BIOSEGURIDAD, ESTERILIZACIN Y MATERIALES MICROBIOLOGA

AO DE LA PROMOCIN DE LA INDUSTRIA

RESPONSABLE Y DEL COMPROMISO CLIMTICO

FACULTAD: Ingeniera Qumica

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
TEMA: Bioseguridad, Esterilizacin y materiales Sonia Herrera Snchez

PROFESOR:

INTEGRANTES: o Azorza Guillen, Kevin Remigio - 1026120053 o Roca Pelayo, Cynthia Liliana - 1026120089 o Quispe Oroya, Luis Jeffry - 1116110027 o Torres Baquerizo, Angie Isabel - 1116120417

GRUPO HORARIO: SEMESTRE:

91G

2014-A

Bellavista - Callao

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MICROBIOLOGA

INTRODUCCIN En los laboratorios de microbiologa se trabaja con microrganismos que pueden infectar, o con materiales que los contienen. Algunos pueden ser patgenos o con potencial de convertirse en ellos; debido a esto es muy importante La bioseguridad y correcta esterilizacin son indispensables para un buen desempeo dentro del laboratorio. El objetivo primordial de la bioseguridad consiste en prevenir, combatir y/o gestionar los riesgos para la vida y la salud La bioseguridad requiere un ambiente de trabajo asptico, ordenado y seguro, para esto es importante tener en cuenta los procesos para la esterilizacin y desinfeccin. La esterilizacin es una tcnica de saneamiento preventivo que garantiza la eliminacin total de todos los microorganismos; algunos de los procesos con los que se puede lograr una esterilizacin exitosa son: calor hmedo, calor seco, radiaciones y fro. Si se requiere multiplicacin de un microorganismo, ya sea para investigacin o para su utilizacin, es necesario conocer sus requerimientos para lograr un medio de cultivo propicio para su crecimiento y multiplicacin; para tener un medio de cultivo adecuado es necesario que este contenga los nutrientes adecuados para que el microorganismo se desarrolle, adems de contener humedad suficiente, un pH optimo, una concentracin adecuada de oxgeno y estar completamente estril. Cuando se desea el crecimiento y la multiplicacin de una bacteria en un medio solido generalmente es utilizada el agar el cual es un polisacrido proveniente de un alga marina; este medio de cultivo se puede utilizar en tubos de ensayo y en cajas de Petri.

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LABORATORIO N1 BIOSEGURIDAD, ESTERILIZACION Y MATERIALES

OBJETIVOS Comprender los conceptos bsicos de esterilizacin, las metodologas existentes para desinfectar y las distintas aplicaciones en la industria. Aprender a manipular correctamente los distintos equipos as como tambin el funcionamiento y conservacin de ellos. Conocer y aplicar las normas de bioseguridad para el desarrollo de actividades y el bienestar de personal que elabora en el laboratorio de microbiologa.

CONCEPTOS BASICOS La microbiologa.- Ciencia encargada del estudio de los organismos microscpicos (celulares y subcelulares), principalmente de aquellos que se encuentran por debajo del poder de resolucin del ojo humano. Microorganismo.- Organismo vivo que requiere de montajes especiales para su observacin bajo microscopio. Metabolismo microbiano.- Conjunto de reacciones bioqumicas que suceden en los microorganismos y por medio de las cuales, obtienen la energa y los nutrientes necesarios para llevar a cabo su crecimiento, mantenimiento de estructura celular y reproduccin. ESTERILIZACIN La esterilizacin es la eliminacin o muerte de todos los microorganismos que contienen un objeto o sustancia, por lo general se acondicionan de tal forma que no puedan contaminarse nuevamente. El material que se utiliza para determinacin de microorganismos debe esterilizarse previamente para liberarlo de la microbiota ambiental. METODOS DE ESTERILIZACIN Un material es considerado estril cuando la probabilidad de supervivencia de cualquier microorganismo en el mismo es inferior a una entre un milln.

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MTODOS QUMICOS xido de Etileno: Es un gas incoloro e inodoro cuyas especiales propiedades qumicas le permiten buena difusin en los materiales porosos, buena difusin y absorcin en la mayora de los plsticos termosensibles, no reacciona ni deteriora la mayora de los materiales que constituyen los elementos a esterilizar por este mtodo lo que permite su uso sin riesgo. Se utiliza entre los 25 C y los 55 C garantizando la no deformacin o destruccin de los elementos a esterilizar. Traspasa las membranas de las empaquetaduras que contienen los elementos, en especial el film de polietileno. Mecanismo de accin: Acta como agente alquilante, provocando una modificacin irreversible en enzimas e inhiben la actividad su actividad. Es activo contra todo tipo de bacterias, incluyendo esporas bacterianas, virus y bacilos tuberculosos. MTODOS FISICOS Calor: La utilizacin de este mtodo y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposicin y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos. Calor Hmedo (autoclave):El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas estructuras biolgicas son producidas por reacciones que eliminan agua. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado que el aire. Los materiales debern disponerse de tal manera que se asegure el intimo contacto de todas sus partes con el vapor. Ej.: pinzas abiertas, jeringas desensambladas, etc. Se realiza la esterilizacin por el vapor de agua a presin. El modelo ms usado es el de Chamberland. Esteriliza a 120 a una atmsfera de presin (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos.

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Calor Seco (estufa):El agente esterilizante es el aire caliente. Mecanismo de accin: La muerte microbiana se produce como consecuencia de mecanismos de transferencia de energa, adems de la oxidacin. IRRADIACIN (RAYOS GAMMA O ULTRAVIOLETAS) Rayos Ultravioletas:Afectan a las molculas de DNA de los microorganismos. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilizacin en quirfanos. Rayos Gamma:Su empleo est basado en los conocimientos sobre la energa atmica. Este tipo de esterilizacin se aplica a productos o materiales termolbiles y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibiticos, vacunas, alimentos, etc. A BAJAS TEMPERATURAS (FORMALDEHDO, CIDO PERACTICO, PERXIDO DE HIDRGENO) Glutaraldehdo:Consiste en preparar una solucin alcalina al 2%, es esterilizante despus de las 14 horas de inmersin. Posee la desventaja de tener una alta toxicidad, de poseer mltiples etapas de proceso (inmersin, enjuague, secado) y dificultades para validar y controlar el proceso. Pueden esterilizarse con este mtodo: plstico, goma, vidrio, metal, etc. Pero se lo utiliza mayormente como desinfectante de alto nivel Formaldehdo:Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las cuales pueden disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodn, que despus pueden ser expuesta al calor para una rpida esterilizacin (accin del gas formaldehdo. Tambin pueden ser usadas en Estufas de Formol, que son cajas de doble fondo, en donde se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60 C y pueden esterilizar materiales de ltex, goma, plsticos, etc.Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 horas. Gas-Plasma de Perxido de Hidrgeno:Se define al plasma gaseoso como una nube de partculas cargadas positivamente y negativamente, junto a partculas atmicas neutras y otras especies moleculares. Una solucin de peroxido de hidrogeno al 58%, es vaporizado en el interior de una cmara hermtica. Por medio de la induccin de radiofrecuencia, se generan campos elctricos que provocan la aceleracin de electrones y otras partculas, colisionando unas con otras. Estas colisiones inician reacciones que generan radicales libres: hidroxilos, hidroperoxidrilos, peroxido activado, luz ultravioleta, y otras especies activas.

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Dichos radicales libres, interactan con la membrana celular, enzima y cidos nucleicos, provocando la anulacin de las funciones vitales de los microorganismos y en consecuencia su muerte.Por filtracin (filtros EPA) FILTRACIN: Se usan membranas filtrantes con poros de un tamao determinado. El tamao del poro depender del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos ltimos estn en el lmite de separacin segn el dimetro de poro que se utilice. La filtracin se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolbiles. Su usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftlmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnsticas, radiofrmacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibiticos y vitaminas. Existen tres tipos bsicos de filtros: Filtros profundos o Filtros de profundidad: Consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo de filtros la retencin de las partculas se produce por una combinacin de absorcin y de retencin mecnica en la matriz. Membranas filtrantes: Tienen una estructura continua, y la retencin se debe principalmente al tamao de la partcula. Partculas ms pequeas al tamao del poro quedan retenidas en la matrizdel filtro debido a efectos electrostticos. Filtros de huella de nucleacin (Nucleoporo):Son pelculas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiacin y sustancias qumicas. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partcula con un tamao mayor al del poro.

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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin. Llevar puesta el guardapolvo en todo momento. La misma debe permanecer completamente cerrada. Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesin prctica. Lavar las manos con agua y jabn antes de realizar las actividades programadas, antes de salir del laboratorio y siempre despus de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes. Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las reas de laboratorio. Evitar llevar en laboratorio accesorios que podran ser fuente de contaminacin. Recoger el cabello largo. No comer, beber fumar, almacenar comida, objetos personales u utensilios, aplicarse cosmticos ni ponerse o quitase lentes de contacto en ningn rea del laboratorio. Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades indicadas en la prctica. Si usted tiene alguna duda, dirigirse al profesor. Mantener el rea de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales, exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realizacin del trabajo prctico.

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Regresar lo reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte cualquier dao de los mismos al profesor. No usar ningn reactivo que no est debidamente identificado, verificar las etiquetas de los mismos y estar seguro de como emplearlo. No devolver sustancias a sus envases originales. Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo experimentos no autorizados. Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor. Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la inoculacin accidental y la generacin de aerosoles durante su manipulacin y desecho. Emplear tcnicas aspticas para el manejo de cultivos de microorganismos.

MATERIALES TIPO LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA A. Materiales de uso corriente: 1. Material de vidrio o plstico que se usa para contener o medir : Aqu se incluyen tubos de ensayo, vasos precipitados, matraces embudos, probetas, pipetas, dosificadores, etc., todo ellos de distintos tamaos y capacidades. Tambin incluimos las placas de Petri, los portaobjetos y cubreobjetos, cmaras de recuento, cestillos para efectuar tinciones, jarras para incubar en anaerobiosis, etc.

Jarras de anaerobios: Recipientes que se usan para conseguir una atmosfera libre de oxgeno para el cultivo de microorganismos anaerobios.

Placas de Petri: Recipientes para la preparacin de medios de cultivos slidos.

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Porta y cubres objetos: se utiliza para realizar observaciones al microscopio

2. Material de siembra: constituido principalmente por asas y filamentos de platino, asas de Digalski y pipetas estriles.
Asas de Digralski: Se utilizan para la extensin de microorganismos sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri.

Asas de siembra:Se utilizan para sembrar. Pueden ser metlicas o de plstico, curvas o rectas (para la siembra por picadura).

3. Material para toma de muestras e inoculaciones: escobillas estriles, tubos y frascos estriles, jeringa y agujas, trocares, cnulas, catteres y material de diseccin. B. Aparatos productores de calor: 1. Para esterilizacin: autoclave (calor hmedo), horno Pasteur (calor seco) y mechero Bunsen (esterilizacin por calentamiento directo) Autoclave: Es el equipo ms utilizado. Es un procedimiento de esterilizacin mediante calor hmedo. Se realiza en al autoclave durante 15 20 min, segn el volumen, a 115C 121C, segn la naturaleza del material que se desee esterilizar.
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Horno de Pasteur: Emplea altas temperaturas (160-180 C) durante un tiempo prolongado (1.5 a 3 horas). Debido a su poca capacidad de penetracin se usa para esterilizar vidrio y metales. Acta principalmente desnaturalizando las protenas y secundariamente oxidando los compuestos celulares.

Mechero bunsen: Todas las manipulaciones deben realizarse en un radio de 10-15cm de la llama del mechero (zona asptica).Antes de comenzar a trabajar se procurar disponer de todo el material necesario para el procesamiento de la muestra. Tomar las medidas necesarias para evitar la contaminacin de las muestras o/ y cultivo por microorganismos ambientales.

2. Para incubacin: Estufas de incubacin y baos de agua Estufas de incubacin: Es una cmara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos. Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura ptima de crecimiento (generalmente entre 3537)

Baos termostticos: Son recipientes que contienen agua de regulacin de la temperatura. Se utiliza para atemperar medios de cultivos o incluso para incubar cultivos de microorganismos.

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C. Aparatos productores de frio 1. Refrigeradores: Son indispensables para conservar los medios de cultivo, productos biolgicos y patgenos, as como mantener la supervivencia de algunos mo. Su temperatura oscila alrededor de los 4C.

2. Congeladores: Alcanzan temperaturas entre -20 y -70C y son indispensable para conservar determinados productos biolgicos ( sueros, clulas, mo)

D. Material ptico: Es de capital importancia en el al laboratorio ya que permite la observacin de los microorganismos. 1. Microscopio: Instrumento diseado para ser posible la observacin y examen de seres muy pequeos o los elementos formativos de uno de ellos y que estn fuera de la visibilidad adecuada del ojo humano. En su distintas versiones (campo claro, campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia).

2. Lupa estereoscpica o cuenta colonias: Es un aparato que mediante la iluminacin de la placa y una lupa, nos permite observar con mayor nitidez las colonias y por lo tanto facilita su recuento

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E. Otro tipo de material y aparatos 1. Centrifugas: Aparato que aplica sobre los tubos una fuerza centrfuga lo que permite la separacin de los distintos componentes de la muestra mediante la precipitacin en el fondo del tubo de las partculas en suspensin.

2. Balanza Analtica:Sirve para pesar materiales, lquidos o slidos con fracciones de gramos. Tiene una precisin de 0.0001g; necesitan ser calibradas

3. Destiladores:Se utiliza para hacer destilaciones de algunas sustancias, especialmente el agua. Quita las sales del agua.

4. Plancha de calentamiento (agitador magntico): Este aparato tiene un agitador magntico y por esta razn permite calentar sustancias en forma homognea

5. PH metros:es un sensor utilizado en el mtodo electroqumico para medir el pH de una disolucin, es decir el nivel de acidez o alcalinidad de una solucin o medio.

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CUESTIONARIO 1. Liste al menos tres microrganismos representativos mencionando la importancia que representa para su rea de formacin. Segn la clasificacin de niveles: Nivel 1 Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Treponema carateum

Son importantes para la industria alimentaria ya que puede dar indicios de su origen y de su procesamiento. Nivel 2 Estafilococos Salmonella Erysipelothrix rusiopathae

Son importantes para el manejo de las aguas residuales y contaminacin en los suelos. Nivel 3 M. tuberculosis Brucella Coxiella burneti

Es importante en el medio de investigacin y en el control de enfermedades. Nivel 4 Bovis Herpesviridae Alphaherpesvirinae

Control biolgico en las poblaciones humanas.

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2. Qu medidas podra tomar usted para verificar la efectividad de la esterilizacin? Existen diversos tipos de controles durante el proceso de esterilizacin entre ellos tenemos: Control fsico Son elementos incorporados al esterilizador como termmetros, manmetros de presin, sensores de carga, vlvulas y sistemas de registro. Estos monitores fsicos son de gran utilidad, pero no son suficientes como indicadores de esterilizacin. Deben ser calibrados peridicamente. Control qumico Los indicadores qumicos son productos comerciales consistentes en sustancias qumicas que cambian de color si se cumple un elemento clave del proceso de esterilizacin como por ejemplo la temperatura necesaria; un indicador es una sustancia natural o sinttica que aadida a la muestra sobre la que se desea realizar el anlisis produce un cambio fsico que es apreciable a los sentidos. Se utilizan qumicos que viran de color en contacto con agente esterilizante. Pueden ser externos, se colocan por fuera del paquete y distingue de un material procesado de uno que no. Los internos detectan la correcta penetracin del agente esterilizante. Ej.: Prueba de Bowie Dick que visualiza la eficacia en la penetracin de vapor en textiles. Control biolgico Un indicador biolgico es una preparacin caracterizada de un microorganismo especfico resistente a un proceso de esterilizacin en particular. Los indicadores biolgicos se utilizan como auxiliares en la operacin de la calificacin fsica de aparatos de esterilizacin, en el desarrollo y establecimiento de un proceso de esterilizacin validado para un producto, en la verificacin peridica de esterilizacin validada de un equipo, materiales y componentes de empaque que se empleen en procedimientos aspticos y en programas de verificacin peridica de ciclos de esterilizacin previamente establecidos y documentos.Uso de dispositivos inoculados con bacterias. Las esporas bacterianas presentan una gran resistencia frente a los antimicrobianos fsicos y qumicos debido a esa propiedad y a la facilidad de cultivar es que se utilizan las esporas de Bacillius, para monitorear y validar los procesos de esterilizacin de calor seco, hmedo, radiacin y agentes qumicos.

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3.Qu metodologa de esterilizacin es adecuada para cada una de las Siguientes muestras ambientales? a) Medios de cultivo slidos contaminados con Salmonella Para este tipo de muestra se utiliza el mtodo de autoclave aplicando calor hmedo con una temperatura de 121C (con un tiempo de exposicin mayor a 15 minutos para destruir microorganismos formadores de esporas. La esterilizacin ultravioleta es otro caso, es un proceso de destruccin de toda vida microbiana por medios de la radiacin ultravioleta, es uno de los medios probados para tratar aguas, aire o superficies contaminas biolgicamente.Entre los microorganismos sensibles a la radiacin ultravioleta encontramos la salmonella. b) Muestras de agua residual domstica Al ser una solucin lquida se utiliza el mtodo de filtracin, que consiste en pasar las soluciones por filtros con poros de dimetros a escala de micras que retienen por tamao a los microorganismos. c) Hisopos utilizados en muestreo de manipuladores de alimentos Utilizacin de calor seco proporcionado por el horno as como tambin los hisopos los podemos esterilizar con alcohol isoproplico, que es una, lquido compuesto qumico orgnico incoloro e inflamable. Sostener el hisopo de algodn sobre el fregadero con ambas manos para que no se caiga y pedir ayuda para verter una pequea cantidad de alcohol isoproplico en el hisopo hasta que est completamente mojada. d) Tejidos de procedencia animal y origen desconocido El mtodo ms confiable a utilizar es la radiacin ionizante como los rayos X y rayos , que producen iones o radicales libres que alteran las bases de los cidos nucleicos (estructuras proteicas y lipdicas y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos). Tienen gran penetrabilidad y se utilizan para esterilizar materiales termo-sensibles. e) Suelo La metodologa para esterilizar este tipo de muestra, requiere la utilizacin de calor seco depositando la muestra en un recipiente de vidrio.

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La esterilizacin de suelos puede realizarse por medio de: calor hmedo, calor seco, filtracin, irradiacin o por medio qumicos. En la prctica, el calor hmedo elimina las clulas vegetativas bacterias y hongos en 5-10 min (a temperaturas prximas a los 60C). En cambio las esporas de hongos solo son destruidas despus de 15 min a 120C. Para lograr temperaturas superiores a 100C se utiliza el mtodo de autoclave. En este caso la temperatura se relaciona con la presin utilizada en el aparato, cuando usamos el autoclave utilizamos el principio de vapor saturado a presin como el mtodo de estilizacin y para que este mtodo sea realmente efectivo debe eliminarse totalmente el aire que existe dentro del autoclave.En ciertos casos para esterilizar el suelo en pequeas cantidades, se puede aplicar la tcnica de la esterilizacin fraccionada o le mtodo de vapor fuente a 100C (Tindalizacin). f) Suelo contaminado con patgenos de plantas Requiere la utilizacin de calor seco depositando la muestra en un recipiente de vidrio. En general las formas vegetativas bacterianas mueren por calentamiento a 50-70C. Las endosporas, (las formas de vida ms termoresistentes), requieren mayores temperaturas y tiempo de exposicin. Para esto, se usa el mtodo de autoclave de vapor que trabaja a una presin superior a la atmosfrica. El agua a presin atmosfrica hierve a 100C. A presiones superiores, la temperatura de ebullicin aumenta por lo que se pueden calentar soluciones acuosas (como los medios de cultivo) a temperaturas superiores a 100C. El autoclave permite elevar la presin de una a dos atmsferas sobre la presin atmosfrica. g) Antibiticos Para esterilizar antibiticos se utiliza el mtodo de filtracin, puesto que sta muestra es muy sensible al calor. Los antibiticos se pueden esterilizar por accin de los rayos gamma, su empleo est basado en los conocimientos sobre la energa atmica. Este tipo de esterilizacin se aplica a productos o materiales termolbiles y de gran importancia en el campo industrial

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CONCLUSINES La Bioseguridad es un trmino de suma importancia para lograr una plena seguridad y bienestar tanto del personal presente en el laboratorio de microbiologa como el de su trabajo. La esterilizacin es un mtodo que garantiza la higiene de los materiales necesarios para realizar cualquier procedimiento dentro del laboratorio de microbiologa y con ello obtener resultados exitosos. El conocimiento acerca del uso de los instrumentos del laboratorio es de suma importancia para obtener buenos resultados y ahorrar tiempo de trabajo.

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