58

3. Suelo
El suelo est formado por cinco componentes principales: minerales, agua, aire, materia orgnica y seres vivos, cuya proporcin no es la misma en todos los suelos. El aire y el agua juntos representan alrededor de la mitad del volumen del suelo. El agua se mueve por accin de la gravedad atravesando los poros ms grandes y una parte es retenida por interacciones con los otros constituyentes inertes, siendo aprovechada por los organismos vivos slo una fraccin de la misma. La aireacin y la humedad estn interrelacionadas, ya que los poros que no contienen agua estn llenos de gas. La atmsfera subterrnea es diferente de la superficial porque tiene menos O2 y comnmente de diez a cien veces ms CO2 debido a la actividad biolgica (3). Un corte vertical del suelo revela el perfil definido por las capas horizontales: O) mantillo superficial, grueso o delgado, de restos orgnicos en descomposicin; A) horizonte del cual han desaparecido algunos constituyentes inorgnicos durante el largo perodo de formacin del suelo pero ms o menos rico en materia orgnica, que contiene las races, unos pequeos animales y la mayora de los microorganismos; B) horizonte en el cual se depositan algunos coomponentes provenientes de las capas superiores, con poca materia orgnica, algunas races y escasos microorganismos; C) estrato de composicin semejante al material original, donde hay pocas formas de vida (80). El suelo presenta una gran heterogeneidad, pues est dividido en una multitud de microambientes cuyas las condiciones suelen ser muy diferentes unas de otras, lo que explica por ejemplo la presencia de bacterias y actinobacterias neutrfilas y/o alcalfilas en suelos cidos, o desnitrificantes en suelos bien aireados. Los soportes orgnico y mineral no son inerte. Los diversos procesos fsicos, qumicos y biolgicos que ocurren estn ntimamente intrincados, por ejemplo los productos del metabolismo microbiano suelen ser sustrados provisoriamente del proceso de biodegradacin por adsorcin sobre coloides (estabilizacin). Figura 3.1. Biomasa del suelo (12).

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

59

La energa necesaria para el desarrollo de los microorganismos heterotrficos que constituyen la mayora de las poblaciones del suelo, proviene indirectamente de la fotosntesis. Tambin hay una micro y mesofauna que suelen intervenir activamente en los procesos del suelo (4). Adems, el suelo constituye un reservorio de microorganismos que se estn domesticando con el fin de aumentar la productividad agrcola de una manera sustentable (81).

3.1. Microorganismos
Los efectos benficos de los microbios del suelo son amplios y van desde la fijacin de nitrgeno y la descomposicin de la materia orgnica hasta la hidrlisis de agroqumicos y subproductos metablicos, y el mejoramiento de la biodisponibilidad de nitratos, sulfatos, fosfatos y metales esenciales (82). No estn distribudos uniformente en el suelo debido al mosaico discontinuo de microambientes, donde los favorables para el desarrollo microbiano se caracterizan por su limitada extensin en el espacio y el tiempo. La dispersin de los microorganismos, con excepcin de los fototrficos, sigue la distribucin vertical de los nutrientes pero es alterada por otros factores, como la composicin de la atmsfera del suelo, el pH, la humedad, la cantidad de minerales asimilables y la presencia de substancias antimicrobianas (4). Cuadro 3.1. Ejemplo de la densidad microbiana en un suelo (80) Profundidad cm 3-8 20-25 35-40 65-75 135-145 organismos /g Bacterias aerbicas 7.800.000 1.800.000 472.000 10.000 1.000 Bacterias anaerbicas 1.950.000 379.000 98.000 1.000 400 Actinomicetos 2.080.000 245.000 49.000 5.000 ... Hongos 119.000 50.000 14.000 6.000 3.000 Algas 25.000 5.000 500 100 ...

La curva ms frecuentemente observada en la distribucin vertical de las bacterias y hongos es de tipo decreciente, donde la densidad microbiana que alcanz un mximo muy cerca de la superficie disminuye progresivamente con la profundidad. La reduccin en los primeros centmetros de suelo se debe a la accin de la luz solar y la desecacin.

Figura 3-2. Tipos de distribucin vertical de las bacterias del suelo (4)

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

60

En el caso de ciertos suelos forestales donde el mantillo aporta substancias inhibidoras que no son biodegradadas rpidamente en el horizonte superior, la densidad microbiana aumenta en la capa intermedia y la curva es de tipo convexo. Si los compuestos inhibidores de origen vegetal o sintetizados por otros microorganismos, se acumulan en el horizonte intermedio y hay un estmulo en la profundidad debido a la base calcrea que aumenta el pH, la curva es de tipo cncavo porque la densidad microbiana es mayor tanto en la superficie como en la profundidad, aunque esta distribucin es rara (4). La distribucin de las cianobacterias y algas est regida por la luz y la humedad. En los suelos saturados estn en la superficie o los primeros milmetros, en los no saturados dentro del primer centmetro dependiendo de la posibilidad de penetracin de la luz, mientras que en los suelos halomorfos donde la eflorescencia salina forma una costra transparente pueden hallarse en los tres primeros centmetros del perfil. El agua suele arrastrar las clulas ms abajo pero solo aquellas especies capaces de cambiar a un metabolismo heterotrfico pueden sobrevivir. La distribucin horizontal de los microorganismos est ligada a la macroheterogeneidad del suelo y puede ser debida a la accin de la vegetacin que modifica el ambiente superficial, por ejemplo la Figura 3-3. Acidificacin del suelo debida acidificacin producida por el al mantillo de Pinus (4) mantillo de Pinus, y al efecto de las races (4). En muchos de los reconocimientos de las especies pro y eucariticas se han empleado tcnicas de cultivo, pero tambin se suelen detectar los genes del ARN ribosmico o el ADN, por diversas tcnicas de la biologa molecular, para evaluar las comunid} ades microbianas de inters agronmico (83). Las bacterias Gram-negativas (Acinetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Caulobacter, Cellulomonas, Flavobacterium, Pseudomonas, Xanthomonas) predominan en nmero respecto a las Gram positivas (Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Clostridium, Corynebacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Staphylococcus, Streptococcus). En cuanto a los actinomicetos, los gneros ms abundantes son Streptomyces y Nocardia, con menos frecuencia se hallan Micromonospora, Actinomyces y otros (80). Los gneros ms representativos de bacterias del suelo son Myxococcus, Chondrococcus, Archangium y Polyangium (19). Entre las principales poblaciones fototrficas se encuentran las cianobacterias Anabaena, Cylindrospermum, Lyngbya, Microcoleus, Nostoc, Oscillatoria, Plectonema, Schizothrix, Scytonema y Tolypothrix) (84). Los gneros de hongos que tienen especies representativas en la mayora de los suelos son Absidia, Aspergillus, Chaetomium, Epicoccum, Fusarium, Gymnoascus,

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

61

Mortierella, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma, Gliomastix, Memnoniella, Rhizoctonia, Stachybotrys y Zygorhynchus. Tambin es comn hallar micelio de basidiomicetos, mixomicetos y oomicetos (21). Las levaduras Candida, Cryptococcus, Lipomyces y Rhodotorula se encuentran en una amplia variedad de suelos (85). En un mortero, previamente desinfectado con alcohol, triturar 20 g de suelo y agregar poco a poco 180 mL de agua estril. Trasvasar a un frasco estril. Para hacer la diluciones pasar 1 mL al primero de una serie de tubos con 9 mL de agua estril cada uno, mezclar en agitador vrtex y tomar 1 mL para volcarlo en el segundo tubo, y as hasta tener en el tubo sexto una dilucin 1/107. Usar una pipeta estril para cada pasaje. Tomar 0,1 mL del ltimo tubo y extender, con una varilla de vidrio en L (25) flameada, sobre la placa de agar estndar, hacer lo mismo con los tubos penltimo y ante-penltimo. Incubar las placas con la tapa hacia abajo, en la estufa a 30C durante 2 a 3 das. Contar las colonias desarrolladas con ayuda de una lupa, comnmente slo se consideran las placas con 30 a 300 colonias. Calcular el nmero de colonias por mL de dilucin y multiplicar por la inversa de sta para referir el resultado a 1 g de suelo. Sacar el promedio de los valores obtenidos para hallar el nmero de unidades formadoras de colonias (ufc) de bacterias heterotrficas por gramo de suelo. Para el recuento de hongos y actinomicetos usar el agar malta-RB que contiene extracto de malta 20 g, fosfato dipotsico 0,5 g, rosa de Bengala 67 mg, agar 20 g, agua 1 L (sensible a la luz). Sembrar las diluciones 10-5, 10-4 y 10-3, e incubar a 25-30C durante 5 a 14 das dentro de bolsas plsticas. Los actinomicetos aparecen como pequeas colonias rosadas a los 10-14 das. Las muestras de suelo deben estar libres de restos vegetales y piedras, y se mantienen en el refrigerador o congelador dentro de bolsas plsticas el menor tiempo posible. Como agente dispersante, se suele agregar al agua de dilucin ya estril, pirofosfato de sodio en cantidad necesaria para alcanzar una concentracin de 0,18% (86). El clculo del nmero de microorganismos vara de acuerdo al mtodo con el cual se determina. El recuento en placa da valores menores porque muchos son incapaces de crecer en los medios comunes, pero las estimaciones hechas por las tcnicas de recuento microscpico son superiores debido a que suelen contarse los organismos muertos (55). La biomasa microbiana se puede determinar sea por el contenido de lpidos bacterianos o ergosterol fngico, el uso de parmetros fisiolgicos tales como respiracin o cantidad de ATP, o bien por el mtodo de fumigacin. ste consiste en matar a los organismos con cloroformo, remover el fumigante, sembrar clulas vivas que descomponen la materia orgnica y valorar el CO2 y el NH4+ producidos con referencia a un testigo sin tratar (73, 86).

Recuento de microorganismos viables

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

62

Marcar con un lpiz graso, un crculo de 1 cm2 sobre un portaobjetos. Depositar 0,01 mL con un asa calibrada de la dilucin de suelo y extenderlo dentro de la superficie marcada. Secar al aire y fijar con metanol durante 3 minutos. Colorear unos 30 segundos con solucin de azul de metileno alcalina. Lavar, secar y colocar una gota de aceite y un cubreobjetos, y sobre ste otra gota de aceite para observar por inmersin. Contar las clulas de varias decenas de campos (de 0,02 mm2 para la mayora de los objetivos de inmersin). Dividir el nmero de microbios por el nmero de campos observados. Calcular el nmero de clulas correspondiente a un cm2 o sea contenidas en el volumen depositado. Obtener el nmero/mL de dilucin y multiplicar por la inversa de sta para hallar el nmero total de microorganismos/g. Un asa de 4 mm de dimetro interno hecha con alambre Ni-Cr de 0,457 mm de dimetro, carga aproximadamente 10 L (25).

Recuento microscpico directo

3.2. Rizsfera
Las interacciones entre los vegetales y los microorganismos del suelo se manifiesta de modo especial en zona que est en contacto con las races (rizsfera). Las poblaciones microbianas son modificadas por la estimulacin, o la inhibicin, debida a los exudados radicales y restos tisulares. En las diferentes partes de un mismo sistema radical, no slo vara la intensidad del efecto rizosfrico sino tambin la colonizacin de la superficie de las races (rizoplano) (4). Cada especie o variedad de planta induce un efecto rizosfrico caracterstico que desaparece progresivamente cuando las races envejecen, dando lugar a la proliferacin de los microorganismos que intervienen en la descomposicin de los tejidos vegetales muertos (3). Las races de una planta de cebada exudan, en sus primeros diez das, de 0,4 a 0,5 mg de materia orgnica constituda principalmente por aminocidos y otras sustancias de bajo peso molecular fcilmente aceptadas por los microorganismos (87). Cuadro 3.2. Efecto rizosfrico del trigo sobre varios grupos de microbios (4) Grupo Bacterias heterotrficas Hongos Protozoos Algas y cianobacterias Bacterias nitrificantes Bacterias esporuladas Bact. celulolticas aerbicas Bact. celulolticas anaerbicas Otras bacterias anaerbicas Bacterias amonificantes Bacterias desnitrificantes Suelo ufc/g 52.700.000 120.000 990.000 26.900.000 100.000 575.000 2.700 120.000 33.000 1.800.000 140.000 Rizsfera ufc/g 1.121.000.000 1.160.000 2.400 4.500 100.000 927.000 720.000 409.000 389.000 >100.000.000 12.650.000 Rizsfera/suelo 21,3 9,7 2,4 0,17 1,0 1,6 267 3,4 11,8 > 50 90,4

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

63

Los exudados radicales suelen estimular el crecimiento de bacterias y actinomicetos que sintetizan sustancias antimicrobianas, enzimas o siderforos, y son antagonistas de bacterias y hongos patgenos. Los microbios rizosfricos y simbiticos estn en estrecha interrelacin pues si se favorece la colonizacin de unos, se influye en la efectividad de otros, como en el caso de Streptomyces lydicus que causa cambios positivos en los ndulos de las plantas de arvejas (88), o de algunos hongos micorrizantes que pueden alterar la composicin de las poblaciones bacterianas por cambios fisiolgicos de la planta hospedador o modificaciones en la composicin de los exudados radicales (82). Los factores ecolgicos fsicos (humedad, temperatura, luz) actan directamente sobre las poblaciones rizosfricas o indirectamente por intermedio de la planta modificando la calidad y cantidad de los exudados radicales. La elevacin de la humedad del suelo por sobre un cierto nivel puede modificar considerablemente el equilibrio microbiano. La atmsfera de la rizsfera se caracteriza por una concentracin alta de CO2 proveniente tanto de la planta (2/3) como de los microorganismos (1/3) (3). Cuadro 3.3. Variacin de la poblacin microbiana a diferentes niveles de humedad (4) Humedad del suelo % 6,5 10,0 16,1 17,4 21,4 % capacidad de campo 30 50 65 70 100 Bacterias /g 9.980.000 11.890.000 16.410.000 29.960.000 25.280.000 Humedad % 8,9 11,2 18,5 24,2 27,2 Hongos /g 99.000 89.000 142.000 149.000 173.000

Cuadro 3.4. Influencia del anegamiento sobre los diferentes grupos bacterianos en la rizsfera de maz cultivado en un suelo salino (4) Grupos microbianos Sulfatorreductores Fijadores N2 Amonificantes Suelo a la capacidad de campo Rizsfera Suelo Rizsfera ufc/g ufc/g /suelo 44.000 17.000 2,6 800 800 1 4.200.000 15.000 280 Suelo anegado Rizsfera Suelo Rizsfera ufc/g ufc/g /suelo 550.000 11.000 50 6.000 1.000 6 22.000.000 4.500.000 5

Cuadro 3.5. Influencia de la temperatura sobre la densidad microbiana en la rizsfera y el rizoplano de trigo y soja (4) Suelo no Trigo ufc106/g rizosfrico Rizoplano Rizsfera 13-16 78 308 1.165 21-24 120 150 710 30-32 167 147 266 R: rizsfera; S: suelo no rizosfrico C R/S 14,9 5,9 1,6 Soja ufc106/g Rizoplano Rizsfera 28 186 62 230 138 3.570 R/S 2,4 1,9 21,4

La temperatura acta directamente sobre los microorganismos del suelo no rizosfrico como se observa en el cuadro anterior, pero tambin indirectamente

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

64

controlando los exudados radicales correspondientes a las temperaturas ptimas de crecimiento de las plantas consideradas, 30-32C para soja y 13-16C para trigo.

3.3. Microorganismos promotores del crecimiento vegetal

Se denomina MPCV a la poblacin microbiana que vive en la rizosfera y como endfita intra o extracelular del tejido vegetal sano, con capacidad para suprimir a los fitopatgenos y/o estimular el crecimiento vegetal (81). Los microorganismos endotrficos residen dentro de las clulas, en el espacio intercelular o en el sistema vascular de la planta y provienen de la semilla o el ambiente circundante. Son detectados por cultivos despus de la esterilizacin superficial de las races. En algunos casos pareciera que las plantas escogen a los endfitos, por ejemplo en la rizsfera de maz predominan las -proteobacterias (Enterobacter spp.) seguidas por -proteobacterias (Burkholderia spp.) (83). Las bacterias endotrficas tienen algunas ventajas competitivas sobre las rizosfricas debido a que la disponibilidad de nutrientes es mayor en el interior de las plantas y se encuentran mejor protegidas de las condiciones ambientales adversas que las rizosfricas. Por otra parte pueden brindar beneficios directos a su hospedador excretando fitohormonas o sustancias que inhiben el crecimiento de los patgenos. Los microorganismos promotores del crecimiento vegetal son inoculados a los suelos para mejorar la disponibilidad de nitrgeno, o en calidad de agentes de biocontrol que inhiben a los patgenos vegetales como Fusarium oxysporum, Phytophthora spp., Pythium spp., y Rhizoctonia solani entre otros. Entre las bacterias consideradas dentro del grupo MPCV se encuentran especies productoras de antimicrobianos (Bacillus, Pseudomonas, Pantoea) y fitohormonas (Azospirillum), y fijadoras de nitrgeno (Azoarcus, Burkholderia, Gluconacetobacter, Herbaspirillum). Numerosos actinomicetos son colonizadores de las races y endfitos biolgicamente activos, por ejemplo Streptomyces, Microbispora, Micromonospora, y Nocardia (81). En cambio, el papel de los hongos del suelo es complejo, pues por un lado constituyen el grupo principal de los fitopatgenos, pero por el otro participan en el ciclo de los nutrientes, estimulan el crecimiento de las plantas, descomponen los residuos vegetales, producen antibiticos o son antagonistas de patgenos (82). En las semillas se encuentran endfitos en nmero variable, desde 10 ufc/g en maz hasta 103 105 ufc/g en algodn, pero la fuente ms importante de MPCV es la rizsfera desde donde entran por fracturas en las races o degradacin local de la celulosa (83). La colonizacin de las semillas es crtica para controlar a los patgenos, tales como Pythium, que son atrados por quimiotaxis y las infectan a las pocas horas despus de plantadas (89). Los MPCV suelen ser adheridos a las semillas con ayuda de un aglutinante inerte para que colonicen la rizsfera y segn el xito alcanzado en la instalacin de estos organismos ser el resultado observado en la planta. Las bacterias mviles tienen mayor probabilidad que sus competidoras inmviles, aunque estas ltimas pueden ser desplazadas por el agua que drena y el movimiento de las races o de otros organismos del suelo como los nemtodos (90).

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

65

Sin embargo, la supervivencia de los MPCV en la rizsfera es crucial porque la inoculacin de las semillas no es factible en muchos casos, por ejemplo rboles, plantas perennes o las propagadas vegetativamente (91). Trichoderma es un hongo antagnico de algunos fitopatgenos del suelo que suele colonizar la rizsfera y el rizoplano (82). Muchas cepas capaces de mejorar el crecimiento vegetal y la resistencia a las enfermedades en los ensayos en macetas, no son satisfactorias en el campo debido a la dificultad para manejar un ambiente tan complejo como es la rizsfera, donde la introduccin de una mezcla de microbios no adaptados a un suelo y un cultivo determinados puede llegar a reducir la diversidad y los niveles de colonizacin de las poblaciones naturales (81). Algunos materiales compostados empleados como abono del suelo o soporte de las plantas, protegen a stas de los fitopatgenos porque estimulan la proliferacin de los antagonistas en la rizsfera (92). El uso intensivo de fertilizantes minerales cambia sustancialmente la composicin de las poblaciones microbianas de un suelo y los agroqumicos no solo afectan a los patgenos y otros pobladores del suelo sino tambin a los endfitos de las races, directamente o a travs de los cambios originados en la rizosfra (83).
3.3.1. Productores de fitohormonas

En la rizsfera los microorganismos suelen originar sustancias que estimulan el desarrollo de las plantas (auxinas, citoquininas, giberelinas) en concentraciones muy bajas. Adems de numerosos patgenos, varios MPCV producen cido indolactico, como Azospirillum spp., Gluconacetobacter diazotrophicus, Pseudomonas putida (93-95), y citoquininas, por ejemplo Azotobacter vinelandii, Methylobacterium y Rhizobium (96-97). Entre los hongos formadores de citoquininas se hallan Agaricus, Boletus, Coprinus, Rhizopus y Suillus, y de auxinas, especies de Aspergillus, Boletus, Penicillium y Rhizopus (71). Diferentes especies de hongos que estn asociados la rizsfera y el rizoplano de plantas hortcolas, sintetizan giberelinas, entre ellos Aspergillus flavus, A. niger, Penicillium aurantiogriseum, P. corylophilum, P. funiculosum y Rhizopus stolonifer, adems de patgenos como Fusarium oxysporum y Gibberella fujikuroi (98). Tambin unos pocos actinomicetos (Streptomyces) y bacterias (Azospirillum brasiliense, A. lipoferum) producen estas fitohormonas (99 ).
3.3.2. Productores de antimicrobianos

Numerosos organismos rizosfricos producen y excretan antibiticos y surfactantes que pueden ser absorbidos por las races o modificar el equilibrio entre las poblaciones microbianas, pero tal actividad est limitada a unos pocos microambientes favorables (100). Pseudomonas fluorescens forma los antibiticos aerugina, pirrolnitrina, pioluteorina y 2,4- diacetilfluorglucinol (101). Tambin los lipopeptidos cclicos (viscosinamida, tensina, anfisina) con propiedades antifngicas y biosurfactantes, estables en suelo estril pero degradables por los microorganismos nativos de la rizsfera (102). Otras especies de Pseudomonas producen fenazinas, ramnolpidos, azomicina, oomicina A, cepaciamida A, cepafungina y 2,3-deepoxi-2,3-didehidrorizoxina (101, 103). Stenotrophomonas sp., una bacteria de la rizsfera de remolacha azucarera, forma el lipoptido cclico xantobacina A (102). Las concentraciones de los

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

66

antibiticos pirrolnitrina, 2,4-diacetilfluoroglucinol, pioluteorina y cido fenazin-1carblico, observadas en suelo, suelen ser de 1; 0,94-1,36; 30-50 y 29-578 ng/g respectivamente (73). En un suelo donde se suprimi a un determinado fitopatgeno la densidad de Pseudomonas productoras de 2,4-diacetilfluoroglucinol era 5105 - 2106 ufc/g de raz mientras que en otros, en los cuales no se lograba controlaba la enfermedad, no se detectaban o su nmero era 40 veces menor (104). Bacillus subtilis produce varios lipopptidos cclicos, entre ellos surfactina que es estable en el suelo, e iturin A que pronto desaparece debido a la lixiviacin, degradacin microbiana o adsorcin por las partculas del suelo (102). B. polymyxa sintetiza el surfactante polimixina y B. cereus el antibitico zwittermicin A (66, 105). Los biosurfactantes herbicolina A, iturina A y surfactina suelen alcanzar en suelo una concentracin de 2,3-3; 0,4-5 y 1,7-11,4 g/g, respectivamente (73). Pantoea agglomerans genera dos antibiticos, pantocina A y B (= herbicolina A y B), que contribuyen a su accin antagnica frente a la bacteria patgena Erwinia amylovora (106). Los Streptomyces son organismos ampliamente distribudos en el suelo que originan ms del 70% de los antibiticos conocidos, pero menos del 10% inhiben a todas las bacterias rizosfricas y ms del 40% no inhiben prcticamente a ninguna debido a que la probabilidad de la formacin de antibiticos no es la misma en todos los microambientes (107).

3.4. Fijacin del nitrgeno

3.4.1. Bacterias de vida libre
Se consideran diaztrofos de vida libre a los que no poseen necesariamente un socio vegetal simbitico, aunque a veces tambin puedan actuar como endfitos. Cuadro 3.6. Algunos organismos del suelo capaces de fijar N2 (1) Bacterias aerbicas o facultativas Bacterias anaerbicas
* microaerfilo, ** facultativo

Heterotrficas Autotrficas Fototrficas Heterotrficas Autotrficas Fototrficas

Azotobacter, Azomonas, Azospirillum lipoferum*, Bacillus polymyxa**, Beijerinckia, Citrobacter freundii**, Klebsiella**, Mycobacterium flavum Alcaligenes, Streptomyces thermoautotrophicus Anabaena, Nostoc Clostridium spp. Methanobacterium Chromatium, Chlorobium, Heliobacterium

La reduccin del N2 es un proceso inhibido por el oxgeno y las clulas de las bacterias aerbicas presentan diversos mecanismos de proteccin que incluyen, entre otros, la produccin de una capa mucosa que retarda la difusin del O2 por ejemplo Azotobacter vinelandii, o la formacin de clulas especiales (heterocistos) como ocurre en las cianobacterias. Los Clostridium diazotrficos proliferan en los microambientes anxicos de los agregados del suelo o en consorcios donde los organismos facultativos consumen

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

67

rpidamente el oxgeno por la respiracin. La mayora de los fijadores son mesoflicos pero Streptomyces thermoautotrophicus es activo hasta 75C (1). Inocular una placa de medio LG, con algunos grnulos de suelo o bien una suspensin del mismo, e incubar a 30C durante 3-7 das.. Las colonias blancas y hmedas de Azotobacter chroococcum aparecen a las 24 hs, pero despus se tornan pardas, las de A. vinelandii y Azomonas spp. no se obscurecen. Las colonias de A. paspali con el centro amarillo por la acidificacin, se observan a las 48 hs. Las colonias pequeas y blancas de Derxia gummosa se ven rizadas, grandes y pardas despus a una semana. Despus sembrar una colonia por agotamiento en estras sobre el mismo medio, e incubar a 30C. El medio LG contiene: sacarosa 20 g, fosfato dipotsico 50 mg, fosfato monopotsico 150 mg, cloruro de calcio 10 mg, sulfato de magnesio 200 mg, molibdato de sodio 2 mg, cloruro frrico 10 mg, azul de bromotimol 10 mg, carbonato de calcio 1 g, agar 15 g, agua 1L, pH 6,8. El medio LG modificado para Derxia contiene glucosa o almidn en vez de sacarosa (86).

Aislamiento de bacterias diazotrficas del suelo

3.4.2. Bacterias endotrficas

El interior de las plantas es un ambiente propicio para la fijacin de nitrgeno por las bacterias endotrficas, debido a la baja concentracin de oxgeno y la presencia de glcidos fcilmente aprovechables. Entre los organismos diazotrficos endfitos se encuentran especies de Azoarcus, Azospirillum, Burkholderia, Enterobacter, Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Klebsiella y Pseudomonas (108). Lavar la raz para quitar el suelo adherido, cortar trozos y ponerlos durante 30 segundos en etanol 95% y luego sumergir en lavandina concentrada diluida al 1/10 durante 3 a 6 minutos. Lavar tres o cuatro veces, agitando enrgicamente, en sendos tubos de agua estril. Transferir los trozos con una pinza cuyas puntas fueron previamente mojadas en alcohol y flameadas. Moler 10 g en un mortero con arena estril, suspender con 90 mL de agua estril, dejar decantar y hacer diluciones desde 10-2 a 10-6. Inocular en tubos con el medio semislido NFb. Incubar a 30C. Herbaspirillum spp. y Azospirillum spp. forman una pelcula superficial. Sembrar por agotamiento en estra sobre agar papa mlico e incubar a 30C. El medio semislido NFb contiene: cido mlico 5 g, fosfato dipotsico 1,5 g, sulfato de magnesio 200 mg, cloruro de calcio 20 mg, solucin de micronutrientes 2 mL, extracto de levadura 20 mg, cloruro frrico 10 mg, azul de bromotimol 10 mg, agar 2 g, agua 1 L, pH 6,8. La solucin de micronutrientes contiene sulfato cprico 40 mg, sulfato de zinc 12 mg, cido brico 140 mg, molibdato de sodio 100 mg, sulfato de manganeso 150 mg, agua 100 mL. El agar papa mlico contiene caldo de papas 200 mL, cido mlico 2,5 g, sacarosa 2,5 g, agar 15 g, agua 800 mL, pH 6,8. El caldo de papas contiene papas cortadas en cubos 200 g, agua 1 L; hervir durante 30 minutos y filtrar por algodn (86). La colonizacin de las races por Azospirillum (A. lipoferum, A. brasiliense y otros) no es especfica y las bacterias migran entre diferentes especies de plantas. Se encuentran en el espacio intercelular del crtex radical dando lugar a una interrelacin donde se benefician los dos participantes de la asociacin Este gnero se encuentra naturalmente en regiones tropicales y templadas, pero cuando se lo inocula en un suelo sobrevive con dificultad (91). Gluconoacetobacter diazotrophicus fija nitrgeno en presencia de nitrato y excreta el 50% del amonio hacia su hospedador (caa de azcar, cafeto). Coloniza el rizoplano

Aislamiento de bacterias endotrficas

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

68

y penetra a travs de los sitios desde donde emergen las races laterales, llegando a los vasos del xilema (108). Las especies de Azoarcus infectan las races de gramneas fijando nitrgeno dentro de la planta. Herbaspirillum seropedicae coloniza la zona subepidrmica de las races de arroz, caa de azcar, maz, sorgo y otras gramneas (109). Burkholderia vietnamiensis es una especie diazotrfica de amplia distribucin geogrfica, asociada a maz y arroz (110). Pseudomonas putida es un diaztrofo que coloniza las races de colza a bajas temperaturas (103). Tambin se suelen observar consorcios endotrficos de bacterias anaerbicas diazotrficas (Clostridium pasteurianum, C. acetobutylicum, C. saccharolyticum) con especies no diazotrficas (Enterobacter y otras) (111). Otros ejemplos de asociacin endoftica se observan en las cavidades de las hojas del helecho de agua Azolla que contienen a la cianobacteria Anabaena azollae, en las races areas de Cycas y Gunnera donde se halla Nostoc, y en el lquen Peltigera constitudo por Nostoc y un hongo (36).

3.4.3. Bacterias simbiticas

Son las que se asocian a la planta en un verdadero rgano de fijacin del nitrgeno: el ndulo. A este grupo pertenecen los distintos gneros de rizobios y otras pocas bacterias (Burkholderia tuberum, Methylobacterium nodulans, Ralstonia taiwanensis) que nodulan con leguminosas, y un actinomiceto (Frankia) que forma actinorrizas en plantas de otras familias (112, 113).

3.4.3.1. Rizobios
Una particularidad de las plantas leguminosas es su capacidad para asociarse con bacterias fijadoras de nitrgeno del gnero Rhizobium y otros relacionados. Esta simbiosis se manifiesta por el desarrollo del ndulo en cuyo interior se multiplican las bacterias y transforman el nitrgeno del aire en amonio. La asimilacin de ese amonio por parte de las plantas les permite crecer en suelos pobres en nitrgeno (36). En la primera etapa, la planta excreta un exudado radicular con flavonoides que atraen a los rizobios por quimiotactismo y activan en las bacterias la expresin de ciertos genes que determinan la produccin de molculas fundamentales para el reconocimiento y la infeccin de la planta. Las bacterias se adhieren mediante protenas especficas, a los pelos absorbentes de la raz e inducen la curvatura del extremo de los mismos mediante la liberacin de Figura 3.4. Formacin de un ndulo lipooligosacridos conocidos como indeterminado (4) factores de nodulacin (Nod) (116).

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

69

Cuando los pelos radicales jvenes se han doblado lo suficiente como para atrapar al rizobio en un bolsillo de pared celular del hospedador, sta es hidrolizada y la bacteria penetra por invaginacin de la membrana citoplasmtica. La planta reacciona depositando una nueva pared celular alrededor de la lesin, y genera un tubo de infeccin que crece hacia adentro por donde los rizobios avanzan hacia la base del pelo, internndose en la raz hasta arribar al citoplasma de las clulas meristemticas (114). Simultneamente con la formacin del tubo, las clulas de la corteza interna de la raz se dividen y forman el primordium nodular. La multiplicacin intensa de estas clulas provoca la aparicin del ndulo, que es un verdadero rgano especializado en el intercambio metablico entre ambos asociados. Las simbiosis entre rizobios y leguminosas son muy especficas, por ejemplo R. leguminosarum bv. phaseoli induce la nodulacin en el poroto pero no en la alfalfa (117). Cuadro 3.7. Plantas hospedadors de varios gneros de rizobios (108, 114, 115) Rizobios Allorhizobium undicola Azorhizobium caulinodans Bradyrhizobium elkanii B. japonicum B. yuanmingense Mesorhizobium chacoense M. ciceri M. huakuii M. loti Rhizobium etli R. galegae R. leguminosarum bv. viciae bv. phaseoli bv. trifolii R. tropici Sinorhizobium sp. S. fredii S. meliloti Bradyrhizobium sp. Plantas hospedadors Medicago sativa, Acacia spp., Lotus arabicus, Neptunia natans Sesbania spp. (ndulos del tallo) Glycine max, G. soja, y otras legumbres Glycine max, G. soja, y otras legumbres Lespedeza cuneata Prosopis alba Cicer arietinum Astragalus sinicus Lotus spp. Phaseolus vulgaris Galega officinalis, G. orientalis Pisum, Vicia, Lathyrus, Lens spp. Phaseolus vulgaris Trifolium spp. Phaseolus vulgaris, Leucaena spp., Macroptilium spp. Acacia, Prosopis Glycine max, G. soja, y otras legumbres Medicago, Melilotus, Trigonella spp. Parasponia spp. (no legumbre)

Las bacterias no se mezclan con los orgnulos citoplasmticos, sino que se mantienen confinadas en los simbiosomas que son vesculas protegidas por membranas. Los simbiosomas del lupino tienen una sola bacteria, los de la soja varias. La membrana del simbiosoma acta a modo de barrera que controla el flujo de cidos carboxlicos (malato, succinato, fumarato) que constituyen la fuente de carbono para los bacteroides. Tales cidos proceden de la oxidacin de azcares sintetizados en las hojas por la fotosntesis. Durante el proceso de formacin de los simbiosomas, las bacterias se van transformando en bacteroides, grandes e irregulares, que generan diversas

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

70

protenas especficas como la enzima nitrogenasa y algunos citocromos. Las clulas intersticiales sin infectar intervienen en las ltimas etapas de la sntesis de ureidos, asparagina o glutamina, por incorporacin del amonio recibido desde el bacteroide, y stos se exportan hacia la parte area a travs de los vasos del xilema (114). Para que los ndulos de las leguminosas fijen nitrgeno es imprescindible que contengan leghemoglobina cuyo grupo hemo es sintetizado por el vegetal (119). La fijacin de nitrgeno requiere gran cantidad de energa que se produce en los bacteroides durante la oxidacin de los cidos dicarboxlicos y la leghemoglobina transporta el O2 a una concentracin baja pero estable, que permite mantener una elevada actividad respiratoria sin afectar la nitrogenasa, pues esta enzima se inactiva en presencia de oxgeno. Los bacteroides tienen forma irregular, son ms grandes que los bacilos originales y acumulan poli--hidroxibutirato (1). Reconocer los ndulos en la raz de una leguminosa, medirlos y dibujar su forma. Cortarlo y observar el color. Aplastarlo entre dos portaobjetos. Extender el material interno mezclado con una gota de agua, secar y fijar por calor. Colorear con fucsina fenicada durante 30 segundos, lavar con agua y secar. Depositar una gota de aceite de inmersin, apoyar un cubreobjetos y sobre ste poner otra gota de ese aceite. Observar al microscopio los bacteroides coloreados de rojo (18). En general hay dos tipos de ndulos, uno indeterminado y alargado (arveja, alfalfa) y otro determinado y globoso (soja, poroto). Los ndulos indeterminados se alargan debido a la presencia de un meristema persistente localizado en el pice. Una seccin longitudinal del mismo muestra zonas con clulas infectadas en distintos estadios y una diferenciacin progresiva de los simbiosomas. En cambio los ndulos determinados son globosos, originados en un meristema esfrico que no se aprecia en la madurez, y las clulas infectadas y los simbiosomas se encuentran en una etapa de diferenciacin similar (120). Lavar la raz para quitar el suelo adherido. Elegir los nodulos de mayor tamao, separarlos y colocarlos en un tubo o frasquito. Lavarlos nuevamente, agitando con fuerza para eliminar la mayor parte de los residuos. Poner los nodulos durante 30 segundos en etanol 95% y luego sumergir en lavandina concentrada diluida al 1/10 durante 3 a 6 minutos. Lavar tres o cuatro veces, agitando enrgicamente, en sendos tubos de agua estril. Transferir los nodulos con una pinza cuyas puntas fueron previamente mojadas en alcohol y flameadas. Tomar un ndulo y aplastarlo entre dos portaobjetos previamente flameados. Tomar con el asa parte del contenido y hacer una serie de estras sobre la placa de agar papa levadura. Incubar 4 o 5 das a 28-30C. Elegir una colonia y repicar en tubos con el mismo medio. Las colonias de R. meliloti son convexas, circulares, blancas, de 2-5 mm diam., las de R. trifolii con frecuencia son gomosas. El agar papa levadura contiene: caldo de papas 200 mL, glucosa 10 g, agar 20 g, extracto de levaduras 2,5 g, agua 1 L; pH 7,0. Caldo de papas: cortar en cubos 200 g de papas, agregar 200 mL de agua, calentar en autoclave a 110C durante 15 minutos, filtrar por gasa y algodn (118). Hay dos grupos de genes esenciales para la nodulacin. Uno, incluye los implicados en la formacin de la pared celular bacteriana que determinan la sntesis de exo y lipopolisacridos. El otro, comprende a los genes de nodulacin (nod), que

Examen de ndulos

Aislamiento de rizobios

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

71

en muchas especies de rizobios residen en un plsmido (Sym) junto a los genes de fijacin (nif). En general los genes de nodulacin no estn expresados, pero son inducidos por la presencia del hospedador. La principal funcin de los genes nod es la sntesis de protenas de reconocimiento de los flavonoides especficos excretados por la planta asegurando el intercambio de seales entre ambos simbiontes. En algunas plantas, por ejemplo man, la presencia del rizobio induce la emergencia de una raz lateral que al crecer causa la separacin de las clulas corticales y epidrmicas, permitiendo la entrada del microsimbionte y su diseminacin intercelular. La continua divisin de las clulas del hospedador lleva al desarrollo de un tejido central infectado uniformemente, a semejanza de un ndulo determinado (114). La presencia en el suelo de especies de rizobios promiscuas suelen generar ndulos inefectivos en plantas no especficas. No todas la cepas efectivas en un hospedador particular son capaces de fijar nitrgeno, debido a las diferencias varietales y a la interaccin con los suelos y sistemas de produccin., por ejemplo la ausencia de ndulos puede indicar un bajo pH o una deficiencia de fsforo en el suelo (121). La inoculacin con rizobios resulta imprescindible cuando se introducen nuevas leguminosas, sobre todo si son hospedadores de alta especificidad o cuando la deficiencia en nitrgeno limita el desarrollo vegetal. El mtodo y las condiciones de inoculacin deben permitir la supervivencia de los rizobios, y favorecer la colonizacin de la rizsfera por la bacteria, para lograr la formacin de los ndulos y su funcionamiento efectivo. La inoculacin puede resultar intil si las leguminosas nodulan eficientemente con las cepas nativas. Pero en muchos suelos el nivel y la eficiencia de stas suelen no ser adecuados, y la nodulacin y la fijacin de nitrgeno consecuente resultan insuficientes para satisfacer las demandas del cultivo. La cepa seleccionada debe ser genticamente estable, tener una alta competencia frente a las cepas menos eficientes propias del suelo, crecer en los medios corrientemente utilizados en la industria y sobrevivir en el soporte a las condiciones de comercializacin. La eficencia de la fijacin se evala por el nmero de ndulos, la masa nodular, el peso seco de la planta y el contenido de nitrgeno de la parte area. Son bacterias efectivas las que aportan suficiente amonio al hospedador para promover un aumento de peso del mismo. Para determinar la necesidad de inoculacin se suele emplear un ensayo simple de tres tratamientos: 1. inoculacin con una cepa de rizobio conocida para saber si es efectiva en el hospedador, 2. fertilizacin para asegurar un buen desarrollo del hospedador si no hay inhibidores en el suelo, 3. control no inoculado para observar la presencia o ausencia de rizobios nativos y su efectividad. Un inoculante para enriquecer el suelo con la bacteria simbitica deseada, contiene altas concentraciones celulares en un sustrato que favorece largos perodos de supervivencia sin prdidas de las caractersticas fisiolgicas del microorganismo. Los pasos a seguir en su elaboracin comprenden:

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

72

a) b) c) d) e)

seleccionar las cepas convenientes por su mayor eficiencia; cultivar del microorganismo en un medio lquido; elegir, preparar y esterilizar el material de soporte; impregnar del soporte con el cultivo que posee un alto nmero de clulas, controlar del nmero de bacterias vivas en el producto terminado .

Colocar semillas de alfalfa de buen poder germinativo, en un matraz de Erlemeyer con etanol al 70% v/v y agitar durante 3 a 5 minutos. Volcar y aadir agua lavandina al 10% v/v, agitando por igual tiempo. Lavar con agua destilada estril. Depositarlas en cajas estriles sobre papel humedecido con agua y dejar germinar durante 4-5 das. Colocar unos 6 cm de arena amarilla en 4 tubos de 3 x 20 cm, con tapn de algodn, y humedecer ligeramente. Agregar 0,4 mL de solucin mineral y 0,12 mL de solucin de fosfatos a cada uno, y en el tubo [4] aadir 0,1 g de nitrato de amonio. Suspender el cultivo en tubo de rizobio aislado con 2 mL de una solucin estril de sacarosa al 0,1%. Hacer lo mismo con un cultivo puro de R. meliloti o R. trifolii. Esterilizar con alcohol una varilla de vidrio y hacer pocitos de unos 2 cm de hondo en cada tubo. Con una pinza esterilizada con alcohol, transferir las plntulas a los tubos. Inocular el tubo [1] con 1 2 gotas de la suspensin de la cepa aislada y el [2] con la del cultivo conocido. Aadir 1 2 gotas de la solucin de sacarosa al tubo [4]. Con la varilla estril cubrir las radculas con arena. Dejar las gradillas a la luz durante 5 semanas, controlando la humedad del substrato. Retirar las plantas y lavar las races con cuidado. Observar la ubicacin, tamao y forma de los ndulos. La planta del tubo 4 crecer normalmente, las de los tubos 1 y 2 debern presentar ndulos y la del 3 morir por falta de nitrgeno. La solucin mineral contiene sulfato de potasio 4 g, sulfato de zinc 0,3 g, sulfato de cobre 0,15 g, molibdato de sodio 0,5 mg, agua destilada 100 mL. La solucin de fosfatos contiene fosfato dicido de calcio 8 g, cido fosfrico 25 mL, fosafato dicido de sodio 10 g, agua destilada 100 mL, neutralizada a pH 6,0. La arena amarilla aportar hierro y otros micronutrientes (118) . El empleo de turba estril como soporte, el almacenamiento refrigerado del producto y el control de calidad, permiten mantener altos niveles de rizobios vivos en la distribucin del inoculante. Esto se traduce en un incremento de rizobios por semilla. Se suele exigir 2*109 bacterias/g de inoculante a la salida de la fbrica, para as asegurar que el momento de aplicacin permanezcan vivos en nmero suficiente, tambin las condiciones de transporte, almacenamiento y uso determinan el xito de la inoculacin (121).

Ensayo de inoculacin

3.4.3.2. Actinomicetos
Varias dicotiledneas, que no pertenecen a las leguminosas, poseen ndulos en las races capaces de fijar N2 asociadas con actinomicetos del gnero Frankia. Los ndulos, conocidos como actinorrizas, son races laterales modificadas y contienen una hemoglobina que facilita la provisin de oxgeno al endfito (119). Algunos rboles, como alisos y casuarinas, forman los ndulos les proporcionan entre 70 y 90% del nitrgeno total necesario. Crecen en suelos empobrecido por lo que son tiles para reforestacin y en plantaciones mixtas con especies arbreas valiosas. La eficacia de la simbiosis entre Frankia y las plantas leosas est principalmente determinada por los factores ambientales como el pH, el potencial

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

73

matricial del suelo y la disponibilidad de nitrgeno o fsforo. La inoculacin de plantines con cepas de Frankia mejora, mediante la simbiosis, el crecimiento de planta y disponibilidad de nitrgeno. De esta Figura 3-5. manera pueden establecerse el actinomiceto Ndulos de Frankia en los ndulos de la raz bajo condiciones que (36) no favorecen la nodulacin por la poblacin indgena y como los ndulos son perennes, el efecto positivo puede continuar durante varios aos. Sin embargo, la capa introducida debe competir para la formacin de los ndulos, permanecer activa en los mismos y sobrevivir en la rizsfera. La poblacin del actinomiceto puede mantenerse activa en el suelo por la presencia de vegetacin que favorece su crecimiento saproftico pues coloniza la superficie radical obteniendo nutrientes de los exudados y sigue siendo infectiva an en suelos desprovistos del hospedador especfico. Tambin puede obtener recursos de la descomposicin de la materia orgnica fijadoras muerta (122).

3.5. Micorrizas
Las plantas parecen totalmente autnomas pero la mayora tienen en sus races hongos asociados formando micorrizas, cuya funcin ms importante es absorber los elementos minerales menos mviles del suelo y transferirlos a la planta hospedadora mientras sta proporciona compuestos carbonados al hongo. Hay dos tipos bsicos de asociacin: las ectomicorrizas y las endomicorrizas.

3.5.1. Endomicorrizas
Cuando el hongo penetra en el interior de las clulas de la raz formando minsculas arborescencia y a veces vesculas que almacenan lpidos, se las llama endomicorrizas arbusculares y generalmente estn presentes en la vegetacin herbcea (123). Los simbiontes ms comunes son micromicetos de los gneros Acaulospora, Gigaspora, Glomus y otros zigomicetos, cuyo micelio forma una extensa red en el suelo alrededor de las races micorrizadas (124). Las races se infectan con las hifas

Figura 3-6. Endomicorriza arbuscular (129)

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

74

desarrolladas a partir de los propgulos presentes en el suelo, que pueden ser esporas o clamidosporas, cuya colonizacin es favorecida por algunas bacterias rizosfricas (125). Los hongos micorrcicos pueden estimular el crecimiento de los vegetales, y algunos ayudan a regular el microambiente alrededor de las races y prevenir la infeccin de las plantas, aunque a veces resultan antagonistas de agentes de biocontrol como Trichoderma harzianum (126). El hongo suministra nutrientes minerales al hospedador, especialmente fsforo. Las hifas extrarradicales captan el fosfato del suelo a travs de un transportador y all es condensado en polifosfato, el que luego es trasladado por la corriente citoplsmica a las hifas intrarradicales (127). Las bacterias diazotrficas proveen a las legumbres una fuente adicional de nitrgeno, pero requieren gran cantidad de energa y fsforo. Por tal motivo estas plantas se asocian con hongos endomicorrcicos que son eficientes proveedores de fosfatos (128). Lavar la raz con agua corriente.. Cortar en porciones de un centmetro de largo y colocarlos en solucin de hidrxido de sodio o potasio al 10% p/v. Calentar a 90C durante 30 minutos o ms si es necesario. Cuando el material es obscuro sumergirlo en agua oxigenada de 10 volmenes durante 15 minutos, sino omitir este paso. Lavar 4 veces con agua corriente. Poner los trozos en solucin de cido clorhdrico 0,1 N durante 10 minutos. Colorear con azullactofenol a 90C por 5 minutos. Pasar a lactofenol. Colocar un trozo de la raz tratada entre dos portaobjetos y aplastarla. Observar al microscopio entre porta y cubreobjetos El lactofenol contiene: cido lctico 100 ml, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 ml. La solucin colorante se prepara mezclando 5 mL de solucin acuosa de azul de algodn o azul tripn o azul de anilina al 1% p/v, con 95 mL de lactofenol (124). Hay otros tipos de endomicorrizas como las que forman ovillos intracelulares en las orqudeas, donde cada una de las diferentes especies del vegetal tiene una alta especificidad por un simbionte particular, generalmente un basidiomiceto. El grado de interdependencia entre los asociados es tal, que en muchos casos la planta no pueden ser cultivada sin el hongo (27). Mezclar 50 g de suelo con 1 L de agua, agitar intensamente, dejar decantar 30 segundos y pasar sucesivamente por una serie de tamices cuya malla tiene aberturas de 700, 250 y 100 m. En este ltimo quedarn retenidas la mayora de las clamidosporas. Se resuspenden en poca cantidad de agua y se colocan en una maceta con a unos 2-3 cm por debajo de las semillas, por ejemplo de Allium cepa. El sustrato es una mezcla de suelo y arena (2+1) de pH ligeramente cido. Luego de 12-15 semanas se extraen las races colonizadas (131).

Observacin de micorrizas

Obtencin de hongos endtrofos

3.5.2. Ectomicorrizas
Los suelos de los bosques muestran una heterogeneidad espacial y temporal en la disponibilidad de nutrientes, particularmente de nitrgeno. Para acceder a ellos, los rboles han desarrollado esta estrategia simbitica donde el micelio micorrcico se ensancha de

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

75

tal manera que los hongos pueden explorar un volumen de suelo ms grande que el accesible a la raz La ectomicorriza es por consiguiente ventajosa para la nutricin y el crecimiento de la planta (130). Las especies fngicas implicadas son macromicetos que solamente estando en simbiosis pueden formar basidiomas, por ejemplo Amanita, Boletus, Lactarius, Pisolithus y Suillus, o ascomas como Tuber. Es poca la especificidad de estas asociaciones (27) . La estructura de la asociacin entre un rbol y un basidiomiceto tiene tres componentes: un manto o vaina que encierra a la raz, una red intrarradical de hifas en los espacios intercelulares y un sistema exterior de filamentos que se extiende por el suelo y forma las conexiones esenciales con los cuerpos frutferos del hongo. La penetracin intercelular y la formacin de una red llamada de Hartig inducen a un profundo cambio en la morfologa y metabolismo de las hifas. La vaina ectomicorrcica permite el almacenamiento de nutrientes y controla el intercambio de los mismos por hidratos de carbono debido el contacto ntimo con la superficie de la raz. Este intercambio responde a los cambios medioambientales, y elevados niveles de CO2 aumentan el potencial de transferencia de la planta, mientras que un alto nivel de N mineral acrecienta el del hongo. El micelio extrarradical que se extiende como hifas aisladas o largos cordones, conecta a la vaina con el suelo permitiendo por ejemplo, la incorporacin de compuestos nitrogenados a considerables distancias del manto o movilizando nutrientes desde el mantillo en un suelo Figura 3.7. Micorrizas en pino (27) forestal (130). Cortar el basidioma con un instrumento previamente mojado en alcohol y encendido. Con un gancho o pinza estril tomar porciones del interior del sombrero y depositarlas sobre la superficie de una placa de agar malta levadura. Incubar a 25-27C, dos o ms semanas en la obscuridad. Repicar en 50 ml de medio lquido de Melin Norkrins modificado en un matraz de Erlenmeyer de 250 mL e incubar a 25-27C con una agitacin de 100 rpm y en la obscuridad, el tiempo requerido para un buen crecimiento. Homogeinizar el cultivo, mezclar con el sustrato pasterizado previamente con vapor de agua a 60C durante 1 hora.. Llenar unas macetas pequeas y colocar los plantines. Llevarlos al invernculo. El agar malta levadura contiene: extracto de malta 20 g, extracto de levadura 2 g, agar 20 g, agua 1 L. Se esteriliza a 121C durante 15 minutos. El medio lquido de Melin Norkins modificado contiene cloruro de calcio 0,05 g, cloruro de sodio 0,025 g, fosfato monopotsico 0,5 g, fosfato diamnico 0,25 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,15 g, cloruro frrico (al 1% p/v) 1,2 mL, extracto de malta 1,5 g, sacarosa 10 g, agua 1 litro. Esterilizar a 110C durante 20 minutos (131). Algunos hongos micorrzicos estimulan el crecimiento de los vegetales o producen antibiticos, contribuyendo a regular el microambiente alrededor de las races y prevenir la infeccin de las plantas. Pero a pesar de los beneficios que

Inoculacin de ectomicorrizas

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

76

ciertos hongos confieren a determinados hospedadores, pueden llegar a causar un dao considerable en otras plantas (27). En general los hongos ectomicorrcicos deben incorporarse a las plntulas de rboles y plantas ornamentales, cuando se desarrollan en medios artificiales con vermiculita o arena. La falta de micorrizacin acarrea problemas en el transplante, excepto en los casos en que el suelo contenga especies fngicas. Las primeras tcnicas de inoculacin consistan en el transporte de suelo desde la zona de origen de la plantacin al vivero, pero se corra el riesgo de llevar tambin microorganismos patgenos. Para inocular con cultivos puros, el substrato (suelo, turba) debe ser previamente pasterizado o fumigado con el fin de disminuir la poblacin fngica nativa que podra competir con el inculo (27). Los hongos pueden ser incorporados al substrato con pedazos de ascoma o basidioma, trozos de races micorrizadas, o micelio obtenido in vitro. El agregado de micelio es conveniente en el caso de hongos que se desarrollan bien en cultivo. El primer paso de toda inoculacin consiste en la seleccin del hongo, los siguientes obtener el cultivo y multiplicarlo para aadirlo al suelo donde se coloca la plntula crecida en condiciones axnicas. Por ejemplo, la micorrizacin de pinos puede hacerse con especies comestibles de Boletus o Lactarius, pero Pisolithus tinctorius permite implantarlos en suelos muy erosionados, pobres en materia orgnica y nutrientes minerales (27).

3.5. Compostaje
El compostaje es un proceso biodegradativo aerbico de materiales orgnicos residuales en fase slida, autocalentado por la generacin metablica de calor debida a bacterias, hongos, protozoos, nemtodos, lombrices y otros organismos. A nivel microbiano influyen varios factores interrelacionados, tal como la temperatura, la aireacin, el contenido de agua y los nutrientes disponibles. El proceso comienza con la recoleccin del material orgnico que contiene una poblacin grande de hongos y bacterias. La paja es una de las materias primas ms adecuadas para la elaboracin del compuesto, junto con el estircol de cerdo, vaca y gallina. Tambin se suelen agregar residuos procedentes de mataderos, rastrojo, podas o basura urbana. La relacin C/N no debe ser mayor de 30, pues un bajo contenido de nitrgeno no permite la formacin de suficiente biomasa microbiana, pero un exceso de nitrgeno, por ejemplo C/N < 15, causa la volatilizacin de amonaco. Es conveniente que el rango de pH se encuentre entre 6 y 8, para el crecimiento ptimo de bacterias y actinomicetos. Si los residuos son ricos en cidos orgnicos, debe aadirse cal o caliza. El estircol aporta fsforo, potasio y otros elementos (132). Los materiales, cortados convenientemente, se distribuyen en capas superpuestas de 20 cm de grosor, entre las cuales se esparce el suplemento necesario y 1-2 cm de compuesto viejo a modo de inculo. Cada capa se humedece bien. La altura de la pila es de 90-150 cm, el ancho alcanza los 120-200 cm y el largo es variable. En la primera etapa se recubre todo con suelo o material vegetal seco. El autocalentamiento debido a la actividad microbiana, eleva la temperatura interior hasta 55-60C en dos o tres das y luego hay un descenso gradual. El ecosistema del compuesto tiende a autolimitarse debido a una excesiva

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

77

acumulacin de calor e implica una transicin brusca de una microbiota mesfila a una termfila. En general la concentracin de oxgeno dentro de la pila es unas cinco veces menor que en el aire y la ventilacin se realiza por volteos peridicos. La remocin del montn produce un ascenso secundario de la temperatura ocasionada por el reaprovisionamiento de oxgeno. El contenido de agua debe mantenerse entre 50 y 70%, o sea el compuesto debe estar hmedo pero no empapado, porque un exceso interfiere con la aireacin y reduce el autocalentamiento. Si el proceso es continuo, con remociones frecuentes y buena aireacin, el estado termognico se prolonga hasta que la produccin de calor sea menor que la disipacin. A las 8-10 semanas, durante el enfriamiento terminal o fase de maduracin, la cantidad de nutrientes fcilmente disponibles comienza a ser un factor limitante, causando una disminucin de la actividad microbiana y el calor generado (133). Cuadro 3.8. Contenido de nitrgeno de algunos materiales residuales (base seca) (132, 154) Residuos Estircol de gallinas Estircol de ovejas Estircol de cerdos Estircol de caballos Estircol de vacunos Desperdicios de matadero N total % 6,3 3,8 3,8 2,3 1,7 7-10 C/N 29 13 24-25 18-25 2 Residuos Rastrojo soja Rastrojo maz Paja Aserrin Basura domstica Heces humanas N total % 1,30 0,75 0,53 0,1 2,2 5,5-6,5 C/N 32 53 87 511 25 6-10

Diversos microorganismos mesfilos, termotolerantes y termfilos (bacterias, actinomicetos, levaduras, mohos y otros hongos) estn activos durante los diferentes momentos del proceso, en funcin de su capacidad para degradar el sustrato y crecer a elevadas temperaturas. Los microorganismos mesfilos mueren o estn inactivos durante el estado termognico inicial, en el cual aumenta el nmero y la variedad de los termotolerantes y termoflicos. La temperatura ptima de los hongos termoflicos est entre 40 y 55C, con un mximo a 60-62C, y por encima de estos valores solo perduran las esporas termotolerantes. Las bacterias termoflicas estn activas a 5060C, pero a temperaturas mayores se reduce sensiblemente la diversidad (133). Entre las bacterias termoflicas se encuentran Geobacillus stearothermophilus, Thermomonospora spp., Thermoactinomyces spp. y Clostridium thermocellum. Los hongos frecuentes en los compost son Mucor pusillus, Aspergillus fumigatus, Chaetomium thermophile y Thermoascus aurantiacus (19). En general durante una descomposicin rpida y eficiente, la temperatura en la pila de compostaje no excede los 55-60C, pero ocasionalmente suele alcanzar a 65 y 80C con una gran variedad y alto nmero (entre 107 y 1011 clulas/g peso seco) de bacterias aerbicas capaces de crecer entre 60 y 82C (132). El compuesto acabado suministra algunos nutrientes vegetales y antimicrobianos, y puede contribuir en el acondicionamiento del suelo y la eliminacin de patgenos de las races (92). Se aplica para la regeneracin de terrenos y en parques y jardines.

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.

78

3.6. Biorremediacin
La biorremediacin es el uso de los microorganismos para eliminar contaminates y puede reducir el riesgo de impactos adversos en el ambiente causados por compuestos txicos y peligrosos. Se lleva a cabo por dos caminos, la modificacin ambiental como pueden ser la aplicacin de nutrientes y la aireacin, y el bioaumento que es la siembra de los organismos apropiados para la transformacin de los xenobiticos (sustancias no halladas en la naturaleza) (19). La degradacin depende del tipo y la cantidad del contaminante, las condiciones locales y estacionales, y la composicin de la comunidad microbiana autctona. Si sta puede degradar a la sustancia molesta no suele ser necesario aadir cultivos de microorganismos y la biorremediacin se basa en el cambio de las condiciones ambientales para favorecer la actividad microbiana, como por ejemplo suministrar oxgeno mediante el arado del suelo. El mantenimiento de las condiciones aerbicas es importante para la degradacin de los hidrocarburos del petrleo. En otros casos las condiciones anxicas favorecen la alteracin requerida, por ejemplo en la deshalogenacin reductora. Tambin hay procesos que necesitan la alternancia de condiciones aerbicas y anaerbicas como la transformacin de los policloruros de bifenilo. Adems de la regulacin del oxgeno y el control del pH, se precisan nutrientes minerales, en especial nitrgeno y fsforo, para mantener el crecimiento microbiano sobre los contaminantes. Diversas frmulas fertilizantes, principalmente los abonos de difusin lenta, se emplean en distintas aplicaciones de la biorremediacn de suelos y aguas contaminados. La biodisponibilidad es fundamental para la degradacin de ciertos xenobiticos en suelos y sedimentos. Estas sustancias suelen ser absorbidas y quedar secuestradas en las tramas arcillosas y dentro de los agregados hmicos inaccesibles a los microorganismos, o bien escindirse en otros contaminantes que forman una fase hidrfoba separada. A veces el empleo de biosurfactantes y/o agentes solubilizantes corrige el problema. Cuando las poblaciones microbianas autctonas no pueden degradar los contaminantes aun en condiciones ambientales favorables, se suele sembrar microorganismos con una capacidad metablica especfica. Este procedimiento es eficaz por ejemplo para la biorremediacin de compuestos con mltiples sustituciones de cloro(73).. Entre las bacterias usadas por su capacidad para degradar una gran diversidad de compuestos estn Pseudomonas, Burkholderia y Shewanella. El hongo Phanerochaete tiene enzimas para la hidrlisis de la lignina, las que a su vez pueden atacar una amplia gama de compuestos aromticos. Tambin se suele utilizar bacterias genticamente modificadas con un catabolismo especfico, pero la consecuencia de la liberacin de estos organismos al ambiente es incierta. Algunos de los tratamientos se efectan in situ pero otros se llevan a cabo ex situ, por ejemplo bombeando el agua contaminada hacia un reactor con un cultivo de microbios. La biorremediacin se usa tambin para el tratamiento de algunos contaminantes del aire mediante filtros biolgicos que permiten eliminar por ejemplo malos olores cerca de granjas, en estaciones depuradoras de aguas residuales y en procesos industriales. Estos filtros contienen bopelculas de microbios que degradan a los contaminantes voltiles del aire (19).

Carrillo L. 2005. Microbiologa Agrcola.