UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIN FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

*Preparacin de Reactivos **Noelia Carolina Filizzola Ruiz

San Lorenzo-Ciudad Universitaria-Paraguay Ao 2012

*Prctica No 1, presentada en la ctedra de Microbiologa **Alumna de la carrera de Biologa.

INTRODUCCIN
La ciencia de la microbiologa tiene una gran antigedad de solo doscientos aos, aunque el descubrimiento reciente del DNA de Micobacterium tuberculosis en momias egipcias de 3000 aos nos recuerda que los microorganismos han estado presentes durante mucho ms tiempo. De hecho los ancestros bacterianos fueron las primeras clulas vivas que aparecieron en la tierra. Robert Hooke observ que el corcho estaba formado por celdillas e introdujo el trmino clula. Las observaciones de Leeuwenhock, mediante el empleo de un microscopio simple, fue el primero en observar los microorganismos (1673) (Tortora, 2007). Como casi todos los microorganismos son casi incoloros a travs de un microscopio ptico estndar, a menudo es preciso prepararlos para la observacin y una de las maneras de hacerlo consiste en someterlos a tincin (coloracin). La mayora de las observaciones iniciales de los microorganismos se realizan con preparados teidos. El trmino tincin significa simplemente colorear los microorganismos con un colorante que destaque ciertas estructuras. Sin embargo entes de teir los microorganismos se los debe fijar al portaobjetos (Ibid). Los colorantes son sales compuestas por un in positivo y un in negativo, uno de los cuales est coloreado y se conoce como cromforo. El color de los denominados bsicos est en el in positivo; en los colorantes cidos, est en el in negativo. En un pH de 7 las bacterias presentan una carga levemente negativa. Por lo tanto, el in positivo coloreado en colorante bsico es atrado hacia la clula bacteriana con carga negativa. Los colorantes bsicos, entre los que se encuentran el violeta de genciana, el azul de metileno, el verde de malaquita y la safranina, se utilizan con ms frecuencia que los colorantes cidos. Estos ltimos no son atrados por la mayor parte de los tipos de bacteria porque la superficie bacteriana con carga negativa repele a los iones negativos del colorante, de modo que este tie el fondo en lugar de la estructura bacteriana. Los preparados bacterianos incoloros contra un fondo coloreado se denomina tincin negativa, una tcnica valiosa para la observacin de las formas generales, los tamaos y las cpsulas celulares porque las clulas resultan muy visibles contra un fondo oscuro que contrasta. Para aplicar los colorantes cidos o bsicos los microbilogos emplean tres clases de tcnicas de tincin: simple, diferencial y especial (Ibid). Generalmente se requieren tinciones biolgicas para visualizar bacterias en forma adecuada y poner en evidencia los detalles finos de las estructuras internas. La introduccin de las tinturas (Koneman, 2004). Los medios pueden ser selecticos o no selectivos. Los no selectivos no presentan inhibidores, y sustentan al crecimiento de la mayora de los microorganismos que se encuentran en los laboratorios clnicos (Ibid). El personal que trabaja en los laboratorios de microbiologa corre riesgo de infeccin, por lo que debe adoptar un conjunto de normas de seguridad que sirven para reducir a un nivel aceptablemente bajo el riesgo inherente a la manipulacin de todo material peligroso. El diseo arquitectnico y el equipamiento de los laboratorios de microbiologa han de contribuir a la seguridad; pero sta slo es posible si la formacin, actitud y forma del proceder personal que trabaja en ellos es la adecuada para este propsito (Prast, 2005). Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

OBJETIVOS
Utilizar correctamente los elementos de laboratorio, teniendo en cuenta las normas de bioseguridad. Adquirir conocimiento acerca de los distintos tipos de preparaciones de reactivos.

MATERIALES
Esptula para pesada. Vasos de precipitados de vidrio de diferentes volmenes. Matraz Erlenmeyer de diferentes volmenes. Embudos de vidrio. Pipetas. Pro-Pipetas (peras de goma). Bureta de 100mL y 500mL. Varillas de vidrio. Matraz aforado de diferentes volmenes. Pizeta conteniendo agua destilada. Marcadores para vidrio. Papel Aluminio para pesada. Rtulos adhesivos. Guantes descartables. Mascarillas (tapa boca). Recipientes de vidrio obscuro con tapa. Elementos de Limpieza/desinfeccin.

REACTIVOS
Cristal Violeta. Etanol al 95% Safranina Iodo Metlico Ioduro de Potasio p.a. Acetona p.a. Verde de Malaquita Fucsina Bsica Cristales de Fenol Acido Clorhdrico al 37% Azul de Metileno Cloruro de Sodio Oxalato de Amonio Hidrxido de Potasio Para-dimetil-amino-benzaldehido Butanol p.a. -Naftol al 5% Rojo Metilo Perxido de Hidrgeno.

PROCEDIMIENTO
1- Solucin de Cristal Violeta:
Este colorante se prepar en dos partes:

a. Solucin A: en un vaso de precipitados de 50mL se coloc 10mL de Etanol y se disolvi 1gr de Cristal Violeta. Solucin B: en otro vaso se disolvi 0,4gr de Oxalato de Amonio en 40mL de agua destilada. b. Se mezcl cuidadosamente las soluciones A y B. c. Se guard la mezcla en un frasco mbar en obscuridad durante 24 horas. Se filtr antes de utilizarlo. 2- Solucin de Safranina:
Se pes 0,25gr de colorante Safranina y se coloc en un matraz aforado de 100mL, se disolvi con 10mL de Etanol y se afor con Agua Destilada.

3- Solucin de Lugol:
Se mezcl 0,666gr de Ioduro de Potasio y 0, 332gr de Yodo Metlico, con ayuda de un mortero y la mano del mortero. Se lav el contenido de este con pequeas alcuotas de Agua Destilada, se pas a un matraz aforado de 100mL, se mezcl completamente y se afor.

4- Solucin Decolorante Alcohol-Acetona:

En una probeta de 100mL, se coloc 66,7mL de Etanol y 33,3mL de Acetona, luego se mezcl homogneamente.

5- Solucin Verde de Malaquita:

Se pes exactamente 5gr del colorante Verde de Malaquita y se disolvi en 100mL de Agua Destilada. Se filtr (en casos necesarios).

6- Solucin de Carbol Fucsina (Fucsina Fenicada):

Se coloc 5gr de Fenol en 100mL de Agua Destilada y se calent en bao de ebullicin, se aadi 1gr de Fucsina Bsica y se disolvi; se aadi 10mL de Etanol, se mezclo bien y luego se afor la solucin a 100mL con Agua Destilada.

7- Solucin Decolorante cido-Alcohol:

Se midi volumtricamente 3mL de cido Clorhdrico concentrado y 97mL de Etanol. Se agreg lentamente el cido al Alcohol y se almacen en una botella con tapn de vidrio y se etiquet correctamente.

8- Solucin de Azul de Metileno Alcalino:

Se disolvi 0,3gr de Azul de Metileno en 30mL de Etanol y se mezcl con 100mL de Hidrxido de Potasio al 0,01%.

9- Suero Fisiolgico:
En un vaso de precipitados se coloc 0,85gr de Cloruro de Sodio y se diluy con 100mL de Agua Destilada.

10- Solucin -Naftol:

Se disolvi 5gr de -Naftol en 100mL de Etanol. hermticamente cerrado. Se mantuvo en frasco de vidrio

11- Solucin Rojo de Metilo al 1%:

Se disolvi 0,1gr de Rojo de Metilo en 50mL de Etanol, y luego, se agresg 50mL de Agua Destilada. Por ltimo se filtr la preparacin.

12- Solucin de Hidrxido de Potasio al 40%:

Se disolvi 40gr de Hidrxido de Potasio en 75mL de Agua Destilada, se agit y se enfri constantemente. Cuando la solucin estuvo ms o menos a la temperatura ambiente (25C) se agreg el resto de Agua Destilada necesaria para enrasar a 100mL.

13- Reactivo de Kovacs:

Se disolvi 1gr de Para-dimetil-amino-benzaldehido en 80mL de Butanol y luego se aadi 20mL de cido Clorhdrico. Se conserv el reactivo en una botella con tapn de vidrio. Es importante mantenerlo refrigerado.

14- Solucin de Perxido de Hidrgeno al 3%:

Se disolvi 100mL de Perxido de Hidrgeno al 10% en 333,3mL de Agua Destilada. Se conserv en una botella con tapn de vidrio y refrigerado. (100mL de Agua Oxigenada al10% con 333,3mL de Agua Destilada para llegar a una concentracin de 3%)

15- Solucin de Hidrxido de Potasio al 3%:

Se disolvi 3gr de Hidrxido de Potasio en 100mL de Agua Destilada. Se guardo en un frasco de vidrio con tapa.

16- Lactofenol:
Se disolvi 20 gr de fenol en 20 ml de agua destilada, se calent ligeramente al agregar 40 ml de glicerina y 20 ml de cido lctico, se pueden agregar (opcional) colorantes tales como el azul algodn u otros, para teir las esporas y para que la observacin sea ms agradable a la vista.

17- Solucin Hipoclorito de Sodio al 1,5 %: Se mezcl 250mL de Hipoclorito de Sodio en 1000mL de agua destilada.
OBS: Los reactivos y colorantes preparados deben ser almacenados en recipientes con tapa y rotulados adecuadamente (nombre del reactivo, fecha de preparacin, responsable de preparacin, otras indicaciones).

RESULTADOS
1-Solucin de Cristal Violeta. 2-Solucin de Safranina. 3-Solucin de Lugol. 4-Solucin Decolorante Alcohol-Acetona. 5-Solucin Verde de Malaquita. 6-Solucin de Carbol Fucsina (Fucsina Fenicada). 7-Solucin Decolorante cido-Alcohol. 8-Solucin de Azul de Metileno Alcalino. 9-Suero Fisiolgico. 10- Solucin -Naftol. 11- Solucin Rojo de Metilo al 1%. 12- Solucin de Hidrxido de Potasio al 40%. 13- Reactivo de Kovacs. 14- Solucin de Perxido de Hidrgeno al 3%. 15- Solucin de Hidrxido de Potasio al 3%. 16- Lactofenol. 17- Solucin Hipoclorito de Sodio al 1,5 %.

DESCRIPCIN Y ANLISIS DE LOS RESULTADOS.

1- Solucin de Cristal Violeta: El violeta de metilo, comnmente denominado cristal violeta o violeta de genciana. La solucin de cristal violeta esta compuesta de Cristal Violeta, Metanol, Agua. Solucin de Cristal violeta en agua-alcohol sirve para la coloracin de Gram. Los organismos Gram positivos retienen el color violeta, mientras que los Gram negativos son decolorados y re coloreados por un colorante de contraste como la fucsina o la safranina (Toro). El cristal violeta (violeta de genciana) sirve como colorante primario, y se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solucin dbil de yodo, que sirve como mordiente para la unin del colorante. Cuando estas coloraciones de Gram son observadas junto con el tipo (cocos y bacilos) y la disposicin de las clulas bacterianas, pueden ser usadas para realizar identificaciones presuntivas (Koneman, 2004). 2- Solucin de Safranina: Es un colorante que sirve de contraste para la tincin Gram y esporas. Est compuesta de 0,25gr de colorante Safranina disuelto en 10mL de Etanol al cual se agrega Agua Destilada hasta llegar a 100 mL. La safranina, es un colorante biolgico, de contraste que al ser utilizado en la Tincin de Gram proporciona un color violeta ms intenso a las bacterias grampositivas y tie de rosa a las bacterias gramnegativas (Toro). Es una solucin acuosa de Safranina, es empleada como colorante alternativo en la coloracin de Gram. Liquido Color rojo sangre sin presencia de partculas suspendidas, ni precipitadas. Los organismos Gram positivos retienen el color violeta, mientras que los Gram negativos son decolorados y re coloreados por un colorante de contraste como la fucsina o la safranina. 3- Solucin de Lugol: El Lugol o solucin de Lugol est compuesto de yodo molecular y yoduro potsico en agua destilada. La disolucin de Lugol contiene Ioduro de Potasio, Yodo Metlico, y agua. Es empleado en la tincin de Gram para retener a colorante cristal violeta. El yodo entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el colorante cristal violeta. Los organismos Gram positivos retienen el color violeta, mientras que los Gram negativos son decolorados y re coloreados por un colorante de contraste como la fucsina o la safranina de Gram. No debe confundirse con la tintura de yodo, que consiste en yodo diatmico y sales de yodo diluidas en agua y alcohol etlico ( etanol). La solucin de Lugol no contiene alcohol. (Toro) Se agrega yodo a las preparaciones hmedas de las muestras parasitolgicas para reforzar el contraste de las estructuras internas. Facilita la diferenciacin entre amebas y leucocitos del anfitrin (Koneman, 2004). Lugol-parsitos: Solucin de yodo yoduro en agua. El yodo hace que se retarden los movimientos de los flagelados y permite distinguirlos, tie de amarillo los ncleos de los quiste, de pardo las vacuolas que contienen glucgeno y de azul los grano de almidn.

4- Solucin Decolorante Alcohol-Acetona: Esta solucin es una mezcla de alcohol acetona en proporcin 3:1 para la tcnica de de Gram. Lquido inflamable y muy voltil. Utilizado como el decolorante de Gram. Los organismos Gram positivos retienen el color violeta, mientras que los Gram negativos son decolorados y re-coloreados por un colorante de contraste como la fucsina o la safranina de Gram (Toro). 5- Solucin Verde de Malaquita: El verde de Malaquita es una disolucin compuesta por el colorante Verde de Malaquita en 100mL de Agua Destilada. El verde de malaquita es un colorante verde activo frente a una gran variedad de parsitos externos y agentes patgenos como hongos, bacterias, etc. Su principal aplicacin es para el tratamiento contra parsitos protozoos de agua dulce. La solucin acuosa saturada de verde malaquita es un colorante para esporas (Toro). 6- Solucin de Carbol Fucsina (Fucsina Fenicada): Esta solucin est compuesta de fenol en cristales, metanol, y agua. La solucin Fenicada de fucsina empleada como colorante primario en la coloracin de Ziehl Neelsen. Es un lquido color fucsia translucido sin presencia de partculas suspendidas, ni precipitadas. Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos de cadena larga que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos como la fucsina de fenicada. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. En el caso de la Fucsina de Gram, Solucin de Fucsina bsica en metanol y agua con fenol, para la coloracin de Gram. Los organismos Gram positivos retienen el color violeta, mientras que los Gram negativos son decolorados y re coloreados por un colorante de contraste como la fucsina o la safranina de Gram (Toro). 7- Solucin Decolorante cido-Alcohol: Compuesto de Metanol 98% y cido Clorhdrico 2%. Lquido decolorante en la coloracin de Ziehl Neelsen, transparente sin presencia de partculas suspendidas, ni precipitadas. Tambin denominado alcohol cido. Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos de cadena larga que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras Las micobacterias, estn cubiertas por un material grueso, ceroso, que resiste la tincin; no obstante, una vez que se tien las paredes celulares bacterianas resisten la decoloracin por solventes orgnicos fuertes, como el alcohol-cido (Koneman, 2004). Esta tincin tambin se utiliza para identificar las clulas patgenas del gnero Nocardia (Tortora)

8- Solucin de Azul de Metileno Alcalino: Tincin simple que consiste en 0,3gr de Azul de Metileno en 30mL de Etanol mezclado con 100mL de Hidrxido de Potasio al 0,01%. Se utiliza como reactivo una disolucin de azul de metileno, se extiende la preparacin con colorante y se deja actuar de 15 minutos. Se lava bien con agua quitando el exceso. Se seca al aire y se ve con el objetivo de 100%. Las bacterias aparecern de color azul en mayor o menor grado. (http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/tinciones/acido). 9- Suero Fisiolgico: En un vaso de precipitados es colocado 0,85gr de Cloruro de Sodio, que se diluye con 100mL de Agua Destilada. Sirve para determinar la actividad biolgica de los microorganismos, como movilidad y reacciones a ciertos qumicos o reactividad serolgica contra sueros especficos. Esto ltimo incluye la reaccin de hinchazn capsular de Neufeld usada para identificar tipos capsulares Strptococcus pneumoniae y Haemophylus influenza (Koneman, 2006). 10- Solucin -Naftol: La reaccin de Molisch es una reaccin que tie cualquier carbohidrato presente en una disolucin; es llamada as en honor del botnico austraco Hans Molisch. Se utiliza como reactivo una disolucin de -naftol al 5% en etanol de 96. En un tubo de ensayo a temperatura ambiente, se deposita la solucin problema y un poco del reactivo de Molisch. A continuacin, se le aade cido sulfrico e inmediatamente aparece un anillo violeta que separa al cido sulfrico, debajo del anillo, de la solucin acuosa en caso positivo. Es una reaccin cualitativa, por lo que no permite saber la cantidad de glcidos en la solucin original. (http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/tinciones/acido). 11- Solucin Rojo de Metilo al 1%: Se disolvi 0,1gr de Rojo de Metilo en 50mL de Etanol, y luego, se agreg 50mL de Agua Destilada. Por ltimo se filtr la preparacin. Rojo de Metilo/Voges-Proskauer: Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetras y permiten la diferenciacin dentro de las enterobacterias del grupo coli y aergenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarn la glucosa en dos fases: primero la metabolizarn aerobiamente (respiracin oxibintica) consumiendo rpidamente el oxgeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizndola por va anaerobia (fermentacin). sta puede ser de dos tipos: -Fermentacin cido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son cidos orgnicos (cidos frmico, actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4. -Fermentacin butiln gliclica: La realizan las bacterias del grupo KlebsiellaEnterobacter (antiguo aergenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, producindose acetona como intermediario que podr ser detectada aadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarn con este compuesto produciendo un color rojo caracterstico. (http://www.joseacortes.com prcticas de laboratorio).

12- Solucin de Hidrxido de Potasio al 40%: Solucin compuesta de Hidrxido de Potasio en Agua Destilada a 100mL.Sirve para detectar Escherichia coli y Enterobacter aerogenes, etc. El Hidrxido de potasio al 40% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos (http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm). 13- Reactivo de Kovacs: Compuesto de Paradimetil amino benzaldehdo, Acido Clorhdrico y Alcohol amlico. Es un lquido traslucido de color amarillo pardusco sin presencia de partculas suspendidas ni precipitadas. Mediante esta prueba se detecta la liberacin de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberacin se debe a la degradacin del aminocido triptfano mediante el enzima triptofanasa. Para la realizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptfano). Para la posterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovac's. (http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm). Los organismos de control por el Kovac (Indol) son; E. coli, K. y pneumoniae; con reacciones esperadas de rojo (positivo) y sin color rojo (negativo) respectivamente (Koneman, 2004). 14- Solucin de Perxido de Hidrgeno al 3%: El Agua oxigenada (H2O2) es un compuesto que acta como oxidante suele emplearse en la limpieza de las heridas. Otros oxidantes son: el ozono (O3) y el dicromato-potsico, permanganato. Decolorante y/o desinfectante de reas biolgicas. En caso de contacto con la piel lave con abundante agua. La oxidacin de la piel genera unas manchas blancas que desaparecen unas horas despus del contacto, si permanecen estas manchas consulte al mdico. (http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm). 15- Solucin de Hidrxido de Potasio al 3%: Est compuesto de Hidrxido de Potasio en Agua Destilada. 16- Lactofenol: Compuesto de fenol en agua destilada, se con agregado de glicerina y cido lctico; tambin puede contener colorantes tales como el azul algodn u otros, se utiliza para la tincin de las esporas y para que la observacin sea ms agradable a la vista. Se realizan las preparaciones a partir de cultivos. El fenol destruye la flora acompaante y organismos; el cido lctico conserva las estructuras fngicas y el azul algodn tie la quitina de las paredes fngicas. El fenol destruye la flora acompaante, el acido lctico conserva las estructuras fngicas al provocar un cambio de gradiente osmtico con relacin al interior del fngico generando una pelcula, el Azul de algodn posee la capacidad de adherirse a la quitina presente en las hifas y conidios y de los hongos microscpicos. (http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/tinciones/acido).

17- Solucin Hipoclorito de Sodio al 1,5 %: sta solucin contiene 250mL de Hipoclorito de Sodio en 1000mL de agua destilada. Los desinfectantes que contienen hipoclorito sdico (detergentes) son potentes agentes oxidantes que liberan Cl2 (gas cloro). La exposicin al cloro produce irritacin de mucosas y del tracto respiratorio superior. En las reas en que se manipulen estos productos deber existir una ventilacin adecuada y deben usarse guantes resistentes, protectores oculares y ropa adecuada (bata) (Lazo, 2004 -65)

CONCLUSIN
Finalizada la prctica realizada, se lograron los objetivos propuestos; pues, durante la prctica se tuvo en cuenta las normas de bioseguridad que debe tenerse en el laboratorio, utilizando correctamente los elementos de laboratorio. Tambin se adquiri conocimiento acerca de distintos tipos de reactivos, y se prepar algunos de stos. De manera siguiente, se describi y analiz los resultados obtenidos con ayuda de materiales bibliogrficos.

BIBLIOGRAFAS
Koneman, E., et al. 2006. Diagnstico Microbiolgico: Texto atlas en color. 5a Ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. Pgs.: 23 y 25 Lazo, E. 2004. Manual de seguridad en Laboratorios de Microbiologa Molecular. Coordinacin Editorial MCA. Mxico. Pg.: 65 Prast, G. 2005. Microbiologa Clnica. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. Pgs.: 18, 22 y 23 Toro, D. 2005. Manual de Introduccin al Laboratorio de Microbiologa. 1 a Ed. Editorial Universidad de Caldas. Colombia. Pg.: 103 y 104 Tortora, G. et al. 2007. Introduccin a la microbiologa. 9a Ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. Pgs.: 6 y 70. (http://www.joseacortes.com prcticas de laboratorio). (http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm). (http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/tinciones/acido).