de cultivo. dentro del desarrollo de la Microbiologa surgi del uso de medios diferenciales, en los que se manifiesta alg!n rasgo bioqumico o metab lico, lo que contribuye a la identificaci n microbiana. Hue PArt' quien, en *L=J, introdujo el uso de indicadores de pK, incorporados en los medios, lo cual permita revelar la producci n de acidificaciones por fermentaci n en ciertas bacterias.

Mientras tanto, en la ciudad de Nena se haba creado una atm sfera de progreso donde confluan grandes naturalistas como KaecCel, 9trassburger o 0bb" interaccionando con una pujante editorial especiali'ada en 6iologa y Medicina 2;ustav Hischer3 y con una poderosa industria ptica y qumica. Estas influencias recprocas se plasmaron en numerosos proyectos que reflejaban la efervescencia de las ciencias naturales tras la estela de )arBin 2cfr. Nahn et al., *=L+3. #oncretamente, la industria ptica de 0bb" y Qeiss, que se mantena en cone(i n con la compaa vidriera 9chott, pudo satisfacer la necesidad de 7och de perfeccionar el microscopio compuesto, introduciendo lentes acrom1ticas y una iluminaci n inferior provista de condensador. El mismo 0bb" desarroll en *L>L el objetivo de inmersi n en aceite. Por otro lado, la industria qumica 609H, que por aquella "poca se encontraba en pleno auge de patentes de nuevos colorantes, sumistr al laboratorio de 7och una serie de derivados de anilina que tean las bacterias permitiendo su f1cil visuali'aci n al microscopio en frotis de tejidos infectados. En *L>+ #arl Peigert ti bacterias con pirocarmn, un colorante que ya vena siendo usado desde haca unos aos en estudios 'ool gicos. En aos sucesivos se fueron introduciendo el a'ul de metileno 27och, *L>>3, la fuchsina, y el violeta cristal. En *LLJG*LLD Qiehl y :eelsen desarrollan su m"todo de 1cidoGalcohol resistencia para teir Mycobacterium tuberculosis. En *LLF el pat logo dan"s #hristian ;ram establece una tinci n de contraste que permite distinguir dos tipos bacterianos en funci n de sus reacci n diferencial de tinci n y que, como se vera mucho m1s tarde, reflejaba la e(istencia de dos grupos de bacterias con rasgos estructurales distintivos. En *L=, Loeffler logra visuali'ar flagelos bacterianos por medio de su t"cnica de impregnaci n arg"ntica. #omo veremos m1s adelante, la misma industria de colorantes alemana previa a la primera guerra mundial fue decisiva tambi"n para los comien'os de la quimioterapia. I:19-*05-A* ;.: 9-56,75,8-," <61+, ;. :0 5,:0G,605-A* .*+6. O,53 C AGG.

OGE.+-/, ;. -*9.67-A*" <61+, ;. :0 5,:0G,605-A* .*+6. O,53 C :0 I*;17+6-0 A8+-50 C06: Q.-77 Estas innovaciones t"cnicas 2m"todos de cultivo, microscopa y tinciones3 fueron fundamentales 2junto con los sistemas de esterili'aci n abordados en el anterior apartado3 para la consolidaci n de la Microbiologa como ciencia, permitiendo eliminar las grandes dosis de especulaci n que hasta entonces haban predominado.

2. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS ENFERMEDADES.

)urante el siglo $&$ la atenci n de muchos naturalistas se haba dirigido hacia las diversas formas de animales y plantas que vivan como par1sitos de otros organismos. Este inter"s se redobl tras la publicaci n de los libros de )arBin, estudi1ndose las numerosas adaptaciones evolutivas que los distintos par1sitos haban adquirido en su peculiar estilo de vida. 9in embargo, la adjudicaci n de propiedades de par1sitos a los microorganismos vino del campo m"dico y veterinario, al revalori'arse las ideas sobre el origen germinal de las enfermedades infecciosas. En *LD+ 0gostino 6assi 2*>>DG*L+?3 demostr que cierta enfermedad del gusano de seda 2mal di segno3, que haba hecho su aparici n en Lombarda, se deba a un hongo 2Botrytis bassiana3. #uatro aos m1s tarde N.L. 9chRnlein descubri la asociaci n de un hongo con una enfermedad humana de la piel. En *LF, Kenle, de la escuela fisiol gica de Nohannes MAller, plante la teora de que las enfermedades infecciosas est1n causadas por seres vivos invisibles, pero de nuevo la confirmaci n de estas ideas tuvo que esperar a que la intervenci n de Pasteur demostrara la e(istencia de microorganismos especficos responsables de enfermedades. Kacia mediados del siglo $&$ otra enfermedad infecciosa 2pebrina3 comen' a diseminarse por los criaderos de gusano de seda de toda Europa, alcan'ando finalmente a #hina y Nap n. 0 instancias de su maestro Nean 6aptiste )umas, Pasteur acept el reto de viajar a la Proven'a para investigar esta enfermedad que estaba dejando en la ruina a los industriales sederos, a pesar de que nunca hasta entonces se haba enfrentado con un problema de patologa. Es m1s que probable que Pasteur viera aqu la oportunidad de confirmar si sus estudios previos sobre las fermentaciones podan tener una e(tensi n hacia los procesos fisiol gicos del hombre y de los animales. Es sorprendente que, al principio no se mostrara dispuesto a aceptar la idea de que la pebrina fuera una enfermedad ocasionada por un agente e(trao, creyendo durante los dos primeros aos que se trataba de alteraciones meramente fisiol gicas. 4ras una serie de tanteos, y en medio de una intensa actividad intelectual que le obligaba a repasar continuamente los e(perimentos y las conclusiones e(tradas, inmerso en el drama personal de la muerte de su padre y de dos de sus hijas en un corto lapso de tiempo, Pasteur llega finalmente, en *L?=, a identificar al proto'oo Nosema bombycis como el responsable de la epidemia, y por medio de una serie de medidas de control, "sta comien'a a remitir de modo espectacular. La intervenci n de bacterias como agentes especficos en la producci n de enfermedades fue descubierta a ra' de una serie de investigaciones sobre el carbunco o 1ntra(, enfermedad que afecta a ganado y que puede transmitirse al hombre. #. )avaine, entre *L?D y *L?L, encontr que en la sangre de vacas afectadas aparecan grandes cantidades de microorganismos a los que llam bacteridios< adem1s, logr inducir la enfermedad e(perimentalmente en vacas sanas, inocul1ndoles muestras de sangre infectada. En *L>J el m"dico alem1n #.N. Eberth consigui aislar los bacilos filtrando sangre de animales carbuncosos. Pero fue /obert 7och 2*LFDG*=*,3, que haba sido alumno de Kenle, quien con su reciente t"cnica de cultivo puro logr , en *L>?, el primer aislamiento y

propagaci n in vitro del bacilo del 1ntra( 2Bacillus anthracis3, consiguiendo las primeras microfotografas sobre preparaciones secas, fijadas y teidas con a'ul de metileno. M1s tarde 2*LL*3, 7och y sus colaboradores confirmaron que las esporas son formas diferenciadas a partir de los bacilos, y m1s resistentes que "stos a una variedad de agentes. Pero m1s fundamental fue su demostraci n de que la enfermedad se poda transmitir sucesivamente a ratones sanos inocul1ndoles bacilos en cultivo puro, obtenidos tras varias transferencias en medios lquidos. Este tipo de estrategias para demostrar el origen bacteriano de una enfermedad fue llevado a una ulterior perfecci n en *LLJ, con la publicaci n de -Die thiologie der !uber"ulose, donde se comunica por primera ve' la aplicaci n de los criterios que Kenle haba postulado en *LF,. Estos criterios, que hoy van asociados al nombre de 7och, son los siguientes@ *. El microorganismo debe de estar presente en todos los individuos enfermos. J. El microorganismo debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro. D. La inoculaci n del microorganismo crecido en cultivo puro a animales sanos debe provocar la aparici n de sntomas especficos de la enfermedad en cuesti n. F. El microorganismo debe poder ser reaislado del hospedador infectado de forma e(perimental. Hue asimismo 7och quien demostr el principio de especificidad biol gica del agente infeccioso@ cada enfermedad infecciosa especfica est1 causada por un tipo de bacteria diferente. Estos trabajos de 7och abren definitivamente el campo de la Microbiologa M"dica sobre firmes bases cientficas. )urante las dos d"cadas siguientes la Microbiologa e(periment una aut"ntica edad de oro, en la que se aislaron y caracteri'aron muchas bacterias pat genas. La 0lemania del /eich, que a la sa' n se haba convertido en una potencia poltica y militar, se decidi a apoyar la continuidad de los trabajos del equipo de 7och, dada su enorme importancia social y econ mica, creando un &nstituto de investigaci n, siendo 7och su director en el )epartamento de 9alud. )e esta forma, en la Escuela 0lemana se aislaron los agentes productores del c lera asi1tico 27och, *LLD3, de la difteria 2Loeffler, *LLF3, del t"tanos 2:icolaier, *LL+ y 7itasato, *LL=3, de la neumona 2HraenCel, *LL?3, de la meningitis 2Peichselbaun, *LL>3, de la peste 2Iersin, *L=F3, de la sfilis 29chaudinn y Koffman, *=,+3, etc. &gualmente se pudieron desentraar los ciclos infectivos de agentes de enfermedades tropicales no bacterianas que la potencia colonial se encontr en ultramar@ malaria 29chaudinn, *=,*G*=,D3, enfermedad del sueo 27och, *=,?3, peste vacuna africana 2debida al ingl"s 6ruce, *L=+G*L=>3, etc. Por otro lado, la Escuela Hrancesa, nucleada en el &nstituto Pasteur, se concentr en los estudios sobre los procesos infectivos, la inmunidad del hospedador, y la obtenci n de vacunas, sobre todo a ra' de la vacuna antirr1bica ensayada por Pasteur 2*LL+3, contribuyendo al nacimiento de la &nmunologa 2ver apartado 2. 93

2.! DESARROLLO DE LA ASEPSIA" #UIMIOTERAPIA Y ANTIBIOTERAPIA

Los avances de las t"cnicas quir!rgicas hacia mediados del siglo $&$, impulsados por la introducci n de la anestesia, trajeron consigo una gran incidencia de complicaciones postGoperatorias derivadas de infecciones. On joven m"dico brit1nico, Noseph Lister 2*LJ>G *=*J3, que haba ledo atentamente los trabajos de Pasteur, y que crea que estas infecciones se deban a g"rmenes presentes en el aire, comprob que la aplicaci n de compuestos como el fenol o el bicloruro de mercurio en el lavado del instrumental quir!rgico, de las manos y de las heridas, disminua notablemente la frecuencia de infecciones postGquir!rgicas y puerperales. M1s tarde, Paul Ehrlich 2*L+FG*=*=3, que haba venido empleando distintas sustancias para teir c"lulas y microorganismos, y que conoca bien el efecto de tinci n selectiva de bacterias por ciertos colorantes que dejaban, en cambio, incoloras a c"lulas animales, concibi la posibilidad de que algunos de los compuestos de sntesis que la industria qumica estaba produciendo pudieran actuar como -balas m1gicas. que fueran t (icas para las bacterias pero inocuas para el hospedador. Ehrlich concibi un programa racional de sntesis de sustancias nuevas seguido de ensayo de "stas en infecciones e(perimentales. 4rabajando en el laboratorio de 7och, prob sistem1ticamente derivados del ato(ilo 2un compuesto que ya 4hompson, en *=,+, haba mostrado como efica' contra la tripanosomiasis3, y en *=,= inform de que el compuesto ?,? 2salvars1n3 era efectivo contra la sfilis. 0unque el salvars1n presentaba algunos efectos colaterales, fue durante mucho tiempo el !nico agente disponible contra enfermedades producidas por espiroquetas, y sirvi para ilustrar brillantemente la valide' del enfoque de la llamada quimioterapia 2t"rmino acuado por el mismo Ehrlich3, de modo que encau' toda la investigaci n posterior. En *=J> ;erhard )omagC, en cone(i n con la poderosa compaa qumica &.;. Harbenindustrie, inici un ambicioso proyecto de b!squeda de nuevos agentes quimioter1picos, siguiendo el esquema de Ehrlich< en *=DJG*=D+ descubre la acci n del rojo de prontosilo frente a neumococos hemolticos dentro del hospedador, pero seala que esta droga es inactiva sobre bacterias creciendo in vitro. La e(plicaci n la sumistra el matrimonio 4r"fouSl, del &nstituto Pasteur, al descubrir que la actividad antibacteriana depende de la conversi n por el hospedador en sulfanilamida. El mecanismo de acci n de las sulfamidas 2inhibici n competitiva con el 1cido paraGaminoben'oico3 fue dilucidado por el estadounidense )onald ). Poods. Las investigaciones de "ste encaminaron a la industria farmac"utica hacia la sntesis de an1logos de metabolitos esenciales, introduciendo un enfoque m1s racional frente a la "poca anterior, m1s emprica. En *L>F, el m"dico ingl"s P. /oberts haba descrito las propiedades antibi ticas de ciertos cultivos de hongos 2#enicillium glaucum3 contra las bacterias, e introdujo en Microbiologa el concepto de antagonismo. 5tros investigadores de finales del siglo $&$ reali'aron observaciones similares, pero fue Hleming quien, en *=J=, logr e(presar ideas claras sobre el tema, al atribuir a una sustancia qumica concreta 2la penicilina3 la acci n inhibidora sobre bacterias producida por el hongo #enicillium notatum. Hleming desarroll

un ensayo crudo para determinar la potencia de la sustancia en sus filtrados, pudiendo seguir su producci n a lo largo del tiempo de cultivo, y mostrando que no todas las especies bacterianas eran igualmente sensibles a la penicilina. Las dificultades t"cnicas para su e(tracci n, junto al hecho de que el inter"s de la "poca a!n estaba centrado sobre las sulfamidas, impidieron una pronta purificaci n de la penicilina, que no lleg hasta los trabajos de #hain y Hlorey 2*=F,3, comprob1ndose entonces su gran efectividad contra infecciones bacterianas, sobre todo de ;ramGpositivas, y la ausencia de efectos t (icos para el hospedador. &nmediatamente comen' una b!squeda sistem1tica de microorganismos del suelo que mostraran actividades antibi ticas. En *=FF 0. 9chat' y 9. PaCsman descubren la estreptomicina, producida por Streptomyces griseus, siendo el primer ejemplo de antibi tico de amplio espectro. Los die' aos que siquieron al t"rmino de la segundad guerra mundial vieron la descripci n de =? antibi ticos distintos producidos por +> especies de microorganismos, principalmente 0ctinomicetos. En la d"cada de los ?, se abri una nueva fase en la era de los antibi ticos al obtenerse compuestos semisint"ticos por modificaci n qumica de antibi ticos naturales, pali1ndose los problemas de resistencia bacteriana a drogas que haban empe'ado a aparecer, disminuy"ndose en muchos casos los efectos secundarios, y ampli1ndose el espectro de acci n. 0parte de la revoluci n que supusieron en el campo de la aplicaci n clnica, los antibi ticos ha permitido notables avances en el desentraamiento de determinados aspectos de arquitectura y funci n moleculares de las c"lulas susceptibles 2paredes celulares microbianas, ribosomas, sntesis proteica, etc.3.

2.$ AUGE DE LA MICROBIOLOGA GENERAL.

;ran parte de los avances en Microbiologa descritos hasta ahora se debieron a la necesidad de resolver problemas pr1cticos. Pero hacia finales del siglo $&$ una serie de investigadores Galgunos de ellos procedentes de 1reas m1s cl1sicas de la Kistoria :aturalG desarrollaron importantes estudios b1sicos que fueron revelando una enorme variedad de microorganismos y sus actividades metab licas, as como su papel crucial en ciclos biogeoqumicos, sus relaciones con procesos de nutrici n vegetal, etc. El descubrimiento de la quimioautotrofa, obra del gran microbi logo ruso 9ergei PinogradsCy 2*L+?G*=+D3, oblig a revisar los conceptos previos, procedentes de la Hisiologa %egetal, de que el crecimiento autotr fico dependa de la presencia de clorofila. PinogradsCy haba comen'ado investigando las bacterias del hierro descubiertas por #ohn en *L>+, observando que podan crecer en medios minerales, por lo que supuso que obtenan su energa de la o(idaci n de sales ferrosas a f"rricas 2*LLL3. En *LL=, combinando t"cnicas de observaci n secuencial de cultivos microsc picos con ensayos microqumicos sobre bacterias del a'ufre 2Beggiatoa$ !hiothrix3, infiri que estos microorganismos o(idaban sulfuro de hidr geno hasta a'ufre elemental 2acumulando "ste como gr1nulos3, y luego hasta 1cido sulf!rico, obteniendo de este modo su energa. Estas observaciones pueden haber sido el arranque del concepto de litotrofa. Pero el descubrimiento de la

quimioautotrofa lleg cuando al ao siguiente PinogradsCy y 5meliansCy pasaron a estudiar las bacterias nitrificantes, demostrando de manera clara que la energa obtenida de la o(idaci n del amonio o del nitrito era usada para fijar #5J 2*LL=G*L=,3. M1s tarde el mismo PinogradsCy e(tendi la demostraci n a cultivos puros en los que el agente solidificante de los medios era el gel de slice. La e(plicaci n del proceso de o(idaci n de los compuestos de a'ufre no lleg hasta los estudios de )angeard 2*=**3 y 7iel 2*=*J3. :uevas capacidades metab licas fueron reveladas al estudiar los procesos respiratorios de las bacterias que o(idan hidr geno o metano 29Rhngen, *=,?3. El qumico 6erthelot haba sealado 2*LL+3 que los microorganismos del suelo podan incorporar nitr geno molecular directamente del aire. Hue igualmente PinogradsCy el primero en aislar una bacteria capa' de fijar nitr geno atmosf"rico 2%lostridium pasteurianum3 y en e(plicar el ciclo del nitr geno en la naturale'a 2*L=,3, siendo el holand"s Martinus 6eijerincC 2*L+*G*=D*3 el descubridor de &'otobacter como bacteria aerobia fijadora de vida libre 2*=,*3. M1s tarde 6eijerincC demostr por m"todos qumicos que, en efecto, &'otobacter incorpora nitr geno de la atm sfera mientras crece 2*=,L3. La importancia de la fijaci n de nitr geno para la nutrici n vegetal lleg con los estudios sobre bacterias formadoras de n dulos en las races de las leguminosas. Ia los e(perimentos cuantitativos sobre plantas creciendo en recipientes, reali'ados por 6oussingault a mediados del siglo $&$, haban indicado que las leguminosas asimilaban nitr geno de la atm sfera. En *L?? %oronin descubri las bacterias de los n dulos radicales de esta familia de plantas. HranC, en *L>=, demostr que los n dulos parecan inducirse por las mismas bacterias albergadas en ellos, y Pard 2*LL>3 us bacterias procedentes de n dulos machacados para inocular semillas, logrando la producci n de n dulos en suelo est"ril, y describiendo en un bello trabajo el proceso de infecci n, con su producci n de -hifas. 2cord n de infecci n3. 4ras la introducci n del concepto de simbiosis por )e 6ary, en *L>L, fue 9chindler 2*LLF3 el primero en describir los n dulos radicales como resultado de una simbiosis entre planta y bacterias. Los trabajos de Kermann Kellriegel 2*LD*G*L=+3 y de su colaborador Kermann Pillfahrt 2*L+DG*=,F3, que trabajaban en la Estaci n E(perimental de 6ernburg, comunicados en primer lugar en un congreso en 6erln, en *LL?, y publicados en un artculo ejemplar en *LLL, asociaron la fertilidad nitrogenada natural de las leguminosas con la presencia de sus n dulos radicales, sealando que estos n dulos se inducan por microorganismos especficos< de este modo lograron una brillante sntesis de las observaciones microbiol gicas y qumicas. El mismo ao de *LLL 6eijerincC logr el cultivo puro in vitro de las bacterias nodulares 2a las que bauti' como Bacillus radicicola3, observando que no reducan nitr geno en vida libre< m1s tarde 2*L=,3 aport la prueba definitiva de que las bacterias aisladas eran capaces de nodular especficamente ciertas especies de leguminosas, adquiri"ndose de esta forma la facultad de fijar nitr geno en su asociaci n con la ra' de la planta. &r nicamente el nombre definitivo para las bacterias de los n dulos de leguminosas 2(hi'obium3 fue propuesto por HranC, quien durante mucho tiempo se haba negado a reconocer los resultados de Kellriegel y Pillfahrt, y que haba oscilado en sus opiniones, desde suponer que la fijaci n de nitr geno era un rasgo general de las plantas, hasta creer que las estructuras intranodulares observadas a microcopio 2bacteroides3 eran gr1nulos de reserva 2incluidas las que "l mismo observ en plantas no leguminosas de los g"neros &lnus y )leagnus, originadas por una bacteria bauti'ada en su honor G*ran"ia3< incluso cuando se convenci de que los simbiontes eran bacterias 2y no hongos o mi(omicetes3, pensaba que "stas s lo estimulaban a que las

plantas fijaran nitr geno en sus hojas< su -conversi n. 2y a!n as incompleta y con reticencias3 no lleg hasta *L=J. El aislamiento de los bacteroides intranodulares 2Pra'moBsCi, *L=,3, y la relaci n entre su formaci n y la fijaci n de nitr geno 2:obbe y Kiltner, *L=D3 complet esta primera oleada de investigaci n sobre este tema que tanta trascendencia presentaba para la 0gronoma. Estos estudios est1n en la base de todos los ulteriores trabajos de Microbiologa 0grcola, de modo que esta especiliadad fue incorporada tempranamente a los laboratorios cientficos y estaciones e(perimentales. Las obras trascendentales de PinogradsCy y 6eijerincC abrieron un nuevo hori'onte para el estudio de la diversidad microbiana. La escuela de 6eijerincC, en la Oniversidad 4"cnica de )elft, fue continuada por por 0.N. 7luyver y #.6. van :iel, siendo este !ltimo el -padre. de la escuela norteamericana desde su establecimiento en #alifornia, ya que form a figuras tan importantes como /.I. 9tanier, /.E. Kungate o M. )oudoroff. La escuela holandesa fundada por 6eijerincC tuvo asimismo otra fructfera -colonia. en la ciudad alemana de 7onstan', donde :. Pfennig continu el trabajo emprendido junto a van :iel en )elft. 4odos estos autores, y sus colaboradores, fueron reali'ando contribuciones esenciales sobre una amplia diversidad de bacterias, descubriendo la variedad de las bacterias fotosint"ticas, los tipos de organismos litotr ficos, y profundi'ando en multitud de aspectos estructurales y fisiol gicos de las bacterias reci"n descubiertas. #omo dice 4.). 6rocC en una recensi n de 7luyver 2*=?*3 -los hombres de la escuela de )elft de Microbiologa ;eneral fueron pioneros en una "poca en la que la mayora de los investigadores estaban demasiado fascinados por problemas aplicados en medicina, agricultura o industria, como para preocuparse por microorganismos quimiosint"ticos o fotosint"ticos, o por aquellos que muestran fermentaciones inusuales..... Pero, como en tantas otras ocasiones, este enfoque de ciencia b1sica ha sido e(traordinariamente f"rtil, y aparte de la profundi'aci n en la unidad y diversidad de la vida ha dado origen a penetrantes percepciones en multitud de problemas planteados, tarde o temprano, a las ciencias biol gicas.

2.% DESARROLLO DE LA INMUNOLOGA

La inmunologa es, en la actualidad, una ciencia aut noma y madura, pero sus orgenes han estado estrechamente ligados a la Microbiologa. 9u objeto consiste en el estudio de las respuestas de defensa que han desarrollado los animales frente a la invasi n por microorganismos o partculas e(traos, aunque su inter"s se ha volcado especialmente sobre aquellos mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de especificidad y de memoria, frente a agentes reconocidos por el cuerpo como noGpropios, as como de su neutrali'aci n y degradaci n. #omo tantas otras ciencias, la &nmumologa presenta un prolongado perodo preG cientfico, de observaciones y apro(imaciones meramente empricas. La resistencia a ulteriores ataques de una enfermedad infecciosa fue ya recogida en escritos de la antigAedad< el historiador griego 4ucdides 2F?FGF,F a.#.3 narra que en una epidemia acaecida durante la guerra del Peloponeso, los enfermos eran atendidos solo por aquellos que haban sobrevivido previamente a la enfermedad, en la seguridad de que "stos no volveran a ser contagiados. &gualmente, en la antigua #hina se haba observado que las

personas que en su nie' haban padecido la viruela no la adquiran m1s adelante en su vida. Los mismos chinos, en el siglo $& a. #., fueron los primeros en intentar una aplicaci n de estas observaciones que indicaban la inducci n de un estado protector por medio de una forma suave de la enfermedad@ la inhalaci n de polvo de escaras de viruela provocaba un ataque suave que confera resistencia ante infecciones posteriores. Ona modificaci n fue introducida en 5ccidente en el siglo $%&&& por Pylarini y 4imoni, y fue populari'ada en ;ran 6retaa por Lady Mary Portley Montagu, esposa del embajador ingl"s en #onstantinopla, tras una serie inicicial de pruebas sobre -voluntarios. 2sic, en realidad prisioneros3. 9in embargo, este tipo de pr1cticas no llegaron a arraigar ampliamente, ya que no estaban e(entas de riesgos, entre los cuales figuraba la posibilidad de transmisi n de otras enfermedades. El primer acercamiento a la inmuni'aci n con criterios racionales fue reali'ado por el m"dico ingl"s EdBard Nenner 2*>F=G*LJD3, tras su constataci n de que los vaqueros que haban adquirido la viruela vacunal 2una forma benigna de enfermedad que s lo produca p!stulas en las manos3 no eran atacados por la grave y deformante viruela humana. En mayo de *>=? inocul a un nio fluido procedente de las p!stulas vacunales de 9arah :elmes< semanas despu"s el nio fue inyectado con pus de una p!stula de un enfermo de viruela, comprobando que no quedaba afectado por la enfermedad. Nenner public sus resultados en *>=L 2-&n en+uiry into the causes and e,,ects o, the variolae vaccinae...3, pronosticando que la aplicaci n de su m"todo podra llegar a erradicar la viruela. Nenner fue el primero en recalcar la importancia de reali'ar estudios clnicos de seguimiento de los pacientes inmuni'ados, consciente de la necesidad de contar con controles fiables. La falta de conocimiento, en aquella "poca, de las bases microbiol gicas de las enfermedades infecciosas retras en casi un siglo la continuaci n de los estudios de Nenner, aunque ciertos autores, como 4urenne, en su libro --a syphili'ation 2*L>L3 lograron articular propuestas te ricas de cierto inter"s. El primer abordaje plenamente cientfico de problemas inmunol gicos se debi , de nuevo, a Pasteur. Estudiando la bacteria responsable del c lera aviar 2m1s tarde conocida como #asteurella aviseptica3, observ 2*LL,3 que la inoculaci n en gallinas de cultivos viejos, poco virulentos, las protega de contraer la enfermedad cuando posteriormente eran inyectadas con cultivos normales virulentos. )e esta forma se obtuvo la primera vacuna a base de microorganismos atenuados. Hue precisamente Pasteur quien dio carta de naturale'a al t"rmino vacuna, en honor del trabajo pionero de Nenner. En los aos siguientes Pasteur abord la inmuni'aci n artificial para otras enfermedades< concretamente, estableci de forma clara que cultivos de Bacillus anthracis atenuados por incubaci n a F+E# conferan inmunidad a ovejas e(puestas a contagio por carbunco. Ona famosa demostraci n p!blica de la bondad del m"todo de Pasteur tuvo lugar en Pouilly le Hort, el dos de junio de *LL*, cuando ante un gento e(pectante se pudo comprobar la muerte del grupo control de ovejas y vacas no inoculadas, frente a la supervivencia de los animales vacunados. 0os despu"s, abordara la inmuni'aci n contra la rabia, enfermedad de la que se desconoca el agente causal. Pasteur observ que "ste perda virulencia cuando se mantenan al aire durante cierto tiempo e(tractos medulares de animales infectados, por lo que dichos e(tractos se podan emplear efica'mente como vacunas. /eali' la primera vacunaci n antirr1bica en humanos el ? de julio de *LL+, sobre el nio Noseph Meister, que

haba sido mordido gravemente por un perro rabioso. 0 este caso siguieron otros muchos, lo que vali a Pasteur reconocimiento universal y supuso el apoyo definitivo a su m"todo de inmuni'aci n, que abra perspectivas prometedoras de profila(is ante muchas enfermedades. Estos logros determinaron, en buena medida, la creaci n del &nstituto Pasteur, que muy pronto reuni a un selecto grupo de cientficos, que enfocaran sus esfuer'os en diversos aspectos de las inmuni'aciones y de sus bases biol gicas. 0 su ve', los norteamericanos 9almon y 9mith 2*LL?3 perfeccionaron los m"todos serol gicos de Pasteur, lo que les permiti producir y conservar m1s f1cilmente sueros tipificados contra la peste porcina.

caricatura deMetchniCov 0 finales del siglo $&$ e(istan dos teoras opuestas sobre los fundamentos biol gicos de las respuestas inmunes. Por un lado, el 'o logo ruso &lya &lich MechniCov 2*LF+G*=*?3, que haba reali'ado observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y pulgas de agua, estableci , a partir de *LLD, su -4eora de los fagocitos., tras estudiar fen menos de englobamiento de partculas e(traas por los leucocitos de conejo y de humanos. &nform que e(istan fen menos de eliminaci n de agentes pat genos por medio de -c"lulas devoradoras. 2fagocitos3 que actuaban en animales vacunados contra el carbunco, y e(plic la inmuni'aci n como una -habituaci n. del hu"sped a la fagocitosis. M1s tarde, ya integrado en el &nstituto Pasteur, propugn la idea de que los fagocitos segregan en'imas especficos, an1logos a los -fermentos. digestivos 2*=,,3. Esta teora de los fagocitos constituy el n!cleo de la teora de la inmunidad celular, de modo que la fagocitosis se consideraba como la base principal del sistema de defensa inmune del organismo. Por otro lado, la escuela alemana de 7och haca hincapi" en la importancia de los mecanisnos humorales. Emil von 6ehring 2*L+FG*=*>3 y 9hibasaburo 7itasato 2*L+?G *=D*3, a resultas de sus trabajos sobre las to(inas del t"tanos y de la difteria, observaron que el cuerpo produce -antito(inas. 2m1s tarde conocidas como anticuerpos3 que tendan a neutrali'ar las to(inas de forma especfica, y evidenciaron que el suero que contiene antito(inas es capa' de proteger a animales e(puestos a una dosis letal de la to(ina correspondiente 2*L=,3. La intervenci n de Ehrlich permiti obtener sueros de caballo con niveles de anticuerpos suficientemente altos como para conferir una protecci n efica', e igualmente se pudo disponer de un ensayo para cuantificar la -antito(ina. presente en suero. Ehrlich dirigi desde *L=? el &nstituto Estatal para la &nvestigaci n y #omprobaci n de 9ueros, en 9teglit', cerca de 6erln, y, a partir de *L==, estuvo al frente del mejor equipado &nstituto de 4erapia E(perimental, en HranCfurt. )urante este !ltimo periodo de su vida, Ehrlich produce una impresionante obra cientfica, en la que va ahondando en la comprensi n de la inmunidad humoral. En *=,, da a lu' su -4eora de las cadenas

laterales., en la que formula una e(plicaci n de la formaci n y especificidad de los anticuerpos, estableciendo una base qumica para la interacci n de "stos con los antgenos. Por su lado, /. 7raus visuali'a por primera ve', en *L=>, una reacci n antgenoGanticuerpo, al observar el enturbiamento de un filtrado bacteriano al me'clarlo con un suero inmune especfico 2antisuero3. En *L=L Nules 6ordet 2*L>,G*=?*3 descubre otro componente s"rico relacionado con la respuesta inmunitaria, al que bauti'a como -ale(ina., caracteri'ado, frente al anticuerpo, por su termolabilidad e inespecificidad. 2M1s tarde se impondra el nombre de complemento, propuesto por Ehrlich3. El mismo 6ordet desarroll , en *=,*, el primer sistema diagn stico para la detecci n de anticuerpos, basado en la fijaci n del complemento, y que inici una larga andadura, que llega a nuestros das. La conciliaci n de las dos teoras se debi a 0lmorth Prigth y 9teBart /. )ouglas, quienes en *=,F descubren las opsoninas, anticuerpos presentes en los sueros de animales inmuni'ados y que, tras unirse a la superficie bacteriana, incrementan la capacidad fagoctica de los leucocitos. El 1rea de la inmunopatologa inicia su andadura con la descripci n del fen meno de anafila(ia producido por introducci n en un animal de un suero de una especie distinta 2Portier y /ichet, *=,J< 0rthus, *=,D3, lo que a su ve' abrira la posibilidad de m"todos de serodiagn stico, con aplicaciones m!ltiples en Medicina, Qoologa, y otras ciencias biol gicas. En *=,+ Pirquet sugiere que la enfermedad del suero 2un fen memo de hipersensibilidad3 tiene relaci n directa con la producci n de anticuerpos contra el suero inyectado, introduciendo el t"rmino de alergia para referirse a la reactividad inmunol gica alterada. La inmunoqumica cobra un gran impulso en las primeras d"cadas del siglo $$ con los trabajos de 7arl Landsteiner 2*L?LG*=FD3. 9u primera contribuci n de importancia haba sido la descripci n, mediante reacciones de aglutinaci n, del sistema de antgenos naturales 206#,3 de los eritrocitos humanos 2*=,*G*=,J3, completada 2en colaboraci n con %on )ungern y Kir'feld3, con las subdivisiones del grupo 0 y el estudio de su transmsi n hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estmulo para avan'ar en el desentraamiento de la especificidad qumica de los antgenos que determinan la formaci n de anticuerpos. Landsteiner estudi sistem1ticamente las caractersticas de inmunogenicidad y especificidad de reacci n de antgenos con anticuerpos, vali"ndose de la modificaci n qumica de antgenos, denominando haptenos a aquellos grupos qumicos que por s mismos no desencadenan formaci n de anticuerpos, pero s lo hacen tras ser conjugados a protenas portadoras. La cuesti n de las reacciones antgenoGanticuerpo se convirti en otra pol"mica entre escuelas hasta finales de los aos J,. Mientras Ehrlich y sus seguidores mantenan que estas reacciones tienen una base puramente qumica, 6ordet y sus discpulos las e(plicaban como fen menos fsicos de reacciones entre coloides. La resoluci n del debate debi aguardar hasta finales de los aos D,, al incorporarse avances t"cnicos como la electroforesis, la cromatografa en papel, la ultracentrifugaci n y el microscopio electr nico. Keidelberg y 7endall 2*=D?3 purificaron anticuerpos a partir de sueros por disociaci n de precipitados. 4iselius 2*=D=3 demostr que los anticuerpos constituyen la fracci n gammaGglobulnica del suero. %einte aos despu"s /./. Porter y ;.M. Edelman

establecen la estructura de las inmunoglobulinas. )urante este lapso de tiempo se descubre que la sntesis de anticuerpos ocurre en las c"lulas plasm1ticas, aunque "stas no son puestas en relaci n a!n con los linfocitos< durante muchos aos se sigui creyendo que los linfocitos eran c"lulas pasivas, sin funci n inmune. Por aquella "poca se describe, tambi"n, la diversidad de inmunoglobulinas, lleg1ndose al establecimiento de una nomenclatura. Enseguida comien'a la era de los m!ltiples e(perimentos sobre timectoma en ratones neonatos y sobre bursectoma en aves, as como los de reconstituci n de animales irradiados, con timocitos y c"lulas de la medula sea, y que permiten afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales 4 y 6, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente. Ona importante faceta de la inmunologa de la primera mitad del siglo $$ fue la obtenci n de vacunas. 9e lograron to(oides inmunog"nicos a partir de to(inas bacterianas, en muchos casos por tratamiento con formol@ to(oide tet1nico 2Eisler y LoBenstein, *=*+3 y to(oide dift"rico 2;lenny, *=J*3. En *=JJ se desarrolla la vacuna 6#; contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de #almetteG;u"rin. La utili'aci n de coadyuvantes se inicia en *=*?, por LeMoignic y Piroy. La inmunogen"tica nace cuando 6ernstein describe en *=J* el modelo de transmisi n hereditaria de los cuatro grupos sanguneos principales, bas1ndose en el an1lisis estadstico de sus proporciones relativas, y con el descubrimiento por Landsteiner y LevTne 2*=J>3 de los nuevos sistemas M: y P. Los e(perimentos de transfusiones sanguneas interespecficas permitieron distinguir la gran complejidad de los antgenos sanguneos, e(plicables seg!n unos D,, alelos m!ltiples. Ona contribuci n esencial a las ideas sobre el mecanismo de formaci n de los anticuerpos la reali' el australiano Macfarlane 6urnet 2*L==G*=L+3, al establecer su teora de la selecci n clonal< "sta argumenta que cada linfocito 6 sinteti'a un !nico tipo de anticuerpo, especfico para cada antgeno 2determinante antig"nico3, de modo que la uni n del antgeno causa la proliferaci n clonal del linfocito 6, con la consecuente sntesis incrementada de anticuerpos especficos. &gualmente, 6urnet lan' una hip tesis sobre el mecanismo subyacente a la autoGtolerancia inmunol gica, que fue confirmada e(perimentalmente por Peter MedaBar. M1s recientemente :iels Nerne ha reali'ado nuevas aportaciones y refinamientos a la teora de la selecci n clonal, proponiendo un modelo de regulaci n inmune conocido como teora de las redes idiotpicas. Los avances en &nmunologa durante los !ltimos aos han sido espectaculares, consolidando a "sta como ciencia independiente, con su conjunto propio de paradigmas, ya relativamente escindida de su tronco originario microbiol gico. Entre los hitos recientes hay que citar la t"cnica de producci n de anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas, desarrollada originalmente por #"sar Milstein y ;eorges 7ohler en *=>+, y que presenta una enorme gama de aplicaciones en biomedicina, o el desentraamiento de los fen menos de reorgani'aci n gen"tica responsables de la e(presi n de los genes de inmunoglobulinas, por 9usumu 4onegaBa.

2.1& ORIGEN Y DESARROLLO DE LA VIROLOGA

La %irologa ha sido la ciencia microbiol gica de origen m1s tardo, habiendo surgido como resultado del halla'go de enfermedades infecciosas en las que la demostraci n de implicaci n de microorganismos se demostraba esquiva con los medios habituales disponibles a finales del siglo $&$. La euforia que se viva en los 1mbitos cientficos y m"dicos, al socaire de la edad de oro de aislamiento de bacterias pat genas, se plasm en el prejuicio de que la incapacidad de hacer crecer los agentes causantes de ciertas enfermedades se deba a una t"cnica inapropida o mal aplicada. El bot1nico ruso )imitri &BanovsCi haba observado 2*L=J3 que la enfermedad del mosaico del tabaco poda ser reproducida e(perimentalmente usando el fluido que atravesaba los filtros de porcelana que normalmente retenan a las bacterias, pero siendo incapa' de aislar y crecer el supuesto microorganismo, abandon la investigaci n. Pocos aos m1s tarde 2*L=L3, y probablemente sin tener noticias del trabajo de &BanovsCi, 6eijerinC reali' e(perimentos similares con el mismo sistema, y en otro rasgo de su genio, enfrent1ndose a los conceptos de la "poca, avan' la idea de que el agente filtrable 2un contagium vivum ,luidum, seg!n su e(presi n3, deba de incorporarse al protoplasma vivo del hospedador para lograr su reproducci n. Este tipo de agentes infectivos que atravesaban los filtros de porcelana fueron llamados en principio -virus filtrables., quedando m1s tarde su denominaci n simplemente como virus. 0quel mismo ao de *L=L Loeffler y Hrosch descubren los virus animales al comprobar que un virus filtrable es responsable de la glosopeda del ganado. En *=,* /eed descubre el primer virus humano, el de la fiebre amarilla, y en *=,= Landsteiner y Pope detectan el de la poliomielitis. 0 comien'os de siglo #opeman desarrolla su t"cnica de multiplicaci n de virus animales en embriones de pollo, con la que P. /ous aisla y cultiva el virus del sarcoma aviar 2*=**3. Los virus bacterianos fueron descubiertos en *=*+ por H.P. 4Bort, si bien su trabajo no alcan' la elegancia y claridad del desarrollado poco m1s tarde por el canadiense H"li( dUK"relle 2*=*>3< fue "ste quien acu el t"rmino bacteri.,ago, y supuso correctamente que el fen meno de lisis por estos agentes deba de estar ampliamente difundido entre las bacterias. 0unque su esperan'a en la aplicaci n de los fagos como elementos bactericidas para uso m"dico no pudo satisfacerse, la contribuci n de los virus bacterianos al avance de la gen"tica y biologa moleculares ha sido decisiva@ de hecho, los primeros estudios cuantitativos sobre replicaci n vir1sica se reali'aron sobre fagos de )scherichia coli, lo que suministr modelos aplicables a otros virus, incluidos los de animales. En *=J+ 6ordet y 6al describen por primera ve' el fen meno de lisogenia, pero las relaciones entre los ciclos ltico y lisog"nico de los fagos no fueron aclaradas hasta los estudios de 0ndr" LBoff 2*=+,3. La primera visuali'aci n de un virus se debe a las observaciones a microscopio ultravioleta del bacteri logo ingl"s 6arnard 2*=J+3, y en *=D= se reali'a la primera fotografa de un virus a microscopio electr nico. Pero los avances m1s significativos en el estudio de la composici n y estructura de los virus se inician con la purificaci n y cristali'aci n, por Pendell M. 9tanley, del virus del mosaico del tabaco G4M%G 2*=D+3, aplicando procedimientos tpicos de la cristali'aci n de en'imas. &nicialmente 9tanley

comprob que el 4M% contena gran proporci n de protena, pero poco m1s tarde detecta, adem1s, la presencia de 1cido nucleico. 0 partir de aqu, la %irologa entra en una fase de ciencia cuantitativa, en la que participan numerosos fsicos, bioqumicos y genetistas, en un esfuer'o interdisciplinar que da origen a la moderna 6iologa Molecular. On importante avance metodol gico para el estudio de los virus animales se debi a Enders, Peller y /obbins 2*=F=3, al desarrollar por primera ve' un m"todo para la multiplicaci n vir1sica sobre cultivos de tejidos de mamferos, t"cnica que fue perfeccionada m1s tarde por el equipo de /enato )ulbecco. Los recientes progresos en las numerosas t"cnicas de biologa molecular han propiciado una aut"ntica e(plosi n de descubrimientos sobre la biologa de los virus y de sus c"lulas hospedadoras< baste citar la replicaci n del genomio de 0/: de los retrovirus por reversotranscripci n a 0):, los fen menos de transformaci n oncog"nica vir1sica y su aplicaci n a los estudios generales del c1ncer, el diseo de vacunas recombinantes por manipulaci n in vitro de genomios vir1sicos, la pr (ima aplicaci n clnica de la primeras terapias g"nicas en humanos recurriendo a vectores vir1sicos, etc. En el terreno de las necesidades urgentes, la metodologa e(istente ha permitido la r1pida identificaci n y caracteri'aci n del virus de la inmunodeficiencia humana, lo que se est1 traduciendo en una intensa y racional b!squeda de procedimientos para prevenir y eliminar la inesperada epidemia de 9&)0. En aos recientes han sido descubiertos dos nuevos tipos de entidades infectivas, subvir1sicas@ 4.5. )iener describi en *=?> la e(istencia de 0/: desnudos infectivos en plantas, a los que llam viroides, y en *=L* Prusiner puso de manifiesto que determinadas enfermedades de mamferos se deben a partculas proteicas aparentemente desprovistas de material gen"tico, a las que bauti' como priones.

2.11 RELACIONES ENTRE LA MICROBIOLOGA Y OTRAS CIENCIAS BIOLGICAS.

El auge de la microbiologa desde finales del siglo $&$ se plasm , entre otras cosas, en el aislamiento de gran variedad de cepas silvestres de microorganismos, lo que suministr un enorme volumen de nuevo material biol gico sobre el que trabajar, aplic1ndose una serie de enfoques que eran ya habituales en las ciencias naturales m1s antiguas< as, haba que crear un marco ta(on mico 2con sus normas de nomenclatura3 para encuadrar a los organismos reci"n descubiertos, era factible desarrollar trabajos sobre morfologa y fisiologa comparadas, sobre variabilidad y herencia, evoluci n, ecologa, etc. )e este modo la joven Microbiologa fue objeto, en pocos aos, de la utili'aci n, a un ritmo acelerado, de los m"todos ta(on micos y e(perimentales que haban ido surgiendo y madurando desde el siglo $%&&& en los 1mbitos de la -Kistoria :atural. cl1sica. 0unque nos referiremos en otro apartado /v0ase cap. 12 a los avances de 4a(onoma Microbiana, vale la pena resear aqu los esfuer'os tempranos para lograr un clasificaci n bacteriana por parte de #ohn 2*L>+3 y Migula 2*L=F3, que sustentaban su concepto de especie predominantemente sobre caracteres morfol gicos. Pero hacia *=,, era evidente la

arbitrariedad e insuficiencia de este tipo de clasificaciones, de modo que los intentos posteriores hicieron uso de caracteres bioqumicos 25rma Nensen, *=,=3, o de una me'cla de rasgos morfol gicos, bioqumicos, patog"nicos y de tinci n 26uchanan, *=*+3. El sistema de ta(onoma bacteriana adquiri un nuevo impulso a partir de la *V edici n del -Bergey3s Manual o, Determinative Bacteriology 2*=JD3, y de las propuestas de 7luyver y van :iel 2-#rospects ,or a natural system o, classi,ication o, bacteria, *=D?3. En cuanto a la nomenclatura, no fue hasta *=+L en que cuaj un # digo &nternacional de :omenclatura 6acteriol gica, aunque ya se vena aplicando desde haca tiempo el procedimiento tipol gico para los microorganismos, con criterios similares a los de la Qoologa y la 6ot1nica. El establecimiento de relaciones ta(on micas precis el recurso a m"todos cada ve' m1s amplios y afinados de an1lisis gen"tico, estructural o fisiol gico. En un apartado anterior ya vimos las cone(iones tempranas entre la 6ioqumica y la Microbiologa a prop sito del descubrimiento de la base en'im1tica de las fermentaciones, lo cual abri el camino para dilucidar el metabolismo energ"tico microbiano, y para demostrar su similitud qumica con rutas metab licas de organismos superiores. 5tro paso importante en la percepci n de la unidad bioqumica del mundo vivo deriva del descubrimiento de las vitaminas 2t"rmino acuado por HunC en *=**3, al establecerse que determinados factores de crecimiento requeridos por algunos microorganismos eran qumicamente similares a las vitaminas necesarias en la dieta de los animales, y que este tipo de compuestos representa precursores biosint"ticos de coen'imas del metabolismo celular. 0s pues, este tipo de investigaciones sent claramente la idea de la unidad qumica de los seres vivos, independientemente de su encuadre ta(on mico, y encau' una buena parte de los trabajos bioqumicos hacia los microorganismos, dadas sus cualidades de facilidad de manejo y cultivo en laboratorio. En cuanto a las cone(iones de la Microbiologa con la ;en"tica, ya 6eijerinC, en *=,,, tras anali'ar la teora de la mutaci n de )e %ries, haba predicho que los microoganismos podran convertirse en objetos de investigaci n m1s adecuados que los sistemas animales o vegetales. Pero las primeras cone(iones entre ambas ciencias arrancan de la necesidad que hubo, a principios del siglo $$, de determinar la se(ualidad de los hongos con fines ta(on micos. En *=,+ Maire demostr la e(istencia de meiosis en la formaci n de ascosporas, y #laussen 2*=,>3 evidenci fusi n de n!cleos en 0scomicetos, mientras que 7niepp, hacia finales de los aos D, haba recogido un gran volumen de informaci n sobre procesos se(uales en 6asidiomicetos. El sueco Lindegren 2*=D?3 reali'a las primeras cartografas gen"ticas en cromosomas de Neurospora, durante su estancia en el laboratorio californiano de Morgan< este !ltimo, propugnador de la -teora de los genes. 2*=J?3, confiaba desde haca aos en ampliar sus "(itos, logrados en Drosophila, hacia el estudio de la gen"tica microbiana. En *=F*, otros dos discpulos de Morgan, 6eadle y 4atum, aislan mutantes au(otr ficos de Neurospora, con lo que se inicia el estudio de la base bioqumica de la herencia, y convierten a este hongo en una valiosa herramienta de trabajo en esta lnea de investigaci n. Las estrategias diseadas por 6eadle y 4atum fueron aplicadas por Luria y )elbrAcC 2*=FD3 a cultivos bacterianos, investigando la aparici n de mutaciones espont1neas resitentes a fagos o estreptomicina. La cone(i n de estos e(perimentos con las

observaciones previas de ;riffith 2*=JL3 sobre la transformaci n del neumococo, llev a 0very y colaboradores 2*=FF3 a demostrar que el -principio transformante. portador de la informaci n gen"tica es el 0):. En *=F= ErBin #hargaff demuestra bioqumicamente la transmisi n gen"tica mediante 0): en )scherichia coli , y en *=+J 0lfred Kershey y Martha #hase, en e(perimentos con componentes marcados de fagos, ponen un elegante colof n a la confirmaci n de la funci n del 0):, con lo que se derribaba el antiguo y asentado -paradigma de las protenas. que hasta mediados de siglo intentaba e(plicar la base de la herencia. )e esta forma, la Microbiologa e(perimental se sit!a en pleno centro del nacimiento de la ;en"tica molecular, de la mano de los avances paralelos en 6ioqumica 2an1lisis por rayos $ de la estructura del 0): debido a Maurice PilCins y /osalind HranClin, modelo de Patson y #ricC de la doble h"lice del 0):, etc.3, dando origen esta confluencia a lo que se ha llamado la -Edad de 5ro. de la 6iologa Molecular.

3 OB'ETO DE ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGA

El objeto de estudio de una ciencia se puede desglosar en dos apartados@ objeto material y objeto formal.

3.1 OB'ETO MATERIAL( LOS MICROORGANISMOS

La Microbiologa es la ciencia que se ocupa del estudio de los microorganismos, es decir, de aquellos organismos demasiado pequeos para poder ser observados a simple vista, y cuya visuali'aci n requiere el empleo del microscopio. Esta definici n implica que el objeto material de la Microbiologa viene delimitado por el tamao de los seres que investiga, lo que supone que abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y ta(on micos@ desde partculas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los proto'oos y parte de las algas y de los hongos. )e esta manera la Microbiologa se distingue de otras disciplinas organsmicas 2como la Qoologa y la 6ot1nica3 que se centran en grupos de seres vivos definidos por conceptos biol gicos homog"neos, ya que su objeto de indagaci n se asienta sobre un criterio artificial que obliga a incluir entidades sin m1s relaci n en com!n que su pequeo tamao, y a e(cluir a diversos organismos macrosc picos muy emparentados con otros microsc picos. 0 pesar de esto 2o incluso debido a ello3, la Microbiologa permanece como una disciplina perfectamente asentada y diferenciada, que deriva su coherencia interna del tipo de metodologas ajustadas al estudio de los organismos cuyo tamao se sit!a por debajo del lmite de resoluci n del ojo humano, aportando un conjunto especfico de conceptos que han enriquecido la moderna 6iologa. Podemos definir, pues, a los microorganismos como seres de tamao microsc pico dotados de individualidad, con una organi'aci n biol gica sencilla, bien sea acelular o

celular, y en este !ltimo caso pudiendo presentarse como unicelulares, cenocticos, coloniales o pluricelulares, pero sin diferencianci n en tejidos u rganos, y que necesitan para su estudio una metodologa propia y adecuada a sus pequeas dimensiones. 6ajo esta denominaci n se engloban tanto microorganismos celulares como las entidades subcelulares.

3.1.1

MICROORGANISMOS CELULARES

#omprenden todos los procariotas y los microorganismos eucari ticos 2los proto'oos, los mohos mucosos, los hongos y las algas microsc picas3. El encuadre de todos estos grupos heterog"neos ser1 abordado en el pr (imo captulo.

3.1.2

VIRUS Y PARTICULAS SUBVIRASICAS

5tro tipo de objetos de estudio de la microbiologa son las entidades no celulares, que a pesar de no poseer ciertos rasgos atribuibles a lo que se entiende por vida, cuentan con individualidad y entidad biol gica, y caen de lleno en el dominio de esta ciencia. Los virus son entidades no celulares de muy pequeo tamao 2normalmente inferior al del m1s pequeo procariota3, por lo que debe de recurrirse al microscopio electr nico para su visuali'aci n. 9on agentes infectivos de naturale'a obligadamente parasitaria intracelular, que necesitan su incorporaci n al protoplasma vivo para que su material gen"tico sea replicado por medio de su asociaci n m1s o menos completa con las actividades celulares normales, y que pueden transmitirse de una c"lula a otra. #ada tipo de virus consta de una sola clase de 1cido nucleico 20): o 0/:, nunca ambos3, con capacidad para codificar varias protenas, algunas de las cuales pueden tener funciones en'im1ticas, mientras que otras son estructurales, disponi"ndose "stas en cada partcula vir1sica 2viri n3 alrededor del material gen"tico formando una estructura regular 2c1psida3< en algunos virus e(iste, adem1s, una envuelta e(terna de tipo membranoso, derivada en parte de la c"lula en la que se desarroll el viri n 2bicapa lipdica procedente de membranas celulares3 y en parte de origen vir1sico 2protenas3. En su estado e(tracelular o durmiente, son totalmente inertes, al carecer de la maquinaria de biosntesis de protenas, de replicaci n de su 1cido nucleico y de obtenci n de energa. Esto les obliga a un modo de vida 2sic3 parasitario intracelular estricto o fase vegetativa, durante la que el viri n pierde su integridad, y normalmente queda reducido a su material gen"tico, que al superponer su informaci n a la de la c"lula hospedadora, logra ser e(presado y replicado, produci"ndose eventualmente la formaci n de nuevos viriones que pueden reiniciar el ciclo. Los viroides son un grupo de nuevas entidades infectivas, subvir1sicas, descubiertas en *=?> por 4.5. )iener en plantas. Est1n constituidos e(clusivamente por una pequea mol"cula circular de 0/: de una sola hebra, que adopta una peculiar estructura secundaria alargada debido a un e(tenso, pero no total, emparejamiento intracatenario de bases por 'onas de homologa interna. #arecen de capacidad codificadora y muestran cierta semejan'a con los intrones autocatalticos de clase &, por lo que podran representar

secuencias intercaladas que escaparon de sus genes en el transcurso evolutivo. 9e desconocen detalles de su modo de multiplicaci n, aunque algunos se locali'an en el nucleoplasma, e(istiendo pruebas de la implicaci n de la 0/: polimerasa && en su replicaci n, por un modelo de crculo rodante que genera concat"meros lineares. Esta replicaci n parece requerir secuencias conservadas hacia la porci n central del viroide. Los viroides aislados de plantas originan una gran variedad de malformaciones patol gicas. El mecanismo de patogenia no est1 aclarado, pero se sabe que muchos de ellos se asocian con el nucleolo, donde qui'1 podran interferir< sin embargo, no e(isten indicios de que alteren la e(presi n g"nica 2una de las hip tesis sugeridas3< cada mol"cula de viroide contiene uno o dos dominios conservados que modulan la virulencia. En *=L? se descubri que el agente de la hepatitis delta humana posee un genomio de 0/: de tipo viroide, aunque requiere para su transmisi n 2pero no para su replicaci n3 la colaboraci n del virus de la hepatitis 6, empaquet1ndose en partculas similares a las de este virus. 0 diferencia de los viroides vegetales, posee capacidad codificadora de algunas protenas. Los ARNs satlites son pequeas mol"culas de tamao similar al de los viroides de plantas 2DD,GF,, bases3, que son empaquetados en c1psidas de determinadas cepas de virus 2con cuyos genomios no muestran homologas3. 9e replican s lo en presencia del virus colaborador especfico, modificando 2aumentando o disminuyendo3 los efectos pat genos de "ste. Los virusoides constituyen un grupo de 0/:s sat"lites no infectivos, presentes en el interior de la c1psida de ciertos virus, con semejan'as estructurales con los viroides, replic1ndose e(clusivamente junto a su virus colaborador. Los priones son entidades infectivas de un tipo totalmente nuevo y original, descubiertas por 9tanley Prusiner en *=L*, responsables de ciertas enfermedades degenerativas del sistema nervioso central de mamferos 2por ejemplo, el -scrapie. o prurito de ovejas y cabras3, incluyendo los humanos 2Curu, sndrome de ;erstmannG 9traAssler, enfermedad de #reut'feldtGNaCob3. 9e definen como pequeas partculas proteicas infectivas que resisten la inactivaci n por agentes que modifican 1cidos nucleicos, y que contienen como componente mayoritario 2si no !nico3 una isoforma an mala de una proteina celular. 4anto la versi n celular normal 2PrP#3 como la pat gena 2PrP9c en el caso del -scrapie.3 son glicoprotenas codificadas por el mismo gen cromos mico, teniendo la misma secuencia primaria. 9e desconoce si las caractersticas distintivas de ambas isoformas estriban en diferencias entre los respectivos oligosac1ridos que adquieren por procesamiento postGtraduccional. 0 diferencia de los virus, los priones no contienen 1cido nucleico y est1n codificados por un gen celular. 0unque se multiplican, los priones de nueva sntesis poseen mol"culas de PrP que reflejan el gen del hospedador y no necesariamente la secuencia de la mol"cula del PrP que caus la infecci n previa. 9e desconoce su mecanismo de multiplicaci n, y para discernir entre las diversas hip tesis propuestas qui'1 haya que dilucidar la funci n del producto normal y su posible conversi n a la isoforma pat gena infectiva.

/ecientemente se ha comprobado que, al menos algunas de la enfermedades por priones son simult1neamente infectivas y gen"ticas, una situaci n ins lita en la Patologa humana, habi"ndose demostrado una relaci n entre un alelo dominante del PrP y la enfermedad de #reut'feldtGNaCob. El gen del pri n 2#rn4p3 est1 ligado gen"ticamente a un gen autos mico 2#rn4i3 que condiciona en parte los largos tiempos de incubaci n hasta el desarrollo del sndrome.

3.2 OB'ETO FORMAL

4odos los aspectos y enfoques desde los que se pueden estudiar los microorganismos conforman lo que denominamos objeto formal de la Microbiologa@ caractersticas estructurales, fisiol gicas, bioqumicas, gen"ticas, ta(on micas, ecol gicas, etc., que conforman el n!cleo general o cuerpo b1sico de conocimientos de esta ciencia. Por otro lado, la Microbiologa tambi"n se ocupa de las distintas actividades microbianas en relaci n con los intereses humanos, tanto las que pueden acarrear consecuencias perjudiciales 2y en este caso estudia los nichos ecol gicos de los correspondientes agentes, sus modos de transmisi n, los diversos aspectos de la microbiota pat gena en sus interacciones con el hospedador, los mecanismos de defensa de "ste, as como los m"todos desarrollados para combatirlos y controlarlos3, como de las que reportan beneficios 2ocup1dose del estudio de los procesos microbianos que suponen la obtenci n de materias primas o elaboradas, y de su modificaci n y mejora racional con vistas a su imbricaci n en los flujos productivos de las sociedades3. Hinalmente, la Microbiologa ha de ocuparse de todas las t"cnicas y metodologas destinadas al estudio e(perimental, manejo y control de los microorganismos, es decir, de todos los aspectos relacionados con el modo de trabajo de una ciencia emprica.

4 IMPORTANCIA DE LA MICROBIOLOGA
La Microbiologa es una ciencia biol gica e(traordinariamente relevante para la humanidad, dado que los microorganismos est1n presentes en todos los h1bitats y ecosistemas de la 4ierra y sus actividades presentan una gran incidencia en numerossimos 1mbitos de inter"s@ Los microorganismos han sido los primeros en aparecer en la evoluci n, y constituyen seguramente la mayor parte de la biomasa de nuestro planeta. 9e calcula que s lo hemos descrito menos del *,W de los microorganismos e(istentes, por lo que los bi logos tienen una gran tarea por delante para estudiar esta parte de la biodiversidad. Las actividades microbianas sustentan los ciclos biogeoqumicos de la 4ierra@ los ciclos del carbono, del nitr geno, del a'ufre o del f sforo dependen de modo fundamental de los microorganismos. Las actividades metab licas microbianas son e(cepcionalmente variadas, siendo algunas de ellas e(clusivas del mundo procari tico. La biolologa b1sica tiene aqu un gran

campo de estudio. El aspecto aplicado y la incidencia econ mica y social de los microorganismos es ingente, y aqu daremos unas breves pinceladas@ 0spectos beneficiosos@ 4odas las culturas desarrollaron de modo emprico multitud de bebibas y alimentos derivados de fermentaciones microbianas@ vino, cerve'a, pan, verduras fermentadas, etc. Producci n de multitud de productos industriales@ alcoholes, 1cidos org1nicos, antibi ticos, en'imas, polmeros, etc. La ingeniera gen"tica empe' con los microorganismos, que siguen desempeando un papel fundamental en la nueva generaci n de medicamentos recombinantes y de terapias novedosas En su aspecto perjudicial, la Microbiologa dedica una especial atenci n a los microorganismos pat genos, sobre todo a los que afectan a la humanidad Las enfermedades microbianas han sido causa de grandes males a nuestra especie. 6aste recordar que la peste 2muerte negra3 caus a mediados del siglo $&% la muerte de la tercera parte de la poblaci n europea, y ya en la primera mitad del siglo $% lleg a afectar a m1s del >+W. 6asta leer la literatura o ver las pinturas de la "poca para darse cuenta del impacto terrorfico que supuso, lo que a su ve' supuso un factor esencial en el surgimiento de las ideas del /enacimiento. )esde la "poca del descubrimiento de 0m"rica, las e(ploraciones han conllevado el intenso trasiego de agentes pat genos de un lugar a otro. La desaparici n de buena parte de la poblaci n indgena se debi en buena parte a no tener defensas frente a la viruela europea, pero a su ve' los descubridores importaron la sfilis a Europa. :o hace falta resaltar el papel que ha tenido la microbiologa m"dica, desde la "poca de Pasteur y 7och, en la lucha contra las enfermedades infecciosas 2antisepsia, desinfecci n, esterili'aci n, quimioterapia3. I aunque ahora tengamos nuevos retos 29&)0, fiebres hemorr1gicas, etc.3, no cabe duda de que la Microbiologa est1 contribuyendo a no perder esta permanente batalla contra los g"rmenes pat genos. 0parte de todas estas actividades de los microorganismos sobre los humanos, hay que tener en cuenta que e(isten g"rmenes que afectan a animales, plantas, instalaciones industriales, que afectan a alimentos, etc., representando otras tantas 1reas de atenci n para la Microbiologa.

5 UBICACIN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL MUNDO VIVO

4ras el descubrimiento de los microorganismos, a los naturalistas de la "poca les pareci normal intentar encuadralos dentro de los dos grandes reinos de seres vivos conocidos entonces@ animales y plantas. )e este modo, a finales del siglo $%&&& las algas y

los hongos quedaron en el reino #lantae, mientras que los llamados -infusorios. se encuadraron en el reino &nimalia. 0 mediados del siglo $&$ se empe' a ver que esa clasificaci n era demasiado sencilla, y que el grupo de los infusorios era muy heterog"neo. En *L?? KaecCel, seguidor de )arBin, propone un famoso 1rbol filogen"tico con tres reinos@ 0nimalia Plantae Protista@ todos los seres vivos sencillos, sean o no fotosint"ticos o m viles. )entro de "l consideraba los siguientes grupos@ Proto'oos Proto'oos 0lgas Kongos Moneras 2Xbacterias3 Pero esta clasificaci n iba a ser puesta en entredicho a mediados del siglo $$, cuando las t"cnicas de microscopa electr nica y bioqumicas demuestran la gran diferencia de las bacterias respecto del resto de organismos. )e hecho, ya en los aos ?, se reconoce que esta diferencia representa la mayor discontinuidad evolutiva del mundo vivo. En *=>F, el Manual Bergeys 2la biblia -oficiosa. de la clasificaci n bacteriana3 considera que la clasificaci n al m1(imo nivel del mundo vivo debe reconocer la e(istencia de dos -/einos.@ Procaryotae 2material gen"tico no rodeado de membrana nuclear3 Eucaryotae 2n!cleo aut"ntico3 Pero en los aos recientes, la incorporaci n a la ta(onoma de los m"todos de biologa molecular, especialmente la secuenciaci n de 0/: ribos mico y la gen mica, est1obligando a nuevos planteamientos. Para resumir, hoy se asume lo siguiente@ E(isten dos tipos de organi'aci n celular, la procari tica y la eucari tica. )entro de los seres vivos con organi'aci n procari tica, e(isten dos grandes -dominios. o -imperios.@ Bacteria 2las eubacterias o bacterias -cl1sicas.3 y &rchaea 2antes llamadas arqueobacterias3 0 su ve', el dominio eucari tico comprende numerosas lneas filogen"ticas, muchas de ellas de microorganismos. Los mismos Proto'oos es un grupo muy heterog"neo, que comprende lneas filogen"ticas diversas y a veces muy separadas en el tiempo evolutivo. El alumno ampliar1 todo esto cuando comience su estudio de la ta(onoma microbiana.

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NDICE 1 2 3 CARACTERES DISTINTIVOS DE LOS PROCARIOTAS COMPOSICIN #UMICA BSICA DE LA CLULA PROCARITICA ESTRUCTURA GENERAL DE UNA CLULA PROCARITICA

1 CARACTERES DISTINTIVOS DE LOS PROCARIOTAS

%amos a e(poner los rasgos distintivos de los procariotas en forma de tabla comparativa con los eucariotas, de modo que se aprecien mejor los rasgos distintivos de cada tipo de organi'aci n celular@ Procariotas Eucariotas Genforo On solo cromosoma N)*+,-.+/01/ %arios cromosomas 0): c.d., c.c.c. 2cadena doble, 0): c.d. lineal, terminado circular cerrado en tel meros covalentemente3 :o e(iste membrana nuclear E(iste membrana nuclear :o histonas Kistonas Replicacin del material gentico@ no Replicacin del material gentico@ mitosis mitosis rgani!acin del citoplasma rgani!acin del citoplasma :o org1nulos de tipo 5rg1nulos 2mitocondrias, eucari ticos cloroplastos, retculo endopl1smico, ;olgi, lisosomas, etc3 :o citosqueleto 2no corrientes #itosqueleto y corrientes citopl1smicas3 citopl1smicas /ibosomas >,9 /ibosomas L,9 0parte de estos que acabamos de citar, e(isten otros rasgos que, aunque no universales, caracteri'an a numerosos procariotas@ 9us membrana plasm1ticas carecen de esteroles, salvo los micoplasmas 2pero en este caso los esteroles proceden del hospedador eucari tico al que parasitan3, algunas especies de cianobacterias y de bacterias melitotrofas. La movilidad no es universal, pero muchas bacterias se mueven en medios acu1ticos debido a unas estructuras llamadas flagelos, que nada tienen que ver con los flagelos eucari ticos. Las eubacterias 2dominio Bacteria3 poseen, salvo los micoplasmas, una pared celular a base de una peptidoglucano 2una macromol"cula que no e(iste en eucariotas3. Muchas arqueas 2dominio &rchaea3 poseen pared celular, diferente a las del dominio Bacteria.

2 COMPOSICIN #UMICA BSICA DE LA CLULA PROCARITICA

El contenido en agua de una c"lula vegetativa bacteriana tpica es de un >,W, mucho menor que el de los eucariotas 2que ronda el =,W3. Ona c"lula de )scherichia coli, creciendo de forma equilibrada en un medio a base de glucosa y sales minerales, a D>*#, tiene la composici n@

tipo de componente protena 0/: 0): Lpidos Lipopolisac1rido Peptidoglucano ;luc geno total macromol"culas@ Pequeas mol"culas org1nicas@ &ones inorg1nicos@

Porcenta"e so#re peso seco ++., J,.+ D.* =.* D.F J.+ J.+ =?.* J.= *.,

5bs"rvese que@ las macromol"culas constituyen la porci n mayoritaria de la masa celular 2=?W3< las protenas representan m1s de la mitad de esta cantidad< las bacterias poseen una proporci n de 0/: superior a la de los eucariotas< la mayor parte de los compuestos son semejantes a los de eucariotas, pero dentro de las macromol"culas encontramos dos que son e$clusivas de los procariotas 2concretamente, de eubacterias, aunque no de todas3@ lipopolisac1rido 2e(clusivo de ;ramGnegativas3< peptidoglucano 2presente en eubacterias ;ramGpositivas y ;ramGnegativas3.

3 ESTRUCTURA GENERAL DE UNA CLULA PROCARITICA

%eamos de qu" partes principales se compone una c"lula procari tica /consultar la ,igura2. Karemos una enumeraci n desde el e(terior al interior celular. Los nombres en ro"o indican los componentes obligatorios de cualquier bacteria, mientras que los dem1s son -dispensables. en el sentido de que no son universales, sino que est1n presentes en grupos m1s o menos amplios de procariotas@ c%psula o capa mucilaginosa capa & paracristalina vaina #otones de ancla"e pared celular protoplasto, que a su ve' se compone de mem#rana citopl%smica 2que puede tener o no invaginaciones3 citoplasma, que incluye@ genforo, constituido por un cromosoma en algunas especies, uno o varios pl%smidos 2elementos gen"ticos

e(tracromos micos3 ri#osomas inclusiones org%nulos Pueden e(istir, adem1s, apndices filamentosos@ 'lagelos 'im#rias 2X pelos3

I90B.* N-;.0:-D0;0N ;. :0 .7+615+160 ;. 1*0 5H:1:0 86,506-,+0" 5,* 0:B1*,7 ;. 717 5,98,*.*+.7 9K7 50605+.6F7+-5,7.

En los pr (imos temas abordaremos el estudio de estos componentes de la c"lula procari tica, centr1ndonos en su composici n qumica, estructura y sus funciones o papeles.

1 1.1 2 3 4

TAMARO DE LOS PROCARIOTAS C,*7.51.*5-07 ;.: 8.@1.P, +090P, ;. :07 G05+.6-07 FORMA AGRUPACIONES BACTERIANAS FENMENOS DE MULTICELULARIDAD EN BACTERIAS

1 TAMA2O DE LOS PROCARIOTAS

El tamao es un par1metro que est1 determinado gen"ticamente, pero los valores concretos para cada ra'a o cepa de bacterias vienen influidos por una serie de condiciones ambientales 2nutrientes, sales, temperatura, tensi n superficial, etc3.

Las bacterias suelen presentar un pequeo tamao, por lo general menor que el de una c"lula eucari tica tpica. 25bs"rverse en el esquema la comparaci n entre el tamao de una bacteria tpica como )scherichia coli 2,.+ ( J m3 y el de una c"lula eucariota3. 9in embargo, e(iste un amplio rango de tamaos, seg!n las especies@ Ona bacteria grande es Beggiatoa gigantea, con un tamao similar al de muchas c"lulas eucari ticas 2F, m3. 9in embargo, los aut"ntico -gigantes. entre las bacterias se han descubierto hace poco@ En *==D se desubri una bacteria que mide ,,+ mm de longitud. 9e trata de )pulopiscium, un comensal del intestino del pe' cirujano. En *=== se descubri en un lago de :amibia una bacteria 2a la que se bauti' como !hiomargarita3 que alcan'a los >,, m. Bacillus megaterium mide *.D ( D m.

Ona bacteria relativamente pequea es 5aemophilus in,luen'ae, que mide ,.J+ ( *.J m. Los organismos celulares cultivables m1s pequeos que e(isten son los micoplasmas, muchos de los cuales no superan los ,.J m de di1metro. Las nanobacterias o ultramicrobacterias miden en torno a ,.,+ m, pero la mayora no se han podido cultivar, y s lo se pueden estudiar al microscopio.

1.1 C-30,*),3*4/0 5,+ .,6),7- 8/1/7- 5, +/0 9/*8,:4/0(

Metodol.gicas6 9e necesita recurrir a microscopios para su visuali'aci n, y emplear t"cnicas especiales adecuadas al pequeo tamao< Para sacar conclusiones sobre muchas caractersticas de las bacterias hay que hacer estudios -promediados., es decir, obtenidos a partir de una gran poblaci n de c"lulas, y no sobre un solo individuo. 2El estudio de c"lulas bacterianas aisladas es posible, pero es complicado y no se emplea en la mayor parte de la investigaci n habitual sobre procariotas3. #ropiedades ,7sicas@ se derivan del comportamiento como partculas coloidales@ movimiento broBniano 2movimiento aleatorio derivado del empuje de mol"culas de agua alrededor de la bacteria3< capacidad de dispersar la lu' 2el llamado efecto 4yndall3. Por esta ra' n, las suspensiones acuosas relativamente densas de bacterias tienen una apariencia -turbia. 2trasl!cida3< aumentan la viscosidad del medio donde van suspendidas. Por tener carga el"ctrica@ migran en un campo el"ctrico y aglutinan y precipitan a altas concentraciones de sales. #ropiedades biol.gicas6

La relaci n superficie]volumen 29]%3 es muy alta. En efecto, supongamos una c"lula esf"rica< en dicha c"lula, la relaci n 9]% es D]r, 2la superficie de una esfera es F^rJ mientras que su volumen es F]D^rD3. 5 sea, cuanto menor sea el radio 2r3 mayor ser1 esta relaci n. Esto significa que el pequeo tamao de las bacterias condiciona un ma(or contacto directo con el medio am#iente inmediato que las rodea, lo que se traduce en que reciben las influencias ambientales de forma inmediata. El pequeo tamao condiciona una alta tasa de crecimiento. La velocidad de entrada de nutrientes y la de salida de productos de desecho es inversamente proporcional al tamao de la c"lula, y a su ve', estas tasas de transporte afectan directamente a la tasa metab lica. Por lo tanto, en general, las bacterias crecen 2se multiplican3 de forma r1pida.

2 FORMA

Los principales tipos de formas bacterianas son@ cocos 2c"lulas m1s o menos esf"ricas3< bacilos 2en forma de bast n, alargados3, que a su ve' pueden tener varios aspectos@ cilndricos fusiformes en forma de ma'a, etc. 0tendiendo a los tipos de e(tremos, "stos pueden ser@ redondeados 2lo m1s frecuente3 cuadrados

biselados afilados espirilos@ al igual que los bacilos, tienen un eje m1s largo que otro, pero dicho eje no es recto, sino que sigue una forma de espiral, con una o m1s de una vuelta de h"lice. vibrios@ proyectada su imagen sobre el plano tienen forma de coma, pero en el espacio suelen corresponder a una forma espiral con menos de una vuelta de h"lice. 5tros tipos de formas filamentos, ramificados o no anillos casi cerrados formas con prolongaciones 2con prostecas3 Estos distintos tipos de morfologas celulares deben de haberse originado por mecanismos evolutivos, a saber, por selecci n y estabili'aci n adaptativa frente a las distintas presiones ambientales presentes en diferentes nichos ecol gicos. Relaciones entre tamao y forma )ifusin citopl%smica* Este aspecto lo ilustraremos con una bacteria tpica de forma bacilar. Ona protena de unos +, C)a difundira desde la periferia del citoplasma al eje longitudinal en menos de medio segundo, mientras que si difundiera desde un polo de la c"lula al opuesto, tardara unos + segundos. #omo vemos, el tiempo de difusi n es muy breve. )ifusin desde el medio e$terior* el entorno inmediato de las bacterias es bastante peculiar, debido al bajo valor de n!mero de /eynolds que poseen. El n!mero de /eynolds 2/3 es un par1metro muy empleado en &ngeniera y 0rquitectura para e(presar la tensi n o estr"s que soporta una estructura determinada inmersa en el medio local que la sustenta. / equivale a la relaci n entre la fuer'a de inercia y fuer'a de fricci n 4eniendo en cuenta la masa y velocidad de movimiento de una bacteria como ). coli@ m X *, G*J g v X D, m]s tenemos que el valor / para esta bacteria es de *,G+. )e aqu se deduce que la inercia es irrelevante, mientras que predominan las fuer'as viscosas. Por lo tanto, las bacterias llevan, en su avance, un entorno local debido a la resistencia por viscosidad. Este entorno es una fase fluida cuya forma reproduce, ampliada, la forma de la bacteria en cuesti n. +e"ora en las propiedades ,idrodin%micas o de flotacin* Es posible que la forma tambi"n tenga relaci n con propiedades hidrodin1micas. Por ejemplo, las

bacterias m viles raramente son esf"ricas< la forma ptima sera aqu la bacilar. )e hecho, e(isten pocos casos de cocos flagelados. #omo veremos oportunamente, e(iste un grupo de bacterias alargadas pero con morfologa espiral y que est1n muy bien adapatadas a avan'ar en medios muy viscosos. Esta morfologa de las espiroquetas ha debido ser seleccionada evolutivamente precisamente por este factor ecol gico. Por otro lado, las formas con prostecas, prolongaciones, las morfologas en disco o en l1mina parecen estar especiali'adas en facilitar la flotaci n. Las bacterias adoptan formas en las que optimi'an la relaci n 9]%, y por consiguiente su entorno local. %eamos algunos ejemplos de valores 9]%@ los menores valores los poseen las bacterias esf"ricas 2cocos3, en las que 9]% X +.L. La forma esf"rica permite una mayor resistencia frente a la desecaci n< los bacilos alcan'an valores de 9]% de alrededor de *,< las formas espirales y las bacterias con prolongaciones vivas 2prostecas3 tienen valores mayores que los de los bacilos< la mejor relaci n 9]% conocida 2de *?3 la posee la curiosa bacteria cuadrada de Palsby.

3 AGRUPACIONES BACTERIANAS
Las bacterias normalmente se multiplican por fisi n transversal binaria. En muchas especies, las c"lulas hijas resultantes de un evento de divisi n por fisi n tienden a dispersarse por separado al medio, debido a la actuaci n de fuer'as fsicas 2movimiento broBniano, ci'allamiento, corrientes de convecci n, etc3. Esto hace que al observar al microscopio una poblaci n de estas bacterias veamos mayoritariamente c"lulas aisladas. Pero en algunas especies las c"lulas hijas pueden permanecer unidas entre s 2al menos durante un cierto tiempo tras la divisi n de la que proceden3 debido a que el tabique sea incompleto o a la e(istencia de capas mucosas que retienen juntos los productos de la divisi n. 9i la tendencia a permanecer unidas es baja, tendremos agrupaciones de dos c"lulas, que dependiendo que sean de morfologa esf"rica o alargada, se denominan como@ diplococos diplo#acilos 9i la tendencia a permanecer unidas es mayor 2por m1s tiempo3, nos encontramos con varias posibilidades, dependiendo del n!mero de planos de divisi n y de la relaci n entre ellos@ 9i los tabiques son paralelos entre s 2o sea, e(iste un solo plano de divisi n3@ estreptococos 2cadenetas arrosariadas de cocos3 y estrepto#acilos 2cadenetas de bacilos3. 9i e(iste m1s de un plano de divisi n, en el caso de cocos podemos encontrar tres

posibilidades@ dos planos perpendiculares@ ttradas 2F c"ls. en un plano3 o m!ltiplos< tres planos ortogonales@ sarcinas 2paquetes c!bicos3< muchos planos de divisi n@ estafilococos 2racimos irregulares3. En el caso de bacilos, se pueden dar variantes adicionales, debido a la posibilidad de que se produ'can movimientos postfisionales 2en algunos casos con desgarro3@ bacilos en empali!ada o en pa-uetes de cigarrillos 2debido a giros de *L,o3 dos bacilos en 1ngulo 2en forma de letra . o /3 varios bacilos formando -letras c,inas0.

4 FENMENOS DE MULTICELULARIDAD EN BACTERIAS

#iertos grupos de bacterias e(hiben una pluricelularidad incipiente, de modo que se dan conjuntos de c"lulas asociadas permanentemente. En muchos casos, dentro de estos grupos celulares e(isten formas celulares diferenciadas y especiali'adas. Por supuesto, en ninguna instancia se puede hablar de diferenciaci n de tejidos 2algo e(clusivo de eucariotas3. +i$o#acterias. #omo estudiaremos oportunamente, se trata de bacterias con dos fases dentro de su ciclo de vida@ una fase a base de en"am#res donde todas las c"lulas se mueven coordinadamente, y otra fase a base de cuerpos fructificantes en los que se aloja un tipo especiali'ado de c"lula llamado mi$ospora. 'ilamentos 12 tricomas3 de ciertos grupos de 4iano#acterias. En ellos las c"lulas vegetativas individuales est1n unidas entre s por puentes citoplasm1ticos 2permitiendo, por tanto, comunicaci n intercelular3. #iertas cianobacterias filamentosas poseen, adem1s, c"lulas especiali'adas 2,etero-uistes5 a-uinetos3. Los filamentos no son e(clusivos de cianobacterias, ya que tambi"n se dan en ciertas bacterias ;ramGnegativas no fotosint"ticas. 4uerpos circulares del gnero Thermus@ unas *F c"lulas se encuentran englobadas por una pared e(terna com!n. 'ilamentos cenoc6ticos ramificados de los Actinomicetos@ constituyen las denominadas -hifas. 2por analoga con las de los hongos3, que a su ve' originan -micelios..

C1.68,7 <615+-<-50*+.7 ;. A? Myxococcus fulvusL =B? Stigmatella aurantiacaL C =C? Chondromyces crocatus. S. aurantiaca 9-;. 1*07 15& 9-5607. =D. M. D2,64-*" Microbiol Rev" &(!&>1&2" 1%% ?

M-56,B60<F07 .:.5+6A*-507 ;. G066-;, ;. 51.68,7 <615+-<-50*+.7 ;. Myxococcus xanthus. A :0 ;.6.530 7. 81.;. /.6 ;.+0::. ;. 1* 51.68, 0G-.6+," 9,7+60*;, :0 ;-78,7-5-A* ;. :07 9-J,78,607.

NDICE( 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.4.1 1.4.2 2 3 4 CPSULA CONCEPTOS GENERALES MTODOS DE OBSERVACION Y ESTUDIO COMPOSICIN #UMICA Y ESTRUCTURA FUNCIONES PROPIEDADES O PAPELES GENERALES PROPIEDADES PARTICULARES

CAPA ISM =CAPA SUPERFICIAL PARACRISTALINA? VAINAS BOTONES DE ANCLA'E

BIBILIOGRAFA

1
1.1

CPSULA
CONCEPTOS GENERALES

La c1psula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas bacterias en sus ambientes naturales, consistente en acumulaci n de material mucoso o viscoso, situado e(ternamente respecto de la pared celular 2o, en su caso, respecto de la capa 9 y de la vaina3. Las c1psulas se pueden describir en funci n de@ su grado de asociaci n con la superficie celular subyacente 2sobre todo pared3@, 7ntegral@ ntimamente asociada con la superficie celular, a saber, con la P.#. Perifrica@ asociada a la sup. celular s lo en determinadas condiciones, pero finalmente se dispersa al medio e(terior. su consistencia y sus lmites e(ternos@ R6gida@ con suficiente consistencia estructural como para evitar la entrada de partculas como las de tinta china o nigrosina. 9uele tener un lmite e(terior definido. 'le$i#le@ poca consistencia, de modo que no e(cluye partculas. 0dem1s, es deformable y carente de lmites precisos. Kay una cierta confusi n en la nomenclatura de las c1psulas. :osotros usaremos los siguientes conceptos@ 4%psulas en sentido estricto son aquellas de tipo r6gido e integral. 4apas mucilaginosas son las de tipo fle$i#le ( perifrico. Glucoc%li$ es el conjunto de estructuras superficiales bacterianas, e(teriores respecto de la pared celular, y compuestas de polisac1rido. Las c1psulas son estructuras inertes, -no vivas., carentes de papel activo 2metab lico3, pero que confieren a las bacterias importantes propiedades@ 0dhesi n a c"lulas hermanas, generando microcolonias y consorcios. 0dhesi n a sustratos inertes o vivos, lo que les permite _la coloni'aci n de sus nichos ecol gicos 2p. ej., tejidos de organismos superiores3 Protecci n contra agentes antibacterianos.

1.2

MTODOS DE OBSERVACION Y ESTUDIO

9u observaci n a microscopa ptica en fresco es difcil, ya que su ndice de refracci n es similar al del medio. 0l ser una estructura muy hidratada 2==W de agua3, su

observaci n con las t"cnicas habituales de microscopa electr nica de transmisi n 2ME43 y de barrido 2ME63 revela una notable contracci n de su estructura. 0dem1s, los colorantes habituales tienen poca afinidad hacia ella.

I90B.* 0 9-56,75,8F0 A8+-50 ;. :0 5K871:0 ;.: *.19,5,5, =Streptococcus pneumoniae?

A microscop6a ptica@ 9e recurre a tinci n negativa por medio de nigrosina o tinta china 2resaltan como un halo transparente sobre el fondo oscuro del porta3. A microscop6a electrnica@ Kay que recurrir a la estabili'aci n previa de la estructura capsular 2para evitar su contracci n ulterior3 por medio de anticuerpos anticapsulares o de lectinas. 4ras esta operaci n, se procede a la tinci n por una ferritina cati nica 2p. ej., el rojo de rutenio3, con afinidad hacia polianiones. Para investigar m1s sobre la estructura de la c1psula se recurre igualmente a difraccin de ra(os 8 del polisac1rido capsular. Aislamiento del material capsular@ El material de las capas mucosas 2es decir, de las c1psulas fle(ibles y perif"ricas3 es muy f1cil de aislar, ya que tiende a dispersarse continuamente en el medio de cultivo. Por lo tanto, se puede aislar directamente de los sobrenadantes resultantes de la centrifugaci n del cultivo correspondiente. El material de las c1spulas rgidas e integrales puede aislarse tratando al cultivo con agua caliente o con 1cidos o 1lcalis d"biles.

1.3

COMPOSICIN #UMICA Y ESTRUCTURA

En general, el material capsular se compone de macromol"culas asim"tricas que, en muchos casos constan de una serie de unidades repetitivas@ polisac1ridos o polip"ptidos. 93 c%psulas polisacar6dicas a3 Keteropolisac1ridos ani nicos, cuyas unidades repetitivas constan de a'!cares 2osas3, aminoa'!cares, 1cidos ur nicos, polioles 2en muchos casos con radicales fosfato, formiato, succinato, etc.3. b3 Komopolisac1ridos neutros, como i3 levanos 2polmeros de unidades de fructosa unidas por 2J ?3

ii3

de(tranos

iii3 celulosa c3 alginatos 2p. ej., en &'otobacter$ #seudomonas3, consistentes en una alternancia de distintos tipos de 1cidos ur nicos. J3 c%psulas polipept6dicas 2s lo encontradas en el g"nero Bacillus3. Est1n formadas por glutamilGpolip"ptidos. 0s p. ej., en B. anthracis el p"ptido es s lo de )Gglut1mico. Las c1psulas y capas mucilaginosas bacterianas constituyen el llamado ant6geno : 1capsular3. Ona misma especie puede constar de distintas ra'as, cada una de ellas con un 0g 7 distintivo, distinguible del de las dem1s por su composici n qumica y su inmunorreactividad. Por ejemplo, en )scherichia coli se encuentran unos >, tipos diferentes de especificidades de 0g 7. Las c1psulas polisacardicas est1n unidas a la superficie subyacente, sobre todo a la pared celular. /a estructura es a base de una matri' muy hidratada, con una ordenaci n regular radial, o a veces, en l1minas conc"ntricas.

1.4

FUNCIONES

En laboratorio, muchas bacterias suelen perder la capacidad de formar c1psulas al cabo de varios subcultivos. 0s pues, la posesi n o no de c1psula es algo que no afecta a la viabilidad de las bacterias. Pero en medios naturales, las c1psulas confieren a las bacterias una serie de propiedades, que dependen del nicho ecol gico particular donde viva cada bacteria. Estudiaremos una serie de propiedades o papeles generales, comunes a todas las c1psulas, para concluir con algunos ejemplos de papeles especficos.

1.4.1

PROPIEDADES O PAPELES GENERALES

*3 Mejora en las propiedades de difusi n de nutrientes hacia la c"lula. Los polisac1ridos e(tracelulares ani nicos funcionan como una resina de intercambio. J3 Protecci n contra la desecacin D3 Protecci n contra la predacin por parte de proto'oos. F3 Protecci n contra agentes anti#acterianos@ a3 contra metales pesados b3 contra bacteri fagos

c3 contra c"lulas fagocticas 2p. ej., la c1psula del neumococo3 d3 contra detergentes e3 contra anticuerpos +3 Ad,esin a sustratos@ a3 sobre sustratos inertes@ propiedad importante, sobre todo en medios acu1ticos. La mayora de las bacterias acu1ticas no son planct nicas, sino que viven en interfases 2superficies, sedimentos3, donde los nutrientes difunden mejor. %eamos c mo se produce el proceso@ i3 ii3 la bacteria se adhiere por la c1psula al sustrato< la c1psula supone un aumento de superficie bacteriana, lo que se traduce en una mejora en la capacidad de absorber nutrientes<

iii3 la bacteria se multiplica, form1ndose una microcolonia donde los individuos est1n m1s protegidos frente a los agentes antibacterianos< iv3 se forman consorcios con otros microorganismos. Ello permite una -alian'a. o colaboraci n metab lica entre distintas especies, por la que se produce la degradaci n concertada de sustratos insolubles. Esta propiedad tiene una serie de importantes secuelas econ micas@ corrosi n y obstrucci n de caeras< formaci n de placa dental y caries< formaci n de biopelculas en cat"teres y pr tesis quir!rgicas

b3 sobre sustratos vivos 2tejidos de organismos superiores3@ i3 En sistemas -normales. 2efectos ben"ficos3@ La flora 2X microbiota3 aut ctona que coloni'a los epitelios de los animales superiores est1 englobada en glucoc1li(, estando las bacterias adheridas a la superficie tisular. Es decir, las c1psulas pueden actuar como ad,esinas 2mol"culas para la adhesi n3. 5tro ejemplo de ello lo da la microflora aut ctona de la simbiosis del rumen En sistemas patol gicos@ La c1psula es uno de los factores de virulencia, de los que depende el inicio de muchas infecciones por parte de bacterias pat genas. 9i, adem1s, la flora aut ctona del individuo afectado est1 alterada o disminuida, esto supone un nicho ecol gico vaco o perturbado, que puede ser coloni'ado por bacterias pat genas, en parte gracias a su glucoc1li(, que adem1s

ii3

las protege frente a surfactantes, c"lulas fagocticas, anticuerpos, etc. Muchas c1psulas polisacardicas no son reconocidas como material e(trao por el sistema inmune, debido a que su estructura -mimeti'a. estructuras del propio hospedador. 5tras c1psulas sobrapasan la capacidad de respuesta del sistema inmune, o bien no activan eficientemente al sistema complemento.

I90B.* 0*-90;0 @1. 91.7+60 .: 9,;, .* @1. :0

5K871:0 G05+.6-0*0 ./0;. :0 055-A* ;.: 5,98:.9.*+, ;.: 3,78.;0;,6 909F<.6,( E: 5,98,*.*+. C3G ;.: 5,98:.9.*+, +-.*;. 0 <-E067. 7,G6. :0 718.6<-5-. G05+.6-0*0" 8.6, .7+, .7 9K7 ;-<F5-: 7- :0 G05+.6-0 8,7.. 5K871:0. P,6 ,+6, :0;," :0 5H:1:0 <0B,5F+-50" 86,/-7+0 ;.: 6.5.8+,6 8060 C3G *, 81.;. -*+.605-,*06 G-.* 5,* :0 G05+.6-0" ;. 9,;, @1. 7. ./-+0 :0 <0B,5-+,7-7.

1.4.2

PROPIEDADES PARTICULARES

Entre las propiedades conferidas por las c1psulas a algunas bacterias tenemos@ *3 #omo receptores para ciertos bacteri fagos. J3 En las bacterias tropicales fijadoras de :J atmosf"rico, de los g"neros Derxia y Bei8erinc"ia la gruesa y espesa c1psula act!a como barrera frente a la difusi n de 5J, con lo cual evitan la inactivaci n de la en'ima nitrogenasa. D3 En (hi'obium 2fijador de :J en simbiosis con las races de leguminosas3 el polisac1rido e(tracelular act!a en la fase de reconocimiento entre la bacteria y la planta especfica, a trav"s de lectinas de esta !ltima. F3 En &cetobacter xylinum la c1psula es a base de fibrillas de celulosa que retienen burbujas de aire, lo cual hace que la bacteria flote hasta su nivel adecuado.

2 CAPA ;S< =CAPA SUPERFICIAL PARACRISTALINA>

#apa que, en muchas eubacterias 2sobre todo ;ramGpositivas3, envuelve a la pared celular, formada por el ensamblaje regular de subunidades id"nticas de protenas o glucoprotenas. En ;ram negativas la capa 9 se une a la membrana e(terna, mientras que el

;ram positivas lo hace al peptidoglucano. En muchas 0rqueas es la !nica capa que rodea al protoplasto, por lo que en ellas cumple funciones de aut"ntica pared celular. )isposicin simetra binaria@ filas oblicuas paralelas simetra cuadrangular@ simetra he(agonal@ unidades morfolgicas ;F9.6,7 tetr1meros he(1meros

La uni n entre los mon meros se reali'a por enlaces no covalentes@ hidr fobos i nicos, bien directos, o por mediaci n de cationes puentes de hidr geno Papel@ En eubacterias provistas de pared celular. la capa 9 cumple varios papeles como tami! molecular protector que impide la entrada de agentes antibacterianos Parece que en muchos casos tambi"n protege frente a fluctuaciones i nicas y de pK, estr"s osm tico, etc. En algunas bacterias pat genas, puede ser un factor de virulencia, al proteger a la bacteria frente al ataque del complemento y de los fagocitos. En 0rqueas da forma ( rigide! a muchas especies, ejerciendo papeles equivalentes al de una pared celular. En arqueas hal filas 2p. ej., 5alobacterium3 la capa 9 de glucoprotena contiene glucop"ptidos especiales, y est1 estabili'ada por altas concentraciones de sodio, presentes en su nicho. En arqueas termoacid filas 2Sul,olobus3 e(isten glucoprotenas en matrices he(agonales, ricas en amino1cidos polares 29er, 4hr3, estando la capa 9 estabili'ada por los bajos pK del medio.

VAINAS

9on estructuras tubulares 2ramificadas o no3 compuestas de un heteropolmero, a base de protena, lpido y polisac1rido, que engloban a conjuntos de c"lulas bacilares en cadenetas o filas. La vaina est1 en contacto con la pared celular subyacente, pero no hay enlaces entre ambas. En Sphaerotilus y -eptothrix las vainas se recubren de ac!mulos de (idos e hidr (idos de He y Mn. #onforme se dividen por fisi n binaria, las c"lulas de los e(tremos del filamento van sinteti'ando nuevo material de la vaina que las va rodeando. Las 0rqueas Methanothrix y Methanospirillum poseen vainas proteicas con subunidades dispuestas en anillos, y son las que confieren la forma.

BOTONES DE ANCLA'E

9on ac!mulos de mucopolisac1ridos 1cidos, segregados en puntos concretos de la c"lula, a nivel de pared celular, e(tremos de prostecas y ped!nculos o de tallos inertes en alg!n momento del ciclo de vida de ciertas bacterias. Hacilitan la uni n de las bacterias que los poseen a sus sustratos. #omo ejemplo, los discos adhesivos 2-holdfast.3 en el e(tremo de las prostecas de %aulobacter .

BIBILIOGRAFA
6E%E/&);E, N.4. 2*=LL3@ 4he bacterial surface@ general considerations toBards design and function. #an. N. Microbiol. 34@ D?DGD>J. 6E%E/&);E, N.4., L.L. ;/0K0M 2*==*3@ 9urface layers of bacteria. Microbiol. /ev. ;;@ ?LFG>,+. 65OL:5&9, ;.N., 7. N0:: 2*=L=3@ 6acterial polysaccharide capsule synthesis, e(port and evolution of structural diversity. Molec. Microbiol. 3@ *L*=G*LJD. #594E/45:, N.P., ;.;. ;EE9EI, 7.GN. #KE:; 2*=>L3@ El mecanismo de adherencia en las bacterias. &nv. y #iencia 2mar'o3@ ??G>>. ;544E9M0:, 9., %. 945O4 2*==*3@ /egulation of capsular polysaccharide synthesis in )scherichia coli 7*J. Molec. Microbiol. ;@ *+==G*?,?. 75%0L, 9.H. 2*=LL3@ Paracrystalline protein surface arrays on bacteria. #an. N. Microbiol. 34@ F,>GF*F. LE#KE:E/, N., H. P&EL0:) 2*=L=3@ 9tructure and biosynthesis of proCaryotic glycoproteins. 0nnu. /ev. 6iochem. ;<@ *>DG*=F.

1 2 2.1

INTRODUCCIN PAREDES DE LAS EUBACTERIAS EL PEPTIDOGLUCANO( COMPOSICIN #UMICA Y ESTRUCTURA

2.1.1 COMPOSICIN #UMICA Y ESTRUCTURA BSICAS DEL PEPTIDOGLUCANO

2.1.2 2.1.3

EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM>NEGATIVAS EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM>POSITIVAS

2.2 RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIN EN EL PEPTIDOGLUCANO 2.3 OTROS COMPONENTES DE LA PARED CELULAR DE BACTERIAS GRAM>POSITIVAS( LA MATRIQ 2.4 PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS CIDO ALCOHOL RESISTENTES 2.5 2.5.1 2.5.1.1 ESTERNA 2.5.1.1.1 2.5.1.1.2 2.5.1.1.3 2.5.1.1.4 2.5.1.2 2.5.2 3 LA PARED DE BACTERIAS GRAM>NEGATIVAS LA MEMBRANA ESTERNA DE BACTERIAS GRAM>NEGATIVAS COMPOSICIN #UMICA Y ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA F-0?-+@.45-0 =FL> L4.-.-+40/*A:45- =LPS> L/ +4.-.:-8,@3/ =LPP" +4.-.:-8,@3/ 5, B:/)3> P:-8,@3/0 5, +/ 1,19:/3/ ,B8,:3/ PAPELES Y FUNCIONES DE LA MEMBRANA ESTERNA EL ESPACIO PERIPLSMICO

PAREDES DE LAS AR#UEAS

BIBLIOGRAFA

1 INTRODUCCIN
La mayor parte de los procariotas posee una pared celular 2P.#.3 rgida rodeando al protoplasto. Las e(cepciones son los micoplasmas 2dentro del dominio Bacteria3 y algunas arqueas, como !hermoplasma. 0l microscopio electr nico se puede observar como una capa en ntimo contacto con la membrana citopl1smica, con un espesor que oscila entre *, y L, nm 2seg!n especies3

Gfrente a los L nm de la membrana celularG , y con una estructura m1s o menos compleja, seg!n los tipos bacterianos. a3 Las paredes celulares m1s frecuentes en eubacterias siguen dos modelos alternativos que, como veremos comparten un componente com!n@ paredes de tipo ;ramGpositivo o de tipo ;ramGnegativo. b3 Onas pocas eubacterias 2como las del g"n. #lanctomyces3 poseen paredes a base de protenas. c3 Las 0rqueas poseen paredes diferentes a las de eubacterias y se pueden agrupar en diversos tipos. El grueso de este captulo est1 dedicado al estudio de las paredes ;ramGpositivas y ;ramG negativas, con sus principales variantes, pero finali'aremos con una alusi n a los principales modelos de paredes arqueanas. 0unque el alumno reali'ar1 en pr1cticas de labororatorio la tinci n de ;ram, vamos a e(plicarla aqu brevemente. La tinci n de ;ram es la m1s importante entre las tinciones llamadas diferenciales 2aquellas que no tien de la misma manera a todos los tipos de bacterias3. /esumiendo, esta tinci n consta de varios pasos@ *. &maginemos un frotis en porta de vidrio con una muestra de varios tipos de bacterias, que se han fijado por calor. En la primera fase, esta preparaci n de trata con un primer colorante llamado violeta cristal o violeta de genciana. J. 0 continuaci n se aade una soluci n de lugol 2yodoGioduro3, que act!a como -mordiente., formando una laca relativamente resistente con el violeta. En este momento todas las bacterias est1n teidas de color violeta.

D. 0hora reali'amos una descoloraci n diferencial con etanol o una me'cla de etanol y acetona. Lo que ocurre es que algunas bacterias 2las que llamaremos ;ramG negativas3 pierden el color violeta 2quedaran pr1ctimante transparentes al microscopio3, mientras que otras 2las ;ramGpositivas3 resisten el tratamiento, y retienen el colorante violeta. F. Hinalmente, tratamos el porta con un segundo colorante 2colorante de contraste3@ se trata de un colorante de color rojo o rosa, como la fucsina o la safranina. Este colorante tie ahora a las bacterias previamente descoloradas por el etanol. Por lo tanto, el resultado en la observaci n al microscopio es que las bacterias ;ramGpositivas se ven de color violeta, y las ;ramGnegativas de color rosa o rojo. #omo veremos enseguida, esta diferencia de comportamiento ante la tinci n de ;ram refleja el hecho de que ambos tipos de eubacterias poseen dos tipos estructuralmente diferentes de pared celular, aunque ambas posean en com!n la posesi n de peptidoglucano. 0 continuaci n estudiaremos con cierto detalle la pared celular de eubacterias.

PAREDES DE LAS EUBACTERIAS

#onsisten en un esqueleto macromolecular rgido, llamado peptidoglucano 12 mucopptido o mure6na3, que en ;ramGpositivas se encuentra inmerso en una matri! aninica de pol6meros a!ucarados< y en ;ramGnegativas est1 rodeada por una mem#rana e$terna5 e inmersa en un espacio peripl%smico. #omen'aremos abordando esa macrol"cula tan peculiar llamada peptidoglucano, para despu"s estudiar globalmente y por separado la pared de ;ramGpositivas y ;ramGnegativas, con algunas variantes que se pueden presentar.

2.1 EL PEPTIDOGLUCANO( COMPOSICIN #UMICA Y ESTRUCTURA

En las bacterias ;ramGpositivas el peptidoglucano representa el componente mayoritario de la pared celular 2+,GL,W en peso3, mientras que en ;ramGnegativas supone s lo del * al *,W.

2.1.1 COMPOSICIN #UMICA Y ESTRUCTURA BSICAS DEL PEPTIDOGLUCANO

Est1 formado por repeticiones de una unidad disacardica fundamental unida a su ve' a un tetrap"ptido. )istintas cadenas 2formadas por el esqueleto de a'!cares3 se unen entre s por determinados enlaces peptdicos entre tetrap"tidos de cadenas diferentes. %eamos todo ello en su concreci n qumica@ /a unidad disacar6dica repetitiva* consiste en NGacetilglucosamina 2:0;3 unida por enlace `2*F3 a NGacetilmur1mico 2:0M3. 5bs"rvese que el :0M es el DG5G)GlactilG"ter de la :0; 2o sea, se deriva de unir el 1cido )Gl1ctico con el 5K del #GD de la :0;3. Las distintas unidades disacardicas se van uniendo entre s por enlaces `2*F3 entre el :0M de una unidad y la :0; de la siguiente. Este enlace es susceptible a la rotura catali'ada por el en'ima liso'ima. El n!mero de repeticiones 2n3 puede oscilar entre *, y *,,. /a cadena tetrapept6dica* )esde el grupo carbo(ilo de cada 1cido :0M, y mediante un enlace amido, se encuentra unido el tetrap"ptido. On tetrap"ptido tpico de muchas bacterias es@

LGalaninaGGG)Gglut1micoGGGmesoGdiaminopim"licoGGG)Galanina 5bs"rvese la alternancia de amino1cidos ) y L en el tetrap"ptido.

/a estructura glo#al* Las distintas cadenas polisacardicas, con sus respectivos tetrap"ptidos, se unen entre s por medio de puentes o enlaces peptdicos, entre un amino1cido de una cadena 2p. ej., el amino1cido nED, como el mesoG)0P del ejemplo3 y otro amino1cido de una cadena adyacente 2la )Gala terminal3. )e este modo, la estructura global es una sola macromolcula gigante que envuelve al protoplasto, formando un s%culo rgido, a modo de tejido continuo, que tiene el volumen y la forma de la bacteria respectiva.

En bacterias ;ramGnegativas este s1culo est1 formado por una sola capa 2o unas pocas3 de cadenas de P;. En ;ramGpositivas e(isten varias capas 2hay varios niveles de P;3. 0 continuaci n describiremos por separado el P; de ;ramGpositivas y ;ramG negativas, dando indicaciones de sus principales variantes.

2.1.2

EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAMCNEGATIVAS

En la mayor parte de ;ramGnegativas el peptidoglucano corresponde a la composici n y estructura que acabamos de describir. 9in embargo, en las espiroquetas, el diamino1cido en posici n D, en ve' de ser mesoG)0P, est1 sustituido por la LGornitina 2que tambi"n es un diamino1cido3. El enlace entre cadenas polisacardicas se reali'a normalmente mediante unin pept6dica directa entre el grupo car#o$ilo de la )=ala terminal ( el grupo =amino del meso=)AP. 0hora bien, en este enlace participan solamente el +,W de los tetrap"ptidos. Los dem1s p"ptidos no participan en enlaces, y entre estos !ltimos se encuentran incluso dip"ptidos y trip"ptidos. El resultado es una capa simple de PG 2de * nm de espesor3, a modo de malla floja, y con grandes poros 2los -huecos. dejados por las 'onas donde no hay enlace peptdicos3. Ello e(plica el comportamiento de las bacterias ;ramGnegativas en la tinci n de ;ram@ al aadir el alcohol, se produce una deshidrataci n que tiende a contraer la estructura del P;, pero los poros son grandes y por ellos sale el primer colorante 2el violeta de genciana3. El ulterior tratamiento de la preparaci n con el colorante de contraste 2fuchsina o safranina3 tie a estas bacterias de rojo.

2.1.3

EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAMCPOSITIVAS

Es m1s variado que el de ;ramGnegativas, sobre todo en funci n de ciertas variantes en la composicin del tetrapptido y del tipo de enlaces entre los tetrapptidos. .ariantes en composicin del tetrapptido@ En #acterias 4orineformes* el grupo G#5G en del )Gglu 2J3 puede estar amidado o unido a una glicina 2;ly3< el aa 2*3 puede ser ;ly o LG9er, en lugar de la LGala< el hidro(ilo en ? del :0M puede estar acetilado, lo que hace que el P; de estas bacterias sea resistente a la liso'ima. +uc,as #acterias Gram=positivas carecen de mesoG)0P 2D3, y en su lugar puede e(istir@ LLG)0P LGdiaminobutrico 2)063 LGlisina LGhomoserina LGornitina +odalidades de uniones interpept6dicas* enlace directo entre la )Gala2F3 y el G:KJ libre del diamino1cido en 2D3 enlace )Gala2F3GG8GGdiamino1cido2D3, donde $ representa un puente, que puede consistir en@ un solo amino%cido@ LGala, o )GisoG0sn un pptido corto@ aLGalaGGLGalab aLGalabD aLGalabD GG LGornitina a;lyb+ enlace )Gala2F3 GGG>mismo tetrapptido?GGG diamino1cido 2D3 enlace entre )Gala2F3 y el )Gglu2J3 2y no el aa en D3, por medio de un p"ptido en el que debe de e(istir obligatoriamente un diamino1cido 2p. ej., )Glys, )Gornitina3. )esde el punto de vista estructural, el P; de ;ramGpositivas se caracteri'a por la e(istencia de m!ltiples capas, e(istiendo entrecru'amientos tanto entre cadenas adyacentes en el mismo nivel como entre niveles distintos. El resultado es una red tridimensional gruesa 2hasta +, capas en algunos Bacillus3, y m1s compacta que en ;ramGnegativas. )e todas formas, el grado de compacidad vara entre especies, y depende de@ nE de :0M que contengan tetrap"tidos que participen en entrecru'amientos< longitud del puente peptdico

Ello condiciona a su ve' la intensidad de la gramGpositividad en la tinci n de ;ram.

2.2 RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIN EN EL PEPTIDOGLUCANO

La arquitectura molecular del s1culo de murena est1 a!n sujeta a debate. 9in embargo, uno de los modelos recientes m1s aceptado se podra resumir de la siguiente manera@ Los resultados de difracci n de rayos $ parecen indicar que las unidades disacardicas de las cadenas est1n giradas unas respecto de otras, formando una estructura helicoidal de orden F o +. 0 resultas de ello, los p"ptidos protruyen alternativamente@ hacia arriba, a la i'quierda, hacia abajo, a la derecha, y vuelta a empe'ar, etc. Esta organi'aci n permite que una cadena de P; se pueda unir con cadenas cercanas de su mismo nivel, as como con cadenas por encima y por debajo de su nivel, formando un perfecto entramado tridimensional 2al menos en las ;ramGpositivas3. La orientaci n de las cadenas a'ucaradas en relaci n con la superficie celular a!n est1 debatida. Parece que se disponen casi paralelas a la superficie celular, con una tendencia a una forma espiral por encima de la membrana citopl1smica. 9i consideramos una bacteria de forma bacilar, esta espiral cerrada se dispone siguiendo el permetro circular 2y no siguiendo el eje longitudinal3. Los grupos tetrapeptdicos salen perpendicularmente de los :0M, en sentido vertical hacia la membrana. 9in embargo, cuando dos tetrap"tidos de un nivel se unen entre s, forman un puente casi hori'ontal, formando 1ngulos de unos =,o repecto de los esqueletos carbonados, y siguiendo el eje longitudinal de la c"lula. Esta estructura confiere una serie de importantes propiedades@ *3 Gran rigide!, que contrarresta las fuer'as osm ticas a que est1 sometido el protoplasto 2aguanta presiones de unas + a *+ atm sferas3. Esta rigide' depende de@ a3 el grado de entrecru!amiento< b3 el hecho de que el enlace @19 43 es mu( compacto. La alternancia regular entre anillos piran sicos de :0; y de :0M genera uno de los polisac%ridos m%s esta#les desde el punto de vista termodin1mico, que recuerda en su -estilo. a la quitina y a la celulosa< c3 la alternancia en el tetrap"ptido, de amino%cidos en configuraciones ) ( / supone una factor adicional que confiere a!n m1s fuer'a estructural, y adem1s permite que todas las cadenas laterales de estos amino1cidos se dispongan hacia el mismo lado, facilitando la formaci n de puentes de K.

J3 Pero, al mismo tiempo, la estructura permite una nota#le fle$i#ilidad. Ello colabora, junto con su rigide', a soportar variaciones amplias de la tensi n osm tica del protoplasto. D3 4ondiciona la forma celular. 0unque la qumica del P;, por s misma, no determina la forma, es su disposici n espacial la responsable principal de esta forma.

2.3 OTROS COMPONENTES DE LA PARED CELULAR DE BACTERIAS GRAMCPOSITIVAS( LA MATRID

#omo ya dijimos, el P; de las bacterias ;ramGpositivas se encuentra inmerso en una matri', que puede representar hasta el +,W del peso de la pared celular, y que est1 constituida por largos polmeros denominados %cidos teicoicos, pudiendo e(istir tambi"n 2o en su lugar3 los %cidos teicurnicos y los lipoteicoicos. Estos componentes llegan a sobresalir de la superficie celular y suministran especificidad antig"nica.

cidos teicoicos@ Est1n presentes en muchas bacterias ;ramGpositivas, pero no en todas. 9on polmeros de hasta D, unidades de glicerolGfosfato o ribitolGfosfato, unidas entre s por enlaces fosfodi"ster, en los que la mayora de los grupos G5K est1n sustituidos por GK, a'!cares, aminoa'!cares o )Galanina. Los 1cidos teicoicos est1n unidos covalentemente al peptidoglucano, concretamente al G5K en posici n ? del :0M, a trav"s de una unidad de enlace, variable seg!n las especies. 2Por ejemplo, en una especie de Micrococcus, el elemento de enlace consiste en aglicerolGPbD GG:0;GP3.

cidos teicurnicos@ #iertas bacterias ;ramGpositivas, cuando se someten a un r"gimen de limitaci n de fosfato son incapaces de sinteti'ar 1cidos teicoicos, pero en su lugar producen 1cidos teicur nicos. Los teicur nicos consisten en polmeros ani nicos formados por la alternancia de 1cidos ur nicos 2que tienen grupos G#55K libres3 y amino'!cares como la :GacetilG galactosamina. cidos lipoteicoicos@ Est1n presentes en todas las bacterias ;ramGpositivas, aun en condiciones de carencia de fosfato. 9e trata simplemente de 1cidos glicerolGteicoicos que se encuentran unidos a la mem#rana citopl%smica, concretamente se unen por enlace fosfodi"ster con glucolpidos de membrana, mientras que el otro e(tremo de la cadena queda e(puesto al e(terior. En Streptococcus pyogenes las cadenas de lipoteicoicos se encuentran asociadas con la llamada prote6na +, originando una microfibrillas que sobresalen notablemente hacia el e(terior celular 2observables a microscopio electr nico3, y que facilitan la uni n a las c"lulas de animales en que parasitan estas bacterias. 'unciones de los pol6meros de la matri!@ Parece ser que su papel principal es suministrar una carga neta negativa a la pared celular, lo que permite captar cationes divalentes 2p. ej., Mgcc3, que a su ve' se necesitan para muchas actividades en'im1ticas de la membrana citopl1smica o del espacio peripl1smico, que participan de la morfog"nesis y divisi n de la pared celular. #omo ya dijimos, los 1cidos teicoicos y teicur nicos son buenos antgenos. #uando no est1n cubiertos por estructuras m1s e(ternas 2como c1psulas3, constituyen el ant6geno som%tico de las #acterias Gram=positivas. Hinalmente, en algunas bacterias, sumistran, junto con el P;, receptores especficos para la adsorci n de ciertos bacteri fagos.

2.4 PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS CIDO ALCOHOL RESISTENTES

)eterminadas bacterias ;ramGpositivas 2corineformes, Nocardia y, en especial Mycobacterium3 presentan una pared celular muy compleja, con a#undancia de l6pidos 2algo e(cepcional entre las ;ramGpositivas3. Estas bacterias no se tien con los colorantes normales, pero una ve' que se han teido con fucsina 2for'ando mediante calentamiento de la preparaci n3, tienen resistencia a decolorarse por una me'cla de 1cido clorhdrico al DW en etanol de =?o. Por ello se denominan como bacterias %cido=alco,ol resistentes. Esta propiedad depende

esencialmente de la presencia, en su pared celular de unos lpidos llamados %cidos miclicos. 8umicamente, esta pared celular consiste en un esqueleto formado por dos tipos de polmeros, unidos covalentemente entre s@ un peptidoglucano especial 2la diferencia m1s importante es que en ve' de :Gacetil mur1mico e(iste :GglucolilGmur1mico3< un ara#inogalactano de gran peso molecular. 0mbos polmeros se encuentran enla'ados a trav"s de fosfodi"ster entre una unidad de mur1mico y una de las arabinosas. Pero a su ve', este esqueleto se une covalentemente a los %cidos miclicos. Los 1cidos mic licos son `Ghidro(i1cidos grasos ramificados en , cuya longitud de cadena es grande 2desde #>L a #=* en Mycobacterium3. Est1n unidos al esqueleto de la P.#. de forma uniforme, a trav"s de enlaces con los G5K en + de las unidades de arabinosa. Por lo tanto, el esqueleto de la P.#. de estas bacterias consiste en@ peptidoglucanoGGGarabinogalactanoGGG1cidos mic licos. Pero aparte de este esqueleto complejo, la P.#. de las bacterias 1cidoGalcohol resistentes e(hibe una variedad de lpidos@ *3 Glucol6pidos* a3 +icolatos de tre,alosa@ dos unidades de trehalosa unidas entre s por enlace 2**d3, y en donde los grupos ? y ?d est1n unidos con 1cidos mic licos. #onstituyen el llamado factor de crecimiento en cuerdas, debido a que son responsables de la agregaci n de los individuos bacterianos en forma de -cuerdas.. b3 &ulfol6pidos de tre,alosa@ est1n locali'ados en la periferia de la P.#., y parecen ser impartantes factores de virulencia. En Mycobacterium tuberculosis 2el bacilo de la tuberculosis3 estos sulfolpidos de trehalosa funcionan como evasinas, es decir, facilitan el que la bacteria escape a la acci n de los macr fagos inhibiendo la fusi n del fagosoma con el lisosoma, lo cual puede e(plicar el hecho de que estosmicroorganismos tengan "(ito como par1sitos intracelulares. c3 +icsidos@ Locali'ados en la periferia, consisten en la uni n por enlace "ster entre 1cidos mic licos y a'!cares 2incluyendo 1cidos ur nicos, deso(iosas, amino'!cares, etc.3. J3 4eras* Oni n de 1cidos mic licos con ftioceroles 2alcoholes ramificados de alto peso molecular@ #D, G #DF3.

El alto contenido en lpidos confiere una serie de propiedades a estas bacterias 2aparte de la 1cidoGalcohol resistencia ya citada3@ aspecto y consistencia c"rea de sus colonias< crecen formando grumos en medios lquidos< gran impermeabilidad de la P.#., que a su ve' condiciona una gran resistencia a la desecaci n y gran resistencia a sustancias antibacterianas 2detergentes, o(idantes, 1cidos, bases, etc3.

2.5 LA PARED DE BACTERIAS GRAMC NEGATIVAS

La pared de las bacterias ;ramGnegativas es estructuralmente m1s compleja que la de ;ramGpositivas, cosa que se puede comprobar al observar un corte transversal al microscopio electr nico@ por encima de la membrana citopl1smica y hasta el e(terior se pueden apreciar + capas, altern1ndose las claras 2LJ, L+3 y las oscuras 2m1s densas a los electrones@ L*, LD, LF3. La capa densa LF corresponde al peptidoglucano 2ya estudiado3, que se encuentra inmerso en la capa clara L+, que consiste en un espacio peripl%smico, limitado entre la membrana citopl1smica y una mem#rana e$terna. La delgada capa de peptidoglucano no constituye m1s del +G*,W de la pared. 0 continuaci n estudiaremos la peculiar membrana e(terna de las bacterias ;ramGnegativas y el espacio peripl1smico.

2.5.1 LA MEMBRANA EETERNA DE BACTERIAS GRAMC NEGATIVAS

9e trata de una estructura de bicapa lipdica e(clusiva de las bacterias ;ramG negativas. #omo otras bicapas lipdicas, consta de una doble capa de lpidos, junto con protenas de matri' 2estas !ltimas atravesando total o parcialmente la bicapa3. Por supuesto, en la bicapa lipdica, los grupos polares quedan hacia afuera, mientras que los hidr fobos tienden al interior. 0hora bien, la composici n qumica y la disposici n de los elementos de esta membrana e(terna son muy distintos a los de una membrana tpica@ la bicapa es altamente asimtrica@ en la capa e(terna e(iste un ?,W de protenas y un F,W de una macromol"cula e(clusiva de esta membrana e(terna@ el lipopolisac%rido 1/P&3< en la capa interna no hay LP9, e(istiendo fosfolpidos 2HL3, lipoprotenas 2LPP3 y otras protenas. El conjunto es un mosaico fluido que permite el despla'amiento lateral de los fosfolpidos, del LP9, y de las protenas, pero no de las lipoprotenas unidas covalentemente al peptidoglucano. 9in embargo, esta fluide! es menor que la de la membrana citopl1smica.

2.5.1.1 COMPOSICIN #UMICA Y ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA EETERNA La membrana e(terna se encuentra unida con el peptidoglucano subyacente a trav"s de distintos componentes y tipos de enlaces@ enlaces inicos, mediados por cationes divalentes, entre distintas protenas de la membrana e(terna y el P;< enlaces ,idrfo#os entre fosfolpidos y protenas de la capa interior de la membrana e(terna con el P;< enlaces covalentes entre algunas mol"culas de lipoprotena y el P;. Parece ser que la membrana e(terna est1 en contacto directo con la plasm1tica en numerosos puntos, denominados 'onas de adhesi n. Puede que se trate de regiones en las que produ'ca una aut"ntica fusi n entre estos dos tipos de membrana, facilitando qui'1 el transporte de ciertas sustancias desde el e(terior al interior celular. Estudiaremos a continuaci n los componentes de la membrana e(terna, aludiendo a su composici n qumica, estructura y funciones.
2.5.1.1.1 F-0?-+@.45-0 =FL>

9e locali'an en la l1mina interna de la m. e(t. La composici n en fosfolpidos es similar a la de la membrana citopl1smica, con un ligero enriquecimiento en fosfatidilG etanolamina.
2.5.1.1.2 L4.-.-+40/*A:45- =LPS>

9e trata de una macromol"cula e(clusiva de la l1mina e(terna de la membrana e(terna de bacterias ;ramGnegativas, responsable de muchas de las propiedades biol gicas de estas bacterias. 9e le conoce tambi"n con el nombre de endoto$ina 2to(ina termoestable, no difusible3. 9e trata de un glucolpido complejo, que podemos considerar compuesto de tres regiones o dominios@ l6pido A, que es la porci n m1s pro(imal, y de car1cter hidrof bico< regi n intermedia, llamada oligosac%rido medular< regi n distal 2cadena lateral espec6fica, polisacardica3 a base de repeticiones de unos pocos a'!cares. Es de car1cter hidroflico y constituye el ant6geno som%tico de las ?bacterias ;ramGnegativas. i3 El l6pido A@ esta regi n es pr1cticamente id"ntica en todas las bacterias ;ramGnegativas. #onsiste en un disac1rido formado por dos unidades de glucosamina unidas por enlace `2*?3, pero donde todos los grupos G5K 2menos uno3 y G:KJ est1n sustituidos 2unidos a otras mol"culas3@ 5bs"rvese que e(isten + 2a veces ?3 1cidos grasos, todos ellos saturados, con predominio de `G hidro(imirstico 2un 1cido graso #*F3.

El G5K original en Fd est1 sustituido por arabinosaminaGfosfato. El G5K en * est1 sustituido por fosforilGetanolamina 2a veces pirofosforilGetanolamina3. ii3 El oligosac%rido medular 2tambi"n llamado cora!n o nAcleo3@ se une al lpido 0 a trav"s del G5K en Dd. 9e pueden considerar dos fracciones@ la fracci n del n!cleo interno, a base de dos tipos de a'!cares e(clusivos de ;ramG negativas@ JGcetoGDGdeso(ioct nico 27)53 y LGgliceroG)Gmanoheptosa 2Kep3. 0lguna de las Kep y alguno de los 7)5 pueden a su ve' estar unidos a fosforilGetanolamina 2o pirofosforilGetanolamina3. Esta regi n es muy rica en grupos cargados, especialmente con carga negativa 2de los fosfatos y 7)53. La fracci n del n!cleo e(terno est1 constituida a base de he(osas 2glucosa, galactosa, :0;, y a veces algunas he(osas m1s raras3. iii3 4adena lateral espec6fica@ polisac1rido repetitivo, que se proyecta hacia el e(terior celular, y que constituye el Ag som%tico de bacterias ;ramGnegativas. #onsiste en la repetici n 2hasta F, veces3 de unidades tri=5 tetra= o pentasacar6dicas 2en estos dos !ltimos casos uno de los a'!cares de cada repetici n queda lateral respecto del esqueleto lineal que forman los dem1s3. )e todas estas regiones del LP9 la !nica indispensa#le para la via#ilidad es el l6pido A. Los mutantes incapaces de sinteti'ar las cadenas laterales o el oligosac1rido medular dan colonias rugosas y est1n afectados en distintas propiedades biol gicas, pero pueden sobrevivir.

PAPE/E& B 'CN47 NE& )E/ /P& *. Papel estructural@ el LP9 es el componente esencial de la membrana e(terna. La porci n hidrof bica 2las cadenas de 1cidos grasos del lpido 03 se proyectan hacia el interior de esta membrana. Precisamente es la estructura del lpido 0 la principal responsable de la menor fluide' de dicha membrana, y por lo tanto de la mayor resistencia fsica. 25bs"rvese que, mientras cualquier fosfolpido tiene dos cadenas de 1cido graso, el lpido 0 posee + o ?, todas ellas unidas al mismo disac1rido, generando una mol"cula m1s -masiva..3. J. 0 su ve', la propiedad anterior hace que sea menos solu#le a detergentes ( m%s resistente a disolventes org%nicos.

D. Es menos permea#le a muc,as molculas ,idrof#icas, incluyendo antibi ticos, debido a las largas cadenas laterales hidroflicas. F. 9e une a cationes divalentes 2como Mgcc o Qncc3, lo que contribuye a la mayor estabilidad de la membrana e(terna. Esta presencia de cationes suministra un am#iente adecuado para muc,as funciones de la P.4. 29i aadimos un agente quelante como el E)40, o eliminamos el Mgcc y lo sustituimos por #acc, se produce la desorgani'aci n de la membrana e(terna3. +. #omo ya dijimos, el LP9 constituye la endoto$ina de las bacterias ;ramGnegativas. La funci n como endoto(ina se debe a la regi n del lpido 0. 9us propiedades como endoto(ina est1n en el origen de muchos sntomas patol gicos propiciados por pat genos ;ramGnegativos@ a. pirogenicidad 2inducci n de fiebre3

b. hipotensi n c. en casos graves, choque letal, por fallo cardaco

d. actividad necr tica de tejidos. ?. Pero igualmente, tiene efectos #eneficiosos@ estimula una serie de mecanismos defensivos del hospedador, incluyendo la activaci n del complemento, que puede ocasionar la lisis de la bacteria, mejora las propiedades de los fagocitos, etc. Es decir, a pesar del nombre de endoto(ina, el LP9 no es intrnsecamente t (ico, sino que su efecto depende de la respuesta del hospedador. El macr fago es la c"lula del hospedador principal responsable de la mediaci n de los efectos del LP9, tanto los positivos como los negativos. El macr fago posee receptores de membrana para detectar el LP9 bacteriano, y en respuesta a "l, libera una serie de mol"culas mediadoras 2citoquinas3 que act!an a su ve' sobre diversas partes del sistema inmunitario. )e hecho, los efectos negativos se deben a comportamientos incontrolados desencadenados en el propio sistema inmunitario. >. El LP9, y concretamente las cadenas laterales constituyen el ant6geno som%tico , cuya especificidad viene determinada por la secuencia repetitiva de a'!cares. Esta porci n condiciona la virulencia de las bacterias ;ramGnegativas pat genas, por lo que debe de ser esencial en la interacci n hospedadorGpar1sito. J.+.*.*.D /a lipoprote6na 1/PP5 lipoprote6na de Draun3 9u porci n polipeptdica es una pequea protena 2>.J C)a3 muy abundante en la membrana e(terna, y es la responsable de la uni n covalente entre "sta y el peptidoglucano. La protena tiene una configuraci n mayoritaria en Gh"lice, que atraviesa el espacio peripl1smico, y parece que se agrega formando trmeros. Ona de las LPP del trmero 2por t"rmino medio3 se une covalentemente con el peptidoglucano.

El amino1cido :Gterminal es una cistena cuyo grupo sulfhidrilo est1 unido por enlace tio"ter a un diglic"rido, y cuyo grupo amino se une por enlace amido con un 1cido graso 2p. ej., palmtico3. )e este modo, la porci n :Gterminal de la LPP est% em#e#ida en la l%mina interna de la mem#rana e$terna. El amino1cido #Gterminal es una lisina. Ona de cada tres mol"culas de LPP usa esta Lys para establecer un enlace peptdico entre su propio grupo G:KJ libre y el G#55K libre del mesoG)0P del P;. Por t"rmino medio, por cada die' unidades disacardicas del P;, e(iste un enlace covalente con la LPP. La principal 2y probablemente !nica3 funci n de la lipopprotena es meramente estructural@ estabili'ar el complejo entre peptidoglucano y membrana e(terna. Esta uni n es tan fuerte que permite aislar la membrana e(terna y el peptidoglucano como una unidad. J.+.*.*.F Prote6nas de la mem#rana e$terna Est1n intercaladas en esta membrana, participando en la estabili'aci n de la arquitectura tridimensional, interaccionando unas con otras y con los lpidos. Entre ellas, las m1s importantes son las porinas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isten otras protenas minoritarias parecidas a porinas, que act!an como canales espec6ficos que permiten el paso de ciertas mol"culas@ vitamina 6*J, quelatos de He, nucle sidos, maltode(trinas, etc. 0lgunas de ellas sirven simult1neamente como receptores de fagos. 2.5.1.2 PAPELES Y FUNCIONES DE LA MEMBRANA EETERNA

*3 0ct!a como tami! molecular, que permite la difusi n !nicamente de mol"culas relativamente pequeas. Esto supone una proteccin frente a muc,os agentes anti#acterianos* colorantes, 1cidos biliares, antibi ticos, en'imas 2p. ej., la liso'ima, que podra alcan'ar y atacar al P;3. /ecu"rdese que las porinas s lo permiten el paso de sustancias hidroflicas por debajo del tamao especificado por el di1metro de los canales. J3 #ondiciona propiedades de superficie@ a3 grado de humedad 2humectabilidad3

b3 adhesividad c3 carga el"ctrica. D3 Es la estructura donde se fi"an los componentes del complemento 2sistema defensivo de los animales superiores que conduce a la inserci n, en la membrana e(terna, de una serie de protenas llamadas complejo de ataque a la membrana, que agujerea dicha membrana y ocasiona la lisis de la bacteria3. F3 #iertas protenas y cadenas laterales del LP9 pueden ser lugares de adsorci n 2receptores espec6ficos3 de fagos y bacteriocinas. +3 Punto de anclaje del anillo e(terno 2-L.3 del corp!sculo basal de los flagelos. J.+.J EL E9P0#&5 PE/&PLe9M&#5

Entre la membrana e(terna y la membrana citopl1smica e(iste un compartimento acuoso baando al peptidoglucano, denominado periplasma o espacio peripl%smico. El volumen de este compartimento puede llegar a representar un J,GF,W del volumen celular total. El contenido del periplasma 2el -gel peripl1smico.3 incluye@ /:asa y fosfatasa, que digieren mol"culas que por s mismas no pueden pasar al citoplasma. Penicilinasa@ degrada penicilina, evitando destrucci n de P; protenas de transporte de nutrientes 2p. ej., de maltosa3 protenas de transporte de nutrientes 2p. ej., de maltosa3 protenas de uni n a estmulos qumicos. En bacterias desnitrificantes y quimiolitoautotrofas, e(isten protenas implicadas en el transporte de electrones. El periplasma cumple una funcin de osmorregulacin@ El periplasma es una soluci n densa, con alta concentraci n de macromol"culas, y que participa en la regulaci n de la osmolaridad celular frente a la tonicidad del medio e(terior. Para ello, e(iste en este espacio peripl1smico un oligosac%rido derivado de la mem#rana citopl%smica 25)M, o seg!n sus iniciales inglesas, M)53, a base de *, unidades de `G)Gglucosa 2unidas entre s por enlaces *J3 con sustituyentes 1cidos. En medios de alta osmolaridad 2por ejemplo, en los fluidos corporales3, disminuye la concentraci n del oligosac1rido. En ambientes de baja osmolaridad 2p. ej., aguas fecales3, aumenta mucho la concentraci n de dicha mol"cula. )e este modo, la presi n de turgor del protoplasto se transmite contra el peptidoglucano, que como sabemos ya, es la estructura de la pared celular. que aguanta las variaciones de presi n osm tica.

3 PAREDES DE LAS AR#UEAS

0unque las arqueas pueden comportarse como ;ramGpositivas o como ;ramG negativas, no se suele aludir a esto en este dominio de procariotas, ya que sus paredes tienen poco que ver con las de eubacterias. E(ceptuando el g"nero !hermoplasma, carente de pared celular, las dem1s arqueas poseen, por encima de la membrana citopl1smica, alg!n tipo de estructura con funciones de pared celular. En muchos casos las funciones de pared celular son ejercidas simplemente por una capa 9 paracristalina 2v"ase tema F3, a base de disposici n regular de subunidades id"nticas de una protena o glucoprotena 2p. ej., Methanococcus$ Methanogenium3. /ecuerde que en ciertas arqueas de ambientes e(tremos, esta capa 9 est1 estabili'ada por factores de esos ambientes@ En el hal filo obligado 5alobacterium las subunidades de glucoprotena se estabili'an por altas concentraciones de i n :ac. En el termoacid filo Sul,olobus la estabilidad la confieren los bajsimos pK. En Methanospirillum y en Methanothrix varias c"lulas, cada una con su capa 9, se encuentran englobadas por una vaina com!n, a base de protenas y carbohidratos, con una estructura a base de anillos paralelos. En Methanosarcina y 5alococcus la capa 9 se encuentra rodeada de metanocondroitina, un polmero a base de :GacetilGgalactosamina, glucur nico, glucosa y manosa. 2Esta metanocondroitina es similar al condroitn sulfato presente en tejido conjuntivo de animales3. Hinalmente, los miembros del orden Methanobacteriales poseen una pared de pseudomure6na, un e(trao peptidoglucano no basado en :0M. #onsiste en un esqueleto de unidades repetitivas de :0; unidas por enlace `2*D3 con :GacetilG talosaminour nico 2:04, un a'!car e(clusivo de estos organismos3. El grupo G:KJ del :04 va unido a su ve' con un tetrap"ptido, pero en "ste s lo participan amino1cidos de la serie L. 0l igual que en la murena de las eubacterias, las diversas cadenas se unen entre s por enlaces peptdicos entre el amino1cido terminal 2F3 de un tetrap"ptido y el diamino1cido 2D3 de otra cadena.

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A5+10:-D0;, .:

9-H65,:.7" 15 <.G6.6, 2&&

NDICE( 1 2 3 INTRODUCCIN BIOSNTESIS DEL PEPTIDOGLUCANO DE MURENA CRECIMIENTO DE LA PARED CELULAR

3.1 CRECIMIENTO DE LA PARED EN UNA BACTERIA GRAM>NEGATIVA : Escherichia coli............................................................................................................

3.2 CRECIMIENTO Y SEPTACIN EN UNA BACTERIA GRAM>POSITIVA( Enterococcus faecalis 4 5 PROTOPLASTOS Y ESFEROPLASTOS FORMAS L

BIBLIOGRAFA

INTRODUCCIN

En el captulo anterior estudiamos la composici n qumica, estructura y funciones de los principales tipos de paredes celulares procari ticas. En este captulo trataremos un aspecto din1mico del tema de las paredes@ c mo se sinteti'a el peptidoglucano de las eubacterias, y c mo se produce el proceso general de crecimiento de la pared, incluyendo el evento particular de formaci n del septo transversal que marca el -nacimiento. de dos c"lulas hijas. :os concentraremos en la biosntesis del peptidoglucano, debido a su inter"s intrnseco y aplicado 2sobre este proceso act!an diversos antibi ticos, algunos de gran importancia clnica3. )esde el punto de vista topol gico, todas las capas de las envueltas bacterianas 2membranas, pared celular3 son superficies cerradas sobre s mismas, fsicamente continuas para mantener la integridad y viabilidad de la c"lula. Pero por otro lado, deben de ser susceptibles de e(pandirse durante el crecimiento por incorporaci n de nuevos materiales. 0dem1s, todos los constituyentes deben crecer coordinadamente e incorporarse en los lugares precisos. Por ejemplo, en el caso de las bacterias ;ramGnegativas, distintos componentes deben de ir a parar a diferentes locali'aciones@ periplasma, P;, membrana e(terna, e incluso medio e(terior. )urante cada ciclo celular, hay una fase en la que los materiales de las envueltas 2y concretamente, de la pared celular que nos ocupa ahora3 deben de facilitar la divisi n de la c"lula en una descendencia de dos c"lulas hijas. Hinalmente, queda el problema de la energa. Los procesos biosint"ticos requieren aporte de energa qumica, pero el 04P y compuestos similares no pueden salir del protoplasto. Precisamente en este captulo vamos a ver algunas de las estrategias bioqumicas y moleculares que las bacterias han evolucionado para solventar estos puntos para el caso del peptidoglucano. %eremos que la estrategia implica varias fases@ 9ntesis de precursores en el citoplasma Ensamblaje parcial en membrana 4ransporte a la cara e(terna e(terna de la membrana Ensamblaje final en el e(terior, mediante reacciones que no precisan energa

2 BIOSNTESIS DEL PEPTIDOGLUCANO DE MURENA

#onsta de F etapas@ *. 9ntesis de precursores solubles en el citoplasma. J. Estos precursores son transferidos a un transportador lipdico situado en la membrana citopl1smica 2un poliisoprenol fosfatado llamado undecaprenilGfosfato3, donde se forman las unidades disacardicas con el pentap"ptido. D. Las unidades disacardicas se polimeri'an en cadenas lineales fuera de la membrana, pero a!n unidas al undecaprenilGfosfato de la membrana. F. Oni n del polmero lineal as formado al peptidoglucano pree(istente en la pared celular, por entrecru'amiento de 2al menos3 parte de sus p"ptidos respectivos. 0 estas etapas hay que aadir una fase adicional de regeneraci n del transportador lipdico, una ve' que ha cumplido su misi n, para que pueda ser operativo en un nuevo ciclo de sntesis. %eamos, pues, en m1s detalle, c mo ocurre este interesante proceso@

'ase 9*. Los monosac1ridos que luego van a constituir la unidad disacardica repetitiva del esqueleto del peptidoglucano 1NA+ ( NAG3 se activan al unirse a urid6n difosfato 1C)P3. 2En general, los monosac1ridos que han de incorporarse a polmeros de pared celular bacteriana se activan mediante su uni n con nucle sidosGfosfato.3 Por lo tanto, en esta fase se sinteti'an por separado@ :0;GO)P :0MGO)P Luego se va produciendo la adicin secuencial ( ordenada de los distintos amino%cidos al :0M 2en reacciones que requieren energa e iones Mncc3@ *. LGala J. )Gglu D. mG)0P 2u otro diamino1cido< p. ej. LGlys en Staphylococcus aureus3

F. )GalaG)Gala 5bservar que no se produce un tetrap"ptido, sino un pentaptido. El !ltimo paso de adici n de amino1cidos es la uni n del dip"ptido )GalanilG)Galanina, que se ha sinteti'ado en dos fases@ una racemasa convierte la LGala a )Gala< creaci n de enlace peptdico entre dos )Gala. 'ase 2* El O)PG:0MGpentap"ptido se transfiere ahora a un transportador de membrana, llamado undecaprenil=fosfato 2que abreviaremos como LipGP3, en una reacci n catali'ada por una translocasa especfica. El undecaprenilGfosfato es un poliisoprenoide de ++ 1tomos de # 2#++, derivado de la repetici n ** veces de la unidad isoprenoide, con un fosfato terminal3. 9e le conoce tambi"n con el nombre de #actoprenol, pero hoy se sabe que no es e(clusivo de bacterias. El bactoprenol permite el transporte y ensamblaje de sustancias que, como los a'!cares, son hidroflicas, y no podran pasar por s mismas la barrera hidrof bica de la membrana. Ona ve' que el :0MGpentap"tido est1 unido al undecaprenil 2por medio de pirofosfato3, una transferasa transfiere a "ste la :0; desde el O)PG:0;. 9e genera pues el enlace `2*F3 entre :0; y :0M. Por lo tanto, se obtiene@ LipGPGPG :0M2pentap"ptido3G:0;. E* .7+0 7-+105-A* .7 510*;, 7. 86,;15.* :0 9,;-<-505-,*.7 @1. C0 .7+1;-09,7 .* :0 .7+615+160 GK7-50 ;.: PG. P,6 .E.98:,( .* Staphylococcus aureus .: B618, >COOH ;.: D>B:1+K9-5, .* 8,7-5-A* =2? .7 09-;0;, =8070 0 >>CO>NH 2. P,6 ,+6, :0;," 7. -*+6,;15.* :,7 81.*+.7 8.8+F;-5,7" @1. .* .: 507, ;. .7+0 G05+.6-0 5,*7-7+.* .* 1*0 8.*+0B:-5-*0" @1. 7. 1*. 0: B618, 09-*, +.69-*0: ;. :0 L>LC7 .* 8,7-5-A* =3?. T0*+, :0 +607:,5070 5,9, :0 +60*7<.6070 .7+K :,50:-D0;07 .* .: :0;, 5-+,8:K79-5, ;. :0 9.9G60*0" ;. 9,;, @1. .: 86.5167,6 L-8>P>P>NAM=8.*+08H8+-;,?>NAG" .* .7+. 9,9.*+, .7+K I5,:B0*;,M 305-0 .: 5-+,8:0790" 0*5:0;, 0 :0 :K9-*0 -*+.6*0 ;. :0 9.9G60*0 0 +60/H7 ;. G05+,86.*,:. F/0, 3( P-+41,:4G/*4F3 5, H/:4/0 )345/5,0 540/*/:@54*/0 ( A3,60 .: G05+,86.*,: I7. ;0 :0 /1.:+0M .* :0 9.9G60*0 =1*0 .78.5-. ;. <:-8><:,8 ;.7;. :0 5080 -*+.6*0 307+0 :0 .J+.6*0?" ;. 9,;, @1. :,B60 @1. .: 86.5167,6 6.71:+0*+. ;. :0 <07. 2 @1.;. .J81.7+, 305-0 .: 9.;-, 051,7, .J+.6-,6 0 :0 9.9G60*0. E*+,*5.7 +-.*. :1B06 :0 8,:-9.6-D05-A* ;. /06-07 1*-;0;.7 ;-70506F;-507( .::, 7. :,B60 .* 1*0 6.055-A* ;. 8:/30I+)*-045/*4F3. C,*7-7+. .* :0 1*-A* ;. 50;0 1*-;0; ;-70506F;-50 =5,* 71 8.*+08H8+-;,? 1*-;0 0 71 6.78.5+-/, L-8>P>P" 5,* .: .J+6.9, :-G6. =6.;15+,6? ;. 1*0 50;.*0 86..J-7+.*+. @1. 0 71 /.D .7+K 1*-;0 0 ,+60 9,:H51:0 ;. L-8>P>P.

En el proceso se libera uno de los LipGPGP 2o sea, el undecaprenil, pero en forma pirofosforilada3. 9obre este LipGPGP act!a una fosfatasa especfica, que elimina el fosfato terminal, regener1ndose el undecaprenilGfosfato, que queda dispuesto para otro ciclo como el descrito. 'ase 4* El polmero surgido de la fase anterior es una cadena lineal de P; sin entrecru'ar, y unido a!n al transportador lipdico de membrana. 0hora este polmero naciente 2con sus pentap"ptidos3 reacciona, por transpeptidacin, con un P; aceptor pree(istente. En esta reacci n se ven implicados el grupo #X5 de la )Gala 2F3 del P; naciente y el grupo G:KJ libre del diamino1cido 2D3 del P; aceptor 2o del !ltimo amino1cido del puente peptdico3. E7+, .7 :, 9-79, @1. ;.5-6 @1. .: .*:05. 8.8+F;-5, .*+6. D>0:0 =4? C D>0:0 =5? ;.: PG *05-.*+. 7. /. 717+-+1-;, 8,6 ,+6, .*:05. 8.8+F;-5," .*+6. ;-530 D>0:0 =4? C .: ;-09-*,K5-;, ;.: PG *05-.*+..

La energa para esta reacci n la suministra la hidr lisis concomitante del enlace peptdico entre las dos )Gala terminales. Es decir, en cada reacci n de transpeptidaci n se libera una )Gala, correspondiente a la que ocupaba la posici n 2+3. Ia dijimos en el captulo anterior que no todos los tetrap"ptidos participan en entrecru'amientos. Las )Gala terminales 2en +3 de los p"ptidos no implicados en tales entrecru'amientos son eliminadas por una en'ima llamada )G)Gcarbo(ipeptidasa. Esta en'ima e(plica no s lo que en el P; maduro e(istan tetrap"ptidos 2y no los pentap"ptidos originales3, sino tambi"n la e(istencia de trip"ptidos.

Muchas bacterias controlan el grado de entrecru'amiento de su P; maduro. &ncluso algunas pueden eliminar totalmente muchos de los p"ptidos originalmente unidos al :0M, mediante en'imas conocidas gen"ricamente con el nombre de autolisinas. 0s por ejemplo, Micrococcus luteus Gun coco ;ramGpositivoG merced a su actividad :0MGLGalaGamidasa, presenta un P; que no est1 entrecru'ado en un +,G>,W. Anti#iticos -ue actAan a nivel de la #ios6ntesis de peptidoglucano* Estos antibi ticos tienen un efecto bactericida sobre bacterias en crecimiento. Ello se debe a que, al inhibir determinados pasos del ciclo de sntesis y ensamblaje del P;, provocan la acumulacin de precursores de dic,o PG, lo que a su ve' desencadena la activacin de las autolisinas de la bacteria, que degradan el P; y que finalmente provoca la lisis celular 2en medios hipot nicos3, por entrada masiva de agua a la c"lula. *. 'osfomicina@ act!a inhibiendo la formaci n del DG5G)GlactilG"ter de la :0; 2o sea, del :0M3. Parece ser que la base molecular estriba en la semejan'a estructural entre el este antibi tico y el PEP 2es decir, la fosfomicina es an1logo estructural del PEP, lo que lleva a la inactivaci n de la en'ima correspondiente a esta reacci n3. J. 4icloserina@ 9e comporta como an1logo estructural de la )Galanina, por lo que inhibe la actuaci n de la racemasa que convierte la LGala a )Gala, as como de la reacci n de uni n de dos )Gala. D. Eunicamicina@ inhibe la traslocasa que cede el :0M unido hasta entonces al O)P y lo pasa al bactoprenol 2fase JV3. F. .ancomicina ( ristocetina@ inhiben la segunda transglucosidaci n 2fase DV3, es decir, la uni n de diversas unidades disacardicas. +. Dacitracina@ se une al undecaprenolGpirofosfato, bloqueando su desfosforilaci n, e impidiendo por lo tanto, la regeneraci n del transportador de membrana. ?. Anti#iticos @=lact%micos 1p. e".* penicilinas5 cefalosporinas3@ inhiben la reacci n de entrecru'amiento por transpeptidaci n. /)studiaremos su mecanismo de acci.n en m9s detalle en el cap7tulo 1: sobre ;uimioter9picos y &ntibi.ticos2.

3 CRECIMIENTO DE LA PARED CELULAR

#omo ya dijimos al comien'o de este tema, aunque la pared celular es una estructura cerrada y sin soluci n de continuidad, debe permitir su e(pansi n 2crecimiento3, y esto supone que se han de romper ciertos enlaces si se quiere que el nuevo material se ensamble con el pree(istente mediante nuevas uniones, es decir, debe e(istir una acci n concertada de murenGhidrolasas y de murenGsintasas. Por otro lado, hay que tener en

cuenta que en el crecimiento de la pared celular se producen dos tipos de procesos@ la e(pansi n 2aumento de tamao3 de esa pared, y la formaci n del tabique transversal en el centro de la c"lula. El crecimiento y septaci n del peptidoglucano est1n basados en la actividad controlada y locali'ada en puntos determinados, de una gama de autolisinas, especialmente las dotadas de actividad transglucosidasa y]o transpeptidasa. )ebido a que estas en'imas son los sitios de acci n de las penicilinas 2y otros antibi ticos `Glact1micos3, se les conoce tambi"n con el nombre de PDP 2de penicillin4binding proteins< v"ase la tabla *3. 406L0 * #ropiedades de las #B#s de Escherichia coli
PDP P6P *V, *6 P6P J P6P D P6P F NI molculasJ clula Actividad en!im%tica conocida Posi#les funciones *,, cada una 4ransglucosilasa]transpeptidasa 9ntesis de P; durante la elongaci n celular J, +, **, 4ranspeptidasa 4ransglucosidasa]transpeptidasa )G)Gendopeptidasa] )G)carbo(ipeptidasa )G)Gcarbo(ipeptidasa #recimiento de la forma bacilar 9ntesis de P; durante la septaci n 2tabique3 Kidr lisis de los entrecru'amientos durante la elongaci n )estrucci n del pentap"ptido no entrecru'ado

P6P +

*L,,

3.1 CRECIMIENTO DE LA PARED EN UNA BACTERIA GRAMCNEGATIVA: Escherichia coli

El crecimiento de la pared en ). coli se puede considerar dividido en dos fases@ *. #recimiento en longitud 2elongaci n3, mientras la c"lula crece en tamao. J. Producci n del tabique transversal 2septaci n3, que conduce a la formaci n de dos c"lulas hijas. Elongacin Las PDPs 9 son las encargadas de la elongaci n de las cadenas de P; naciente 2por transglucosidaci n de las unidades disacardicas3 y simult1neamente, por transpeptidaci n, logran el entrecru'amiento. Las cadenas nacientes del P; se intercalan en la parte cilndrica del s1culo de P; gracias a que las PDP4 ( PDP; cortan enlaces del P; pree(istente. La PDP2 interviene aqu tambi"n para transpeptidaci n. La cadena de P; se va elongando unidireccionalmente

alrededor de la circunferencia de la c"lula. 9e calcula que e(isten unos J,, sitios de inserci n de nuevo material en cada c"lula, dispersos de forma m1s o menos uniforme por toda la superficie de la c"lula. La maquinaria biosint"tica tarda L minutos en completar cada circunferencia de elongaci n. 'ormacin del ta#i-ue transversal La divisi n de la bacteria por fisi n binaria sim"trica se logra por medio de una invaginaci n circular de las envueltas 2membrana citopl1smica y peptidoglucano3 en mitad de la c"lula madre. En el inicio de este proceso tiene un papel esencial la protena HtsQ, y m1s tarde intervienen otras protenas Hts. 'tsK es una protena imprescindible, presente tanto en eubacterias como en arqueas, que muestra parecido con las tubulinas eucari ticas. 0l parecer, al igual que las tubulinas, la HtsQ se une a ;4P, con lo que se promueve su polimeri'aci n. 6ajo control del ciclo celular, la HtsQ se ensambla poco antes de la divisi n en el centro de la c"lula, formando un -anillo citocin"tico. en el lado citopl1smico de la membrana celular. E(isten indicios fuertes de que la formaci n de este anillo de HtsQ seali'a el sitio por donde se producir1 la divisi n y se activar1 el crecimiento del peptidoglucano del tabique transversal. Ona ve' que HtsQ ocupa el lugar del futuro septo, entran en acci n otras protenas Hts, formando un complejo llamado Ldivisoma0. E* :07 <,+,B60<F07 0 9-56,75,8-, .:.5+6A*-5, 7. /. 5A9, G0E, :0 -*/0B-*05-A* ;. 9.9G60*0 @1. 5,*7+-+1C. :0 I0/0*D0;-::0M ;.: 7.8+," 7. :,50:-D0* :07 9,:H51:07 ;. F+7Q. La hip tesis seala que los polmeros de HtsQ se van -contrayendo., de modo que -tiran. de las envueltas hacia el interior, provocando la tpica invaginaci n alrededor del centro del bacilo, y que simult1neamente, la HtsQ provoca la activaci n de la PDP3 12'ts73, que es una transglucosidasa]transpeptidasa especfica del tabique transversal. 0 microscopio electr nico se observa que este tabique est1 formado por dos l1minas de P; 2densas a los electrones3 separadas entre s por otra transparente. El final de la divisi n ocurre como consecuencia de la invaginaci n de la membrana e(terna entre las dos l1minas de P;. f# mo se ensambla la membrana e(terna con relaci n al P;[ Parece ser que esta membrana se ensambla en buena medida por procesos espont1neos guiados por interacciones entre el LP9 y protenas, sirviendo el P; subyacente como andamio que facilita el montaje de toda la estructura. Parece ser que las 'onas de adhesi n 2junturas de 6ayer3 son importantes para la correcta colocaci n de LP9 y protenas de la membrana e(terna.

3.2 CRECIMIENTO Y SEPTACIN EN UNA BACTERIA GRAMCPOSITIVA( Enterococcus faecalis

0 diferencia de lo visto en ). coli, en el enterococo 2)nterococcus ,aecalis3 el crecimiento del P; no es difuso, sino !onal, comen'ando en el centro 2'ona ecuatorial3 y avan'ando hacia afuera. %"ase en la figura el e(perimento de marcado de pared celular con anticuerpos fluorescentes, con ulterior seguimiento del marcaje al microscopio@ tras unos *+ minutos despu"s del marcado se observa que e(iste una banda ecuatorial oscura 2no marcada, por lo tanto est1 constituida por material nuevo reci"n insertado3, mientras que los polos de las c"lulas siguen enteramente marcados. 4ras D, o ?, minutos observamos c"lulas enteramente sin marcar, intercaladas entre c"lulas con uno de sus polos marcados. El proceso se puede describir as@ *. En la c"lula adulta antes de la divisi n aparece una banda ecuatorial donde la pared celular se hace m1s gruesa.

J. )ebajo de esta 'ona engrosada 2hacia el interior del citoplasma3 se va depositando nuevo material, lo que marca el inicio de la formaci n del tabique transversal. Enseguida aparece una muesca en la banda ecuatorial. D. El tabique, con un grosor doble al de la pared celular de la superficie celular, sigue avan'ando, hasta que... F. ... se completa. 9imult1neamente a los pasos DE y FE la 'ona de nueva sntesis de P.#. superficial alcan'a el ecuador de las cel!las hijas nacientes. +. El tabique completo de doble grosor va siendo escindido en dos mitades desde el e(terior hacia el centro, por acci n de autolisinas. )e esta forma se le adjudica a cada c"lula hija la nueva pared correspondiente a uno de sus polos 2el otro procede, intacto, de la c"lula madre3. %"ase igualmente la figura que muestra en m1s detalle la formaci n del tabique. La idea que se saca del proceso en esta bacteria es que posee una sola 'ona de crecimiento de P;, con dos regiones de deposici n de nuevo material@ la regi n del tabique transversal propiamente dicho, y la regi n adyacente, ya en la superficie celular, responsable de la e(pansi n de la pared perif"rica, a ambos lados del tabique.

4 PROTOPLASTOS Y ESFEROPLASTOS
Mediante procedimientos de laboratario se puede lograr eliminar total o parcialmente la pared celular bacteriana. 9e denominan protoplastos las c"lulas bacterianas a las que se ha desprovisto totalmente de pared celular, mientras que esferoplastos son aquellas c"lulas bacterianas que poseen restos de pared. #tencin. E(isten dos posibles m"todos alternativos@ *. Por destrucci n del entramado del P; mediante en'imas lticas 2liso'ima, peptidasas3. En el caso de bacterias ;ramGnegativas, previamente hay que desorgani'ar la membrana e(terna para hacerla permeable a estas en'imas. Ello se logra usando el quelante E)40 y]o sometiendo las c"lulas a bajas temperaturas. J. Por inhibici n de la formaci n de nuevo P; en las c"lulas en crecimiento, trat1ndolas p. ej., con penicilina. 9i se parte de un mutante au(otrofo para un componente del P; basta hacer crecer a la bacteria en un medio carente de dicho componente. Estos m"todos permiten@ en el caso de ;ramGpositivas, la desorgani'aci n total de su pared, por lo que se obtienen protoplastos<

en el caso de las ;ramGnegativas, quedan restos de membrana e(terna y de peptidoglucano atrapados en ella, por lo que se obtienen esferoplastos. En ambos casos, protoplastos y esferoplastos pueden revertir a la forma normal eliminando el tratamiento 2retirando la liso'ima, o la penicilina3.

L,7 86,+,8:07+,7 7,* ,79A+-509.*+. 7.*7-G:.7( E* 1* 9.;-, 3-8,+A*-5," .7+0::0* =:-7-7 ,79A+-50? E* 1* 9.;-, -7,> , 3-8.6+A*-5, 7. 90*+-.*.*.

Protoplastos y esferoplastos son formas osmticamente sensi#les debido precisamente a que al no e(istir o estar desorgani'ado parcialmente el P;, ya no se pueden contrarrestar las fuer'as de presi n osm tica e(istentes en los medios hipot nicos en que normalmente se cultivan o suspenden las bacterias. Por lo tanto, si se quieren obtener suspensiones estables de estas formas, hay que obtenerlas en medios o soluciones isotnicos o ligeramente ,ipertnicos, para evitar su lisis@ soluciones de :a#l ,,J+G,,+ M< sorbitol o sacarosa ,,*G,,+ M< polietil"nglicol 2PE;3 al >,+W. En estos medios los protoplastos y esferoplastos poseen formas esf"ricas, independientemente de la forma que tuviera la bacteria con pared de que proceden. 9e emplean en varios aspectos de investigaci n b1sica@ m"todo suave para luego obtener e(tractos libres de c"lulas y fracciones subcelulares. en algunas bacterias, m"todo para hacerlas permeables al 0):, en e(perimentos de

transformaci n gen"tica. para reali'ar fusi n entre protoplastos de diferentes cepas de la misma especie e incluso entre especies distintas. 9e trata de un m"todo de obtenci n de -recombinantes som1ticos. usado para determinados estudios gen"ticos en bacterias que no tengan sistemas naturales de transferencia gen"tica.

5 FORMAS L
9on c"lulas bacterianas carentes total o casi totalmente de P.#., con formas pleom rficas, irregulares y globulares, que se producen de forma espont1nea en algunas especies bacterianas 2p. ej., Streptobacillus monili,ormis3 cuando se cultivan en medios a base de suero 2que son hipert nicos3. Las colonias de las formas L naturales son muy caractersticas@ en -huevo frito., bif1sicas. 9e pueden obtener de forma inducida formas L en diversas bacterias ;ramGpositivas y ;ramGnegativas, trat1ndolas con penicilina en medios hipert nicos. Las formas L inestables se generan por tratamientos breves, y pueden revertir con frecuencia a la forma normal con pared. Poseen algo de P;, aunque "ste se encuentra alterado respecto al P; de la c"lula normal. Las formas L estables se producen por tratamientos m1s prolongados, y no suelen revertir al tipo normal. La mayora carecen totalmente de peptidoglucano. 0s pues, en las formas L el peptidoglucano ha sido eliminado total o parcialmente, pero de manera que ya no puede servir de aceptor de nuevo P;.

BIBLIOGRAFA
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A5+10:-D0;, .:

9-H65,:.7" 15 <.G6.6, 2&&

NDICE( 1 1.1 1.1.1 MEMBRANA CITOPLSMICA COMPOSICIN #UMICA CARENCIA" EN GENERAL" DE ESTEROLES

1.1.2 1.1.3 1.2 1.3 1.3.1

LPIDOS PROTENAS ESTRUCTURA FUNCIONES DE LA MEMBRANA CITOPLASMICA PARTICIPACIN EN PROCESOS BIOENERGTICOS

1.3.2 PARTICIPACIN EN BIOSNTESIS DE POLMEROS DE LAS ENVUETAS 1.3.3 PUNTO DE ANCLA'E DEL CROMOSOMA Y DE ALGUNOS PLSMIDOS 1.3.4 1.3.5 2 2.1 2.2 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.4 3 3.1 3.2 3.3 BARRERA SELECTIVA ESPORTACIN DE MOLCULAS DE SUPERFICIE TRANSPORTE DE NUTRIENTES TRANSPORTE PASIVO INESPECFICO O DIFUSIN SIMPLE TRANSPORTE PASIVO ESPECFICO O DIFUSIN FACILITADA TRANSPORTE ACTIVO TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE PROTONES TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE IONES SODIO TRANSPORTE ACTIVO DIRIGIDO POR ATP TRANSPORTE ACOPLADO A TRANSLOCACION DE GRUPOS TRANSPORTE DE HIERRO ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS INTRACITOPLSMICAS MESOSOMAS CROMATFOROS OTRAS INVAGINACIONES

3.4

TILACOIDES

BIBLIOGRAFA ENLACES

1 MEMBRANA CITOPLSMICA
1.1 COMPOSICIN #UMICA
La membrana citopl1smica bacteriana es la estructura de tipo bicapa proteoGlipdica que delimita al protoplasto. 9u proporci n protenas@ lpidos es superior a la de las membranas celulares eucari ticas, llegando a alcan'ar valores relativos de L,@J,.

1.1.1

CARENCIA" EN GENERAL" DE ESTEROLES

Las membranas procari ticas, a diferencia de las de eucariotas, carecen de esteroles 2con las salvedades de #ianobacterias, ciertas bacterias metilotrofas< adem1s, los micoplasmas presentan colesterol, pero lo -secuestran. de las c"lulas eucari ticas a las que parasitan3. Pero en cambio, en muchas bacterias e(iste una peculiar clase de compuestos policclicos, denominados ,opanoides 2triterpenoides pentacclicos3 que parecen condicionar parte de la rigide' de las membranas citopl1smicas. Los hopanoides se sinteti'an a partir del mismo tipo de precursores que los esteroles. 2Por cierto, como dato curioso diremos que los sedimentos de combustibles f siles como el petr leo presentan cantidades gigantescas de hopanoides, lo que confirma el papel que tuvieron las bacterias en su formaci n3.

1.1.2

LPIDOS

0bundan sobre todo los fosfol6pidos derivados del 1cido fosfatdico@ fosfatidiletanolamina fosfatidilglicerol cardiolipina 2difosfatidilglicerol3 En bacterias ;ramGpositivas, adem1s se encuentran glucol6pidos y glucofosfol6pidos. La composici n y proporci n concretas de los distintos tipos de lpidos son variables entre distintas cepas bacterianas, y dentro de cada cepa, en funci n de las condiciones de cultivo 2temperatura, pK, etc.3.

Los 1cidos grasos esterificados con el glicerol en los fosfolpidos son principalmente@ *3 saturados, como p. ej.@ a3 palmtico 2*?@,3 b3 mirstico 2*F@,3 c3 de cadena ramificada 2muy frecuentes en muchas bacterias ;ramGpositivas3 J3 monoinsaturados 2sobre todo en ;ramGnegativas3, como p. ej.@ a3 palmitoleico 2cisG=, *?@*3 b3 cisGvacc"nico 2cisG**, *L@*3 0 diferencia de eucariotas, no e(isten 1cidos grasos poliinsaturados, con la e(cepci n de las #ianobacterias. Este grupo de bacterias fotosint"ticas tiene, adem1s, la capacidad de modificar mediante desaturasas el grado de saturaci n de sus 1cidos grasos, lo que representa un mecanismo adaptativo frente a cambios de temperatura. Las bacterias pueden modificar la proporcin entre %cidos grasos insaturados ( saturados, con objeto de mantener un estado de fluide' adecuado en la membrana, como adaptaci n a cambios de temperatura@ a altas temperaturas, aumenta la proporci n de 1cidos grasos saturados, a bajas, aumenta la de los insaturados. Las bacterias psicr filas 2amantes del fro3 presentan casi todos sus 1cidos grasos de tipo insaturado. En 0rqueas, en lugar de los habituales lpidos a base de "steres de 1cidos grasos con glicerol, e(isten l6pidos a #ase de teres de alco,oles de cadena larga con glicerol 2p. ej., difitanilGglicerolGdi"teres3. Los alcoholes suelen ser derivados poliisoprenoides. Este tipo de membranas son m1s rgidas que las de eubacterias. &ncluso e(isten arqueas con membranas a partir de tetrafitanilGdiglicerolGtetra"tereres, que consituyen bicapas monomoleculares. #omo ya vimos en el tema anterior, la membrana citopl1smica alberga un transportador lipdico de tipo politerpenoide, llamado undecaprenil=fosfato, presente en pequea cantidad 2g*W3. &gualmente se dan -uinonas isoprenoides 2como la menaquinona o la ubiquinona3 que, como veremos en otro captulo, participan en cadenas de transporte de electrones. En algunas bacterias e(isten igualmente variedades de pigmentos carotenoides.

1.1.3

PROTENAS

#onstituyen la mayor parte de la membrana bacteriana 2hasta el L,W en peso seco3. E(iste una gran variedad de tipos de protenas en una misma bacteria 2hasta J,,3, pero la composici n y proporci n concreta vara seg!n las condiciones de cultivo. 9eg!n su locali'aci n en la membrana, y su grado de uni n con la porci n lipdica, se distingue entre@ prote6nas integrales de mem#rana 12endoprote6nas3@ son protenas estrechamente unidas a la membrana, por lo general atravesadas en plena bicapa lipdica. 9on difciles de e(traer, teni"ndose que recurrir a detergentes y]o disolventes org1nicos para separarlas respecto de los lpidos. Las protenas integrales pueden despla'arse lateralmente en la bicapa lipdica, pero no son capaces de rotar, por lo que siempre presentan una determinada orientaci n o polaridad. 0lgunas presentan hidratos de carbono que sobresalen hacia la superficie e(terna 2glucoprotenas3. Prote6nas perifricas 12 epiprote6nas3@ unidas a la superficie de la membrana, de forma m1s d"bil, por lo que son m1s f1ciles de e(traer y purificar. &ncluso algunas establecen contactos s lo transitorios con la membrana.

1.2 ESTRUCTURA

+todos de o#servacin ( estudio 0 microscopio ptico, se recurre a la tinci n con 0'ul %ictoria. 0 microscopio electr nico, en cortes ultrafinos, se observan una estructura de unos > nm de grosor, con dos capas e(ternas densas a los electrones limitando una capa central transparente. Los estudios mediante difracci n de rayos $ y de resonancia magn"tica nuclear 2/M:3 demuestran una estructuraci n b1sica a base de cadenas de fosfolpidos en una bicapa, seg!n se describe a continuaci n. Estructura #onsiste en una bicapa lipdica, con los grupos polares 2hidr filos3 hacia afuera, y las cadenas hidrof bicas de 1cidos grasos 2o, en el caso de 0rqueobacterias, de alcoholes3 hacia adentro, ajust1ndose al modelo de mosaico fluido de 9inger y :icholson. &nmersas en esta bicapa se encuentran las abundantes protenas, que pueden moverse lateralmente en el mosaico de mol"culas de lpidos, igualmente dotados de una r1pida movilidad. Parece ser que no e(iste movilidad de lpidos entre las dos capas. La membrana citopl1smica es asim"trica 2aunque no tanto como la membrana e(terna de ;ramGnegativas3. Esto se traduce en el hecho de que muchos de los procesos que tienen lugar en la membrana sean vectoriales 2tengan una direcci n determinada3.

1.3 FUNCIONES DE LA MEMBRANA CITOPLASMICA

La membrana citopl1smica de los procariotas es una notable estructura multifuncional 2como uno podra esperar de la constataci n del gran n!mero de tipos de protenas3, siendo el sitio donde se producen muchos procesos metab licos complejos, en un grado desconocido en el resto del mundo vivo. #itemos brevemente las principales funciones de la membrana procari tica 2aunque en este y otros temas las estudiaremos en detalle3@ Darrera osmtica 2que mantiene constante el medio interno3, impidiendo el paso libre de sales y de compuestos org1nicos polares Es el l6mite meta#licamente activo de la clula@ establece la frontera entre el protoplasto y el medio e(terno, impidiendo la p"rdida de metabolitos y macromol"culas del protoplasto. 0hora bien, merced a sistemas de transporte, permite selectivamente el paso de sustancias entre el e(terior y el interior 2y viceversa3. &nterviene, adem1s, en procesos #ioenergticos 2fotosntesis, respiraci n3 Participa en la #ios6ntesis de componentes de mem#rana5 de pared ( de c%psulas, En la secrecin de prote6nas.

)esglosaremos brevemente estos diversos tipos de papeles de la membrana.

1.3.1

PARTICIPACIN EN PROCESOS BIOENERGTICOS

#ontiene todos los componentes requeridos para la transducci n de energa y la producci n de 04P, por procesos respiratorios. En el caso de una bacteria quimiotrofa, esto incluye@ deshidrogenasas cadenas de transporte de electrones 2con quinonas, citocromos, etc.3 04PGasas 204P sintasas]hidrolasas3 0lgunas bacterias fotosint"ticas anaerobias tambi"n incluyen este tipo de componentes en la membrana citopl1smica. En un captulo posterior veremos en m1s detalle c mo e(plica la teora quimiosm tica de Mitchell el acoplamiento entre el funcionamiento de las cadenas de transporte electr nico 2o de la 04PGhidrolasa3 y la generaci n de un gradiente de protones a trav"s de la membrana 2potencial electroqumico o fuer'a prot nGmotri'3, el cual a su ve' puede@ generar 04P 2desarrollo de un trabajo qumico3 promover transporte de ciertos nutrientes 2trabajo osm tico3 promover movimiento flagelar 2trabajo mec1nico3.

1.3.2 PARTICIPACIN EN BIOSNTESIS DE POLMEROS DE LAS ENVUETAS

#omo ya hemos visto en temas anteriores, la membrana alberga transportadores 2como el undecaprenilGP3 y en'imas relacionados con fases de la biosntesis de polisac1ridos de la c1psula, peptidoglucano, 1cidos teicoicos y teicur nicos y lipopolisac1rido. &gualmente en ella se locali'an los en'imas implicados en la sntesis de los lpidos de la propia membrana.

1.3.3 PUNTO DE ANCLA'E DEL CROMOSOMA Y DE ALGUNOS PLSMIDOS

#omo veremos, sigue estando debatido si un tipo de invaginaci n de la membrana, llamado mesosoma 2ver m1s adelante, en este captulo, apartado D.*3 es o no un artefacto, pero parece fuera de duda que el cromosoma se ancla de alguna manera a la cara interna de la membrana 2sea a los mesosomas, o como proponen otros, a la cara interna de los anillos peris"pticos3. En la 'ona de anclaje parecen residir algunos de los en'imas encargado de la replicaci n. La membrana tiene igualmente un papel en la separaci n 2segregaci n3 de las dos copias del cromosoma replicado a las c"lulas hijas.

1.3.4

BARRERA SELECTIVA

Mantiene la constancia del medio interno 2impidiendo la salida de iones, metabolitos y macromol"culas3, pero simult1neamente permite o promueve activamente la entrada de nutrientes ( la salida de los productos de desec,o o de ciertas molculas e$cretadas. La funci n de transporte de nutrientes ser1 tratada en detalle m1s adelante en este captulo.

1.3.5

EEPORTACIN DE MOLCULAS DE SUPERFICIE

9e trata de un sistema por el que ciertas protenas son trasladadas a su locali'aci n definitiva en la membrana citopl1smica, por la intervenci n de la protena Iid#, que interacciona con 'onas hidrof bicas de aquellas. On ejemplo de protenas insertadas de este modo lo constituye la 04PGsintasa de eubacterias. Este sistema, al parecer filogen"ticamente primitivo, aparece en eubacterias, parte de arqueas 2euriarqueas3 y en mitocondrias 2donde se denomina 5(a*3 y cloroplastos 20lbD3, pero no en eucariotas.
2> SISTEMA S,*

El sistema 9ec es un sistema universal para la secreci n de protenas, es decir, aparece en los tres dominios de la vida, aunque con variantes en cada uno de ellos. :osotros vamos a describir el caso de las eubacterias. Las protenas secretadas se sinteti'an como preGprotenas dotadas en el e(tremo :G terminal de un p"ptido seal, de unos J,GD, amino1cidos. )icha 'ona consta a su ve' de un e(tremo :Gterminal cargado positivamente, seguida de un trecho hidrof bico, y termina con una 'ona m1s polar dotada al final del sitio que va a ser roto por la peptidasa del lder. #uando a!n est1 en el citoplasma, la preGprotena naciente se une a la protena 9ec6 2una chaperona especfica de esta ruta3, la cual impide que la preGprotena se pliegue totalmente. La protena 9ec0, que forma un homodmero, reconoce el complejo 9ec6Gpreprotena, y lo traslada al complejo de protenas de membrana 9ecIE;, que tiene un canal interior de unos J,GD, h. 20l parecer el canal consta de DGF complejos 9ecIE;3. 0hora, la protena 9ec0, con gasto de 04P, logra que los primeros J,GD, amino1cidos de la preGprotena entren a trav"s del canal 9ec, con lo que el p"ptido seal aparece por el lado e(terior de la membrana. Ona ve' que el p"ptido seal asoma por el otro lado de la membrana, es cortado en el sitio especfico por la peptidasa lder, lo que ayuda a liberar al e(terior la parte madura de la protena secretada.
3> SISTEMA SRP

El sistema 9/P procari tico es mucho m1s sencillo que el hom logo 9/P que se encuentra en la membrana del retculo endopl1smico de eucariotas. En este sistema, el e(tremo :G terminal de la protena naciente es reconocido por la partcula de reconocimiento de seal, conocida por sus siglas 9/P. La 9/P eubacteriana consta de un pequeo 0/: y una protena 2Hfh3.

Ona ve' que la 9/P reconoce el e(tremo :Gterminal de la protena naciente, parece que provoca la detenci n moment1nea de la traducci n, y conduce a esa protena naciente hasta el receptor de la partcula 9/P 29/3, a nivel de membrana citopl1smica. 0 su ve' esto provoca la interacci n del p"ptido naciente con el complejo 9ec, que ser1 el que logre la secreci n o inserci n en membrana de la protena madura.
4> SISTEMA T/8

Este sistema se ha empe'ado a caracteri'ar recientemente, y solo se ha descubierto en procariotas y en cloroplastos, pero no en mitocondrias ni en eucariotas. 9e caracteri'a por trasladar al e(terior 2o al espacio peripl1smico de ;ramGnegativas3 protenas ya en su con,iguraci.n nativa, y en su caso, dotadas ya de sus cofactores 2grupos He9, molibdopterina, cofactores nucleotdicos, etc.3. Es decir, a diferencia de los anteriores, las protenas se pliegan ]y en su caso adquieren los cofactores3 antes de ser trasladadas. Este sistema se llama 4at debido a que reconoce una secuencia seal en la que e(isten dos argininas -gemelas. 2una a continuaci n de otra, <t=in arginine transport3. #onsta de al menos tres tipos de protenas de membrana@ 4at0, 4at6 y 4at#. %arias unidades de 4at0 atraviesan la membrana formando una empali'ada que deja un gran canal de unos ?, h. # mo se logra el transporte a trav"s de este gran agujero en la membrana sin que se pierda su capacidad de barrera selectiva es una -ha'aa. que se est1 investigando.

2 TRANSPORTE DE NUTRIENTES
Lo primero que tiene que hacer un microorganismo a la hora de su nutrici n es captar los nutrientes que necesite desde el medio e(terior. )ebido a que la bicapapa lipdica act!a como barrera que impide el paso de la mayor parte de las sustancias, esto significa que deben e(istir mecanismos especficos para lograr la entrada de los nutrientes. 0dem1s, teniendo en cuenta que las bacterias suelen vivir en medios diluidos, deben reali'ar un -trabajo. para trasladar muchos de esos nutrientes en contra del gradiente de concentraci n. 4radicionalmente se viene considerando tres m"todos principales de transporte de sustancias a trav"s de la membrana@ transporte pasivo inespecfico 2X difusi n simple3< transporte pasivo especfico 2X difusi n facilitada3< transporte activo. #omo veremos, los m1s importantes en procariotas son los sistemas de transporte activo.

2.1 TRANSPORTE PASIVO INESPECFICO O DIFUSIN SIMPLE

Este transporte consiste en la difusi n pasiva de ciertas sustancias para las que la membrana es impermeable, debido a la diferencia de concentraci n 2#3 a ambos lados de

dicha membrana 2la sustancia tiene mayor concentraci n fuera que dentro de la c"lula3. 0parte de esta diferencia de concentraci n, en la difusi n pasiva influyen@ la constante de permeabilidad 2P3, es decir, el grado de permeabilidad de la membrana a la sustancia en cuesti n< el 1rea o superficie total 203 a trav"s de la que se produce el transporte. Las membranas citopl1smicas son impermeables en s mismas a la mayor parte de las mol"culas. 9 lo se da en el caso de 5J, #5J, :KD, agua y otras pequeas sustancias polares no ioni'adas. La difusi n simple se produce por el paso de estas sustancias a trav"s de poros inespecficos de la membrana citopl1smica.

2.2 TRANSPORTE PASIVO ESPECFICO O DIFUSIN FACILITADA

Es un proceso que permite el paso de compuestos por difusi n a trav"s de transportadores estereoespecficos y 2al igual que en el caso anterior3 sobre la base de un gradiente de concentraci n 2en la direcci n termodin1micamente favorable3. El transportador suele ser una protena integral de membrana 2permeasa o facilitador3, cuya conformaci n determina un canal interior, y por el cual un determinado sustrato puede alcan'ar el interior, sin gasto de energa. 9e piensa que cuando el soluto se une a la parte de la permeasa que da al e(terior, esta protena sufre un cambio conformacional que libera la mol"cula en el interior. #omo al entrar la mol"cula, enseguida entra en el metabolismo y desaparece como tal, esto basta para mantener el gradiente de concentraci n que permite esta difusi n. La difusi n facilitada e(hibe propiedades similares a las de las reacciones en'im1ticas@ Especificidad de sustrato@ cada permeasa transporte un solo tipo de sustratos qumicamente parecidos. #in"tica de saturaci n de tipo MichaelisGMenten, es decir, la velocidad de transporte aumenta con la concentraci n de sustrato, hasta un valor lmite 2%ma(3 por encima del cual ulteriores aumentos del soluto no aumentan dicha velocidad 2debido a que todas las porinas disponibles est1n ya totalmente ocupadas3@ %elocidad de entrada@ %ent X %m1( i j9e(tk ]7m c j9e(tk %elocidad de salida@ %sal X %m1( i j9intk ]7m c j9intk 0unque este sistema de transporte es muy com!n en eucariotas, es muy raro encontrarlo en bacterias. La e(plicaci n evolutiva es que los procariotas suelen vivir en ambientes con pocas concentraciones de nutrientes, y por lo tanto no es frecuente que se den gradientes adecuados. Ona de las pocas e(cepciones la constituye el glicerol, que es

transportado por difusi n facilitada en una amplia gama de bacterias, tanto ;ramGpositivas como ;ramGnegativas. #onforme el glicerol entra, es r1pidamente convertido a glicerolG fosfato< por lo tanto, la concentraci n interna de glicerol como tal es pr1cticamente nula, lo que facilita esta difusi n incluso a bajas concentraciones e(teriores de esta sustancia. En >ymomonas e(iste un facilitador de membrana que transporta glucosa.

2.3 TRANSPORTE ACTIVO

#onsiste en el transporte de sustancias en contra de un gradiente de concentracin, lo que requiere un gasto energtico. En la mayor parte de los casos este transporte activo 2que supone un trabajo osm tico3 se reali'a a e$pensas de un gradiente de NO 1potencial electro-u6mico de protones3 previamente creado a ambos lados de la membrana, por procesos de respiraci n y fotosntesis< por hidr lisis de AEP. Los sistemas de transporte activo son los m1s abundantes entre las bacterias, y se han seleccionado evolutivamente debido a que en sus medios naturales la mayora de los procariotas se encuentran de forma permanente o transitoria con una baja concentraci n de nutrientes.

Los sistemas de transporte activo est1n basados en permeasas especficas e induci#les. El modo en que se acopla la energa metab lica con el transporte del soluto a!n no est1 dilucidado, pero en general se maneja la hip tesis de que las permeasas, una ve' captado el sustrato con gran afinidad, e(perimentan un cambio conformacional dependiente de energa que les hace perder dicha afinidad, lo que supone la liberaci n de la sustancia al interior celular. Estudiaremos los siguientes tipos de transporte activo@ transporte activo ligado a simporte de protones< transporte activo ligado a simporte de iones :ac transporte activo dirigido por 04P transporte acoplado a translocaci n de grupos.

2.3.1

TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE PROTONES

#omo se recordar1, el simporte se puede definir como el transporte simult1neo de dos sustratos en la misma direcci n, por un mismo transportador sencillo. En el caso del transporte activo ligado a simporte de protones, lo que ocurre es que uno de los sustratos 2Kc3 ha creado previamente un gradiente de concentraci n, cuya disipaci n es aprovechada por el otro sustrato para entrar con "l. Este otro sustrato puede ser@ una mol"cula de carga negativa@ en este caso, su simporte ligado a protones tiende a disipar s lo el gradiente de concentraci n. Ejemplos@ transporte de iones fosfato, de glutamato, etc. una mol"cula neutra@ en este caso, su simporte tiende a disipar no s lo el gradiente de concentraci n, sino tambi"n el gradiente el"ctrico. Ejemplo@ en )scherichia coli, la lactosa usa una `Ggalact sidoGpermeasa, que es una de las permeasas bacterianas m1s intensamente estudiadas. Por otro lado, ciertas mol"culas cati nicas 2iones 7c, lisina3, son transportadas directamente a trav"s de permeasas, en ausencia de simporte de protones.

2.3.2 TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE IONES SODIO

9e puede considerar una versi n modificada del anterior@ algunas sustancias no son transportadas activamente de forma directa por el potencial electroqumico de protones, sino indirectamente, a trav"s de un gradiente de :ac que a su ve' se origina a e(pensas de dicha fuer'a prot nGmotri' 2fpm3. El sustrato entra por una permeasa, junto con iones :ac, pero a su ve' este sodio se recicla por un sistema de antiporte, a e(pensas de la disipaci n del potencial de protones. Ejemplo@ el a'!car melibiosa, en el caso de la enterobacteria ). coli.

Estos dos tipos de transporte activo ligados a simporte quedan inhibidos si tratamos las c"lulas con alg!n agente ionforo 2p. ej., el antibi tico valinomicina3, que destruye el potencial electroqumico de protones. El transporte activo ligado a simporte de iones 2Kc, :ac3 resulta muy econ mico, ya que s lo se gasta un prot n por cada mol"cula transportada, mientras que por cada 04P sinteti'ado se suelen gastar D protones que se disipan en las 04Pasas. Las permeasas que reali'an este transporte suelen ser protenas integrales de membrana provistas de unos *J segmentos transmembranosos en configuraci n de Gh"lice.

2.3.3

TRANSPORTE ACTIVO DIRIGIDO POR ATP

El tipo paradigm1tico de este tipo de transporte se denomina de transportadores AD4 o AEPasas de tr%fico, y se conocen muchos ejemplos en eubacterias y arqueas. %amos a describir el caso de un sistema 06# en enterobacterias 2como ). coli3. 9e trata de un sistema de varios componentes, en el que e(isten protenas peripl1smicas que captan el sustrato con gran afinidad, y lo llevan hasta unas protenas de membrana, las cuales acoplan el paso de dicho sustrato hasta el citoplasma 2sin alteralo qumicamente3 con la hidr lisis de 04P.
L0 ;.*,9-*05-A* ;. N+60*78,6+0;,6.7 ABCN 7. ;.G. 0 @1. .* +,;,7 .::,7 .J-7+. 1*0 , ;,7 86,+.F*07 8.6-<H6-507 ;. 9.9G60*0 5-+,8:K79-50 @1. 8,7..* 1* ;,9-*-, =;. 1*,7 2&& 09-*,K5-;,7? 5,*7.6/0;, ./,:1+-/09.*+." ;.*,9-*0;, N5077.++. ;. 1*-A* 0 ATPN =:07 -*-5-0:.7 ;. ATP>G-*;-*B 5077.++. B.*.60* :0 7-B:0 NABCN?. A: 806.5.6 .7+. ;,9-*-, ABC 5,*7.6/0;, .7 91C 0*+-B1," C 806.5. @1. C0 .J-7+F0 0*+.7 ;. :0 ;-/.6B.*5-0 ./,:1+-/0 .*+6. 86,506-,+07 C .1506-,+07. EJ-7+.* 9153,7 .E.98:,7 ;. 86,+.F*07 ABC" +0*+, .* 86,506-,+07 5,9, .1506-,+07 =;. 3.53, 5,*7+-+1C.* :0 90C,6 <09-:-0 ;. 86,+.F*07 <-:,B.*H+-509.*+. 6.:05-,*0;07 ;. +,;, .: 91*;, /-/,?. L,7 86-9.6,7 .E.98:,7 ;. .7+0 B60* <09-:-0 .7+0G0* -98:-50;,7 .* +60*78,6+06 717+0*5-07 0 1*, 1 ,+6, :0;, ;. :0 9.9G60*0. E* ,+6, +.90 /.6.9,7 .E.98:,7 ;. +60*78,6+0;,6.7 ABC @1. <1*5-,*0* N0: 6./H7N ;. :,7 ;. .7+. +.90( 7,* N.J8,6+0;,6.7N ;. 86,+.F*07 6.5-H* 7-*+.+-D0;07 @1. ;.G.* -*7.6+067. .* :07 .*/1.:+07 G05+.6-0*07 , 7.6 .J56.+0;07 0: 9.;-,. P.6, 7. 30 ;.751G-.6+, @1. :0 B60* <09-:-0 ;. 86,+.F*07 ABC .7+K -98:-50;0 .* ,+6,7 86,5.7,7 =6.B1:05-A* B.*H+-50" 6.80605-A* ;. ADN" 80+,B.*-5-;0;" .+5?.

Elementos de este tipo de sistema* Porinas u otras protenas de membrana e(terna para lograr la difusi n del sustrato desde el medio hasta el espacio peripl1smico. Protena2s3 solubles de espacio peripl1smico que se unen al sustrato con gran afinidad. On heterodmero formado por dos protenas integrales de membrana 2cada una de ellas posee + o ? trechos en Gh"lice que atraviesan la membrana citopl1smica3, que son la permeasa propiamente dicha del sistema 2el canal por donde pasa el sustrato3. )os protenas perif"ricas de membrana citopl1smica, adosadas al lado citopl1smico, que incluyen el m dulo conservado 06# que acopla la hidr lisis de 04P con el transporte unidireccional del sustrato a trav"s de la membrana. +odelo del mecanismo de este sistema*

*. El sustrato e( geno normalmente entra al periplasma a trav"s de alg!n canal inespecfico o porina de membrana e(terna 2por ejemplo, en enterobacterias se pueden usar las porinas generales conocidas como 5mpH y 5mp#3. J. La protena peripl1smica especfica, antes de su uni n al sustrato tiene una determinada configuraci n 2denominada -abierta.3, con dos grandes l bulos globulares unidos formando un 1ngulo 2la forma recuerda una almeja a medio abrir3. #uando el sustrato pasa al periplasma, la correspondiente protena de uni n peripl1smica se une a "l con gran afinidad 2,.*G* M3, y al unirse cambia de conformaci n. En esta configuraci n, llamada -cerrada., el sustrato se encuentra -enterrado. entre los dos l bulos de la protena 2-almeja cerrada.3. D. Mientras tanto, el dmero de protenas integrales de membrana 2antes de la uni n con la protena peripl1smica3 se encuentra en un estado energi'ado pero incapa' de transportar sustrato. En esta situaci n, puede unirse 2por la parte que da al periplasma3 al complejo formado por la protena peripl1smica 2en configuraci n -cerrada.3 ligada al sustrato. 0l hacer esto, el heterodmero de membrana cambia de conformaci n, de modo que ahora muestra mayor afinidad hacia la protena peripl1smica y se abre su canal para dejar entrar el sustrato. F. Entonces, el complejo de membrana alcan'a su estado de mnima energa, y con ello descarga el sustrato en el citoplasma y se logra la separaci n de la protena peripl1smica 2que vuelve a su configuraci n -abierta.3. +. Hinalmente, la hidr lisis de 04P catali'ada por las protenas perif"ricas 06# 2adosadas a la membrana y asociadas a las protenas integrales3 suministra la energa para que el heterodmero de membrana vuelva a su estado energi'ado inicial, preparado as para otro ciclo de transporte.

E: 7-7+.90 ABC ;. G05+.6-07 G609>*.B0+-/07" @1.;0 81.7+, ;. 90*-<-.7+, 510*;, :, -98.;-9,7 8,6 0:BT* 86,5.;-9-.*+, @1. 0:+.6. , .:-9-*. :0 9.9G60*0 .J+.6*0 =5,*/.67-A* 0 .7<.6,8:07+,7?( P,6 .E.98:,( +60+.9,7 E. coli 5,* .: @1.:0*+. EDTA .* 1*0 7,:15-A* +098,*0;0 -7,+A*-50 =5,* 1* 2&U ;. 70506,70?. C.*+6-<1B09,7 C .: 7.;-9.*+, ;. 5H:1:07 :, 6.7178.*;.9,7 .* 1*0 7,:15-A* ;. MBC:2 .* <6F, =&VC?. E: 6.71:+0;, .7 @1. :07 86,+.F*07 ;.: 8.6-8:0790 .75080* 0: 9.;-, .J+.6*,. E7+, .7 1* 507, ;. +60+09-.*+, 8,6 *J-6), -01F84*@1. ,6-B-*0 8H6;-;0 ;. 5,*+.*-;,7 ;.: 8.6-8:0790. S. 5,9861.G0 @1. 5-.6+,7 7-7+.907 ;. +60*78,6+. @1.;0* -*1+-:-D0;,7" ;.G-;, 0 @1. 6.@1-.6.* 8060 71 <1*5-,*09-.*+," /1K3 5, .:-8,@3/0 5, 1,19:/3/ *48-.+A014*/" -8:/0 ,0.,*@?4*/0 5,+ ,0./*4- .,:4.+A014*-. P,6 5,*+60" .7+. 7-7+.90 *, 7. /. 0<.5+0;, 8,6 :,7 0B.*+.7 -,*A<,6,7. P,6 .7+0 60DA*" 0 .7+. 7-7+.90 .* G609>*.B0+-/07 7. :. 30 ::090;, ;160*+. 9153, +-.98, ;8:/30.-:8, /*84H0,3049+, / *J-6), -01F84*-<.

Los sistemas 06# de bacterias ;ramGpositivas est1n menos estudiados, pero en general se parecen a los de ;ramGnegativas, salvo que carecen del transportador libre peripl1smico. En su lugar e(iste una protena con funciones equivalentes 2captar el nutriente del e(terior3, pero que est1 anclada al lado e(terno de la membrana citopl1smica, cerca del heterodmero integral de membrana 2la uni n es mediante su cistena :Gterminal, que se une a un fosfolpido3. E(isten muchos ejemplos de transportadores procari ticos de tipo 06#, y cada uno de ellos est1 especiali'ado en transportar un sustrato especfico o varios sustratos parecidos. Ejemplo de sustratos transportados de esta forma@ Monosac1ridos como arabinosa, galactosa, maltosa, ribosa, (ilosa, etc. 5ligosac1ridos &ones org1nicos e inorg1nicos 0mino1cidos como histidina, glicina, leucina, etc. 5ligop"ptidos

0lgunas vitaminas y metales. 9ider foros con hierro

2.3.4

TRANSPORTE ACOPLADO A TRANSLOCACION DE GRUPOS

Es un sistema de transporte que acopla la entrada del sustrato con su modificaci n qumica por uni n covalente con un grupo qumico. Estrictamente hablando, no es un transporte activo, porque no funciona en contra de un gradiente de concentraci n, pero se considera de hecho como activo, ya que la concentraci n del sustrato modi,icado dentro de la c"lula supera con creces a la del sustrato sin modi,icar en el e(terior. Este sistema supone un ahorro de energa metab lica@ aunque en el transporte se gasta un enlace rico en energa, el sustrato queda modificado en su paso a trav"s de la membrana en la forma que la bacteria emplea como primer intermediario de su ruta metab lica. Es decir, con un solo proceso se cumplen dos funciones distintas@ transporte y preparaci n qumica para la ruta, que de todas formas habra que reali'ar. :o es de e(traar que este tipo de transporte haya sido seleccionado frecuentemente en la evoluci n bacteriana, y que hoy lo encontremos en muchos procariotas, especialmente en bacterias anaerobias o aerobias facultativas que recurren a fermentaciones 2recordar que las fermentaciones tienen un rendimiento energ"tico menor que los procesos respiratorios< por lo tanto, es -l gico. que se seleccionen mecanismos ahorradores como el descrito3. El caso mejor estudiado de esta clase de transporte lo constituye el llamado sistema de fosfotransferasa de a!Acares 2seg!n las casi inevitables iniciales inglesas@ P493. En ). coli el sistema P49 permite el transporte de glucosa, manosa, fructosa y los polioles sorbitol y manitol. #onsta de varios componentes que funcionan como una cadena de transportadores del grupo fosfato de alta energa del fosfoenolpir!vico 2PEP3 hasta el a'!car a transportar en cuesti n. Las dos primeras protenas son inespecficas respecto del a'!car 2son comunes a los diversos sustratos a transportar3, tienen locali!acin citopl%smica y su s6ntesis es constitutiva. 9e conocen como En'imaG& 2E&3 KPr 2esta !ltima es una pequea protena termoestable, rica en histidina3. El otro componente, llamado En'ima && 2E&&3 es espec6fico de cada a!Acar, y su sntesis es induci#le por el correspondiente sustrato@ 9uele estar compuesto por tres subunidades o dominios@ E&&0 2hasta hace poco llamado E&&&3 es citopl1smico y soluble< E&&6 es un dominio perif"rico de membrana@ aunque es hidr filo, se liga al lado citopl1smico de la membrana a trav"s de E&&#. E&&# es una protena integral de membrana

%eamos c mo funciona el sistema@ *. Por un lado, el a'!car se une al en'ima E&&# especfico, pero "ste por s mismo no puede liberar al a'!car sin modificar en el interior celular. J. Mientras tanto, la E& catali'a 2en presencia de Mgcc3 la transferencia del fosfato de alta energa del PEP a la KPr. D. La KPr fosforilada 2KPrGP3 transfiere el fosfato al en'ima &&0 especfico del a'!car jp. ej., la glucosa 2E&&0;lc 3 o el manitol 2E&&0Mtl3k. F. La E&&0GP r1pidamente, y en presencia de Mgcc, transfiere el fosfato a la en'imaG&&6 especfica con la que se asocia 2p. ej., E&&6;lc3, que a su ve' fosforila el a'!car 2en el caso de la glucosa convirti"ndola en glucosaG?GP3@ en este momento la E&&# pierde su afinidad por el a'!car modificado, que de esta forma entra en el citoplasma, preparado ya para actuar como sustrato de la primera reacci n del catabolismo de este a'!car. 5tros ejemplos de transporte acoplado a translocaci n de grupos@ Entrada de 1cidos grasos mediante un sistema de transferencia de #oen'ima 0, que los transforma en acilG#o0. Entrada de purinas y pirimidinas, mediante un sistema de fosforribosilGtransferasas@ purina o pirimidina 2e(terior3 c P/PP :MP 2interior3 c P 2P/PP X fosforribosilGpirofosfato3 2:MP X nucle sido monofosfato3 En bacterias es frecuente encontrar varios sistemas de transporte para un mismo nutriente 2p. ej., )scherichia coli posee cinco sistemas para transportar la galactosa y tres sistemas para algunos de los amino1cidos. Los diversos sistemas se diferencian en cuanto a su requerimiento energ"tico, su afinidad, su regulaci n, etc. L gicamente, la evoluci n ha debido seleccionar esta redundancia de sistemas de transporte con objeto de permitir que el microorganismo sobreviva bajo diversas circunstancias ambientales.

2.4 TRANSPORTE DE HIERRO

El hierro es un cofactor de muchas en'imas y citocromos, por lo que las bacterias necesitan captarlo. La captaci n de hierro se complica porque el i n f"rrico 2HeDc3 es muy insoluble. 0dem1s, las bacterias que viven dentro de animales superiores tienen un problema@ en los fluidos y tejidos de sus patrones el hierro libre es muy poco abundante 2el hierro suele estar acomplejado con protenas3, por lo que se vuelve vital aprovisionarse con este elemento de alguna manera.

Muchas bacterias secretan unas mol"culas de bajo peso molecular llamadas en general siderforos, que son capaces de formar quelatos 2complejos3 con el hierro f"rrico. Por ejemplo, )scherichia coli secreta un sider foro llamado enterobactina. #uando la enterobactina se une al hierro, forma un complejo octa"drico, que luego se engar'a con un receptor especfico de la membrana e(terna, tras lo que el hierro se libera al espacio peripl1smico, desde donde entra al citoplasma por medio de una protena de uni n peripl1smica acoplada a un sistema 06# similar al visto m1s arriba.

3 ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS INTRACITOPLSMICAS

3.1 MESOSOMAS
9on estructuras membranosas intracitopl1smicas que se observan en la mayor parte de las bacterias, constituidas por invaginaciones de la membrana citopl1smica. #servacin@ 0 microscopio ptico se pueden detectar con tinci n negativa con 1cido fosfot!ngstico. 0 microscopio electr nico se observa que, por lo general, el mesosoma se ubica en determinadas locali'aciones@ sitios donde se inicia la divisi n celular< tabiques transversales en crecimiento 2incluyendo los que delimitan el compartimento de la endospora3< 'onas cercanas a los nucleoides 2cuerpos nucleares3. )esde hace mucho tiempo se viene discutiendo si los mesosomas son en realidad estructuras aut"nticas de la bacteria, o como dicen otros, meros artefactos de las t"cnicas microsc picas empleadas. El debate a!n no est1 apagado, seg!n algunos destacados microbi logos. Estructura ( composicin@ Los mesosomas m1s caractersticos y patentes son los de bacterias ;ramGpositivas. 9u aspecto al microscopio electr nico es el de repetidas invaginaciones de la membrana@ una invaginaci n primaria en forma de s1culo irregular, de la que surge una invaginaci n secundaria, llamada t!bulo mesos mico, que rellena el hueco de la invaginaci n primaria. El t!bulo mesos mico suele consistir en un conjunto de pequeas vesculas arrosariadas, o t!bulos, conectados entre s, a veces con aspecto de cebolla. Los mesosomas de ;ramGnegativas son menos conspicuos y menos complejos@ se manifiestan como pequeas invaginaciones de la membrana, con forma laminar o a base de tubos dispuestos de forma verticilada. 'unciones@ La porci n de membrana del mesosoma correspondiente a la invaginaci n primaria 2pero no as a la secundaria3 posee una composici n semejante a la de la membrana

citopl1smica, por lo que se le pueden aplicar los papeles que ya hemos estudiado 2transporte de electrones, sntesis de componentes de las envueltas...3. Probable papel en la sntesis del septo transversal, qui'1 regulando las autolisinas implicadas en la divisi n celular 2v"ase tema +bis3. Puntos de anclaje del cromosoma bacteriano 2y qui'1 de algunos pl1smidos3, actuando en la segregaci n de los cromosomas hijos a las c"lulas hermanas 2y en el caso de las bacterias esporuladas, en la segregaci n de los cromosomas a los compartimentos de la c"lula madre 2esporangio3 y de la preespora. Qonas de secreci n de ciertas e(oen'imas 2p. ej., penicilinasa en Bacillus3.

3.2 CROMATFOROS
9on invaginaciones de la membrana citopl1smica de las bacterias purp!reas 2un grupo de bacterias fotosint"ticas ano(ig"nicas3 que albergan su aparato fotosint"tico. )ependiendo de las especies, pueden adoptar formas variadas@ 0 modo de vesculas huecas< capas de repliegues conc"ntricos, a modo de l1minas paralelas, cercanas a la membrana citopl1smica< formando t!bulos, aislados o en haces. Los cromat foros suponen obviamente una adaptaci n para aumentar la superficie de membrana !til capa' de reali'ar las funciones propias de la fotosntesis.

3.3 OTRAS INVAGINACIONES

En muchas bacterias quimiolitoautrofas 2especialmente las nitrificantes3 e(isten invaginaciones de la membrana 2a menudo denominadas citomembranas3 que permiten una mayor superficie para la reali'aci n de sus actividades respiratorias. 9us formas y disposiciones son igualmente muy variadas /v0anse ,otomicrogra,7as2. En &'otobacter, una bacteria aerobia fijadora de nitr geno atmosf"rico, y que presenta una altsima tasa respiratoria, se pueden detectar tambi"n invaginaciones de membrana que aumentan la superficie disponible para sus intensos procesos de o(idaci n.

3.4 TILACOIDES
9on sacos membranosos aplastados presentes en las cianobacterias, que no est%n en continuidad con la mem#rana citopl%smica< en su cara e(terna se disponen filas de ficobilisomas /v0ase cap7tulo ?2. El conjunto de membrana tilacoidal c ficobilisomas es el responsable de la fotosntesis o(ig"nica en este grupo de procariotas.

BIBLIOGRAFA

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354*,(
1 CITOPLASMA BACTERIANO( VISIN DE CON'UNTO

MATERIAL GENTICO( EL NUCLEOIDE

2.1 EL CROMOSOMA PROCARIOTA 2.1.1 MTODOS DE OBSERVACIN Y ESTUDIO

2.1.2 COMPOSICIN #UMICA" ESTRUCTURA Y ORGANIQACIN DEL CROMOSOMA 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 PLSMIDOS DEFINICIN Y CONCEPTOS GENERALES FENOTIPOS DETERMINADOS POR LOS PLSMIDOS REPLICACIN DE LOS PLSMIDOS REGULACIN DEL NWMERO DE COPIAS REPARTO DE LAS COPIAS A LAS CLULAS HI'AS

2.2. INCOMPATIBILIDAD ENTRE PLSMIDOS Y GRUPOS DE INCOMPATIBILIDAD 2.3 ELEMENTOS GENTICOS MVILES 2..3.1 2.3.2 3 3.1 3.2 ELEMENTOS TRANSPONIBLES NCLSICOSN NNUEVOSN ELEMENTOS GENTICOS MVILES

RIBOSOMASL SNTESIS Y PLEGAMIENTO DE PROTENAS ESTRUCTURA DEL RIBOSOMA EUBACTERIANO.................................... EL MECANISMO DE LA SNTESIS DE PROTENAS

3.3 EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTENAS( PAPEL DE LAS PROTENAS CELADORAS =ICHAPERONASM? 4 4.1 4.1.1 INCLUSIONES Y ORGNULOS PROCARIOTAS INCLUSIONES DE RESERVA INCLUSIONES POLISACARDICAS

4.1.2 GRNULOS DE POLI>X>HIDROSIBUTRICO =PHB? Y DE POLI> HIDROSIALCANOATOS 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1. 4.2 4.2.1 4.2.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 ENLACES INCLUSIONES DE HIDROCARBUROS GRNULOS DE CIANOFICINA GRNULOS DE POLIFOSFATOS GLBULOS DE AQUFRE OTRAS INCLUSIONES INCLUSIONES DE SALES MINERALES FICOBILISOMAS ORGNULOS PROCARITICOS CITOPLSMICOS CARBOSISOMAS =Y CUERPOS POLIDRICOS? VACUOLAS DE GAS CLOROSOMAS MAGNETOSOMAS

1 CITOPLASMA BACTERIANO( VISIN DE CON'UNTO

El citoplasma bacteriano es la masa de materia viva delimitada por la membrana citopl1smica. En su interior se albergan@ cuerpos nucleares 2nucleoide3< pl1smidos 2no en todas las cepas bacterianas3< ribosomas< inclusiones 2no en todas3< org1nulos 2no en todas3. 0l igual que en los dem1s seres vivos, el citoplasma es un sistema coloidal cuya fase dispersante es agua junto con diversas sustancias en soluci n 2citosol3, y cuya fase

dispersa est1 constituida por macromol"culas y conjuntos supramoleculares 2partculas submicrosc picas3. La viscosidad es mayor que la del citoplasma eucari tico, estando desprovisto de corrientes citopl1smicas. #servacin* 0 microscopa ptica, obviamente es poco lo que se puede distinguir en "l. En las c"lulas j venes se suele teir de modo uniforme, teniendo un car1cter bas filo 2debido a la abundancia de 0/:3. En las c"lulas viejas se tie irregularmente, debido a la aparici n de inclusiones y a la acumulaci n de sustancias de desecho. 0 microscopa electr nica destaca el car1cter granulado, producido por los numerosos ribosomas 2que a los aumentos habituales aparecen como partculas esf"ricas3, aunque se observa una 'ona irregular hacia el centro, m1s transparente a los electrones, que se debe a los cuerpos nucleares 2nucleoide3. En los intersticios entre las partculas granuladas e(iste una sustancia amorfa en la que no se pueden distinguir m1s detalles, y que corresponde a la fase dispersante acuosa de la que habl1bamos m1s arriba. /a nueva visin del citoplasma #acteriano 12MM;3 Los nuevos m"todos citol gicos y moleculares nos est1n dando una nueva visi n en la que el citoplasma bacteriano est1 m1s organi'ado y es m1s din1mico de lo que pens1bamos hasta hace poco. /esumiremos esta nueva imagen@ en el citoplasma bacteriano hay una clara separaci n espacial y funcional entre la 'ona central, donde se locali'a el nucleoide y en la que se da la transcripci n, respecto de la 'ona perif"rica rica en ribosomas, en la que se da la sntesis de protenas. La maquinaria para la replicaci n del cromosoma 2replisoma3 se locali'a en un sitio concreto, hacia el centro de la c"lula, y muy probablemente ligado a la membrana. Por el replisoma fijo va pasando el cromosoma para su replicaci n, empe'ando por el origen ori%. Los cromosomas hijos van siendo despla'ados hacia los polos 2segregaci n3, de modo que conforme avan'a la replicaci n, cada ori% se sit!a cada ve' m1s cerca de un polo celular. La protena HtsQ es hom loga de la tubulina eucari tica, y al comien'o de la divisi n se polimeri'a formando un anillo por debajo de la membrana en el centro de la c"lula. Este anillo parece servir de andamio para el -divisoma., implicado en la formaci n del septo transversal que conduce al nacimiento de las dos c"lulas hijas. Kay una protena hom loga de la actina, que se polimeri'a formando amplias h"lices que recorren la c"lula de polo a polo, y que junto con el peptidoglucano, determina la forma celular 9e han descubierto protenas que oscilan r1pida y continuamente de un e(tremo a otro de la c"lula 2en cuesti n de segundos3, y que parecen implicadas en la regulaci n del ciclo celular.

En resumidas cuentas, hoy sabemos que el citoplasma procari tico es m1s din1mico, estructurado y complejo que lo que creamos hace unos pocos aos. GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG En este captulo nos dedicaremos al estudio de las principales estructuras y macromol"culas que alberga el citoplasma. #omen'aremos con la organi'aci n a gran escala del material gen"tico bacteriano, seguiremos con una r1pida revisi n sobre los

ribosomas y la sntesis y plegamiento de las protenas, y terminaremos con las inclusiones y org1nulos especiales que presentan algunas bacterias.

2 MATERIAL GENTICO( EL NUCLEOIDE

El 0): es el material gen"tico de los procariotas, al igual que del resto de seres vivos 2celulares3. )icho 0): est1 contenido en una regi n concreta del citoplasma, denominada nucleoide, en la mayora de los casos sin estar separado por membrana 2hay un par de bacterias en las que se ha descubierto una membrana rodeando al nucleoide3. El genoma es el conjunto de genes y secuencias de 0): de un organismo. En el caso de bacterias, el elemento obligatorio del genoma es el cromosoma, aunque es frecuente encontrar unidades de replicaci n aut nomas llamadas pl1smidos, que son dispensables 2si se pierden, la bacteria sigue siendo viable3.

2.1 EL CROMOSOMA PROCARIOTA

2.1.1 MTODOS DE OBSERVACIN Y ESTUDIO
A microscop6a ptica En las c"lulas en fresco, los nucleoides se pueden poner de manifiesto 2usando microscopio de contraste de fases3 ajustando el ndice de refracci n del medio 2haciendo que dicho ndice sea igual al del resto del protoplasma3. 9e logra m1s detalle usando los recientes microscopios confocales de barrido. Osando tinciones 2en preparaciones fijadas previamente3@ se pueden emplear colorantes b1sicos 2como los de tipo Heulgen3, siempre que previamente se destruya el 0/:r 2que podra enmascarar al nucleoide3 mediante hidr lisis 1cida o en'im1tica. 5tro buen sistema es emplear el #romuro de etidio, colorante que se intercala en la doble h"lice del 0): y que permite visuali'ar los nucleoides de color anaranjado con un microscopio provisto de lu' ultravioleta. A microscop6a electrnica de transmisin Para evitar artefactos de laboratorio, frecuentes en la fase de fijaci n para la microscopa electr nica, se recurre a un m"todo de congelaci n r1pida seguida de criosubsituci n. Las im1genes muestran al nucleoide como una regi n m1s o menos delimitada y libre de ribosomas, dentro del citoplasma, no rodeada de membrana, con muchos l bulos y un aspecto fibroso. :uevas t"cnicas de microscopa electr nica combinada con an1lisis computeri'ado de im1genes acaban de revelar que el nucleoide de las c"lulas en reposo 2en fase estacionaria3 se empaqueta de un modo muy ordenado, formando toroides espirales recubiertos de subunidades de una protena especial.

+todos de o#tencin Para obtener nucleoides -intactos. se recurre a la lisis suave de las c"lulas 2con detergentes no i nicos3 en altas concentraciones de sales 2p ej., :a#l3 con posterior ultracentrifugaci n en gradientes de densidad de sacarosa. 9i el procedimiento se reali'a a J+E# el nucleoide se aisla relativamente libre de restos de membrana, pero si se hace en fro 2FE#3 el nucleoide queda asociado a grandes restos de envueltas. Estudios moleculares La biologa molecular, especialmente a trav"s de las t"cnicas de 0): recombinante, permite la caracteri'aci n fsica detallada de los genomas. Muchos genomas de procariotas han sido cartografiados mediante mapas de restricci n, pero en la actualidad ya contamos con m1s de F,, genomas totalmente secuenciados, lo que est1 permitiendo avances espectaculares en todos los 1mbitos de la gen"tica y bioqumica de estos microorganismos.

2.1.2 COMPOSICIN #UMICA" ESTRUCTURA Y ORGANIDACIN DEL CROMOSOMA

Los cromosomas aislados muestran una composici n de un ?,W de 0):, D,W de 0/: y *,W de protenas. El 0): sigue el modelo cl1sico de Patson y #ricC@ dos hebras antiparalelas en doble h"lice de J nm de di1metro, paso de rosca de D,F nm y *, pares de nucle tidos por cada vuelta de la espiral. La mayor parte de este 0): est1 en conformaci n 6, aunque e(isten 'onas donde se puede dar la configuraci n Q. En la mayor parte de las bacterias este 0): constituye un solo cromosoma circular, cerrado covalentemente 20): c.c.c.3. E(isten algunas e(cepciones, en el sentido de que podemos encontrar cromosomas lineares o incluso m1s de un grupo de ligamiento 2m1s de un cromosoma3@ en el g"nero Borrelia el cromosoma es lineal con los e(tremos cerrados covalentemente 2es decir, los e(tremos forman una especie de bucle de horquilla3< bacterias del g"nero Streptomyces tambi"n poseen un cromosoma lineal, pero sus e(tremos contienen secuencias cortas repetidas y est1n acomplejados con protenas, lo que recuerda de alg!n modo los tel meros eucariotas< algunas bacterias parecen poseer dos o m1s cromosomas@ (hodobacter sphaeroides$ @ibrio$ -eptospira y Brucella presentan dos cromosomas circulares Sinorhi'obium melitoti presenta tres cromosomas circulares )istintas cepas de Bur"holderia cepacia presentan entre J y F cromosomas &grobacterium tume,aciens cuenta con un cromosoma lineal y otro circular. Las bacterias son organismos ,aploides@ poseen un solo cromosoma. 9in embargo, cuando las c"lulas bacterianas se encuentran en crecimiento activo, y debido al desfase de

la divisi n celular respecto de la replicaci n, cada individuo puede albergar varias copias de ese cromosoma. Por ejemplo, ). coli puede llegar a *, copias. &'otobacter puede llegar hasta las *,, copias al final de la fase de crecimiento e(ponencial. On caso e(tremo lo constituye la bacteria gigante )pulopiscium, que aumenta el n!mero de copias en cuatro rdenes de magnitud 2lunas *,.,,, vecesm3, aunque se desconoce el significado de este descomunal -e(ceso.. EamaQo del cromosoma Ona bacteria tpica, como )scherichia coli posee un cromosoma con F.>,, pares de Cilobases 2Cb3. Pero los rangos de tamao oscilan entre las >,, Cb de Mycoplasma genitalium 2una bacteria carente de pared y par1sita3 y las m1s de *J ,,, Cb de ciertas bacterias capaces de diferenciaci n celular y fen menos de multicelularidad 2cianobacterias, actinomicetos3. rgani!acin del cromosoma ( de la cromatina #acterianos 9i despleg1ramos el cromosoma de ). coli de modo lineal, medira * mm, es decir, *,,, veces m1s de lo que mide la longitud de la bacteria. 9i adem1s tenemos en consideraci n que el cromosoma ocupa s lo *,W del volumen celular, nos daremos cuenta que debe de estar densamente empaquetado. f# mo es la organi'aci n a gran escala de este cromosoma dentro de la c"lula[ Esta es una cuesti n que a!n desconocemos en todos sus detalles. 0 continuaci n e(ponemos un resumen de lo que se sabe 2o sospecha3 actualmente@ La doble h"lice est1 superenrollada negativamente sobre s misma. Parte de este superenrollamiento se debe al equilibrio entre la actuaci n de dos en'imas@ A)N girasa, que es un tipo especial de topoisomerasaG&& que tiende a introducir superhelicidad negativa< A)N topoisomerasa=7, que tiende a relajar la superhelicidad negativa, cortando cada ve' en una de las dos cadenas de la doble h"lice, pasando la cadena intacta por el hueco, y volviendo a sellar el enlace fosfodi"ster que antes rompi . 0parte de este superenrollamiento producido por -topoen'imas., el material gen"tico bacteriano presenta interacciones con una serie de prote6nas estructurales. El conjunto de 0): y protenas estructurales se denomina Lcromatina05 pero, nunca aparecen histonas. 9alvo en algunas arqueas, esta cromatina procari tica tiene menos densidad de protenas que la cromatina de eucariotas. %eamos algunas de esas protenas. En )scherichia coli, e(iste la protena b1sica NC, un heterodmero 2KOG, KOG`3, que presenta cierto parecido con las histonas aut"nticas 2pero sin guardar homologa con ellas3. :o forma aut"nticos nucleosomas con el 0):. En otras bacterias, e(isten protenas hom logas con la KO. En todos los casos se unen d"bilmente al 0): -normal., pero en cambio lo hacen con gran afinidad hacia 0): curvado o que forme bucles, induciendo mayores curvaturas en ese 0):. La uni n de KO no depende del reconocimiento de ninguna secuencia particular. Parece que su papel no s lo es estructural, sino que tambi"n colaboran con otras protenas en procesos de recombinaci n

hom loga, recombinaci n especfica, reparaci n del 0): y e(presi n gen"tica. La 7N' 2llamada as por las iniciales inglesas de factor de hospedador para la integraci n3 es una protena que reconoce un tipo de secuencia de *D pares de bases, y que al unirse al surco menor de la doble h"lice provoca grandes curvaturas locales en ella. )e esta forma colabora en procesos de recombinaci n especfica /lo veremos en la secci.n de Gen0tica2 y de e(presi n de ciertos genes. /ecientemente se ha descubierto un importante tipo de prote6na estructural para el mantenimiento del cromosoma 1&+43. 9e trata de un homodmero con forma de M%M en el que cada bra'o de la M%M es un mon mero. 0mbos mon meros interaccionan por la base de la %. Las dos puntas de esa % contienen dominios de uni n e hidr lisis del 04P, e interact!an a su ve' con una serie de protenas accesorias relacionadas con la organi'aci n y mantenimiento del 0): durante la replicaci n y segregaci n de los cromosomas hijos. #omo se ve, tanto el superenrollamiento como la compactaci n generada por las protenas estructurales tienen una notable influencia sobre las funciones del 0):, ya que modulan procesos tan importantes como la replicaci n, transcripci n, recombinaci n y e(presi n g"nica, aunque estamos lejos de conocer e(actamente los mecanismos implicados. El papel biol gico del 0/: que se detecta en los nucleoides aislados in vitro tampoco est1 claro. Este no es un 0/: especial, sino 0/: naciente, y parece servir para mantener -sujetos. los diversos dominios superenrollados. Ia aludimos antes al descubrimiento reciente de que en la fase estacionaria, cuando las bacterias carecen de fuente de energa y no pueden seguir creciendo, el nucleoide e(perimenta una reorgani'aci n radical, en la que el 0): se arrolla de formando toroides espirales separados entre s por una capa de subunidades de una protena especial 2)ps3, y dando lugar a una macroestructura coGcristalina muy regular. Probablemente esto suponga una adaptaci n para proteger el 0): sin gastar energa. Hinalmente, otro tema largamente debatido es el modo de asociaci n del cromosoma con la membrana citopl1smica 2fqui'1 a trav"s de mesosoma[3. Kay indicios de que el cromosoma, y concretamente su origen de replicaci n /ori%2$ se encuentra -anclado. a determinadas protenas de la membrana 2protenas que probablemente est"n implicadas en el inicio de la replicaci n cromos mica3. En los cromosomas circulares, la replicaci n avan'a bidireccionalmente desde el sitio ori%, hasta que las dos horquillas se encuentran a *L,E de ese lugar, termin1ndose la replicaci n.

2.2
2.2.1

PLSMIDOS
DEFINICIN Y CONCEPTOS GENERALES

0unque en general es adecuado decir que el genoma de los procariotas consta de un solo cromosoma, muchas bacterias poseen, adem1s, uno o varios elementos gen"ticos accesorios e(tracromos micos, a los que denominamos pl%smidos.

9e definen como elementos gen"ticos e(tracromos micos con capacidad de replicacin autnoma 2es decir, constituyen replicones propios3. 4odos los pl1smidos bacterianos estudiados son de 0): de cadena doble. La inmensa mayora son circulares cerrados covalentemente 2c.c.c.3 y superenrollados 2aunque en Borrelia y algunos 0ctinomicetos e(isten pl1smidos lineares3. 0lgunos pl1smidos poseen, adem1s, la capacidad de integrarse reversiblemente en el cromosoma bacteriano@ en esta situaci n se replican junto con el cromosoma 2bajo el control de "ste3, y reciben el nombre de episomas. En cuanto al tamaQo, e(iste una amplia gama@ desde pl1smidos muy pequeos 2de unas J Cb3 hasta pl1smidos muy grandes 2ciertos pl1smidos de #seudomonas tienen +,, Cb3. &ncluso e(isten -megapl1smidos. en ciertos (hi'obium que llegan a tener *?,, Cb. 2)e hecho, ciertos -megapl1smidos. se ha visto que son imprescindibles, por lo que se han recalificado como cromosomas3. #ada tipo de pl1smido tiene un nAmero medio de copias por c"lula caracterstico. Por regla general, los grandes pl1smidos tienen una o dos copias por c"lula 2pl1smidos con control estricto de la replicacin3, mientras que los pequeos suelen estar presentes como varias copias 2n*,3, denomin1ndose pl1smidos de control rela"ado. En funci n de que los pl1smidos sean o no transmisibles de una bacteria a otra por medio de contactos intercelulares, se pueden distinguir@ pl%smidos con"ugativos 2autotransmisibles3, que son aquellos que se transfieren entre cepas por medio de fen menos de con"ugacin. 0lgunos de estos pl1smidos no s lo se transfieren entre cepas de la misma especie, sino que son capaces de hacerlo entre especies y g"neros muy diversos, recibiendo el muy apropiado nombre de pl%smidos promiscuos o de amplio espectro de hospedadores, permitiendo transferencia ,ori!ontal de informacin gentica entre grupos bacterianos filogen"ticamente alejados. pl%smidos no con"ugativos, carentes de esta propiedad de conjugaci n. )entro de esta categora e(iste un subgrupo, el de los pl1smidos movili!a#les@ son aquellos no autotransmisibles que pueden ser transferidos por la acci n de un pl1smido conjugativo coe(istente en la misma bacteria. /&mpliaremos el estudio de los pl9smidos con8ugativos en la secci.n de Gen0tica bacteriana2.

2.2.2

FENOTIPOS DETERMINADOS POR LOS PLSMIDOS

Los pl1smidos no suelen ser indispensables para la viabilidad de la bacteria, y muchos de ellos se pierden en ausencia de una presi n selectiva. Ona bacteria puede ser -curada. de su2s3 pl1smido2s3, es decir, se le pueden eliminar, bien de forma espont1nea, bien por una serie de tratamientos en el laboratorio 2incubando las bacterias a temperaturas cercanas a la m1(ima o por agentes qumicos como el naranja de acridina, que se insertan entre las bases del 0):3. La ra' n de esta curaci n de los pl1smidos es que esos

tratamientos interfieren con su replicaci n sin afectar a la replicaci n del cromosoma. Esto hace que en sucesivas divisiones de una bacteria, el pl1smido se vaya -diluyendo. en la poblaci n resultante. Los pl1smidos no suelen determinar productos esenciales para el crecimiento 2por eso son dispensables3, pero en la naturale'a parece que resultan favorecidas las bacterias con alg!n pl1smido, qui'1 porque acarrean ventajas selectivas en determinados ambientes o en determinadas condiciones. E(iste una variedad de fenotipos ( funciones determinados por pl%smidos@ /esistencia a antibi ticos 2pl1smidos /< los estudiaremos en la secci n de Gen0tica3. /esistencia a metales pesados 2por ejemplo, resistencia a mercurio3. Pl1smidos de virulencia@ producci n de to(inas, factores de penetraci n en tejidos, adherencia a tejidos del hospedador, etc., en ciertas bacterias pat genas. Producci n de bacteriocinas 2protenas t (icas producidas por bacterias que matan a otras de la misma especie3. Producci n de sider foros 2quelatos para secuestrar iones HeDc3. Otili'aci n de determinados a'!cares. Otili'aci n de hidrocarburos, incluyendo algunos cclicos recalcitrantes 2degradaci n de tolueno, (ileno, alcanfor, etc.3 en #seudomonas. &nducci n de tumores en plantas 2pl1smido 4i de &grobacterium tume,aciens3. &nteracciones simbi ticas y fijaci n de nitr geno en ciertos (hi'obium. etc... 5bs"rvese que la mayor parte de estos fenotipos no est1n directamente relacionados con el proceso de crecimiento bacteriano, sino que se pueden calificar como funciones para ocupar nic,os ecolgicos y resistir circunstancias adversas. Los dos fenotipos de -utili'aci n de...2fuente alternativa de #3. nos recuerdan que muchas bacterias est1n sometidas a perodos alternos de hambrunas y de -festines de comida.@ ciertas bacterias, como #seudomonas se adaptan a los perodos de hambre de las fuentes habituales de # recurriendo a fuentes Le$ticas0, como hidrocarburos cclicos. La informaci n para los en'imas degradativos correspondientes la llevan en pl1smidos. fPor qu", entonces, si determinadas propiedades conferidas por pl1smidos son tan !tiles, no han pasado a lo largo de la evoluci n a ser codificadas por el cromosoma[ :o podemos contestar a ciencia cierta a esa pregunta, pero cabe especular que resulta ventajoso que algunas poblaciones bacterianas dispongan de ciertos genes en replicones distintos del cromosoma, de modo que los cromosomas no lleguen a ser demasiado grandes. #uando no hay presi n selectiva para los rasgos conferidos por un pl1smido, "ste se puede perder de parte de la poblaci n. Pero cuando e(iste dicha presi n selectiva 2p. ej., un antibi tico3, sobreviven y se multiplican preferencialmente las bacterias portadoras del pl1smido, de modo que en poco tiempo, la poblaci n contiene mayoritariamente dicho elemento. 0dem1s, como muchos pl1smidos son autotransmisibles o movili'ables, pueden transferirse a cepas que originalmente carecan de ellos. En resumen, se logra una gran fle(ibilidad adaptativa sin -cargar. demasiado el cromosoma o replic n principal.

Kay pl1smidos que, aunque se pueden evidenciar por m"todos fsicos 2p. ej., electroforesis3, no se ha podido demostrar que determinen ning!n rasgo fenotpico@ tales pl1smidos se califican como cr6pticos, constituyendo un ejemplo de -0): egosta. 2s lo se mantienen por su capacidad de replicaci n, sin necesidad de aportar ventaja selectiva clara a la bacteria que los alberga3.

2.2.3

REPLICACIN DE LOS PLSMIDOS

#omo dijimos, los pl1smidos son replicones, es decir, unidades de replicaci n aut noma, pero ello no significa que codifiquen toda la maquinaria para su propia replicaci n. )e hecho, la mayora de los pl1smidos s lo codifican unas pocas protenas para este fin, y aprovechan la maquinaria de replicaci n de la bacteria hu"sped 20): polimerasas, ligasas, primasas, etc3, que act!a sobre unas secuencias del pl1smido denominadas secuencias ori@, donde tiene lugar el inicio de esa replicaci n. #ada tipo de pl1smido se replica por uno de dos principales tipos de mecanismos@ *. +odelo de replicacin en 1t,eta3* comien'a por la separaci n de las dos cadenas en el sitio ori@, creando una estructura que se parece a la letra griega 2theta3. En algunos pl1smidos, la replicaci n es unidireccional 2s lo hay una horquilla de replicaci n , que avan'a a lo largo de la mol"cula, hasta que vuelve al sitio ori@$ en el que las dos mol"culas hijas se separan3. 5tros pl1smidos se replican en por un modelo bidireccional 2dos horquillas de replicaci n de sentidos opuestos, que se encuentran cerca de la mitad de la mol"cula3. La replicaci n en es frecuente en pl1smidos de bacterias ;ramGnegativas. J. +odelo de replicacin en 1sigma35 o modelo del c6rculo rodante* una de las dos cadenas es rota a nivel de ori@, de modo que el e(tremo Do suministra el cebador para la replicaci n de la -cadena adelantada.. La cadena despla'ada 2cadena -menos.3 funciona como cadena retrasada 2-lagging.3 y debe ser replicada a partir de sitios de cebado especiales. Este tipo de replicaci n es frecuente en pl1smidos de bacterias ;ramGpositivas.

2.2.4

REGULACIN DEL NLMERO DE COPIAS

La regulaci n del n!mero medio de copias de cada pl1smido en cada bacteria es una propiedad caracterstica dependiente de c mo se controla el inicio de replicaci n, siendo diferentes los mecanismos en los pl1smidos de alto n!mero de copias 2con control relajado3 y en los pl1smidos de bajo n!mero de copias 2de control estricto3. En general, los pl1smidos de control relajado tienen mecanismos que inhiben el inicio de replicaci n s lo cuando el n!mero de copias ha llegado a un cierto nivel. En cambio, los pl1smidos de control estricto tienen mecanismos que logran que s lo se repliquen una ve' o un pequeo n!mero de veces en cada ciclo celular.

2.2.5

REPARTO DE LAS COPIAS A LAS CLULAS HI'AS

Muchos pl1smidos poseen sistemas de reparto 2X partici n3, que tienden a asegurar que una ve' que el pl1smido ha sido replicado, cada una de las c"lulas hijas va a recibir al menos una copia. 0 falta de un tal sistema, y si el reparto fuera aleatorio, de ve' en cuando, las propias fluctuaciones de la segregaci n aleatoria haran que parte de la progenie no recibiera una copia, con lo que quedara curada de ese pl1smido. El reparto de las copias a las c"lulas hijas se suele deber a las llamadas funciones par, que est1n cerca de los genes rep y de la 'ona ori. 9e trata de cortas secuencias de 0): que de alguna manera a!n no aclarada, debe unirse a alguna 'ona de la membrana de la bacteria que se duplica durante la divisi n celular, de modo que cada copia, unida a una de esas 'onas, se segrega a una c"lula hija.

2.2. INCOMPATIBILIDAD ENTRE PLSMIDOS Y GRUPOS DE INCOMPATIBILIDAD

#ada pl1smido, dentro de la amplia diversidad de los que se conocen, se suele clasificar seg!n el grupo de incompati#ilidad al que pertenece 2los grupos de incompatibilidad se suelen denominar con las siglas &nc seguidas de una letra may!scula 2por ejemplo &ncP, &ncH&&, etc.3. 9e dice que dos pl1smidos son incompatibles cuando no pueden coe(istir establemente en la misma bacteria en ausencia de una presi n selectiva permanente. ;rupo de incompatibilidad es el conjunto de pl1smidos incompatibles entre s. La incompatibilidad depende del hecho de que los distintos miembros de un mismo grupo poseen el mismo tipo de sistema de control del nAmero de copias ( de reparto de dichas copias a las c"lulas hijas. En cada c"lula con dos pl1smidos distintos del mismo grupo de incompatibilidad, el n!mero total de copias n0cn6 X : 2determinado por el sistema de control3 no vara, pero por fluctuaciones aleatorias en el reparto, algunas c"lulas heredan m1s copias de uno de los pl1smidos que del otro, y tras varias generaciones aparecen c"lulas carentes de uno o del otro pl1smido 2n0 X , y n6 X :, o viceversa3.

2.3

ELEMENTOS GENTICOS TRANSPONIBLES

En los aos >, del pasado siglo se descubrieron en bacterias los primeros ejemplos de 0): -saltarn., elementos que presentaban la por entonces novedosa propiedad de moverse de un lado a otro de los genomas, pasando desde pl1smidos a cromosomas 2o viceversa3 o desde un pl1smido a otro de la misma bacteria 2para entendernos, los llamaremos elementos gen"ticos transponibles -cl1sicos., por el simple hecho de que son los que fueron estudiados en primer lugar3. Pero desde hace unos *+ aos se est1n descubriendo nuevos tipos de elementos gen"ticos m viles, que no encajan en el modelo de los cl1sicos. En conjunto, esta gama de elementos nos est1n mostrando que en los genomas procari ticos e(iste una especie de -pool. de 0): con propiedades especiales de movili'aci n, que confieren a veces notables rasgos fenotpicos a las cepas que los poseen,. 0dem1s bien por ellos mismos o bien por el hecho de que a veces son transportados entre cepas de la misma especie o de diferentes especies 2mediante pl1smidos conjugativos y fagos3, se pueden transferir de unas bacterias a otras, constituyendo un -pool. compartido de material gen"tico. I finalmente, estos elementos aportan una notable plasticidad a los

genomas, suministrando una base potente sobre la que act!a la selecci n y por lo tanto la evoluci n de los procariotas.

2.3.1

ELEMENTOS GENTICOS TRANSPONIBLES MCLSICOSM

9on entidades gen"ticas discretas que forman parte de cromosomas y de pl1smidos, capaces de moverse de un lugar a otro del genoma 2pasando a otros lugares del replic n original, o a otros replicones presentes en la misma bacteria3. #omo estudiaremos oportunamente en la secci n de ;en"tica, esta capacidad de transponerse se debe a un tipo de recombinaci n especfica denominado transposicin. E(isten varias clases de mecanismos de transposici n, pero muchas de ellas suponen la simult1nea replicaci n del elemento, de modo que queda una copia en el sitio original y aparece una copia nueva en la nueva locali'aci n. Los elementos gen"ticos m viles acarrean una serie de reorgani!aciones en los genomas@ inversiones de segmentos gen"ticos, delecciones, cointegraciones entre dos replicones, etc. Kay que resaltar que estos elementos no son replicones, es decir, no poseen la capacidad de replicaci n aut noma que hemos visto en cromosoma y pl1smidos, sino que son partes integrantes de los genomas de muchas bacterias, confiriendo plasticidad gentica sobre la que pueden actuar mecanismos evolutivos. Esto hace que los genomas bacterianos, y sobre todo los pl1smidos, sean relativamente din1micos y maleables a escala evolutiva.

2.3.2

MNUEVOSM ELEMENTOS GENTICOS MVILES

#omo dijimos, en los !ltimos aos se han descrito nuevos tipos de elementos m viles que no se ajustan a los cl1sicos. 0lgunos de ellos poseen funciones simult1neamente de pl1smidos y transposones, otros tienen me'clas de rasgos de fagos y de pl1smidos, etc. )escribiremos brevemente algunos de ellos@ Ono de los primeros tipos de -nuevos. elementos son los llamados transposones con"ugativos5 que presentan la propiedad de promover su diseminaci n de una bacteria a otra por conjugaci n. Los transposones movili!a#les consisten en un transpos n que posee un sitio ori! similar al de ciertos pl1smidos conjugativos, y que puede ser transferido -pasivamente. a otra c"lula mediante un pl1smido conjugativo coGresidente 2es decir, presente en la misma c"lula de origen3. Las islas genmicas son elementos discretos de 0): con tamaos de entre *, y +,, Cb, presentes en ciertas cepas de una especie pero ausentes en otras, y que confieren notables ventajas adaptativas 2para ocupar nichos ecol gicos3. Muchas islas gen micas se asemejan a enormes transposones atpicos, que se insertan preferentemente en o cerca de ciertos genes cromos micos 2como p. ej., genes de 0/:t3, que est1n enmarcados por secuencias cortas repetidas 2similares a las que usan ciertos fagos, como el fago p3, y que de hecho codifican una en'ima de tipo integrasa como la del propio fago p. 0lgunas de estas islas a su ve' pueden transferirse activamente a otras c"lulas debido a que poseen tambi"n genes parecidos a los de los pl1smidos conjugativos. 0 su ve', las islas gen micas son de varios tipos en funci n de la ventaja adaptativa que confieren a las cepas que las albergan@ Las primeras en descubrirse fueron las llamadas islas de patogenicidad. 4ienen la capacidad de conferir a la cepa notables capacidades patog"nicas sobre animales, debido a que llevan genes de to(inas, adhesinas, sider foros, etc3. Ejemplos@ la -inocente. )scherichia coli se convierte en una bacteria uropat gena cuando adquiere una cierta -isla.< el temible bacilo del c lera 2@ibrio cholerae3 parece proceder de inocuos parientes que, de ve' en cuando adquieren una de esas islas, y que codifica la to(ina col"rica< casos similares se han visto en otras bacterias ;ramGnegativas 2Aersinia$ Salmonella$ Neisseria3 y ;ramGpositivas 2-isteria$ %lostridium3 Mientras que los casos anteriores son islas de patogenicidad locali'adas en el cromosoma, se han descubierto tambi"n ejemplos de islas situadas en pl1smidos. 4al es el caso del bacilo del carbunco 2mal llamado 1ntra( en espaol3 2Bacillus anthracis3, que produce sus tres to(inas debido a genes de una isla gen mica plasmdica. 0lgunas bacterias pat genas de plantas 2Banthomonas$ )r=inia3 tambi"n poseen islas gen micas. 0lgunas bacterias 2como ciertos #seudomonas3 poseen en islas cata#licas los genes que les confieren la propiedad de degradar compuestos contaminantes 2(enobi ticos3. 0lgunas especies del grupo de (hi'obium poseen islas &(m 2de symbiotic3 donde se locali'an genes responsables de la interacci n simbi tica con las races de ciertas

leguminosas.

En resumidas cuentas@ los elementos m viles permiten que los genomas procari ticos sean relativamente -modulares. y -maleables., y habida cuenta de que por s mismos o por el efecto de pl1smidos y fagos se pueden movili'ar entre cepas y especies diferentes, suministran mecanismos r%pidos de cam#io evolutivo. En el caso de la adquisici n de islas gen micas, observa que el fenotipo de la bacteria cambia espectacularmente 2p. ej., de no pat gena a pat gena, de no simbi tica a simbi tica, etc3, por lo que este fen meno se ha calificado como de -evoluci n por saltos cu1nticos.. qqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqq 0ntes de terminar esta parte del tema sobre el 0): procari tico, debemos decir que la mayor parte del genoma bacteriano consta de genes y conjuntos de genes 2y a diferencia de eucariotas, e(iste poco 0): -no g"nico. y pocas secuencias cortas repetidas sin funci n clara3. La mayora de los genes codifican protenas, bien sean estructurales o en'im1ticas. La -ruta. de e(presi n por la que la secuencia de un gen se decodifica hasta protena consta de dos fases@ transcripci n y traducci n. On concepto muy importante a tener ya en cuenta, y que distingue la organi'aci n gen"tica procari tica de la eucari tica es que los genes bacterianos relacionados con una misma funci n gen"tica suelen estar agrupados de forma contigua, formando una unidad de transcripci n y de regulaci n gen"tica que se denomina opern, bajo el control unitario de unas secuencias de 0): colocadas en el lado +o, entre las que siempre e(iste una llamada promotor, que es el lugar de entrada de la 0/: polimerasa.

3 RIBOSOMASN SNTESIS Y PLEGAMIENTO DE PROTENAS

3.1 ESTRUCTURA DEL RIBOSOMA EUBACTERIANO

La ausencia de membrana nuclear en los procariotas hace que la traducci n de un mensaje ocurra mientras ese mensaje a!n no ha terminado de formarse@ tan pronto como ha comen'ado la transcripci n de un oper n, los ribosomas se unen al e(tremo +U del mensajero naciente, y da comien'o enseguida la traducci n del mensaje. Esto constituye otro rasgo distintivo de la e(presi n gen"tica en procariotas@ la transcripcin ( la traduccin est%n estrec,amente acopladas. &gualmente caracterstico de las eubacterias es el hecho de que el primer amino1cido que se incorpora no es la metionina, sino la :G formilGmetionina. #omo ya vimos, en las micrografas electr nicas de cortes finos de bacterias el citoplasma aparece muy granulado, correspondiendo estos granos a los *,.,,, a *+.,,, ribosomas que posee cada c"lula 2dependiendo de la fase de crecimiento3. El ribosoma es probablemente el complejo supramacromolecular m1s estudiado, a pesar de lo cual, y debido a su e(traordinaria complejidad, a!n reserva una buena cantidad de aspectos no totalmente comprendidos. :os referiremos a la composici n y estructura del ribosoma eubacteriano 2concretamente, de la especie en que est1 mejor estudiado@ )scherichia coli, por supuesto3. El ribosoma est1 compuesto de un ?DW de 0/: 2que a su ve' representa m1s del =,W del 0/: total de la bacteria3 y un D>W de protenas. El ribosoma eubacteriano posee un coeficiente de sedimentaci n de >,9, frente al de L,9 de los ribosomas citopl1smicos eucari ticos. 6ajando la concentraci n de iones Mgcc cada ribosoma se disocia en sus dos subunidades@ la pequea 2D,93 y la grande 2+,93. Cn vivo esta disociaci n ocurre cada ve' que se completa la sntesis de una mol"cula de protena, para volver a unirse las dos subunidades al inicio del mensaje de otro gen. M!ltiples t"cnicas moleculares 2algunas relativamente recientes3 permiten desentraar aspectos de los ribosomas@ difracci n de rayos $< difracci n de neutrones< inmunoelectromicroscopia. &u#unidad pe-ueQa 13M&3 #apeles@ Est1 implicada principalmente en decodificar la informaci n del 0/:m. #ontiene los sitios de uni n para los 0/:t cargados. 4iene un papel central en el inicio de la traducci n.

%omposici.n y estructura@ #ontiene un solo tipo de 0/:@ el 0/:r *?9, con una caracterstica estructura secundaria con 'onas de emparejamiento intracatenario 2de cadena doble3 y bucles. Posee J* tipos de protenas, denominadas 9*, 9J ... 9J*. Las posiciones relativas de algunas de estas protenas han podido ser -cartografiadas. en el conjunto de la estructura de la subunidad D,9 por las t"cnicas citadas arriba. &u#unidad grande 1;M&3 #apeles@ &nterviene principalmente en la formaci n del enlace peptdico entre el amino1cido situado en el sitio 0 2ligado a su 0/:t3 y el p"ptido naciente 2unido a un 0/:t3 del sitio P. %omposici.n y estructura@ Posee dos tipos de 0/:@ 0/:r JD9 y 0/:r +9, cada uno con su correspondiente y peculiar estructura secundaria 2En general, los 0/:r presentan abundantes 'onas de emparejamientos intracatenarios y bucles de cadena sencilla3. #ontiene DJ tipos de protenas diferentes, denominadas L* ... LDJ. La L> y la L*J tienen la misma secuencia, pero la L> est1 modificada qumicamente en su e(tremo amino por uni n con un radical acetilo. #on e(cepci n de L>]L*J, que est1n presentes en F copias cada una, las dem1s aportan una sola mol"cula cada una a la subunidad grande. %"ase en la figura la locali'aci n de algunas de estas mol"culas dentro de la estructura global. La secuencia primaria y la estructura secundaria de los 0/:r est1n muy conservados evolutivamente@ hay pocas diferencias entre bacterias muy alejadas desde el punto de vista filogen"tico 2fPodra el alumno e(plicar el porqu" de esta notable conservaci n qumica y estructural[3. Parece ser que el papel principal de los 0/:r es suministrar un -n!cleo. sobre el que se van ensamblando ordenadamente las protenas ribos micas, interaccionando con sitios especficos de los 0/: y con otras protenas. /ecientemente se est1n acumulando pruebas de que el 0/:r pueda jugar, adem1s, alg!n papel funcional, aparte del estructural@ El 0/:r *?9, adem1s de unirse por su e(tremo DU con la secuencia de 9hineG)algarno del e(tremo +U del 0/:m, parece representar un papel en la terminaci n de la sntesis de protenas. El 0/:r JD9 tiene un papel en la elongaci n, interaccionando con factores EH. &ncluso e(iste la sospecha de que es una ribo'ima necesaria para la actividad peptidilGtransferasa.

3.2 EL MECANISMO DE LA SNTESIS DE PROTENAS

0!n no tenemos un cuadro completo de c mo coordina el ribosoma la compleja serie de reacciones que forman parte de la traducci n@ uni n y liberaci n de los 0/:t, transpeptidaci n, movimientos coordinados del molde de 0/:m y del p"ptido naciente, etc. 9in embargo, el intenso estudio al que se est1n sometiendo el ribosoma y el proceso de la traducci n desde los aos ?, ha permitido notables profundi'aciones. El alumno de biol gicas puede recurrir a los conocimientos que se imparten en otras asignaturas de la Licenciatura 26ioqumica, ;en"tica, 6iologa Molecular3 y a alguno de los e(celentes te(tos modernos. El sitio de entrada del ribosoma al 0/:m es la secuencia de &,ine=)algarno 1&= )35 cerca del e(tremo +o del mensajero, de unas = pb, y complementaria de e(tremo Do del 0/:r *?9 2de la subunidad pequea del ribosoma3. Esta secuencia de 9G) est1 situada dentro de una regi n m1s amplia de secuencia no aleatoria que abarca desde la base rJ, a la c*D. 4ambi"n es importante la distancia entre la 9G) y el cod n iniciador. La formaci n del complejo iniciador con la subunidad iD, 9 requiere los factores de iniciaci n &H*, &HJ e &HD, el 0/:m y un 0/:t especial, cargado normalmente con el amino1cido :GformilGmetionina. 2El grupo formilo bloquea el grupo amino de ese amino1cido iniciador, de modo que obliga a que la sntesis proceda s lo en una direcci n3.
N, 7-.986. .: 5,;A* ;. -*-5-, .7 AUG =9.+?" 7-*, @1. 0 /.5.7 :, 7,* GUG =V0:? C UUG =P3.?.

E*+,*5.7 7. 0P0;. :0 71G1*-;0; 5&S" <,69K*;,7. .: 6-G,7,90 !&S" C :-G.6K*;,7. :,7 <05+,6.7 ;. -*-5-05-,* E: ARN+ <M.+ 7. .*51.*+60 .* .: 7-+-, P ;.: 6-G,7,90. A: :0;, ;. H:" .* .: 7-+-, A" 30 .*+60;, .: ARN+ 5,66.78,*;-.*+. 0: 7-B1-.*+. 5,;A*" 506B0;, 5,* 71 09-*,*K5-;,. E* :0 <07. ;. +607:,505-A*" .: 6-G,7,90" E1*+, 5,* .: <05+,6 ;. .:,*B05-A* EF>G <,690 1* .*:05. 8.8+F;-5, .*+6. .7+,7 ;,7 09-*,K5-;,7" <,6D0*;, :0 :-G.605-A* ;.: <>M.+ ;. 71 ARN+ C 9,/-H*;,7. .: 6-G,7,90 1* 5,;A* 0;.:0*+.. L07 ;,7 9,:H51:07 ;. ARN+ 8.690*.5.* 1*-;07 0: 6-G,7,90" 8.6, 03,60 .: ARN+ ;.7506B0;, 7. 7-+T0 .* .: 7-+, E =.J-+Y70:-;0?" C .: ARN+ 5,* :0 50;.*0 *05-.*+. =8,6 03,60 ;. 2 09-*,K5-;,7? @1.;0 .* .: 7-+-, P. U* *1./, 5-5:, 5,9-.*D0( .*+60 .: +.5.6 ARN+ 506B0;, 0: 7-+-, A" C .* 86.7.*5-0 ;.: <05+,6 ;. .:,*B05-A* EF>T1" :-G.60 0: ARN+ ;.7506B0;, ;.: 7-+-, E. Y 5,*+-*T0* :,7 5-5:,7 ;. .:,*B05-A* =8,6 +607:,505-A*? 307+0 ::.B06 0: 5,;A* ;. 8060;0. H0C +6.7 5,;,*.7 @1. *, +-.*.* 7.*+-;, =*, .@1-/0:.* 0 *-*BT* 09-*,K5-;,?( UAAL UAG" UGA. C10*;, 1*, ;. .7+,7 5,;,*.7 ::.B0 0: 7-+-, A" *, 30C ARN+ @1. :, +60;1D50" C :0 50;.*0 86,+.-50 @1.;0 :-G.60;0 ;.: 6-G,7,90. #omo los procariotas suelen tener mensajes policistr nicos, cuando un ribosoma llega al final de un gen, se puede mover hasta encontrar otro cod n iniciador, pero si el espacio intercistr nico es muy grande, se puede disociar el ribosoma, de modo que las subunidades deben reensamblarse para continuar la lectura del mensaje.

3.3 EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTENAS( PAPEL DE LAS PROTENAS CELADORAS =;CHAPERONAS<>

Kasta hace poco se pensaba que el polip"ptido naciente adquira espont1neamente su configuraci n funcional al ser sinteti'ado en el ribosoma. Pero hoy se sabe que tanto el correcto plegamiento de las protenas como su adecuado ensamblaje en complejos requiere el concurso de unas protenas especiales, conocidas como prote6nas celadoras o Lcara#inas moleculares0, debido a que su papel es vigilar y eventualmente corregir el plegamiento. 29e est1 imponiendo, para denominarlas, la castellani'aci n de su nombre ingl"s@ chaperonas, procedente de chaperones3.
Estas protenas est1n presentes en todos los seres vivos. 0lgunas de ellas se inducen ante determinados estr"s ambientales< de hecho se descubrieron como protenas inducibles ante un aumento de temperatura, por lo que se denominaron como prote6nas del c,o-ue trmico 2 con su acr nimo ingl"s Nsp3.

En )scherichia coli se han estudiado especialmente la )na7, )naN, ;rpE, ;roEL y ;roE9. Parece que act!an de un modo secuencial@ *. #uando el ribosoma a!n est1 sinteti'ando la protena y ya ha -asomado. la primera porci n del polip"ptido, se une la )naN a esa parte del polip"ptido a!n sin plegar. J. Enseguida se une la )na7, que ha formado antes un complejo con el 04P, y se produce hidr lisis de este 04P 2pero quedando el 0)P unido a )na73, lo que aumenta la afinidad de )na7 por el polip"ptido sin plegar. D. #uando se ha sinteti'ado toda la protena, la ;rpE se une al complejo polip"ptidoG )naNG)na7G0)P, liberando el 0)P. F. :uevas mol"culas de 04P se unen ahora a )na7, con lo que se facilita la disociaci n de las protenas )na7 y )naN respecto del polip"ptido. En este momento, muchos polip"ptidos pueden haber adquirido su configuraci n final, pero otros necesitan a!n un paso final de -refinamiento.@ +. El polip"ptido pasa al canal interior formado por ;roEL y ;roE9, que catali'an 2con gasto de 04P3 la correcta isomeri'aci n, de modo que la protena adquiere su plegamiento nativo biol gicamente activo.

4 INCLUSIONES Y ORGNULOS PROCARIOTAS

4.1 INCLUSIONES DE RESERVA

9on ac!mulos de sustancias org1nicas o inorg1nicas, rodeadas o no de una envuelta limitante de naturale'a protenica, que se originan dentro del citoplasma bajo determinadas condiciones de crecimiento. #onstituyen reservas de fuentes de # o : 2inclusiones org1nicas3 y de P o 9 2inclusiones inorg1nicas3. Estudiaremos@ *3 7nclusiones org%nicas* a3 inclusiones polisacardicas b3 gr1nulos de poliG`Ghidro(ibutrico 2o, en general de poliG`Ghidro(ialcanoatos3 c3 inclusiones de hidrocarburos d3 gr1nulos de cianoficina J3 7nclusiones inorg%nicas* a3 gr1nulos de polifosfato b3 gl bulos de a'ufre

4.1.1

INCLUSIONES POLISACARDICAS

9on acumulaciones de 2*F3 glucanos, con ramificaciones en 2*?3, principalmente almid n o gluc geno 2seg!n especies3, que se depositan de modo m1s o menos uniforme por todo el citoplasma cuando determinadas bacterias crecen en medios con limitacin de fuente de N, pero donde a!n sean abundantes las fuentes de # y energa. En esta situaci n, se detiene pr1cticamente la sntesis de protenas y de 1cidos nucleicos, y la mayor parte del # asimilado se convierte r1pidamente en estos materiales de reserva. #uando a estas c"lulas las pasamos a un medio rico en :, pero carente de fuente de #, estas inclusiones se usan como fuente interna de # para la sntesis de 1cidos nucleicos y protenas. Estas inclusiones act!an, pues, como sistemas de almacenamiento de carbono osmticamente inertes 2la c"lula puede albergar grandes cantidades de glucosa que, si estuvieran como mol"culas libres dentro del citoplasma, podran tener efectos osm ticos muy negativos3. Para observarlas se recurre a la tinci n con una soluci n de &J c &7 2como el lugol3 gluc geno@ aparece de color pardoGroji'o< almid n 2amilopectina3@ color a'ul

4.1.2 GRNULOS DE POLICOCHIDROEIBUTRICO =PHB> Y DE POLIC HIDROEIALCANOATOS

Los gr1nulos de poliGGhidro(ibutrico son ac!mulos del poli"ster del 1cido `G hidro(ibutrico 2X DGhidro(ibutrico3, rodeados de una envuelta protenica, y que al igual que en el caso anterior, se producen en ciertas bacterias como reserva osmticamente inerte de 4 en condiciones de hambre de :. 0dem1s de la protecci n osm tica, estos gr1nulos suponen la ventaja de neutrali'ar un metabolito 1cido 2el grupo carbo(ilo de cada unidad de `Ghidro(ibutrico desaparece como tal, al intervenir en el enlace "ster con la siguiente unidad3. En las especies de Bacillus constituye la fuente de carbono y energa al inicio de la esporulaci n. Ona funci n semejante parece implicada a la hora del enquistamiento de &'otobacter. Ona c"lula puede contener de L a *J de estos gr1nulos, que miden unos ,.JG,.> m de di1metro, y que van provistos de una envuelta proteica de unos DGF nm de grosor. Pueden llegar a representar el L,W en peso de la c"lula. 0 diferencia de los ac!mulos de polisac1ridos, los gr1nulos de PK6 son visibles a microscopio ptico en fresco, debido a su elevado ndice de refringencia. 9e tien bien mediante :egroG9ud1n. En los !ltimos aos est1 quedando patente que los gr1nulos descritos de PK6 son un ejemplo de una clase m1s amplia de gr%nulos de poli=@=,idro$i=alcanoatos.
P,6 .E.98:,( 510*;, ;.+.69-*0;07 .78.5-.7 ;. seudomonas 56.5.* .* *>,5+0*, 5,9, <1.*+. ;. 506G,*," 7. 05191:0 1* 8,:F9.6, ;. H7+.6.7 ;.: K5-;, X>3-;6,J->,5+0*,-5," 5,* 1*0 <1*5-A* 9.+0GA:-50 7.9.E0*+. 0 :0 ;.: PHB. C-.6+07 5.807 ;. Ralstonia eutropha" 510*;, 56.5.* .* B:15,70 C 86,8-A*-5, 86,;15.* 5,8,:F9.6,7 0:.0+,6-,7 ;. 1*-;0;.7 ;. >3-;6,J-G1+F6-5, C >3-;6,J-/0:H6-5, =Y3>3-;6,J-8.*+0*,-5,?. EJ-7+.* -*+.6.70*+.7 8.678.5+-/07 ;. 086,/.5309-.*+, .5,*A9-5, ;. .7+,7 8,:F9.6,7" C0 @1. :,7 PHA 7. 5,98,6+0* 5,9, .J5.:.*+.7 +.69,8:K7+-5,7 G-,;.B60;0G:.7. P,6 .E.98:," :0 .986.70 G6-+K*-50 ICI +-.*. 80+.*+0;,7 86,5.7,7 -*;17+6-0:.7 8060 <0G6-506 PHA ;,*;. 507- .: %&U ;. :07 1*-;0;.7 7,* ;. 3-;6,J-/0:H6-5," @1. ;0 1* 8,:F9.6, <:.J-G:. 5,9.65-0:-D0;, 5,* .: *,9G6. ;. B-,8,: . L,7 8,:F9.6,7 0 G07. ;. 4> , 5>3-;6,J-G1+F6-5, C 3>3-;6,J-G1+F6-5, 7,* 9K7 :06B,7" 9K7 .:K7+-5,7 C 9K7 G-,;.B60;0G:.7 =7. 30* .98:.0;, .* :0 <0G6-505-A* ;. .*/07.7?

4.1.3

INCLUSIONES DE HIDROCARBUROS

9on ac!mulos de reserva 2con envuelta proteinica3 de los hidrocarburos que determinadas bacterias 2especialmente 0ctinomicetos y relacionados3 usan como fuente de #.

4.1.4

GRNULOS DE CIANOFICINA

Muchas cianobacterias 25(ifotobacterias3 acumulan grandes gr1nulos refringentes de reservas nitrogenadas cuando se acercan a la fase estacionaria de crecimiento. Estos gr1nulos de cianoficina son ac!mulos de un copolmero de arginina y asp1rtico@ consta de un n!cleo de poliasp1rtico, en el que todos los carbo(ilos de las cadenas laterales est1n unidos con LGarginina. 9u sntesis no est1 basada en el mecanismo habitual en ribosomas, ya que no se ve inhibida por el cloramfenicol.

4.1.5

GRNULOS DE POLIFOSFATOS

9e denominan tambi"n gr1nulos de volutina o metacrom1ticos. El nombre de -metacrom1ticos. alude al efecto metacrom1tico 2cambio de color3@ cuando se tien con los colorantes b1sicos a'ul de toluidina o a'ul de metileno envejecido, se colorean de rojo. 0 microscopio electr nico aparecen muy densos a los electrones. 9on ac!mulos de polifosfato, polmeros lineales del ortofosfato, de longitud variable 2por t"rmino medio, unas +,, unidades3, que representan un modo osm ticamente inerte de almacenar fosfato. Parece ser que la parte central de estos gr1nulos constituye un n!cleo formado por lpidos y protenas. En algunos casos pueden constituir una fuente de energa, en sustituci n del 04P 2fse trata en este caso de una especie de -f sil bioqumico[.3. 9e acumulan cuando alg!n otro nutriente distinto del fosfato se hace escaso 2sobre todo cuando va desapareciendo el sulfato3. En estas condiciones se detiene la sntesis de los 1cidos nucleicos, y la volutina se acumula a la espera de su utili'aci n para esta sntesis de nucleicos, cuando apare'ca el nutriente originalmente limitante.

4.1.

GLBULOS DE ADUFRE

Las inclusiones de 9 aparecen en dos grupos de bacterias que usan sulfuro de hidr geno 29KJ3@ las bacterias purp!reas del a'ufre 2que usan el 9KJ como donador de electrones para la fotosntesis3< bacterias filamentosas no fotosint"ticas como Beggiatoa$ !hiomargarita o !hiothrix, que lo usan como donador de electrones para sus o(idaciones. En ambos casos, el sulfuro de hidr geno es o(idado a a'ufre elemental 29,3, que en el citoplasma se acumula como gl bulos muy refringentes y rodeados de envuelta protenica. Estos gl bulos son transitorios, ya que el 9, se reutili'a por o(idaci n hasta sulfato, cuando en el medio se agota el sulfuro.

4.2
4.2.1

OTRAS INCLUSIONES
INCLUSIONES DE SALES MINERALES

0c!mulos grandes, densos y refringentes de sales insolubles de calcio 2sobre todo carbonatos3 que aparecen en algunas bacterias 2como &chromatium3, cuyo papel parece consistir en mantenerlas en el fondo de los lagos y ros.

4.2.2

FICOBILISOMAS

9on estructuras supramacromoleculares, en forma de cilindros o bastones, adosadas a la superficie de la membrana tilacoidal de las #ianobacterias, confiriendo a "sta un tpico aspecto -granuloso. en las micrografas electr nicas. #omo se puede ver en el esquema, est1n constituidas por pilas de discos a base de fico#iliprote6nas, cromoprotenas que sirven como -antenas. para la captaci n de lu' en la fotosntesis de estos procariotas. Los grupos crom foros son@ ficocianinas, aloficocianinas y ficoeritrina. #omo veremos oportunamente, la disposici n ordenada de los distintos pigmentos tiene un papel central en la -canali'aci n. de la energa de la lu' hacia los centros de reacci n 2ubicados ya en plena membrana tilacoidal3 donde se locali'an los complejos fotosint"ticos protenasGclorofilas.

4.3 ORGNULOS PROCARITICOS CITOPLSMICOS

#omo ya dijimos, en procariotas no e(isten por regla general org1nulos citopl1smicos rodeados por unidad de membrana. Las !nicas e(cepciones est1n constituidas por los tilacoides de las 5(ifotobacterias, ya estudiados en el captulo anterior. En algunos grupos bacterianos se pueden encontrar org1nulos citopl1smicos no rodeados por unidad de mem#rana 2o sea, sin bicapa lipdica3. Muchos de ellos presentan envueltas basadas en subunidades de protenas@ carbo(isomas vacuolas de gas clorosomas magnetosomas.

4.3.1

CARBOEISOMAS =P CUERPOS POLIDRICOS>

Estructuras presentes en bacterias fotoautotrofas 2#ianobacterias y ciertas bacterias purp!reas3 y quimioautotrofas 2nitrificantes, !hiobacillus3, de apariencia poli"drica con tendencia a esf"rica. 9u di1metro oscila entre +, y +,, nm, y est1n rodeadas de envuelta monocapa proteinica de unos D,+ nm. El interior tiene aspecto granular, debido a la acumulaci n de la en'ima ri#ulosa=#ifosfato=car#o$ilasa 2/u6is#o, la carbo(idismutasa, el en'ima clave en el ciclo de #alvin de asimilaci n de #5J3. 0unque se pens que eran los sitos de fijaci n del #5J, parece m1s bien que se trata de reservas de dicha en'ima.

4.3.2

VACUOLAS DE GAS

9on org1nulos muy refringentes al microscopio ptico, que al electr nico muestran una estructura a base de agrupaciones regulares de ves6culas de gas. #ada vescula tiene una forma de cilindro bic nico 2J,,G*,,, nm de longitud y unos >, nm de di1metro3, rodeado de una monocapa de unidades globulares de protena ensambladas helicoidalmente que dan un aspecto a bandas 2-costillas.3. Esta envuelta es impermeable al agua, pero permeable a los gases, por lo que la composici n y concentraci n del gas dentro de la vescula depende de las que e(istan en el medio. #onforme se sinteti'an y ensamblan las vesculas, el agua va siendo eliminada del interior. Las vesculas de gas est1n constituidas por dos tipos de protena@ la mayoritaria ;vp0 es una pequea protena rgida y muy hidr foba. 9u rigide' est1 en la base del hecho de que las vesculas y vacuolas de gas aguanten presiones e(ternas. La protena minoritaria ;vp# tiene como funci n refor'ar las vesculas de gas. La funci n de estas vacuolas es mantener un grado de flota#ilidad ptimo en los h1bitats acu1ticos a las bacterias que las poseen, permiti"ndoles alcan'ar la profundidad adecuada para su modo de vida 2seg!n los casos, para obtener una intensidad adecuada de lu', concentraci n ptima de o(geno o de otros nutrientes3. Las vacuolas de gas son muy frecuentes en eubacterias fototrofas 2#ianobacterias y bacterias fotosint"tiocas purp!reas y verdes3< tambi"n se dan en algunas arqueas 25alobacterium, algunas metan genas3 y en bacterias prostecadas 2&ncalomicrobium$ #rosthecomicrobium3.

4.3.3

CLOROSOMAS

9on vesculas oblongas situadas por debajo de la membrana citopl1smica, que contienen los pigmentos antena de las bacterias fotosint"ticas verdes 2antigua familia %hlorobiaceae3. 9on invisibles a microscopa ptica< miden *,,G*+, nm de longitud y unos +, nm de anchura, estando rodeadas de una monocapa de protenas. 9e disponen por debajo de la membrana citopl1smica, sin estar en continuidad con ella, aunque en muchos casos aparecen conectadas a trav"s de un ped!nculo de naturale'a no lipdica.

4.3.4

MAGNETOSOMAS

9on org1nulos sensores del campo magn"tico terrestre, que aparecen en ciertas bacterias acu1ticas flageladas microaer filas o anaerobias 2p. ej., en &+uaspirillum magnetotacticum3. #onsisten en cristales homog"neos de magnetita 2HeD5F3, de formas cuboGocta"dricas o de prisma he(agonal delimitados por una envuelta protenica. Los diversos cristales suelen disponerse en filas paralelas al eje longitudinal de la bacteria, o en otras agrupaciones regulares de varios unidades, hasta varias decenas. Hueron descubiertas en *=>+, y se sabe que permiten la orientaci n magn"tica a las bacterias que las poseen 2bacterias magnetot1cticas3, determinando la orientaci n de su nataci n. En el hemisferio :orte, el campo magn"tico est1 orientado hacia abajo, y en el sur hacia arriba. Las bacterias magnetot1cticas del hemisferio septentrional se orientan al :, y

las del meridional, al 9. Por consiguiente, cuando las bacterias son removidas de los fondos donde viven, por magnetota(ia pueden volver al fondo, que es donde encuentran las concentraciones de o(geno adecuadas para su modo de vida.

LA ENDOSPORA BACTERIANA Y LA ESPORULACIN 1.1 1.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 1.3.5 1.4 1.5 1. 1.! 1.$ 1.% 1.%.1 1.%.2 1.%.3 1.%.4 2 INTRODUCCIN A LA ESPORULACIN BACTERIANA OBSERVACIN DE LAS ESPORAS ESTRUCTURA Y COMPOSICION #UIMICA DE LA ENDOSPORA PROTOPLASTO O NWCLEO PARED DE LA ESPORA CORTEQA O CRTES CUBIERTAS ESOSPORIO DESENCADENAMIENTO DE LA ESPORULACIN FASES DE LA ESPORULACIN GENTICA MOLECULAR DE LA ESPORULACIN CUERPOS PARASPORALES PROPIEDADES BIOLGICAS DE LAS ESPORAS( SU FUNDAMENTO GERMINACIN DE LA ENDOSPORA PREACTIVACIN ACTIVACIN INICIACIN O GERMINACIN EN SENTIDO ESTRICTO TERMINACIN Y CRECIMIENTO ULTERIOR

ESOSPORAS

3 4 5

DIFERENCIACIONES EN LOS ACTINOMICETOS #UISTES BACTERIANOS DIFERENCIACIONES EN CIANOBACTERIAS

ENLACES

Kasta ahora hemos abordado la estructura y funciones de las diversas partes de la c"lula procariota. Para terminar esta secci n del programa, en este captula vamos a tratar de algunos casos de diferenciaci n celular en bacterias, es decir, procesos por los que a partir de c"lulas -normales. 2vegetativas3 se producen formas celulares especiali'adas. 0lgunas de ellas son formas de reposo, capaces de aguantar mucho tiempo en ausencia de nutrientes 2caso de la endospora3. Muchas de ellas pueden resistir circunstancias ambientales adversas 2la endospora es, de hecho, la forma bacteriana m1s resistente a calor, desecaci n, lu' O%, etc3.

1 LA ENDOSPORA BACTERIANA Y LA ESPORULACIN

1.1 INTRODUCCIN A LA ESPORULACIN BACTERIANA
0lgunas especies de bacterias ;ram positivas 2principalmente de los g"neros Bacillus$ %lostridium$ Sporosarcina y !hermoactinomyces3, disponen de una notable estrategia adaptativa cuando se ven sometidas a privaci n de nutrientes en su medio ambiente@ si los niveles de fuentes de #, :, o P caen por debajo de un umbral, esto constituye una seal a la c"lula de que se avecina un largo perodo de privaci n de nutrientes. Entonces, la c"lula se implica en una serie de complejos cambios gen"ticos, metab licos, estructurales, etc. 2proceso de esporulacin o esporognesis3, que conducen a la diferenciaci n, en el interior de la c"lula vegetativa original, de una c"lula durmiente 2la endospora3. La c"lulaGmadre 2o sea, la c"lula vegetativa original que gener la endospora3 finalmente se autolisa, liberando la espora, que es capa' de permanecer en estado criptobi tico, durmiente, varios decenios, Gincluso siglos. Las esporas son f1cilmente diseminadas por el aire< cuando caen en medios ricos en nutrientes, se desencadena su germinacin, se reinicia la actividad metab lica, de modo que cada espora genera una nueva c"lula vegetativa, capa' de divis n binaria, etc. 5 sea, la esporulaci n se puede considerar como un proceso de supervivencia -en !ltima instancia., la -!ltima carta. que se juegan ciertas bacterias ;ram positivas cuando se enfrentan a condiciones severas de hambre de nutrientes.

&ignificado adaptativo@ Estas bacterias suelen vivir en medios nutricionalmente pobres 2suelos, hierba seca, etc.3. La esporulaci n es un proceso muy refinado que ha aparecido evolutivamente en una lnea filogen"tica de bacterias ;ramGpositivas, y que les permite sobrevivir largos perodos de carencia nutricional. 20tenci n@ :5 son estrictamente formas de resistencia3. Las endosporas son formas de reposo 2y no formas reproductivas3, que representan una etapa del ciclo de vida de ciertas bacterias, y que se caracteri'an por una estructura peculiar, diferenciada respecto de las c"lulas vegetativas, por un estado metab lico pr1cticamente detenido, y por una elevada resistencia a agentes agresivos ambientales. La esporulaci n bacteriana es un sistema modelo donde se pueden estudiar, con relativa sencille', determinados pro#lemas #iolgicos m%s generales@ fqu" bases moleculares y gen"ticas tiene la diferenciacin de un tipo de clula a otro tipo distinto[, fc mo se regula el proceso en funcin del tiempo ( del espacio[, fc mo se -reparten los papeles0 los tipos celulares implicados[, etc. Por esta ra' n, presenta un enorme inter"s para los bi logos, interesados en escudriar las bases ntimas de este tipo de importantes cuestiones, tan frecuentes en los organismos superiores.

1.2 OBSERVACIN DE LAS ESPORAS

0l microscopio ptico, en fresco 2sin teir3, aparecen como cuerpos esf"ricos, ovoides e incluso en algunas especies, cilndricos, mu( refringentes, libres, o a!n incluidos en la c"lula vegetativa 2c"lula madre3. Esporangio X c"lula madre c espora El tamao relativo de la espora, y su situaci n en el esporangio, son criterios ta(on micos importantes en las bacterias esporulantes. 9eg!n que el di1metro de la espora sea o no mayor que el de la c"lula vegetativa@ Esporas deformantes Esporas no deformantes 9eg!n la locali'aci n de la espora dentro del esporangio@ 4erminal 9ubterminal #entral Los esporangios deformantes de %lostridium son caractersticos@ en forma de cerilla o palillo de tambor 2plectridios3 en huso 2clostridios3 Eincin@

:o se tien por los colorantes normales. Kay que for'ar por calor y]o mordientes 2por ejemplo, tras teir refor'adamente con fuchsina, resisten decoloraci n por alcoholG #lK3. 5tra tinci n muy empleada es la refor'ada con verde de malaquita 2+ue es la +ue el alumno reali'a en nuestras pr9cticas de laboratorio3.

1.3 ESTRUCTURA Y COMPOSICION #UIMICA DE LA ENDOSPORA

Partes que comprende la endospora@ Protoplasto o nAcleo 2-core., en ingl"s3, con la membrana citopl1smica de la espora 2membrana esporal interna3. Pared de la espora 2X Germen de la pared de la futura clula vegetativa3. 4orte!a o crte$, rodeado e(ternamente de la membrana esporal e(terna. 4u#iertas E$osporio 2no universal@ las esporas de algunas especies carecen de "l3.

M4*:-I:/?@/ ,+,*8:F34*/ 6), 1),08:/ +/0 ./:8,0 .:43*4./+,0 5, )3/ ,35-0.-:/

1.3.1

PROTOPLASTO O NLCLEO

El citoplasma de la espora est% mu( des,idratado. 9us componentes est1n inmovili'ados en una matri! de -uelatos de iones 4aOO ( %cido dipicol6nico. El citoplasma de la espora contiene altas concentraciones de ion #acc 2*GDW del peso seco de la espora3, y de 1cido dipicolnico 2)P03 2*,W en peso3< ambos est1n

formando un quelato, llamado dipicolinato c1lcico 2)P#3, una sustancia e(clusiva de las esporas bacterianas. Papel del )P4@ #omo veremos, es una -reserva de #aJc., que durante la esporulaci n secuestra este i n, lo que tendr1 un papel importante en la deshidrataci n del protoplasto< durante la germinaci n, la liberaci n del #aJc ser1 fundamental en este proceso. El protoplasto contiene un cromosoma completo, condensado, y todos los componentes indispensables para reiniciar el crecimiento vegetativo cuando la espora germine, pero carece de muchos componentes tpicos de la c"lula vegetativa@ posee una pe-ueQa dotacin de ri#osomas, junto con componentes estables de la maquinaria de sntesis de protenas 20/:t, cofactores, etc.3 0/: polimerasa. nucle sidos monoG y difosfatados, pero no NEP 1no ,a( AEP3 carece de componentes inestables@ no ,a( ARNm5 ni en!imas #iosintticas5 ni amino%cidos ni #ases nitrogenadas li#res5 ni cofactores reducidos 1NA)NR 4oA3 pero en cambio, e(iste una gran cantidad de una serie de pequeas protenas especiales 2llamadas &A&P, del ingl"s -small acidGsoluble proteins.3. #uando se produ'ca la germinaci n, estas protenas ser1n hidroli'adas r1pidamente, y los amino1cidos resultantes ser1n empleados en la sntesis de nuevas protenas necesarias en la germinaci n y crecimiento ulterior. 0dem1s, las 909Ps est1n acomplejando al 0): 2induciendo en "l un cambio conformacional hacia la rara forma 0, en ve' de la 6 habitual3, protegi"ndolo del dao por lu' O%. la -moneda energ"tica. de la espora es el 3=fosfoglicerato, otra mol"cula estable del protoplasto, que ser1 convertido r1pidamente a JGfosfoglicerato, y de "l a PEP 2fosfoG enolGpir!vico3 al germinar la espora 2el PEP es donador de P para generar 04P3. /odeando al protoplasto est1 la mem#rana citopl%smica 1mem#rana interna de la espora3, una bicapa lipdica carente de fluide!, posiblemente como resultado de su estructura policristalina.

1.3.2

PARED DE LA ESPORA

&ituacin@ inmediatamente por encima de la membrana interna de la espora 2ver micrografa a microscopio electr nico, o el esquema de la ultraestructura3. 4omposicin@ a base de un peptidoglucano 2P;3 similar al de la c"lula vegetativa, con sus caractersticos enlaces entre los tetrap"ptidos. 'unciones@ al germinar la espora, dar1 lugar a la pared celular de la nueva c"lula vegetativa, confiri"ndole, mientras tanto, resistencia osm tica. rigen@ se sinteti'a a partir de la prespora, atravesando los precursores la membrana interior que hemos citado arriba.

1.3.3

CORTEDA O CRTEE

/Obs0rvese su aspecto a microscopio electr.nico6 transparente a los electrones$ relativamente gruesa$ a base de l9minas conc0ntricas2. 4omposicin@ un peptidoglucano 2P;3 especial, diferente en composici n al P; de la c"lula vegetativa@ D,W del :0M tiene tetrap"ptidos normales, pero el grado de entrecru'amiento es muy bajo 2?W3. *+W del :0M tiene solo la LGala inicial, en lugar de tetrap"tido. ++W de una modificaci n del 1cido mur1mico 2lactama del 1cido mur1mico3, producida por condensaci n del G#55K lactilo con el G:KJ, para formar la lactama correspondiente3. rigen@ 9e sinteti'a a partir de la c"lula madre, con sus intermediarios ensamblados a nivel de la membrana e(terna que rodea a la corte'a. Propiedades de la corte!a@ *3 4iene un bajo grado de puentes entre tetrap"ptidos 2s lo un ?W3. Ello condiciona@ a3 una estructura m1s la(a, floja y fle(ible que el peptidoglucano normal, capa' de e(pandirse en ausencia de cationes que neutralicen sus grupos negativos 2sobre todo del m)0P y del glut1mico de los tetrap"ptidos3. Esto es la base de su apariencia de gel. b3 su r1pida autolisis, durante la germinaci n de la espora. J3 la lactama del mur1mico condiciona una gran resistencia a la liso'ima. La corte'a est1 limitada por la mem#rana esporal e$terna, procedente de invaginaci n de la membrana citopl1smica de la c"lula vegetativa madre. Posee una polaridad opuesta a la de la membrana esporal interna.

1.3.4

CUBIERTAS

4omposicin ( estructura@ la composici n depende de las especies, pero en general, a base de una o varias protenas de tipo queratina, todas muy ricas en cistena y en amino1cidos hidr fobos, y que llegan a constituir el ?,W en peso seco de la espora. 6uena parte de la cistena se aade postGtraduccionalmente, por modificaci n de la protena inmadura. 0 microscopio electr nico se puede comprobar el gran grosor 2volumen3 de las cubiertas, y su aspecto relativmante denso a los electrones.

Propiedades@ son muy insolubles e impermeables, e impiden la entrada de numerosos agentes qumicos, incluyendo sustancias t (icas. La abundancia de puentes 9G9 las hace muy compactas y muy estables qumicamente.

*.D.+

EEOSPORIO

En B. cereus es una estructura membranosa transparente, a modo de saco cerrado, delgado y flojo, envolviendo al resto de la espora de una forma -suelta., despegado en principio respecto de las cubiertas 2tras la liberaci n de la espora, al perderse el contenido acuoso que haba entre e(osporio y cubiertas, aquel se pega a "stas3. En B. subtilis y B. megaterium, el e(osporio est1 envolviendo a la espora de una forma m1s estrecha, estableciendo algunos contactos fsicos con la superfie de las cubiertas. 4omposicin -u6mica@ me'cla de protenas, polisac1ridos complejos, y lpidos. Propiedades@ muy resistente a en'imas proteolticas, lo que sugiere 2pero no prueba directamente3 que el e(osporio puede representar alg!n papel como barrera de defensa e(terna de la espora.

1.4 DESENCADENAMIENTO DE LA ESPORULACIN

Para que se produ'ca la esporulaci n, se necesitan dos condiciones previas@ *3 los cultivos bacterianos han de estar en #uenas condiciones< J3 cuando cesa el crecimiento e$ponencial, la mayora de las c"lulas entran en esporulaci n, aunque el proceso no es sincr nico 2hay desfases entre unas c"lulas y otras3, de modo que en un lapso de tiempo relativamente breve 2+,+GL horas en Bacillus subtilis3 casi todo el cultivo aparece en forma de esporas, habiendo desaparecido las c"lulas vegetativas. /a divisin celular t6pica de la fase de crecimiento e$ponencial ( la esporulacin son procesos mutuamente e$clu(entes. f8u" est6mulo es el responsable de desencadenar la esporulaci n[ Lo que detiene el crecimiento de estas bacterias y dispara la esporulaci n es un estado de inanicin, de carencia de nutrientes. El nutriente limitante que puede desencadenar la esporulaci n puede ser@ la fuente de carbono, la fuente de nitr geno o incluso la carencia de fosfatos.

1.5 FASES DE LA ESPORULACIN

%amos a estudiar la esporulaci n en Bacillus subtilis o en B. megaterium, dos de las bacterias esporuladas mejor investigadas, y que completan la esporulaci n al cabo de unas >GL horas de su inicio, a D>E#. 9e pueden distinguir siete fases consecutivas 2adem1s de la fase -,. anterior a la esporulaci n3. #ada fase se denota con un n!mero romano, y su duraci n en horas se e(presa como subndice de t, p. ej., tJ. #omo veremos enseguida, cada fase se distingue por un2os3 evento2s3 citol gico2s3 peculiar2es3 y por una serie de cambios bioqumicos propios@ 'ase M 1clula vegetativa3@ 0l final del periodo de crecimiento e(ponencial, la c"lula vegetativa contiene dos cromosomas. 'ase 7 1tM=t93* El material gen"tico 2los dos cromosomas3 se condensa constituyendo un filamento a$ial ancho, que ocupa el centro de la c"lula, seg!n su eje longitudinal. #ada nucleoide est1 unido a uno de los e(tremos de la c"lula. En ve' de iniciarse una divisi n celular sim"trica 2con septo central3, se forman dos esp6culas de la pared celular cerca de los polos hacia el interior, rodeadas de la correspondiente invaginaci n de la membrana citopl1smica. #ada espcula est1 sealando una 'ona donde se est1 formando el anillo de HtsQ 2protena contr1ctil de tipo tubulina@

v0ase el tema D3 9e sinteti'an y se liberan al medio anti#iticos y varias e$oen!imas. Ona serie de proteasas se encargan del turnover de protenas intracelulares, cuyos amino1cidos constituyentes ser1n empleados para sinteti'ar nuevas protenas especficas de la esporulaci n. 'ase 77 1t9=t23* 9e termina por formar un septo transversal acntrico, cerca de un polo de la c"lula, por invaginaci n de la membrana citopl1smica, y deposici n de nuevo peptidoglucano entre las dos membranas adyacentes. #ada nucleoide queda segregado en uno de los dos compartimentos -ue se ,an formado@ un cromosoma va al compartimento pequeo 2compartimento de la preespora3< la otra copia del cromosoma va al compartimento grande 2clula madre3. En esta fase contin!a la sntesis de los antibi ticos y de las e(oen'imas 2serinaGproteasas, metaloGproteasas, ribonucleasas, Gamilasa, etc3. 'ase 777 1t2=t33* 7ndependi!acin del protoplasto de la preespora respecto de la clula madre. Para ello, lo primero que ocurre es la degradaci n selectiva del peptidoglucano del septo que se haba depositado en la fase && 2esta degradaci n comien'a por el centro, es decir, por donde se haba cerrrado, y sigue hacia la periferia, y en ella intervienen los productos de varios genes3. Entonces, la membrana citopl1smica de la c"lula madre va creciendo unidireccionalmente alrededor de la preespora, hasta que "sta queda libre en el citoplasma del esporangio. 5bs"rvese que el citoplasma de la preespora queda rodeado por dos mem#ranas de polaridad opuesta@ la interior tiene la polaridad normal, pero la e(terior, derivada del crecimiento de la membrana de la c"lula madre, tiene polaridad invertida 0 partir de esta fase el turnover 2renovaci n3 de protenas s lo tendr1 lugar en la c"lula madre, deteni"ndose en el compartimento de la preespora. 'ase 7. 1t3=t43* 9e forma casi por completo la corte!a de la espora, por deposici n de peptidoglucano entre las dos membranas. 9in embargo este P; a!n no est1 -maduro. 2no tiene todava las caractersticas que estudiamos en el apartado *.D.D3. 4ambi"n se deposita el peptidoglucano de la pared celular 2que constituye el germen de la pared celular de la futura c"lula vegetativa3. #oincidiendo con esto, la preespora ad-uiere su aspecto refr%ctil al microscopio ptico en fresco. #omien'a la sntesis del %cido dipicol6nico 1)PA3, as como la acumulacin de 4a2O. En las bacterias que lo poseen, en esta fase comien'a la sntesis del e(osporio. 'ase . 1t4=t;5;3*

Los materiales de las cu#iertas 2que se haban ido sinteti'ando durante las fases && y &&& en el compartimento de la c"lula madre3, comien'an a depositarse por fuera de la membrana esporal e(terna. 0l final de esta fase se ad-uiere la resistencia al octanol. #ontin!a la acumulaci n de )P0, que sigue secuestrando iones #aJc 2formaci n del quelato de dipicolinato c1lcico, )P#3. 'ase .7 1t;5;=tH3* La preespora madura ,asta espora. Madura la corte'a 2para generar el caracterstico P; cortical, m1s la(o, con su bajo porcentaje de entrecru'amientos Gpor actuaci n de endopeptidasasG y la lactama del :0M3. Maduran las cubiertas. El citoplasma de la espora se hace m1s ,omogneo ( m%s denso a los electrones. Por una serie de ra'ones a!n no totalmente aclaradas, la espora se hace resistente al calor ( al cloroformo. 9e adquiere resistencia a las radiaciones ultravioleta 1C.3. 9e adquiere resistencia a la liso!ima. 'ase .77 1tH=t<3* /i#eracin de la espora madura por autolisis de la c"lula madre. las bacterias que han producido e(osporio, cuando la espora sale al e(terior, este e(osporio pierde su contenido de citoplasma 2procedente de la c"lula madre3, quedando como un saco vaco y plegado, unido a las cubiertas. La parte superior de la figura muestra un gr1fico de los principales cambios que acabamos de comentar, e(presados en funci n del tiempo transcurrido desde el inicio de la esporulaci n.

1. GENTICA MOLECULAR DE LA ESPORULACIN

Las c"lulas pueden detener el proceso de la esporulaci n si durante las F primeras fases se les suministra el nutriente que estaba limitando y que fue responsable del desencadenamiento 2efecto de des#lo-ueo meta#lico3. Pero a partir de la fase % el aporte de nutrientes no tiene ya ese efecto inhibidor@ el proceso de la esporulaci n ya es irreversible, y se dice que la c"lula est1 comprometida 12 o#ligada3 a esporular. El proceso de la esporulacin es mu( ordenado en el tiempo ( en el espacio. En su base gen"tica e(iste un conjunto de varios operones especficos de la esporulaci n /operones spo2, sometidos a un finsimo control gen"tico espacial y temporal. El conjunto de estos operones 2que se encuentran en cuatro 'onas distintas del cromosoma3, se denomina esporuln, y comprende m1s de *J+ genes. Las principales caractersticas de los operones del esporul n son@

Los operones est1n inactivos durante el crecimiento vegetativo< se van activando de modo ordenado ( secuencial, para luego ser reprimidos 2una ve' han actuado3< est1n sometidos a interacciones pleiotr picas unidireccionales< e(iste una -comunicaci n. regulatoria entre el compartimento de la espora y de la c"lula madre 2interacciones espaciales3< dentro de los mecanismos gen"ticos implicados en la e(presi n y regulaci n de los distintos operones correspondientes a fases distintas de la esporulaci n, un papel muy importante es el jugado por las su#unidades sigma 1 3 alternativas de la 0/:G polimerasa.

1.! CUERPOS PARASPORALES

0lgunas bacterias esporuladas, como Bacillus thuringiensis$ B. popiliae y algunas especies de %lostridium, forman cristales proteicos en el esporangio simult1neamente a la formaci n de la endospora@ son los llamados cuerpos parasporales. #ada c"lula madre e(hibe una sola inclusi n, que se puede presentar libre en el citoplasma, o bien englobada en el e(osporio de la espora. Los cuerpos parasporales pueden ser amorfos, pero los m1s tpicos son pseudocristales octadricos 1#ipiramidales3. Est1n compuestos de la agregaci n regular de subunidades de una glucoprotena de unos *J, C)a, sinteti'ada durante la fase &%. La funci n de estos cuerpos parasporales en la esporulaci n es desconocida 2e incluso puede que de hecho, no tenga tal tipo de funci n3. 6ajo condiciones alcalinas, se disuelven y la protena se convierte en una poderosa to$ina para larvas de lepidpteros y otros insectos, cuando las ingieren v6a oral 2pero no por va parenteral3. %eamos c mo se produce el proceso de la to(icidad@ *. La oruga come materia vegetal que lleva bacterias esporuladas. El cuerpo parasporal se libera junto con la espora, cuando la c"lula madre se autolisa. J. Los cuerpos parasporales se disuelven en el tracto digestivo de la oruga 2que es alcalino3, la protena sufre proteolisis, lo que la transforma en una to(ina. D. Esta to(ina altera la permea#ilidad del epitelio intestinal de la oruga, de modo que los lquidos alcalinos del intestino pasan a la ,emolinfa, que incrementa su pK por encima de L, lo cual termina provocando la par%lisis r%pida del insecto5 ( finalmente su muerte. El significado #iolgico m1s probable de este fen meno es que la producci n de cuerpos parasporales sea una variante de la esporulaci n que evolucion durante la adaptaci n de estas bacterias a sus nichos ecol gicos, como una manera de asegurar la germinacin de las endosporas@ la oruga ingiere los cristales junto con las esporas. Los cristales parasporales matan a la oruga, que se pudre. La oruga muerta y en putrefacci n

asegurara un entorno adecuado en nutrientes para que se alimentaran y multiplicaran las c"lulas vegetativas que surgieran de la germinaci n de esas esporas. )esde hace tiempo ciertos grupos de agricultores vienen usando in culos de bacterias esporuladas de las especies productoras de cuerpos parasporales para rociar sus plantas y protegerlas de insectos@ estamos ante un aut"ntico insecticida biol gico, biodegradable, selectivo hacia las plagas e inofensivo para los seres superiores. La moderna &ngeniera ;en"tica ha logrado insertar y e(presar genes codificadores de las to(inas parasporales de Bacillus thuringiensis en plantas de cultivo. Koy da e(isten millones de hect1reas de cultivo de plantas transg"nicas M6tM 2sobre todo algod n, ma', y patata3 que dependen menos de los insecticidas qumicos merced a estos genes bacterianos 2aunque ello no ha evitado las crticas de ciertos grupos ecologistas opuestos por sistema a todo lo que suene a manipulaci n gen"tica por t"cnicas de 0): recombinante3.

1.$ PROPIEDADES BIOLGICAS DE LAS ESPORAS( SU FUNDAMENTO

Las endosporas son clulas en estado de dormancia, con una #a"6sima tasa meta#lica 2hipometabolia, la menor que e(iste en el mundo vivo3, y capaces de conservar su vitalidad durante largusimos perodos. 9on muy resistentes a la acci n de diversos agentes qumicos 2octanol, cloroformo3 y fsicos 2altas temperaturas, congelaci n, desecaci n, radiaciones3. *3 Nipometa#olia* Poseen la m1s baja tasa respiratoria de todos los seres vivos. Por ello son capaces de sobrevivir en ausencia de nutrientes durante largos perodos de tiempo. J3 )ormancia* Esta propiedad se refiere al hecho de que la espora tiene una gran inercia a los sustratos e( genos. #omo veremos, la espora s lo perder1 la dormancia cuando se haya activado para la germinaci n. D3 Resistencia al calor* Las esporas de ciertas especies resisten el calor h!medo de *J,o# durante *, min, lo cual condiciona los par1metros para esterili'ar materiales /v0ase el cap7tulo EF titulado <&cci.n de agentes ,7sicos sobre las bacterias2. Esta elevada resistencia a las altas temperaturas es un subproducto de los cambios evolutivos que condujeron a la deshidrataci n como medio para lograr la hipometabolia y la dormancia. Por lo tanto, la deshidrataci n es la clave de las anteriores propiedades. 2En cambio, como dijimos antes, al menos parte de la resistencia al calor seco, es decir, en ausencia de vapor de agua, se debe a las protenas 909P, que protegen al 0): de los daos o(idativos de este tipo de calor3. F3 )es,idratacin* El muy bajo contenido en agua de la espora 2,.D g de agua]g de peso seco frente a los DGF g de agua]g de peso seco de la c"lula vegetativa3 hace que la espora sea muy refr1ctil al microscopio ptico en fresco. Ello condiciona las propiedades *, J y D. f#u1l es el mecanismo de la deshidrataci n, base a su ve' de tantas propiedades biol gicas de las endosporas[ El tema es a!n objeto de debate. %amos a e(poner

brevemente una hip tesis 2*=L=3, seg!n la cual habra D etapas en la consecuci n de la espora deshidratada y resistente al calor@ a3 En las fases &&& y &% el 1cido dipicolnico va entrando al protoplasto de la prespora. 9imult1neamente el #aJc entra desde el e(terior a la c"lula madre por transporte activo, y de ella al protoplasto de la prespora por difusi n facilitada. 9e forma el correspondiente quelato de dipicolinato c1lcico 2)P#3. Este es un proceso con retroalimentaci n positiva, ya que conforme el #aJc queda -secuestrado. en forma de quelato 2lo que significa que no hay de hecho iones #aJc libres en el interior de la prespora3, se facilita m1s la entrada de mayores cantidades de #aJc. Parte del #aJc y de otros cationes se acomplejan tambi"n con macromol"culas del protoplasto. 4odo ello redunda en que la corte!a se -ueda sin cationes< por lo tanto, no hay posibilidad de neutrali'ar las cargas negativas del peptidoglucano cortical las cargas negativas de la corte'a se repelen se produce la e$pansin del peptidoglucano cortical en su e(pansi n, la corte'a se -topa. con las cubiertas rgidas, por lo que presiona so#re el protoplasto sale m%s agua del protoplasto. b3 Resultado final* termoesta#ili!acin 12 termorresistencia3 del protoplasto. La gran p"rdida de agua hace que los diversos compuestos del protoplasto se compacten entre s, lo que facilita sus interacciones con los cationes. El resultado es la formacin de un gel a #ase de una matri! constituida por complejos supramoleculares, macromol"culas y pequeas mol"culas densamente empa-uetados5 unidos entre s6 e inmovili!ados. Parece ser que esta es la base principal de la enorme resistencia al calor h!medo por parte de la endospora. +3 Resistencia a los ra(os C.* Parece que depende de varios componentes@ a3 absorci n de lu' O% por las cu#iertas< b3 por el )P4< c3 pero cada ve' est1 m1s claro que las protenas &A&P tienen un papel central en esta resistencia a los O%. #omo ya dijimos, las 90P9 de tipo s]t acomplejan al 0): y favorecen su configuraci n de tipo 0, lo cual a su ve' provoca un cambio en su fotoqumica 2ver apartado siguiente3< d3 cam#io en la foto-u6mica del A)N de la espora@ se puede e(plicar parcialmente por la misma des,idratacin del protoplasto, que impide que se formen dmeros de pirimidina entre pirimidinas adyacentes de una misma cadena del 0):. #omo veremos en el captulo *D, estos dmeros de pirimidina constituyen el principal tipo de fotoproductos generados por rayos O% en el 0): de la c"lula vegetativa, base de la mayor parte de los efectos delet"reos de estas radiaciones. Por otro lado, las 909P de tipo s]t que acomplejan el 0): hacen que en la espora la lu' O% provoque otro tipo de alteraci n, llamada fotoproducto de la espora 2que consiste en +GtiminilG+,?Gdihidrotimina3 que se produce en menor cantidad. 0unque la

acumulaci n de fotoproductos de la espora puede ser igual de letal que la de los dmeros de pirimidina, cuando germina la espora se pone inmediatamente en marcha un eficiente sistema de reparaci n especfico de ese fotoproducto. ?3 resistencia a agentes -u6micos* La resistencia de la endospora a agentes como octanol, cloroformo, etc. se debe a la impermea#ilidad de las cu#iertas, gracias a su gran grosor y su peculiar composici n a base de protenas ricas en amino1cidos hidr fobos y con abundantes puentes disulfuro 2cistinas3. La resistencia a la liso'ima se debe por un lado a la propia impermeabilidad de las cubiertas, y a la resistencia de la corte'a.

1.% GERMINACIN DE LA ENDOSPORA

La germinaci n es el proceso por el cual una espora se convierte al estado vegetativo. Es mucho m1s r1pida que la esporulaci n 2dura unos =, minutos3. Podemos considerar en ella cuatro etapas, seg!n el modelo de Hoster y Nohnstone 2*==,3@ *. preactivaci n J. activaci n D. iniciaci n 2o germinaci n en sentido estricto3 F. crecimiento ulterior 2entrada en fase vegetativa3

1.%.1

PREACTIVACIN

0ntes de que la espora est" en condiciones de germinar se requiere que sus cu#iertas se alteren. En la naturale'a esto ocurre por erosin por enve"ecimiento progresivo. 0rtificialmente, en laboratorio, se puede recurrir a alg!n procedimiento para alterar esas cubiertas@ tratando las esporas a altas temperaturas, pero inferiores a su inactivaci n 2*,,o# durante unos minutos3< por radiaciones ioni'antes< por pK bajos< por tratamiento con sustancias que posean grupos G9K libres 2p. ej., mercaptoetanol3.

1.%.2

ACTIVACIN

La activaci n es una etapa a!n reversi#le, desencadenada por un agente qumico e(terno 2germinante3 presente en el medio. Este agente es variable seg!n las especies@ iones inorg1nicos 2MnJc, MgJc3< LGalanina en B. subtilis< glucosa u otros a'!cares<

adenina u otras bases nitrogenadas. El germinante es detectado por un receptor alost"rico a nivel de la membrana esporal interna. Ona ve' que dicho receptor se activa, adquiere una capacidad proteoltica especfica que le permite romper una proen'ima que hasta ese momento se encontraba unida covalentemente al peptidoglucano de la corte'a. La en'ima resultante reconoce la lactama del :0M y comien'a a hidroli'ar el peptidoglucano cortical. La consecuencia es que comien'a a entrar agua al protoplasto de la espora, por lo que la espora pierde su caracterstica refringencia, y se comien'a a perder la resistencia al calor. )urante toda esta etapa el meta#olismo est% aAn latente.

1.%.3

INICIACIN O GERMINACIN EN SENTIDO ESTRICTO

En esta etapa la germinaci n se hace ya irreversi#le, y se rompe definitivamente el estado de dormancia, si bien el meta#olismo es endgeno 2no depende todava de sustancias e(ternas3. Los principales acontecimientos bioqumicos son@ se pierde )PA, lo que supone p"rdida de #acc< este 4aOO pasa al crte$, donde neutrali'a las cargas negativas se favorece la re,idratacin del protoplasto ( su ,inc,amiento, favorecido por la concomitante contracci n del c rte(, mientras contin!a y se completa r1pidamente la hidr lisis del P; cortical< el 3=fosfoglicrico 2DGP;3 se convierte en JGP;, y "ste en PEP, que a su ve' dona su fosfato de alta energa para producir AEP< las pequeas protenas &A&Ps se ,idroli!an por una proteasa especfica que hasta ese momento estaba inactiva. )e este modo los amino1cidos constituyentes de las 909Ps se reutili'an para la sntesis de nuevas protenas por parte de la pequea dotaci n de ribosomas y dem1s mol"culas accesorias< La 0/: polimerasa comien'a a sinteti'ar 0/: 2comien'a la transcripci n de genes vegetativos3.

1.%.4

TERMINACIN Y CRECIMIENTO ULTERIOR

0parece ya el meta#olismo e$geno, de modo que la espora puede tomar nutrientes del e(terior y metaboli'arlos. Los eventos bioqumicos y estructurales m1s notorios son@ se sinteti'a A)N< el protoplasto crece a!n m1s< la pared de la espora sirve como cebador 2germen3 para la producci n de la pared de la clula vegetativa naciente< la c"lula vegetativa sale por rotura de las cu#iertas, que puede ser de tipo polar o ecuatorial. Kay que aclarar que al salir, esta c"lula vegetativa se tie como ;ramG negativa, y s lo adquirir1 su tpica grampositividad despu"s de la primera divisi n.

S/+45/ 5, +/ 3),H/ *K+)+/ H,I,8/84H/ /+ ?43/+ 5, +/ I,:143/*4F3 . O90,:H/ +/ :-8):/ 5, +/0 *)94,:8/0

2 EEOSPORAS
)eterminadas bacterias /Methylosinum$ (hodomicrobium2 forman esporas reproductivas por gemaciones sucesivas al final de sus prostecas. Estas e(osporas poseen una envuelta a base de pared rodeada de una c1psula o cubierta gruesa.

3 DIFERENCIACIONES EN ACTINOMICETOS
Los actinomicetos constituyen un grupo amplio y complejo de bacterias ;ram positivas con tendencia a un tipo de crecimiento micelial y un estilo de vida similar a los hongos. Muchos de los ta(ones de 0ctinomicetos y bacterias relacionadas poseen c"lulas diferenciadas de tipo reproductivo, gen"ricamente conocidas como esporas. Estudiaremos brevemente la diferenciaci n en dos g"neros tpicos. Gnero Actinoplanes Las especies de este g"nero producen micelios vegetativos de sustrato 2subterr1neos3. 0lgunos de estos micelios generan hifas verticales que sobresalen a la superficie. El e(tremo de cada una de estas hifas se diferencia para constituir un saco llamado esporangio, que se fragmenta en un conjunto de esporas mviles 2flageladas3 llamadas !igosporas o esporangiosporas. Gnero Streptomyces

Horma un micelio de sustrato ramificado, interrumpido de ve' en cuando por pared transversal 2son por lo tanto organismos cenocticos, es decir, el segmento de micelio limitado por dos tabiques sucesivos contienen varios cuerpos nucleares3. #uando hay limitaci n de nutrientes se comien'a a formar un micelio areo a partir de ramificaciones de las hifas subterr1neas. En los e(tremos de algunas de estas hifas a"reas las c"lulas se diferencian en cadenas de esporas. )urante la formaci n de estos micelios a"reos y de las esporas la poblaci n de micelios subterr1neos sufre una lisis masiva. Propiedades de las esporas de los estreptomicetos@ la pared celular de la espora es m1s gruesa que la de la c"lula vegetativa< no hay cambio cualitativo en el peptidoglucano< no hay c rte( ni cubiertas< son mu( ,idrof#icas@ se resisten a ser suspendidas en agua. Esto parece que se debe a una vaina que rodea a la pared celular, compuesta a base de t!bulos autoGensamblables. resisten m1s al calor y a la desecaci n en comparaci n a las c"lulas vegetativas, pero menos que las endosporas. son meta#licamente durmientes 2c"lulas en reposo3.

4 #UISTES BACTERIANOS
9on c"lulas que se producen en algunas especies por engrosamiento de la pared celular de la clula vegetativa, por deposici n de nuevos materiales e(ternamente a la membrana citopl1smica, al mismo tiempo que se acumulan materiales de reserva en el citoplasma. Poseen meta#olismo endgeno, y resisten al calor, a la desecaci n y a agentes qumicos m1s que la correspondiente c"lula vegetativa 2pero menos que las endosporas3. Ejemplos@ 8uistes de &'otobacter y Bdellovibrio. Microquistes de Mi(obacterias, llamados mi$osporas* sus envueltas constan de una corte'a, rodeada de cubiertas 2interna y e(terna3. Estas cubiertas se componen de una glucoprotena muy rica en polisac1ridos.

5 DIFERENCIACIONES EN CIANOBACTERIAS
En las cianobacterias filamentosas 2que forman tricomas3 se pueden observar dos tipos principales de c"lulas diferenciadas a partir de las vegetativas@ heteroquistes y acinetos. Netero-uistes 12 ,eterocistes3

9on c"lulas de trmino, sin funci n reproductiva, especiali!adas en la fi"acin de nitrgeno molecular 1N23, de mayor tamao que las c"lulas vegetativas. La cone(i n entre c"lulas vegetativas y heteroquistes se establece a trav"s de un estrangulamiento de los polos de "stas. La uni n est1 atravesada por una serie de finos canales llamados microplasmodesmos, que reducen al mnimo el intercambio de sustancias entre ambas c"lulas. Por fuera de la pared celular 2que es de tipo ;ramGnegativo3, e(isten tres cu#iertas@ una capa laminada interna a base de glucolpidos e(clusivos de cianobacterias< una capa ,omognea central a base de polisac1ridos< una capa fi#rosa e$terna, tambi"n polisacardica, pero menos compactada. Estas tres capas evitan la difusin del 2 al interior del heteroquiste, lo que representa uno de los mecanismos para la proteccin de la nitrogenasa 2complejo en'im1tico que reduce el :J a :KFc, y que es muy sensible al o(geno3. Pero el heteroquiste dispone de m1s -estrategias. para la protecci n de la nitrogenasa@ aparte de los microplasmodesmos, en las uniones con las c"lulas vegetativas adyacentes se forman sendos -tapones. de cianoficina< los tilacoides se disponen como un retculo polar y perif"rico, y carecen de fico#ilisomas, por lo que no pueden reali!ar la fase 77 de la fotos6ntesis. Por lo tanto, los heteroquistes no generan o$6geno, ya que s lo reali'an la fotofosforilaci n cclica. Acinetos 12a-uinetos3 9on formas de reposo que se originan a partir de c"lulas vegetativas, por acumulaci n de nuevas capas de materiales polisacardicos por fuera de la pared celular, y por formaci n de ac!mulos de reserva en el citoplasma. /esisten m1s que las c"lulas vegetativas los perodos de desecaci n y de congelaci n, pero no al calor. #uando las condiciones ambientales mejoran, se producen sucesivas divisiones transversales en el acineto, que finalmente se convierte en un filamento m1s corto y menos grueso que los tricomas, llamado ,ormogonio.

NDICE( 1 INTRODUCCIN AL CRECIMIENTO BACTERIANO

2 2.1 2.2 3 3.1

CICLO CELULAR PROCARITICO CICLO CELULAR EN FUNCIN DEL TIEMPO DE GENERACIN CONTROL DEL CICLO CELULAR MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS MEDIDA DE MASA CELULAR MTODOS DIRECTOS MTODOS INDIRECTOS MEDIDA DEL NWMERO DE INDIVIDUOS MTODOS DIRECTOS MTODOS INDIRECTOS

3.1.1 3.1.2 3.2 3.2.1 3.2.2 4 4.1 5

CRECIMIENTO BALANCEADO =Y E#UILIBRADO? ESPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADO CULTIVO CONTINUO =SISTEMAS ABIERTOS?. #UIMIOSTATO CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS

.1 CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO L#UIDO .2 CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SLIDOS

1 INTRODUCCIN AL CRECIMIENTO BACTERIANO

9e suele definir el crecimiento de cualquier sistema biol gico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicaci n celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicaci n se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisi n o por gemaci n, lo que ocurre es un aumento de la poblaci n. En los microorganismos cenocticos 2en los que la duplicaci n del genoma no se acompaa de divis n celular3 el crecimiento se traduce en aumento de

tamao de la -colonia. cenoctica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista@ 0 escala individual 0 escala poblacional Los eventos de crecimiento en el 1mbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de "ste podemos abordar los siguientes temas@ inicio y transcurso de la replicaci n cromos mica y de pl1smidos /v0ase tema ?2< segregaci n de cromosoma y pl1smidos a las c"lulas hijas< sntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular /tema D2< seales que coordinan la replicaci n gen mica con la divisi n celular. El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes t picos@ cin"tica del crecimiento< factores que afectan al tiempo de generaci n 2g3< factores ambientales que limitan el crecimiento. En el presente captulo nos dedicaremos al estudio de algunos aspectos del ciclo celular procari tico, pero sobre todo nos centraremos en el crecimiento de poblaciones 2que es el m1s frecuentemente empleado al trabajar con microorganismos3, con una visi n de algunos m"todos para obtener crecimientos balanceados. La influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento son el objeto de los temas EF 2agentes fsicos3 y EG 2agentes qumicos3.

CICLO CELULAR PROCARITICO

On ciclo celular es una secuencia de acontecimientos interconectados que comien'a con la formaci n de una nueva c"lula y termina cuando dicha c"lula se divide en otras dos hijas. Los ciclos celulares se describen generalmente atendiendo a una serie de eventos identifica#les que se van produciendo en una secuencia fi"a, de modo que para que se produ'ca cada uno de ellos hace falta que se complete el anterior. Los periodos del ciclo celular procari tico son@ fase # 2equivalente a la 9 eucari tica3@ replicaci n del 0): cromos mico< fase ) 2equivalente a ;J c M3@ se distingue porque su terminaci n coincide con el final de divisi n celular< fase innominada, equivalente a la ;* eucari tica. Lo caracterstico del ciclo es que las fases 4 ( ) son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generaci n 2g3, lo hace a e(pensas de la fase -;*.. Por ejemplo, en )scherichia coli, # X unos F, min, y ) X unos J, min.

2.1 CICLO CELULAR EN FUNCIN DEL TIEMPO DE GENERACIN

%amos a estudiar con el ejemplo de ). coli qu" ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de generaci n. 4uando gS4O) E(iste fase M;*M 2intervalo que precede a la replicaci n3. En estas condiciones podemos observar ntidamente periodos diferenciados entre s 2de sntesis de 0): y de divisi n celular3. 4uando g24O) Ia no e(iste ;*, y cada ronda de replicaci n comien'a inmediatamente tras la precedente divisi n celular 2es decir, cada c"lula hija reci"n nacida se embarca inmediatamente en replicar el cromosoma, y una ve' que ha terminado de replicarlo, la c"lula inicia la divisi n celular3. 4uando gT4O) Las rondas de replicaci n de un ciclo se inician antes de que haya terminado la divisi n celular del anterior 2superposici n parcial entre fases # y )3. 4uando gT4 ya no se puede detectar fase ) como tal. La sntesis de 0): es continua durante todo el ciclo. 9e inician rondas de replicaci n cromos mica antes de que haya terminado la anterior. Esto se traduce en que los cromosomas muestran un tpico patr n de replicacin dicotmica y en que dichos cromosomas pasan a cada c"lula hija ya embarcados en una nueva ronda de replicaci n. Ona caracterstica del ciclo es que, cuanto m1s rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generaci n 2g3, mayor es el tamao medio de las c"lulas. Es decir, los individuos de una cepa bacteriana que est" en un medio rico son m1s grandes que los individuos de esa misma cepa creciendo en un medio pobre.

2.2 CONTROL DEL CICLO CELULAR

)e lo anterior se deduce que debe de e(istir alg!n tipo de acoplamiento entre las ondas de replicaci n y la divisi n celular. Este es un campo de investigaci n a!n joven, del que no conocemos todava todos los detalles. Las copias de cromosomas reci"n replicadas se encuentran en principio adyacentes de la membrana citopl1smica 2funidas a sendos mesosomas[3 probablemente unidas a trav"s de sus respectivos orgenes de replicaci n 2ori%3. :o se sabe muy bien c mo esas copias se van separando de modo que cada una va a parar a una c"lula hija. 9e sabe que en este reparto o particin de los cromosomas intervienen varias protenas, entre ellas Par0 y Par6, que en las c"lulas a punto de dividirse se sit!an en los dos polos opuestos. Es posible que e(ista alg!n mecanismo -activo. para separar estos cromosomas, pero parece ser que tambi"n intervienen los mecanismos -pasivos. de crecimiento de membrana y pared celular en el tabique transversal en crecimiento.

4ambi"n se sabe hoy que e(isten dos secuencias paralelas e independientes de acontecimientos que controlan el ciclo celular@ un control es sensible a una masa umbral celular para desencadenar el inicio de la replicaci n del cromosoma, y el otro responde a cierta longitud umbral 2en el caso de los bacilos3 para que ocurra el reparto de los cromosomas y la formaci n del tabique. El comien'o de la replicaci n del cromosoma se indica mediante la uni n de muchas unidades de la protena )na0 2unida a 04P3 al origen de replicaci n 2ori%3. Ona ve' que se ha iniciado una ronda de replicaci n en ori%, esta regi n queda hemimetilada, pero en ve' de ser metilada inmediatamente, queda secuestrada u ocultada a efectos de la metilasa )am y de la maquinaria de replicaci n. 9e sugiere que en este fen meno est1 implicada una protena 29eq03, que a su ve' ayudara a esconder a ori% en la membrana. 9 lo m1s tarde 2y por factores desconocidos, pero que puede que tengan que ver de nuevo con la proporci n entre sitios de inicio y alg!n par1metro celular como masa o volumen3, vuelven a quedar las secuencias ori% disponibles para su metalici n y uso en una nueva ronda.
:540@ La metilasa )am es una en'ima que metila las dos adeninas de la secuencia ;04#]#40;. El alumno seguramente sabr1 ya que esta metilasa metila las adeninas de esa secuencia a partir de 0): hemimetilado. El 0): de la c"lula est1 totalmente metilado en esas secuencias, pero cuando pasa la horquilla de replicaci n, la cadena reci"n sinteti'ada carece de esa modificaci n, hasta que llega la metilasa )am, que reconoce la secuencia hemimetilada y metila la adenina de la cadena no metilada. On rasgo curioso de la regi n ori% para el inicio de la replicaci n cromos mica es que contiene una proporci n de secuencias ;04#]#40; muy superior a la media del resto del genoma.

El comien'o de la tabicaci n parece que requiere dos seales@ por un lado, el cromosoma ha debido terminar su replicaci n y las copias hijas deben de estar separadas en e(tremos opuestos por otro lado, la c"lula debe haber alcan'ado una longitud umbral #omo ya vimos en el cap7tulo D, llegado el momento, la protena HtsQ 2que hasta entonces estaba diseminada por toda la c"lula3, se concentra ahora en la parte central, sealando el plano de la tabicaci n@ se forma un -anillo citocin"tico. o divisoma, en el que la HtsQ se va -contrayendo. hacia el interior 2hidroli'ando ;4P hasta ;)P3. 0 continuaci n se van ensamblando en el divisoma varias protenas Hts, entre ellas la P6PD, que como vimos es una transglucosidasaGtranspeptidasa especfica del tabique, que va produciendo peptidoglucano en el septo transversal. La terminaci n del tabique seala el final del ciclo celular.

3 MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS

En la pr1ctica habitual del laboratorio, los e(perimentos se reali'an siempre con poblaciones bacterianas, a menudo tomando muestras en diversos momentos de su

crecimiento en un medio de cultivo. En el resto del captulo nos vamos a referir al crecimiento microbiano a escala de poblaciones. #omen'aremos con algunos m"todos habituales de medir ese crecimiento poblacional, algunos de los cuales ser1n aprendidos -en vivo. por el alumno en las pr1cticas de laboratorio. El crecimiento de una poblaci n o cultivo bacterianos se puede e(presar en funci n de@ aumento de masa del cultivo aumento del n!mero de c"lulas 0mbos tipos de e(presiones son equivalentes entre s en cultivos que est"n en crecimiento #alanceado o e-uili#rado 2en el que todos los componentes aumentan una misma proporci n por unidad de tiempo3.

3.1 MEDIDA DE MASA CELULAR

3.1.1 MTODOS DIRECTOS
En estos m"todos se requieren preparaciones limpias, sin partculas e(traas. 93 )eterminacin del peso ,Amedo* se tara un tubo de centrfuga< se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante< se determina el peso del sedimento.
I*5,*/.*-.*+.7( B60*;.7 .66,6.7" ;.G-;, 0: :F@1-;, -*+.65.:1:06 6.+.*-;," 51C0 510*+F0 ;.8.*;. 0 71 /.D ;. :0 <,690 C +-8, ;. 0B61805-,*.7 ;. :0 5.80" -*+.*7-;0; ;.: .980@1.+09-.*+," .+5.

23 )eterminacin del peso seco* como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado 2*,+E#, toda la noche3, hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el *,G*+W de los valores de peso h!medo.
I*5,*/.*-.*+.7( 9H+,;, +.;-,7, =6.@1-.6. 9153, +-.98,? C 5,* G07+0*+.7 .66,6.7( .7 ;-<F5-: 8.706 9.*,7 ;. 1 9B 5,* .J05+-+1; .* :07 G0:0*D07 30G-+10:.7 ;. :0G,60+,6-,. 1 9B ;. 8.7, 7.5, .@1-/0:. 0 1*07 5J1&% G05+.6-07.

33 )eterminacin del nitrgeno total@ t"cnica de microG7jeldahl. 43 )eterminacin de un componente caracter6stico@ peptidoglucano, 0):, 0/:, protenas, 04P, clorofilas en organismos fotosint"ticos, etc.
C,9.*+06-,7( 7. 71.:. 1706 .* G05+.6-07 8060 :07 @1. ,+6,7 9H+,;,7 9K7 <K5-:.7 ;0* .66,6.7 ;.G-;, 0 @1. <,690* B619,7 *, ;-78.670G:.7" 56.5.* .* <-:09.*+,7" .+5. S. .98:.0* .* ;.+.69-*05-,*.7 ;. 56.5-9-.*+,7 .* 09G-.*+.7 *0+160:.7.

3.1.2

MTODOS INDIRECTOS

93 +edida de consumo de nutrientes o de produccin de algAn meta#olito por unidad de tiempo . Ejemplos@ consumo de o(geno 285J3 y consumo de carb nico 28#5J3, determinados por el respir metro de Parburg. Producci n de 1cidos. 23 +todos tur#idimtricos 1pticos3. 9on muy usados en la pr1ctica cotidiana del laboratorio. La base com!n de estos m"todos consiste en la medici n de la cantidad de lu' dispersada o transmitida a trav"s de un cultivo bacteriano. R.5,6;.9,7 0@1F @1. :07 7178.*7-,*.7 G05+.6-0*07 ;-78.670* :0 :1D" 0: -B10: @1. 510:@1-.6 806+F51:0 8.@1.P0 7178.*;-;0 .* 0B10 =.<.5+, TC*;0::?. L0 ;-78.67-A* ;. :0 :1D .7" ;.*+6, ;. 5-.6+,7 :F9-+.7" 86,8,65-,*0: 0 :0 9070 ;.: 51:+-/,. a3 Espectrofotmetro@ Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o 6ioqumica. Mide la densidad ptica 2).5.3, es decir la absorbancia 2una medida de la lu' transmitida a trav"s de la supensi n3. Por supuesto, hay que reali'ar una curva est1ndar para relacionar los valores de 0 con la masa bacteriana en una muestra problema.
C,9.*+06-,7( L0 50*+-;0; ;. :1D ;-78.670;0 .7 86,8,65-,*0: 0: 5,5-.*+. .*+6. .: +090P, ;. :0 806+F51:0 C :0 :,*B-+1; ;. ,*;0 -*5-;.*+.L :0 7.*7-G-:-;0; ;. :0 +H5*-50 019.*+0 81.7 0 :,*B-+1;.7 ;. ,*;0 =? 5,6+07. L0 86,8,65-,*0:-;0; .*+6. A C 9070 G05+.6-0*0 7A:, .7 /K:-;0 8060 Z1& !5H:7[9:.

#3 Nefelmetro@ Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est1 situado en 1ngulo recto respecto de la direcci n de la lu' incidente, y lo que se mide es pues, la lu' dispersada directamente por la preparaci n. Posee mayor sensibilidad que el espectrofot metro.

3.2 MEDIDA DEL NLMERO DE INDIVIDUOS

3.2.1 MTODOS DIRECTOS
93 4%mara de recuento de Petroff=Nauser* #onsiste en un portaobjetos especial con una graduaci n en superficie y unas medidas muy concretas@ e(cavaci n con ,.,J mm de profundidad< 1rea de * mmJ, dividida en un retculo de J+ cuadrados grandes< cada cuadrado grande est1 subdividido a su ve' en F(F X *? cuadrados pequeos. 5 sea, la muestra se distribuye en *? ( J+ X F,, celdillas 2cuadros pequeos3. La muestra, una ve' dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el n!mero de c"lulas en varias celdillas 2normalmente en *?, equivalentes a uno de los cuadros grandes3. 9e anota el n!mero n de c"lulas observadas en esas *? celdillas. Entonces, la concentraci n celular es f1cil de establecer@

n ( J+ ( +, ( *,,, X concentraci n en c"lulas]ml.

V.*+0E07( .7 1* 9H+,;, 91C 6K8-;,. I*5,*/.*-.*+.7( 7A:, 7-6/. 8060 7178.*7-,*.7 6.:0+-/09.*+. 5,*5.*+60;07 =Z1&J1& 5H:7.[9:?. P,6 ;.G0E, ;. .7+. /0:,6 .: *T9.6, ;. 5H:1:07 /-7+07 .* .: 5098, ;.: 9-56,75,8-, .7 91C 8.@1.P, C 8,5, 7-B*-<-50+-/, .7+0;F7+-509.*+.. E* G05+.6-07 9A/-:.7" 30C @1. -*9,/-:-D06:07 86./-09.*+." 5,* 1*0 9.D5:0 ;. 0:5,3,: C 0B10.

23 4ontadores electrnicos de part6culas 1tipo 4oulter3* 9e hace pasar una suspensi n microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente el"ctrica. #ada ve' que por un orificio 2D, m di1metro3 pasa una partcula 2p. ej., bacteria3 se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electr nico, que detecta el n!mero y el tamao de las partculas que van pasando. 2El tamao detectado es funci n de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partcula3.
C,9.*+06-,7( 30C @1. 1706 7178.*7-,*.7 0G7,:1+09.*+. :-G6.7 ;. 806+F51:07 .J+60P07 =:07 8.@1.P07 7.6F0* 5,*+0G-:-D0;07 .66A*.09.*+. 5,9, G05+.6-07" C :07 90C,6.7 81.;.* ,G+1606 .: ,6-<-5-, ;.: 08060+,?.

3.2.2

MTODOS INDIRECTOS

93 Recuento de via#les en placa* Los m"todos de recuento de n!mero de c"lulas que hemos visto hasta ahora 2los directos3 no distinguen entre c"lulas vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las c"lulas vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. 2Ona c"lula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capa' de dividirse y dar descendencia3. El m"todo habitual de lograr esto es sembrar pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio s lido 2con agar3. #ada c"lula viable dar1 origen a una colonia visible despu"s del tiempo adecuado de incubaci n. #ontando las colonias visibles, teniendo en cuenta la diluci n de la que proceden y el volumen de alcuota utili'ado, es f1cil deducir el n!mero de c"lulas viables en la suspensi n original. 2Para esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre todo, estate atento a la pr1ctica correspondiente, que se suele reali'ar en la DV tanda3. Mientras tanto, y para luego repasar esa pr1ctica, puedes reali'ar un e(perimento onGline sobre crecimiento bacteriano
P6.5015-,*.7( 8060 9-*-9-D06 :,7 .66,6.7 .7+0;F7+-5,7 ;. 91.7+6.," 7. 6.5,9-.*;0 7.9G606 5 8:0507 ;. 50;0 ;-:15-A*L 30C @1. 1706 8-8.+07 *1./07 .* 50;0 ;-:15-A*L 5,*+06 :07 8:0507 ;,*;. .J-7+0* .*+6. 5& C 3&& 5,:,*-07. C,9, *, 8,;.9,7 B060*+-D06 @1. 50;0 5,:,*-0 *, 86,5.;0 ;. 9K7 ;. 1* -*;-/-1;, =C .7+, .7 .78.5-0:9.*+. 5-.6+, 8060 G05+.6-07 @1. <,690* 0B61805-,*.7 ;. 2 , 9K7 5H:1:07?" .: 6.51.*+, 7. 6.<-.6. *, 0 I5H:1:07 /-0G:.7 6.0:.7M 7-*, 0 I1*-;0;.7 <,690;,607 ;. 5,:,*-0M =UFC?. P,6 :, +0*+," 1*0 UFC 5,66.78,*;." 5,9, 9F*-9," 0 1*0 G05+.6-0" 8.6, 7,G6. +,;, .* G05+.6-07 5,* 0B61805-,*.7" :0 9.;-;0 8,6 7-.9G6 .* 8:050 -*<60/0:,60 .: *T9.6, 6.0: ;. -*;-/-;1,7" 8,6@1.

50;0 UFC 81.;. 5,66.78,*;.6 0 ;,7 , 9K7 -*;-/-;1,7 @1. .7+0G0* E1*+,7 0: 7.6 7.9G60;,7 .* :0 8:050.

23 Recuento so#re filtros* 9e usa para suspensiones diluidas de bacterias. 9e hace pasar un gran volumen de suspensi n a trav"s de una membrana de nitrocelulosa o de nylon est"riles 2con un di1metro de poro que retiene las bacterias pero permite el tr1nsito de sustancias3. Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo s lido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las c"lulas retenidas. )ichas colonias se cuentan, deduci"ndose la concentraci n original de viables en funci n del volumen de suspensi n que se hi'o pasar por el filtro.

4 CRECIMIENTO BALANCEADO =P E#UILIBRADO>

Ona poblaci n de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen constantes todos sus par1metros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, no de c"lulas, 0):, 0/:, protenas, etc., es un valor constante ( similar en cada caso@ M]M X :]: X j0):k]j0):k X jprotenask]jprotenask X ... X 7 0s pues, durante este crecimiento, de tipo e(ponencial o logartmico, el cultivo se comporta como una reacci n autocataltica de primer orden@ velocidad de aumento del componente X 7iacantidad del componenteb 4ambi"n se puede decir que el no de c"lulas, la masa celular u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado. Este tipo de crecimiento se denomina #alanceado o e-uili#rado. 9e caracteri'a, pues, por ser el crecimiento en el que todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera@ aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente e$ponencial de crecimiento 1 3, que es caracterstico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado.

4.1 EEPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADO

Para deducirla vamos a aprovechar la definici n emprica anterior, atendiendo por un lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del n!mero de individuos.

a3 En funcin del aumento de masa celular*

, y por lo tanto, dM H MIIdt 9i integramos, resulta@ MJM: H e/t4t:2 0plicando logaritmos neperianos@

a*J.*b )e aqu se puede deducir que el coeficiente es

a*J.Jb #3 En funcin del aumento del nAmero de clulas. 9upongamos que partimos de una c"lula. 4ras una divisi n 2generaci n celular3, tendremos J, tras dos divisiones tendremos F, luego L, etc@ tenemos una serie geom"trica. *, J, JJ, JD, JF, ... Jn 2donde n es el n!mero de generaciones transcurridas3. 9i en ve' de partir de una c"lula partimos de :, c"lulas iniciales, tenemos@ : X :,iJn < por lo tanto@ :]:, X Jn a*J.Db

Por otro lado, el n!mero de generaciones se puede calcular f1cilmente teniendo en cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generaci n 2g3@

9ustituyendo esta e(presi n en la f rmula a*J.Db tenemos@ :]:, X J2tGt,3]g 0pliquemos logaritmos neperianos@

a*J.Fb 0hora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos e(presiones matem1ticas a*J.*b y a*J.Fb que hemos deducido 2la de la secci n 0, basada en masa, y la de la secci n 6, basada en n!mero de individuos3 son equivalentes@

, y por lo tanto@ 2tGt,3 X 2tGt,3]gilnJ, de donde se deduce el valor del coeficiente de crecimiento e(ponencial@

, e(presado en hG*

a*J.+b

Esta es la e(presi n matem1tica del coeficiente del crecimiento balanceado, en funci n del tiempo medio de generaci n 2g3. En un medio ideal, sin limitaci n de nutrientes, este coeficiente es X m1(, o sea, el m1(imo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir, es un crecimiento balanceado no restringido. En un medio donde e(ista algAn nutriente limitante 2o sea, cuya concentraci n est1 por debajo del lmite de eficiencia de las permeasas3, el crecimiento balanceado es de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al m1(imo, seg!n la f rmula emprica siguiente 2ecuaci n de Monod3@

donde j9k es la concentraci n del nutriente limitante< 79 es la constante de saturaci n, equivalente a la concentraci n de nutriente para la que el coeficiente es semim1(imo. #omo se puede ver, la tasa de crecimiento 2medida por 3 es una funci n hiperb lica de la concentraci n del sustratro 2nutriente3 limitante /ver gr9,ico2. Este sustrato puede ser una fuente de # y]o de energa, fuente de :, de P, un factor de crecimiento, etc.
EE.98:,7 ;. OS( :0 OS 8060 :0 B:15,70 .* E. coli .7 1\1&> M :0 OS 8060 .: +6-8+A<0*, .* .7+0 G05+.6-0 .7 2\1&>>! M E7+,7 G0E,7 /0:,6.7 7. ;.G.* 0 :0 /+8/ /?4345/5 5, +/0 .,:1,/0/0 5, 1,19:/3/ 305-0 :,7 717+60+,7" :, 510: .7 1*0 /5/.8/*4F3 ,H-+)84H/1,38, /56)4:45/ 5, +/0 9/*8,:4/0 / +-0 1,54-0

1)Q 54+)45-0 .* *1+6-.*+.7 .* :,7 @1. *,690:9.*+. /-/.*. =P,6 .: 5,*+606-," :,7 9.;-,7 ;. :0G,60+,6-, ;,*;. 7. 71.:.* 51:+-/06 :07 G05+.6-07 71.:.* 7.6 9K7 5,*5.*+60;,7?.

#omo veremos en el apartado ?, en la naturale'a, y en los sistemas de cultivo cerrados que habitualmente se emplean en laboratorio, tarde o temprano el crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se agotan los nutrientes o se acumulan sustancias de desecho.

5 CULTIVO CONTINUO =SISTEMAS ABIERTOS>. #UIMIOSTATO

El cultivo continuo es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto de flujo que se compone de@ una c1mara de cultivo de volumen constante, a la que llega un suministro de nutrientes, y de la que se eliminan o separan los productos t (icos de desecho 2por un dispositivo de rebosadero3. Ona ve' que el sistema alcan'a el equilibrio, el n!mero de c"lulas y la concentraci n de nutrientes en la c1mara permanecen constantes, y entonces se dice que el sistema est1 en estado estacionario, con las c"lulas creciendo e(ponencialmente. Los par1metros a tener en cuenta son@ flujo 2f3, medido en ml]h volumen de la c1mara de cultivo 2v, en ml3 densidad celular en la c1mara 2$3 factor de diluci n ) X f]v 2en hG*3. E(iste una p"rdida de c"lulas por el rebosadero@ Gd(]dt X (i) El crecimiento bruto es d(]dt X (i Por lo tanto, el crecimiento neto es d(]dt X (i G (i) X (i2 G )3 9i logramos que el coeficiente de crecimiento 23 se haga igual al factor de diluci n 2)3, entonces d(]dt X ,, y por lo tanto la concentraci n de c"lulas se hace constante 2(X (3. El cultivo se encuentra entonces en estado din%mico de e-uili#rio. Las p"rdidas de c"lulas por drenaje se compensan con las ganancias por crecimiento.

Ona de las maneras de lograr un cultivo continuo es mediante el llamado -uimiostato@ en el quimiostato podemos controlar de modo independiente la densidad de la poblaci n celular y la velocidad de crecimiento del cultivo. La densidad celular en el equilibrio se controla ajustando el factor de diluci n 2)3, mientras que la velocidad de crecimiento se controla variando la concentraci n del nutriente limitante en la c1mara reservorio 29/3. En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia variedad de tasas de crecimiento e$ponencial El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que e(iste un nutriente o sustrato presente en una concentraci n suficientemente baja como para limitar la densidad de poblaci n. 0s pues, el quimiostato tambi"n permite elegir la densidad de clulas a la que se quiere trabajar.

&lgunos comentarios sobre el gr9,ico6 La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de diluci n 2)3. Este margen es el m1s adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En cambio, el valor de tiempo de generaci n 2g3 var6a ampliamente. 5 sea, el quimiostato puede obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se afecte la densidad celular.9in embargo, a valores e(tremos de diluci n, se puede ver que el equilibrio se rompe@ 0 altas tasas de diluci n la concentraci n microbiana cambia r1pidamente, y en un margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente 2)#@ diluci n crtica3. Es decir, el cultivo se -lava. porque su velocidad de crecimiento es inferior a la tasa de diluci n. 0 muy bajas diluciones 2)M3 el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es la fuente de energa. Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energa s lo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no queda para el crecimiento. 0 este valor lo llamamos energ7a de mantenimiento. Los procesos relacionados con esta energa de mantenimiento son el potencial de membrana, el transporte de solutos y la renovaci n de protenas. Aplicaciones del cultivo continuo en -uimiostato* 0portan una fuente continua de c"lulas en fase e(ponencial, lo que se aplica a procesos industriales de fermentacin 2producci n de bebidas alcoh licas, de antibi ticos, de amino1cidos, etc3. En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite estudiar@

aspectos fisiolgicos 2por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante3< seleccin de mutantes estudios ecolgicos.

CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS

En los sistemas cerrados 2que pueden ser lquidos o s lidos3, no e(iste aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de c"lulas ni de sustancias de desecho. En estos sistemas la fase e$ponencial de crecimiento #alanceado no restringido dura slo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y]o a la acumulaci n de desechos.

.1 CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO L#UIDO

#omo se puede constatar en el anterior gr1fico, el crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar@ 93 'ase de retardo 1fase Llag03* Es el perodo de tiempo durante el que el in culo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. 9e trata de un perodo de a"uste meta#lico. 9u duraci n depende de varios factores@ tamao del in culo< bondad del in culo 2estado metab lico previo del in culo3@

si el in culo procede de c"lulas en fase estacionaria de un cultivo anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coen'imas y otros constituyentes de las c"lulas son bajos, y las c"lulas deben reponerlos en el medio fresco. si las c"lulas est1n daadas por alg!n agente, el lag tambi"n es largo, ya que necesitan un tiempo para la reparaci n de los daos. si las c"lulas del in culo se tomaron de un cultivo previo en fase logartmica, el lag es m1s corto. medio del que procede el in culo@ si el medio es similar al medio fresco, el lag es m1s corto< si el medio del in culo era un medio rico y el medio fresco es m1s pobre, la fase de retardo se hace m1s larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la sntesis de las en'imas biosint"ticas que estaban reprimidas en el medio rico. Pero aun cuando la inoculaci n se hace desde un cultivo previo en fase logartmica, cuyo medio sea id"ntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. fPor qu"[@ necesidad de neutrali'ar sustancias t (icas en el medio fresco< porque se produce diluci n de ciertos metabolitos intracelulares al inocular las bacterias en el medio nuevo< por lo tanto, hasta que no se vuelva a alcan'ar una concentraci n de esos metabolitos adecuada para el crecimiento, "ste no -arranca..
EE.98:,( S18,*B09,7 @1. -*,51:09,7 1*0 G05+.6-0 3.+.6,+6A<-50 .* 1* 9.;-, :-B.609.*+. K5-;," 7,9.+-;, 0 0-6.05-A*( .* 1* 86-*5-8-," 7. 86,;15. ;-:15-A* ;. CO 2" 8,6 :, @1. 7. 6.+06;0* 6.055-,*.7 ;. 506G,J-:05-A* @1. 6.@1-.6.* .7+. CO2" C 7. 86,;15. 1* 6.+06;,.

23 'ase de transicin5 de crecimiento acelerado, que conduce a u 33 'ase de crecimiento e$ponencial 12 fase logar6tmica3. La fase J se debe a que cada c"lula entra en la fase e(ponencial con desfase respecto de sus compaeras. Ello demuestra que las c"lulas del in culo no est1n todas en las mismas condiciones fisiol gicas. )urante la fase logartmica se da un crecimiento #alanceado no restringido durante unas pocas generaciones 2normalmente menos de *,3. El tiempo de generaci n 2g3 es caracterstico para cada especie o cepa, en cada medio concreto@ El valor del tiempo de generaci n 2g3 depende de@ composici n del medio temperatura pK osmolaridad 2tonicidad3, etc. Los microorganismos heterotrofos suelen crecer m1s r1pidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sint"ticos, y dentro de estos !ltimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono. 0lgunos microoorganismos tienen, a su temperatura

ptima tiempos de generaci n muy cortos 2*+, J, min3, mientras que otros tienen crecen m1s lentamente, con tiempos de generaci n que pueden ser de varias horas o incluso das. 43 'ase de aceleracin negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce au ;3 'ase estacionaria* Esta fase se caracteri'a porque el coeficiente neto de crecimiento se ,ace nulo 2 X ,3, pero aAn e$iste crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares. En este perodo se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho. &ncluso el pK del medio empie'a a hacerse inadecuado para el crecimiento celular. 9i la bacteria crece en un medio complejo, la fase F de transici n 2de aceleraci n negativa3 puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas 2p. ej., puede recurrir a amino1cidos como fuente de # una ve' agotados los hidratos de carbono3. En la fase estacionaria a!n e(isten reacciones metab licas, pero el meta#olismo general es diferente al de la fase logar6tmica@ las c"lulas son m%s pe-ueQas, debido a que e(iste divisi n celular despu"s de que se haya detenido el incremento de masa< suelen ser m1s resistentes a agentes fsicos y qumicos< e(iste reciclado de ciertos materiales intracelulares< baja el contenido en 0/:. P3 'ase de transicin ,acia u H3 'ase de muerte e$ponencial* 9e da muerte y lisis masiva, e(ponencial, del cultivo. 9e debe a agotamiento de reservas de energ6a. 0lgunas veces las c"lulas aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas 2formas -fantasmas., -ghost.3. La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies 2por ejemplo, en bacterias ent"ricas es suave, mientras que en Bacillus es m1s acentuada3. 4e recuerdo que puedes hacer un e(perimento MvirtualM con la curva de crecimiento de una bacteria. 8ue disfrutes.

.2 CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SLIDOS

On medio s lido es una soluci n nutritiva 2como el lquido3, pero incorporado a un gel, que le da consistencia. Los tipos de gelificantes usados para los medios s lidos /m9s explicaciones en la 1K tanda de pr9cticas2@

agarGagar 2o simplemente, agar3@ es el m1s com!nmente empleado< gelatina 2inconveniente de que se lic!a a temperaturas relativamente bajas, y adem1s, algunos microorganismos lo degradan por gelatinasas3< silicagel 2o gel de slice3@ tedioso de preparar. Oso casi e(clusivo para quimioautotrofos. Los medios s lidos se suelen inocular mediante asa de siembra o esp1tula, diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en recipientes adecuados, como las placas de Petri /ver pr9cticas2. 4ras la incubaci n a la temperatura y condiciones pertinentes, cada bacteria o agrupaci n bacteriana que ha quedado en un punto determinado del medio da origen, por crecimiento, a una acumulaci n de c"lulas, visible a simple vista, denominada colonia. La densidad de cada colonia es muy alta 2del orden de *,> c"lulas para una colonia de unos + mm3. Esto se debe a que en el medio s lido, a diferencia del lquido, las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este medio s lido permite un aporte continuo de nutrientes 2por difusi n desde el entorno de la colonia, hacia ella3, y eliminaci n continua de productos de desecho 2por difusi n desde la colonia hacia fuera3. Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, e(cepto que no hay drenaje de c"lulas. #omo el alumno comprobar1 en pr1cticas 2JV tanda3, cada especie bacteriana suele originar colonias de un tipo determinado, en cada medio concreto. #on vistas a la determinaci n ta(on mica, se suele tomar nota de una serie de caractersticas de las colonias 2caracteres culturales3@ tamao 2relativo3 forma general forma de los bordes de la colonia aspecto de la superficie y elevaci n sobre el sustrato color consistencia, etc.