Shotgun proteomics using the iTRAQ isobaric tags

Kunal Aggarwal, Leila H.Choe and Kelvin H. Lee Advance Access publication date 10 May 2006

Abstract
Mtodos protemicos escopeta que implican etiquetado isobrico de pptidos permiten alto rendimiento reactivos analysis.iTRAQ protemicas permiten la identificacin simultnea y cuantificacin de protenas en cuatro muestras diferentes utilizando espectrometra de masas tndem (MS). En este artculo, ofrecemos una breve descripcin del anlisis del proteoma utilizando reactivos iTRAQ y revisan las aplicaciones actuales de estos reactivos en estudios protemicos. Tambin comparamos los diferentes aspectos de la identificacin de protenas que incluyen la cobertura de secuencia de la protena y la cobertura proteoma obtenido utilizando reactivos iTRAQ con los que utilizan otras tcnicas protemicas de escopeta. Se discute brevemente la cuestin de la correccin de la pureza isotpica en reas de los picos medidos durante la cuantificacin de protenas usando reactivos iTRAQ. Por ltimo, se concluye con algunos de los retos actuales en el anlisis protemico basado en MS que estn limitando la identificacin de protenas obtenidos por diferentes mtodos protemicos escopeta. Keywords: isobaric tag; iTRAQ; shotgun proteomics; tandem mass spectrometry

INTRODUCCIN Catalizada por los recientes avances en la espectrometra de masas cuantitativa (MS), la protemica escopeta pueden proporcionar una evaluacin relativamente de alto rendimiento de los cambios en expresin de la protena. Este enfoque para el anlisis del proteoma implica generalmente el etiquetado de istopos diferencial de protenas y pptidos, ya sea metablicamente (InVivo), enzimticamente o qumicamente utilizando reactivos externos / etiquetas [1-4]. Los pptidos marcados se separan por cromatografa multidimensional lquida (LC) y los pptidos resueltos se analizan mediante MS. Las reas de los picos o intensidades observadas en los espectros de MS de pptidos eluidos se utilizan para cuantificar el pptido relativa (protena) abundancia. Mtodos protemicos escopeta que implica direccin de marcaje isotpico algunas de las limitaciones que se enfrentan en enfoques protemicos tradicionales a base de gel, a saber, la incapacidad para analizar protenas altamente bsicas / hidrfobo. Sin embargo, estos enfoques an sufren de algunas limitaciones tales como una incapacidad para multiplexar (analizar mltiples muestras en paralelo) y para cuantificar el nivel de expresin de protena cero (debido a la necesidad de observar los cambios de masa por MS). En contraste con las estrategias de marcaje isotpico, mtodos protemicos escopeta implican etiquetado isobrico de pptidos permiten la identificacin y cuantificacin simultnea de pptidos usando tndem MS [5] y permiten el anlisis del proteoma en paralelo de ms de dos muestras. Uno de tales mtodos comercializado por Applied Biosystems se llama iTRAQ y utiliza cuatro reactivos especficos de amina isobricas para etiquetar las aminas primarias de pptidos a partir de cuatro muestras biolgicas diferentes [6]. Los pptidos marcados de cada muestra se mezclan, separados utilizando LC de dos dimensiones y se analizaron utilizando MS y espectrometra de masas en tndem (MS / MS). Debido a la naturaleza isobrica de estos reactivos, el mismo pptido de cada muestra aparece como un solo pico en el espectro MS, reduciendo as la complejidad en el espectro de MS en comparacin con una tcnica de etiquetado isotpico tales como ICAT (istopo codificado etiqueta de afinidad) [3]. Tras la disociacin collisioninduced, los pptidos etiquetados - iTRAQ fragmentan para liberar iones reportero (a 114,1, 115,1, 116,1 y 117,1 m / z) y B - Y y la serie de iones de fragmentos entre otras.

El rea del pico de los iones reportero se utilizan para evaluar la abundancia relativa de pptidos y, por consiguiente las protenas a partir de los que se derivan [6, 7]. En este artculo se revisan algunos de los estudios recientes que emplean reactivos isobricas para el anlisis protemico. Tambin comparamos diferentes aspectos de la identificacin y cuantificacin de protenas obtenidos en los experimentos de marcado isobricos con los observados en otros experimentos protemicos escopeta.

capaces de identificar algunas protenas de baja abundancia y factores de transcripcin en E. coli utilizando etiquetas iTRAQ [7]. Se han observado reactivos iTRAQ a resultar en una mejor relacin de seal a ruido y una fragmentacin mejorada con un aumento de intensidad de la seal en asistida por matriz de ionizacin por desorcin lser ( MALDI ) tndem de tiempo de vuelo ( TOF ) MS [ 8 ] . Esto puede como resultado la identificacin de ms pptidos. Al igual que otros enfoques protemicos de escopeta, la estrategia de etiquetado isobrico proporciona mltiples medidas independientes de la abundancia relativa de una protena. Resultados de cuantificacin de protenas obtenidas utilizando iTRAQ han sido comprobados por anlisis de mezclas estndar de protenas de proporciones conocidas [6, 12]. Expresin diferencial de protenas seleccionadas en diversas muestras como se detect mediante el anlisis de iTRAQ tambin ha sido confirmado cualitativamente usando anlisis de transferencia de Western [9]. Hemos empleado diferente outlier estadstico mtodos de exclusin de datos iTRAQ para obtener estimaciones estadsticamente relevantes de la abundancia relativa de protenas [7]. Tambin hemos comparado la cuantificacin de protenas de las muestras de E. coli obtenidos usando reactivos iTRAQ con que el uso de electroforesis bidimensional (2 -DE). Hemos observado que los dos enfoques de cuantificacin de protenas proporcionan una cuantificacin similares resultados. La mayora de los datos de cuantificacin de protenas de las dos tcnicas era coherente dentro de un cambio de 2 veces. Sin embargo, iTRAQ se observ para proporcionar una cuantificacin de protenas ms consistente, en comparacin con 2 -DE. Alrededor del 95 % de las protenas se cuantificaron con un coeficiente de variacin < 0,53 usando etiquetas isobricas y < 0,81 usando 2 -DE. Adems, iTRAQ se observ para proporcionar una cuantificacin ms consistente en comparacin con el 2 -DE de protenas teidas con menor intensidad, el 2 - DE geles [13]. En el resto de este artculo, se compara la tecnologa iTRAQ con otros enfoques protemicos escopeta bajo diferentes aspectos del anlisis del proteoma. Especficamente, usamos los datos iTRAQ recogidos durante el anlisis protemico de E. coli para la comparacin. Los detalles de los procedimientos de extraccin de protenas, de etiquetado y de cuantificacin utilizados en este trabajo han sido publicados anteriormente [7]. Brevemente, los pptidos trpticos a partir de clulas E. coli que expresan elementos RHSA en cuatro niveles diferentes fueron marcadas diferencialmente con reactivos iTRAQ. La

MARCADORES ISOBRICOS El enfoque iTRAQ ha sido aplicado con xito a una variedad de muestras de procariotas y eucariotas incluyendo Escherichia coli, levadura, la saliva humana, humana fibroblastos y clulas epiteliales mamarias para identificar y cuantificar las protenas en estas muestras. Hardt et al. [8] utiliza reactivos iTRAQ estudiar la diurna efectos sobre la composicin de protemicos humanos saliva partida recogido en cuatro momentos diferentes durante un da. Cong et al. Proteomas [9] en comparacin de fibroblastos humanos en cuatro estados biolgicos diferentes: replicativamente senescentes ( detenido el crecimiento permanente) , prematuramente senescentes , reposo y joven replicante , para identificar las protenas de la firma de cada estado biolgico inducido por el estrs. Zhang et al. [10] combina el mecanismo de etiquetado iTRAQ con inmunoprecipitacin cuantificar tirosina pptidos fosforilados en cuatro poblaciones diferentes de crecimiento epidrmico del factor de clulas epiteliales mamarias estimulada. Tirosina pptidos fosforilados se enriquecieron usando inmunoprecipitacin despus de marcar con reactivos iTRAQ. Este trabajo sugiere que la cuantificacin de protenas utilizando etiquetas iTRAQ no es limitada a las muestras de clulas derivadas de la cultura. DeSouza et al. [11] utiliza etiquetas iTRAQ identificar cinco posibles marcadores de protenas para el cncer endometrial. Tambin identificaron un conjunto diferente de cuatro protenas usando ICAT escindible (CICAT) como posibles marcadores para el cncer endometrial. Identificaron diferentes proporciones de protenas en varias categoras funcionales el uso de estas tcnicas. Un mayor porcentaje de protenas identificadas usando Cicat en comparacin con iTRAQ estaban involucrados en la sealizacin. Anlisis iTRAQ fue capaz de identificar un mayor nmero de protenas ribosomales y factores de transcripcin [11]. Tambin hemos sido

compleja mezcla de pptidos marcados se separ usando un fuerte intercambio catinico (SCX) fraccionamiento seguido de cromatografa lquida de alta presin de fase inversa (HPLC). Los pptidos resueltos se estudiaron mediante MALDI TOF / TOF anlisis en un 4700 Protemica Analyzer v2.0 software en ejecucin. Los datos espectrales se realizaron bsquedas en contra de una base de datos de las traducciones de todo el genoma secuencias de codificacin de la E. coli K-12 genoma (4289 ORFs) con especificidad semi-tripsina para identificar la secuencia del pptido y la protena de origen [14]. Los parmetros de bsqueda utilizados fueron los siguientes: 50 ppm precursor de tolerancia de masa, tolerancia de masa 0,3 Da MS / MS de pptidos, dos mxima perdi divisiones, la oxidacin de metionina variable y dos fijas y tres modificaciones variables asociados con la qumica de etiquetado. Las reas de los picos de los iones de firma, correspondientes a los reactivos isobricas, en el MS / MS espectros se corrigieron para la superposicin de las contribuciones isotpicas como se describe anteriormente [15]. Las reas de los picos corregidos se utilizan entonces para calcular la abundancia relativa de cada pptido detectado y la protena correspondiente de la que se deriva. En este estudio, 23 139 espectros MS / MS se recogieron. 5063 pptidos fueron emparejados a 780 protenas nicas con la mascota de las puntuaciones de iones (P <0,05). COBERTURA SECUENCIA DE LA PROTENA La cobertura de secuencia de la protena total obtenida mientras se realiza la identificacin de protenas depende de la cantidad de coincidencias de pptidos nicos por la protena y la longitud del pptido emparejado. Pptido Resultados por protenas Debido a que los reactivos iTRAQ se dirigen a todos los pptidos para el etiquetado, mltiples pptidos de la misma protena pueden ser detectadas durante la MS. Ross et al. [6] detectado 4,5 por pptidos de protenas por trmino medio durante el anlisis del proteoma de levadura utilizando etiquetas iTRAQ. Cong et al. [9] identific 45% de las protenas (108 de 240) utilizando por lo menos dos pptidos significativos en el anlisis del proteoma de fibroblastos humanos. En nuestro estudio, ms del 65% de las protenas (527 de 780) fueron identificados con al menos dos partidos de pptidos (P <0.05) por la protena [7]. En promedio, 6 pptidos fueron emparejados por la protena para todas las protenas identificadas.

Longitud del pptido Un perfil de distribucin normal de la longitud del pptido se observa en general, para los pptidos de alta puntuacin detectados mediante MS, independientemente del tipo de MS de ionizacin o la instrumentacin utilizada MS [16, 17]. Un perfil de distribucin de longitud de pptido similar se observa para los pptidos procedentes de muestras isobricamente etiquetados en nuestro estudio (Figura 1). Menos pptidos ms cortos de siete aminocidos se corresponden con un alto grado de confianza. Este sesgo se observ en los experimentos de MALDI MS debido a pptidos ms cortos de seis o siete aminocidos aparecen tpicamente en la regin de baja masa en un espectro de MALDI MS , que est dominada por los picos de otro modo de matriz , por lo que estos picos no se utilizan en la bsqueda de base de datos . Una longitud media de pptido de 12-23 residuos de aminocidos ha sido reportado en la literatura para pptidos detectados usando electropulverizacin (ESI) EM (usando QSTAR y espectrmetros de masas LTQ) y MALDI MS (utilizando 4700 Protemica Analyzer) [17] . De acuerdo con los valores reportados en la literatura, se observ una longitud media pptido de 14 aminocidos para los pptidos Highscoring en este estudio. Sesenta y cinco por ciento de estos pptidos eran al menos 12 aminocidos de longitud. Tambin se observ una correlacin entre la longitud del pptido y la puntuacin de iones mascota o un nivel de significacin. Para los pptidos ms cortos que 12 aminocidos, el nivel medio de importancia de la deteccin disminuy con el pptido de longitud. La cobertura de secuencia La cobertura de secuencia de protena se puede calcular utilizando informacin de la secuencia de pptidos no redundantes emparejaron con una protena. Una cobertura de secuencia de 2-77% se ha obtenido en E. coli utilizando el anlisis del proteoma un MALDI TOF / TOF enfoque de 2D-LC [18]. El uso de etiquetas iTRAQ para estudiar el proteoma de las membranas de los grnulos de zimgeno de pncreas de rata, Chen et al. [19] obtuvo la cobertura de secuencia de protenas de 0,1 a 27%. Aqu, se observa que se observ una cobertura de secuencia de 0,8 a 83,5% para todas las protenas identificadas. El cincuenta por ciento de las protenas se identificaron con la cobertura de secuencia de al menos 10% (Figura 2). Sin embargo, slo 10% de las protenas se identificaron con cobertura de secuencia de> 40%.

CONTENIDO DE AMINOCIDOS PEPTIDOS Zhen et al. [18] han informado de la frecuencia de aparicin de E. coli aminocidos en pptidos alta puntuacin analizados mediante 2D - LC MALDI TOF / TOF. Se observ un mayor porcentaje de residuos cargados negativamente en pptidos de alta puntuacin en comparacin con su abundancia natural. La presencia de residuos cidos en un pptido puede resultar en fragmentos de iones ms intensos y completos permitiendo as una mayor identificacin de confianza [18, 20 ] . Por lo tanto, un mayor nmero de pptidos de alta puntuacin se puede esperar a ser rica en residuos cargados negativamente. Similar a Zhen et al. [18], un mayor porcentaje de residuos cargados negativamente en pptidos alta puntuacin tambin se observan aqu con respecto a todas las protenas de E. coli (Tabla 1). En promedio, el 16,8% de los residuos en los pptidos de alta puntuacin se cargan negativamente. Un menor abundancia de residuos de carga positiva en los pptidos de alta puntuacin (7%) se observa con respecto a Zhen et al. [18] (10,8 %) y en comparacin con todas las protenas de E. coli (12,5 %). Esto puede deberse a que el 33% de los pptidos de alta puntuacin en este estudio han ni tampoco lisina arginina en sus extremos debido a la inclusin de pptidos semitryptic. Para los pptidos trpticos slo (es decir, 67 % de los pptidos de alta puntuacin), la frecuencia observada de residuos cargados positivamente es 10 %, que es similar a la observada en todas las protenas de E. coli y se informa en el trabajo de Zhen et al. [18] COBERTURA PROTEOMA Las protenas que pertenecen a todas las categoras funcionales se han detectado usando mtodos protemicos de escopeta basados en iTRAQ en diferentes organismos [6, 7, 11]. Debido a su abundancia relativa, la mayora de las protenas identificadas en estos estudios estn involucrados en funciones de limpieza, incluyendo la biosntesis, el metabolismo y los procesos celulares. Sin embargo, no parece ser un sesgo en contra de cualquier funcional particular clase de protenas durante la identificacin. Las protenas de mltiples localizaciones celulares se identificaron en los fibroblastos humanos usando estrategia de marcaje iTRAQ [9]. Chen y col . [19] han utilizado la electroforesis en gel 2D y 2D- LC con MS para identificar las protenas de las membranas de rata zimgeno granulares pancreticas. El uso de reactivos iTRAQ para cuantificar el enriquecimiento de protenas de membrana intrnsecas en un proceso de purificacin, que fueron capaces de distinguir las protenas de

membrana intrnsecas de las protenas de membrana solubles y perifricos. La localizacin celular de las protenas identificadas en el presente estudio se determin a travs de bases de datos EcoCyc [21]. Cerca de 9.4 % de las protenas totales identificadas en nuestro estudio (73 de 780) se sabe que son protenas de membrana. Este conjunto de protenas identificadas constituye 12,9 % de todas las protenas de la membrana coli E. conocidos. El alcance de la cobertura proteoma obtuvo utilizando una estrategia de anlisis protemico tambin puede evaluarse en trminos del porcentaje de protenas identificadas a travs de diferentes rangos de peso molecular (MW) y el punto isoelctrico (pI). Enfoques basados en gel tradicionales a la identificacin de protenas estn limitados en su capacidad para detectar protenas con extremos en MW y pI. Estudios previos han reportado el uso de mtodos de protemica de escopeta para detectar las protenas que se encuentran en los extremos de MW y PI [22]. Dependencia MW de protenas identificadas Las protenas que van a travs de un amplio espectro de MW se identificaron utilizando marcadores isobricos. La Tabla 2 muestra el nmero total de protenas de E. coli dentro de un cierto rango de MW terico y el nmero de protenas que pertenecen a ese rango identificado en este trabajo. Por ejemplo, 202 protenas identificadas en este trabajo tienen MW entre 40 y 60 kDa. Este grupo es 22,4 % de las protenas totales de E. coli con un PM de 40-60 kDa (902 protenas). Es interesante observar que aproximadamente el 21 % de las protenas totales identificados (163 de 780) tiene MW < 20 kDa, y este grupo representa slo el 15,6 % de las protenas totales de E. coli con MW < 20 kDa. Generalmente, el nmero de sitios de escisin de tripsina disminuye con el tamao de la protena, y por lo tanto el nmero terico de pptidos disponibles para la deteccin disminuye. Esta observacin tambin se hizo con partidos de pptidos por protena aumenta con el tamao de la protena identificada (Figura 3a). Curiosamente, media uniforme la cobertura de secuencia de 10-15 % se obtuvo en todos los intervalos de PM de protenas identificadas, excepto para las protenas con PM < 20 kDa, donde se observ una cobertura de secuencia media de 27 % (Figura 3b). Dependencia pI de las protenas identificadas Tambin se detectaron protenas dentro de una amplia gama de pI en este estudio. La Tabla 3 enumera el nmero total de protenas de E. coli prev que sea dentro de un cierto rango de pI y el nmero de protenas que pertenecen a ese rango identificado en este trabajo.

Cerca de 26.3% de las protenas totales de E. coli predice que tienen pI 5-6 se identificaron en este estudio (387 de 1470). La mayor proporcin del total de protenas identificadas en este trabajo (387 correspondientes al 49,6% de 780) tiene un pI en el rango de 5-6. Se espera que esta observacin porque este grupo es tambin el ms grande sobre la base de pI predicho. Slo una protena con un pI predicho <4 fue identificado en este trabajo. Las protenas con pI <4 tienen menos residuos de arginina / lisina para someterse a digestin trptica, reduciendo as el nmero de pptidos disponibles para la deteccin. Curiosamente, 34,5% de todas las protenas con un pI predicho> 11 fueron identificados en este estudio. La deteccin de protenas altamente expresadas Como una medida indirecta de la extensin de la cobertura proteoma obtenidos utilizando la protemica escopeta basados iTRAQ, se estim el nmero de protenas correspondientes a los genes altamente expresados que se detectaron en este estudio. Anlisis de microarrays de ADN se llev a cabo en las mismas muestras que se utilizaron para el anlisis protemico. Brevemente, el ARN se estabiliza mediante la suspensin de clulas en ARN ms tarde (Ambion, Austin, TX, EE.UU. ) y se extrajo usando MasterPure ARN kits de purificacin ( Epicentro , Madison , WI , EE.UU.). fragmentos de cDNA fueron creados por dos rondas de inversa-reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa utilizando hexamer cebadores aleatorios [ 23 ] . El ADNc resultante a continuacin, fue marcado con fluorescencia y se hibrida a E. matrices de sondas GeneChip antisentido coli (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.) . Los datos de intensidad de escaneado imgenes chip se analizaron usando el procedimiento de GC- RMA [24] disponible en el software GeneTraffic (Iobion, La Jolla, CA, EE.UU.) para calcular la expresin gnica valores. Una seal promedio del ARNm de 12,065.6 era observado para todas las protenas identificadas en este estudio (Tabla 4). Este valor es ms de cuatro veces el media de la seal de ARNm de las protenas no detectadas en este estudio (2950,8 correspondiente a 3547 genes). De las protenas no se detectaron, 5.2 % tenan un promedio mRNA de seal > 12,065.6. Esta observacin es coherente con nuestra identificacin de la mayora de los las protenas altamente expresadas en este estudio. La protenas detectadas no se limitaron a los altamente expresado; 21 diferentes factores de transcripcin y otros protenas de baja abundancia tambin fueron identificados, as cuantificada en este estudio [7].

CORRECCIN DE PUREZA PARA CUANTIFICACION Las etiquetas isobricas utilizados para el anlisis del proteoma diferir en las composiciones isotpicas de nitrgeno, carbono y oxgeno pero tienen masas idnticas [6]. Debido a la contaminacin isotpica en las etiquetas, el rea del pico para cada reportero de iones tendr alguna contribucin de otros iones reportero. Shadforth et al. [15] han presentado un procedimiento detallado para calcular reas de los picos verdaderos que dan cuenta de la superposicin de las contribuciones isotpicas utilizando el reactivo valores de pureza establecidas por el fabricante cuando se utiliza la ionizacin electrospray. Este procedimiento se ha aplicado en el software i-Tracker. A pesar de que los autores del software observaron una alta correlacin entre los valores de rea de pico relativa (medida de la abundancia relativa de pptidos) obtenidos mediante i-Tracker y ProQuant (Applied Biosystems), haba varios pptidos en los que los valores de las reas de pico relativas calculados por el dos programas de software no ha producido [15]. Hemos separado derivado un algoritmo similar para la correccin de la pureza en Microsoft Excel y se aplica a las reas de los picos primas obtenidas de 4700 Protemica Analyser versin de software 2.0 (Applied Biosystems). Se observ una correlacin muy alta entre las reas relativas de los picos obtenidos usando el Explorador de GPS v3.0 (Applied Biosystems) y los calculados usando nuestro algoritmo de correccin de pureza que es matemticamente similar a la implementada en el i-Tracker (Figura 4). Se observ una diferencia mxima de 3% en los valores de las reas de pico relativas obtenidas con este mtodo frente v3.0 GPS Explorer. Es posible que la diferencia entre los valores obtenidos de ProQuant y iTracker, como se ve en la obra de Shadforth et al. [15] se debe a algunos otros errores sistemticos. Por ejemplo, ProQuant y i-Tracker pueden interpretar reas de los picos de los espectros de masas de diferentes maneras (i-Tracker utiliza en tndem no centroided listas de pico de masa). En este estudio, hemos utilizado las reas de pico primas para la aplicacin de este mtodo. CONCLUSIONES Protemica escopeta experimentos que implican reactivos iTRAQ han tenido xito en la identificacin y cuantificacin de protenas a travs de una variedad de muestras de procariotas y eucariotas. Una de las principales ventajas de la tecnologa iTRAQ es que protemico paralelo anlisis de cuatro muestras diferentes se puede lograr, lo que reduce el tiempo total de anlisis. Varios estudios protemicos en la literatura se han beneficiado de esta capacidad de multiplexacin de la tecnologa iTRAQ.

Anlisis del proteoma utilizando reactivos iTRAQ compara favorablemente con la otra protemico escopeta enfoques. El perfil de distribucin de longitud de pptido y el contenido de aminocidos de la isobricamente marcada pptidos detectados durante el anlisis MS son similares a los obtenidos utilizando otros enfoques basados en MS. Esto sugiere que los reactivos iTRAQ no lo hacen negativamente interferir con la fragmentacin del pptido. Una mejor relacin de seal a ruido con un aumento de intensidad de la seal en MALDI TOF / TOF de pptidos etiquetados isobricamente no slo puede dar lugar a la deteccin de un nmero mayor de pptidos por protenas con alta confianza, sino tambin en la deteccin de algunas protenas de baja abundancia (como observado en este trabajo y se inform anteriormente [8]). Reactivos iTRAQ se pueden utilizar para identificar y cuantificar protenas a travs de diversos intervalos de PM y PI, funcional categoras y localizaciones celulares. Reactivos iTRAQ tambin permiten mltiples medidas, independientes de la protena abundancia en el mismo experimento, lo que permite estimaciones estadsticas de cuantificacin de protenas. Protena identificacin basada en mltiples pptido partidos (frente a un pptido) que mejorar la confianza en la identificacin, as como en la cuantificacin . Sin embargo, ms de un tercio de las protenas en todos los estudios llevados a cabo hasta la fecha iTRAQ han sido identificado usando slo un pptido. En este caso, slo el 22 % de la MS / MS recogidos se utiliza para identificar protenas con alta confianza. Muchos espectros de alta calidad no fueron emparejados a cualquier protena. Nueva bsqueda algoritmos y bases de datos para mejorar la lectura abierta asignaciones de marco pueden permitir la asignacin de sin asignar MS / MS datos de secuencias. Una mejorada asignacin de espectros aumentar pptido partidos por protenas, reduciendo as identificaciones positivas falsas y que permite la cuantificacin estadstica para una mayor nmero de protenas identificadas . Adems, puede mejorar la cobertura proteoma total obtenido en un escopeta experimento protemicos.

Puntos clave reactivos iTRAQ permiten el anlisis protemico paralelo de cuatro muestras diferentes, lo que reduce el tiempo de anlisis. Cobertura de secuencia de protena obtenida utilizando reactivos iTRAQ es similar a la obtenida usando otros enfoques protemicos de escopeta. reactivos iTRAQ se pueden utilizar para identificar y cuantificar las protenas a travs de diversas gamas de pI MWand, categoras funcionales, localizaciones celulares y abundancias. Se necesitan ms avances en los algoritmos de bsqueda y bases de datos para una mayor asignacin de espectros MS / MS.