Introduction la culture de cellules animales

Bulletin Technique

Life Sciences

John A. Ryan, Ph.D. Corning Incorporated Life Sciences

Tower 2, 4th floor 900 Chelmsford St. Lowel, MA 01851, USA

Introduction
La culture cellulaire est devenue un des outils majeurs utiliss aujourd'hui dans les sciences de la vie. Ce guide est conu pour servir d'introduction basique la culture de cellules animales. Il convient parfaitement aux personnels de laboratoire qui utilisent cette technique pour la premire fois, ainsi qu' ceux qui collaborent avec les chercheurs en culture cellulaire et qui dsirent mieux comprendre les concepts cls et la terminologie de ce domaine passionnant et en pleine expansion.

Sommaire
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Que signifie culture de cellules et de tissus? . . . . 1 Comment obtenir des cultures cellulaires? . . . . . 2 quoi ressemblent les cellules cultives? . . . . . . 3 Quelques problmes auxquels sont confronts les cellules en culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Comment savoir si des cellules en culture sont "heureuses"? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 quoi servent les cultures de cellules? . . . . . . . . 6 Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Que signifie culture de cellules et de tissus?

Culture de tissus est le terme gnral englobant le prlvement de cellules, tissus ou organes d'un animal ou d'une plante et leur placement ultrieur dans un environnement artificiel conduisant leur croissance. Cet environnement est gnralement constitu de rcipients de cultures appropris en verre ou en plastique contenant un milieu liquide ou semisolide qui apporte les nutriments essentiels la survie et la croissance. La culture d'organes entiers ou de fragments d'organes intacts dans l'intention d'tudier leur fonctionnement ou leur dveloppement prolongs est appele Culture d'organe. Lorsque les cellules sont retires des fragments d'organe avant, ou pendant la culture, interrompant ainsi leurs relations normales avec les cellules voisines, on appelle cela Culture de cellules.

Des informations supplmentaires sur la terminologie et l'utilisation des cultures cellulaires sont consultables sur le site Internet de la Society for In Vitro Biology l'adresse www.sivb.org/ edu_terminology.asp.

Bien que la culture de cellules animales ait t russie pour la premire fois par Ross Harrison en 1907, il a fallu attendre la fin des annes 1940 et le dbut des annes 1950 pour voir apparatre plusieurs dveloppements qui ont rendu la culture cellulaire largement disponible comme outil pour les scientifiques. Tout d'abord, le dveloppement des antibiotiques a permis d'viter plus facilement de nombreux problmes de contamination qui empoisonnaient jusqu'alors les essais de culture. Ensuite se sont dveloppes des techniques, telles que l'utilisation de trypsine pour retirer les cellules des rcipients de culture, ncessaires pour obtenir des lignes cellulaires cultives en continu (comme les cellules HeLa). Enfin, l'aide de ces lignes cellulaires, les scientifiques ont pu dvelopper des milieux de culture cellulaire standardiss chimiquement dfinis facilitant normment la culture de cellules. Ces trois points combins ont permis de nombreux autres chercheurs d'utiliser la culture de cellules, tissus et organes dans leur recherche. Pendant les annes 1960 et 1970, la commercialisation de cette technologie a eu un impact supplmentaire sur la culture cellulaire, impact qui continue de nos jours. Les entreprises, comme Corning, ont commenc dvelopper et vendre des produits pour la culture en verre et en plastique usage unique, et ont amlior les matriaux et produits de filtration, les milieux de culture tissulaire liquides et en poudre, et les hottes flux laminaire. Le rsultat de tout ceci et des autres dveloppements technologiques continus a t une augmentation croissante du nombre de laboratoires et d'industries utilisant aujourd'hui les cultures de cellules.

Prlever les tissus

Broyer ou dcouper

Digrer avec des enzymes proteolytiques

Mettre en culture

Dissociation enzymatique

Explants de prpuce humain fixs et colors la surface d'une bote de culture de 150 mm. Les explants ont t cultivs pendant environ deux semaines. Deux des neuf explants (coins infrieurs gauche et droit) n'ont pas pouss. Les explants restants montrent une bonne croissance. Chaque carr mesure environ 2 cm.

mencent se diviser et prolifrer. Dans la deuxime, mthode la plus gnralement utilise, ce processus est acclr en ajoutant des enzymes de digestion (protolytiques), telles que la trypsine ou la collagnase, des fragments de tissus pour dissoudre le ciment maintenant les cellules ensembles. Ceci cre une suspension de cellules individuelles qui sont places dans des rcipients de culture contenant un milieu de culture pour les laisser pousser et se diviser. Cette mthode est appele Dissociation enzymatique.

Repiquage
Lorsque les cellules dans le rcipient de culture primaire ont pouss et couvert tout le substrat de culture disponible, elles doivent tre repiques pour leur donner de la place afin davoir une croissance continue. Cela se fait gnralement en les retirant aussi dlicatement que possible du substrat avec des enzymes. Ces enzymes sont similaires celles utilises pour obtenir la culture primaire et sont utilises pour rompre les liaisons protiques liant les cellules au substrat. Certaines lignes cellulaires peuvent tre rcoltes en grattant dlicatement les cellules du fond du rcipient de culture. Une fois libres, les cellules en suspension peuvent tre divises et places dans de nouveaux rcipients de culture. Lorsqu'un surplus de cellules est disponible, il est possible de les traiter avec des agents cryoprotecteurs adapts, comme le dimthylsulfoxyde (DMSO) ou le glycrol,

Comment obtenir des cultures cellulaires?

Culture primaire Lorsque les cellules sont prleves chirurgicalement d'un organisme et places dans un environnement de culture appropri, elles se fixent, se divisent et prolifrent. C'est ce qu'on appelle une Culture primaire. Il existe deux mthodes de base pour faire cela. Dans la premire, pour les Cultures d'explants, de petits morceaux de tissus sont fixs sur un rcipient de culture en verre ou en plastique trait et baigns dans du milieu de culture. Aprs quelques jours, des cellules individuelles se dplacent de l'explant de tissus vers la surface du rcipient de culture ou le substrat o elles com-

Culture primaire de poisson Poeciliopsis lucida. Les embryons ont t broys et dissocis avec une solution de trypsine. Ces cellules ont t cultives pendant environ 1 semaine et ont form une couche unique confluence.

de les congeler dlicatement puis de les stocker des tempratures cryogniques (en dessous de 130C) jusqu' ce qu'on en ait besoin. La thorie et les techniques de cryoconservation des cellules sont reprises dans le bulletin technique Corning : Guide gnral de conservation cryognique de cultures de cellules animales (rf. 9).

traits pour la culture de cellules, le choix se faisant en fonction du nombre de cellules ncessaires, de la nature de l'environnement de culture, du cot et des prfrences personnelles. Les cultures en suspension sont gnralement cultives: 1. dans des flacons Spinner (rotation magntique) ou dans des Erlenmeyers agits dans lesquels les cellules sont activement gardes en suspension dans le milieu; 2. dans des rcipients de culture stationnaires comme les flacons T et les bouteilles dans lesquels, bien qu'elles ne soient pas maintenues en agitation, les cellules sont incapables de se fixer fermement au substrat.

Acheter ou emprunter
Les tubes cryognes Corning sont disponibles en diffrentes tailles pour congeler les cellules pour une conservation long terme.

Une alternative la constitution de cultures par culture primaire consiste acheter des cultures cellulaires constitues auprs d'organisations telles que l'American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.org) ou le Coriell Institute for Medical Research (arginine.umdnj.edu). Ces deux organisations but non lucratif proposent des lignes cellulaires de trs bonne qualit qui sont soigneusement testes afin dassurer l'authenticit des cellules. Plus frquemment, les chercheurs obtiennent (empruntent) des lignes cellulaires auprs d'autres laboratoires. Cette pratique s'tant rpandue, elle a un inconvnient majeur. Il y a une forte probabilit pour que les cellules obtenues de cette faon ne donnent pas de cultures saines et utiles. Ceci est gnralement d aux mlanges prcdents ou aux contaminations par d'autres lignes cellulaires, ou est le rsultat de contaminations par des micro-organismes tels que les mycoplasmes, bactries, champignons ou levures. Ces problmes sont traits en dtails dans un bulletin technique Corning : Comprendre et grer les contaminations des cultures cellulaires (rf 7).

De nombreuses lignes cellulaires, surtout celles drives de tissus normaux, sont considres comme adhrentes, c'est dire qu'elles poussent uniquement lorsqu'elles adhrent un substrat leur convenant.
Certaines lignes cellulaires qui ne sont plus considres comme normales (frquemment dsignes par cellules transformes) sont souvent capables de crotre soit fixes un substrat soit en flottant librement en suspension ; elles sont en suspension. De plus, certaines cellules normales, comme celles trouves dans le sang, ne se fixent pas normalement aux substrats et poussent toujours en suspension.

Les botes de culture Corning sont disponibles dans diffrentes tailles et formes pour cultiver des cellules adhrentes.

Types de cellules
Les cellules cultives sont gnralement dcrites d'aprs leur morphologie (forme et apparence) ou leurs caractristiques fonctionnelles. Il existe trois morphologies de base: 1. type pithlial: ces cellules sont attaches un substrat et apparaissent plates et de forme polygonale. 2. type lymphoblaste: ces cellules ne se fixent pas normalement un substrat mais restent en suspension avec une forme sphrique. 3. type fibroblaste: ces cellules sont attaches un substrat et apparaissent allonges et bipolaires. Il faut garder l'esprit que les conditions de culture jouent un rle important dans la dtermination de la forme et que de nombreuses cultures de cellules sont capables de prsenter plusieurs morphologies. l'aide de techniques de fusion cellulaire, il est galement possible d'obtenir des cellules

quoi ressemblent les cellules cultives?

Les flacons de culture Corning sont utiliss pour faire pousser des cellules adhrentes.

Une fois en culture, les cellules montrent une grande diversit de comportements, caractristiques et formes. Certaines parmi les plus communes sont dcrites cidessous. John Paul en donne des dtails dans le chapitre 3 de Culture de cellules et de tissus (rf. 3).

Systmes de culture cellulaire

Deux systmes de base de culture cellulaire sont utiliss pour cultiver des cellules. Ils sont essentiellement bass sur l'aptitude des cellules pousser attaches sur un substrat de verre ou de plastique trait (systmes de culture mono-couche) ou flotter librement dans le milieu de culture (systmes de culture en suspension). Les cultures mono-couches sont gnralement cultives dans des botes, flacons T, flacons roulants ou plaques multipuits

Les flacons Spinner Corning sont utiliss pour faire pousser des cellules non adhrentes en suspension.

Cellules de type fibroblaste 3T3 drives d'embryons de souris.

Ligne cellulaire de type pithlial (Cl-9) drive de foie de rat. Les cellules mitotiques indiquent que cette culture est en croissance active.

hybrides en fusionnant des cellules provenant de deux parents diffrents. Elles peuvent prsenter des caractristiques de l'un des parents ou des deux parents. Cette technique a t utilise en 1975 pour crer des cellules capables de produire des anticorps monoclonaux taills sur mesure. Ces cellules hybrides (appeles hybridomes) sont formes par la fusion de deux cellules diffrentes mais apparentes. La premire est un lymphocyte driv de la rate capable de produire l'anticorps dsir. La deuxime est une cellule de mylome (un type de cellule cancreuse) se divisant rapidement et qui possde la machinerie ncessaire pour fabriquer des anticorps, mais n'est pas programme pour produire d'anticorps. Les hybridomes rsultants peuvent produire de grandes quantits de l'anticorps dsir. Ces anticorps, appels anticorps monoclonaux du fait de leur puret, ont de nombreuses applications cliniques, diagnostics et industrielles importantes avec une valeur annuelle de bien plus d'un milliard d'euros.

somes sont appeles cellules diplodes; celles qui possdent un nombre de chromosomes diffrents de la norme sont appeles aneuplodes. Si les cellules forment des tumeurs lorsqu'elles sont injectes des animaux, elles sont considres comme tant noplasiquement transformes.

Quelques problmes auxquels sont confrontes les cellules en culture?

viter les contaminations
Il existe deux types principaux de contamination des cultures cellulaires : chimique et biologique. La contamination chimique est la plus difficile dtecter car elle est due des agents, tels que les endotoxines, plastifiants, ions mtalliques ou traces de dsinfectants chimiques qui sont invisibles. Les effets sur la culture cellulaire associs aux endotoxines sont dcrits en dtails dans le bulletin technique : Endotoxines et culture cellulaire (rf. 10). Les contaminants biologiques sous forme de levures croissance rapide, bactries et champignons ont un effet visible sur la culture (changement de turbidit ou de pH du milieu) et sont ainsi plus faciles dtecter (surtout en absence d'antibiotiques dans le milieu de culture). Cependant, deux autres formes de contaminations biologiques, les mycoplasmes et les virus, ne sont pas faciles dtecter visuellement et ncessitent gnralement des mthodes de dtection spcifiques. Il existe deux conditions majeures pour viter les contaminations. Premirement, un entranement correct la mise en uvre de techniques de bonne asepsie de la part de la personne qui cultive les cellules. Deuximement, un quipement, matriel en plastique, en verre et des milieux correctement conus, entretenus et striliss. L'utilisation soigneuse et slective (limite) d'antibiotiques conus pour tre utiliss en culture cellulaire peut galement aider viter les pertes de cultures conscutives une contamination biologique. Ces concepts sont repris en dtails dans un bulletin technique Corning : Comprendre et grer les contaminations en culture cellulaire (rf. 7).

Caractristiques fonctionnelles
Les caractristiques des cellules cultives sont le rsultat de leur origine (foie, cur, etc.) et de leur facult d'adaptation aux conditions de culture. Des marqueurs biochimiques peuvent tre utiliss pour dterminer si les cellules sont toujours porteuses des fonctions spcialises qui sont les leurs in vivo (par exemple, des cellules hpatiques secrtant de l'albumine). Des marqueurs morphologiques ou ultra-structuraux peuvent galement tre examins (par exemple les cellules du c?ur battantes). Ces caractristiques sont frquemment perdues ou modifies en consquence du placement des cellules dans un environnement artificiel. Certaines lignes cellulaires finissent par arrter de se diviser et montrer des signes de vieillissement. Ces lignes sont appeles finies. D'autres lignes cellulaires sont, ou deviennent, immortelles ; elles peuvent continuer se diviser indfiniment et sont appeles lignes cellulaires continues. Lorsqu'une ligne cellulaire finie "normale" devient immortelle, elle a subit un changement fondamental irrversible ou "transformation". Ceci peut se produire spontanment ou peut tre provoqu en utilisant intentionnellement des produits, des rayonnements ou des virus. Les cellules transformes poussent gnralement plus vite et plus facilement, peuvent souvent prsenter des chromosomes supplmentaires ou anormaux et peuvent frquemment tre cultives en suspension. Les cellules possdant le nombre normal de chromo-

Cellules CHO-K1 - une ligne cellulaire continue (transforme) largement utilise drive de tissus d'ovaires de hamsters chinois adultes en 1957.

Microphotographie d'une infection de faible niveau par des levures dans une ligne cellulaire de foie (PLHC-1, ATCC # CRL-2406). Les cellules de levure bourgeonnantes sont visibles en plusieurs endroits (flches). ce faible niveau de contamination, aucune turbidit du milieu n'est visible ; cependant, en absence d'antibiotiques, le milieu de culture deviendra probablement trouble en une journe.

Trouver un environnement "heureux"

Pour les personnes cultivant des cellules, un environnement "heureux" permet aux cellules de faire plus que juste survivre en culture. Gnralement, cela signifie un environnement qui, au minimum, permet aux cellules d'augmenter en nombre par division cellulaire (mitose). Mieux, lorsque les

Conditions environnementales de base pour des cellules "heureuses": Temprature contrle Bon substrat pour l'adhrence des cellules Milieu et tuve appropris maintenant l'osmolalit et le pH corrects

conditions sont idales, certaines cellules cultives expriment leur "bonheur" pour leur environnement en ralisant in vivo d'importantes fonctions physiologiques ou biochimiques, telle que la contraction musculaire ou la scrtion d'hormones et d'enzymes. Pour obtenir cet environnement, il est important de fournir aux cellules la temprature approprie, un bon substrat pour la fixation et le milieu de culture correct. La plupart des problmes associs au "bientre" des cellules sont dcrits dans le bulletin technique de Corning : Guide gnral pour l'identification et la rsolution des problmes courants d'adhrence et de croissance de cultures cellulaires (rf. 8). La temprature est gnralement rgle sur la mme valeur que la temprature corporelle de l'hte partir duquel les cellules ont t obtenues. Avec les vertbrs sang froid, une plage de temprature de 18 25C est parfaite ; la plupart des cellules de mammifre ncessitent 36 37C. Cette plage de temprature est gnralement maintenue l'aide d'tuves soigneusement talonnes et frquemment contrles. Les cellules adhrentes ncessitent galement un bon substrat pour la fixation et la croissance. Le verre et les plastiques spcialement traits (pour rendre hydrophile ou mouillable la surface normalement hydrophobe des plastiques) sont les substrats les plus communment utiliss. Cependant, des facteurs d'adhrence, comme le collagne, la glatine, la fibronectine et la laminine, peuvent tre utiliss pour recouvrir les substrats afin d'amliorer la croissance et la fonction de cellules normales drives de cerveau, vaisseaux sanguins, rein, foie, peau, etc. Souvent les cellules adhrentes normales fonctionnent mieux si elles sont cultives sur une surface permable ou poreuse. Cela leur permet de se polariser (avoir un haut et un bas travers lesquels des lments peuvent entrer et sortir de la cellule) comme elles le font dans le corps. Les inserts Transwell sont des rcipients Corning avec des supports permables base de membrane qui permettent ces cellules de dvelopper une polarit et d'acqurir la capacit d'exprimer des fonctions spciales telles que le transport. De nombreuses cellules spcialises ne peuvent tre vraiment "heureuses" (fonctionner normalement) que si elles sont cultives sur un substrat poreux dans un milieu sans srum avec un mlange appropri de facteurs de croissance et d'adhrence. Les cellules peuvent galement tre cul-

tives en suspension sur des microbilles en verre, plastique, polyacrylamide et molcules de dextran rticules. Cette technique a t utilise pour permettre aux cellules adhrentes de pousser dans des systmes de culture en suspension et se dveloppe de faon importante dans la fabrication de produits biologiques cellulaires. Le milieu de culture est le facteur le plus important et le plus complexe grer pour rendre les cellules "heureuses". En plus de satisfaire aux besoins nutritionnels des cellules, le milieu de culture doit galement possder tous les facteurs de croissance ncessaires, rguler le pH et l'osmolarit, et fournir les gaz essentiels (O2 et CO2). La partie "nourriture" du milieu de culture est constitue d'acides amins, vitamines, sels minraux et glucides. Ils permettent aux cellules de construire de nouvelles protines et autres composants essentiels la croissance et aux fonctions et apportent l'nergie ncessaire au mtabolisme. Pour plus d'informations sur ce sujet, consulter l'article : Construction of Tissue Culture Media (Composition des milieux de culture de tissus) par C. Waymouth dans Growth, Nutrition and Metabolism of Cells in Culture, Volume 1 (1972, rf. 5). Les facteurs de croissance et hormones aident rguler et contrler la vitesse de croissance des cellules et leurs caractristiques fonctionnelles. Au lieu de les ajouter directement au milieu, ils sont souvent ajouts de manire non dfinie par adjonction de 5 20% de diffrents srums animaux au milieu. Malheureusement, les types et concentrations de ces facteurs dans le srum varient considrablement d'un lot l'autre. Ceci pose souvent des problmes de contrle de la croissance et des fonctions. Pour cultiver des cellules fonctionnelles normales, les srums sont souvent remplacs par des facteurs de croissance spcifiques. Le milieu rgule galement la plage de pH de la culture et tamponne les cellules pour empcher les modifications trop rapides de pH. Gnralement, un tampon base de CO2 - bicarbonate ou un tampon organique, comme l'HEPES, est utilis pour aider conserver le pH du milieu dans une plage comprise entre 7,0 et 7,4 suivant le type de cellules cultives. En cas d'utilisation d'un tampon CO2 bicarbonate, il est ncessaire de rguler la quantit de CO2 dissous dans le milieu. Cela se fait gnralement en utilisant une tuve rgulant le

Les supports permables Transwell de Corning sont utiliss pour tudier la migration et le transport cellulaires.

Les cultures en suspension et sur micro-supports peuvent tre cultives dans des flacons Spinner en verre.

Cellules CHO-K1 cultives sur un support de microbilles.

CO2rgle pour fournir une atmosphre comprise entre 2% et 10% de CO2 (pour les tampons bass sur les sels de Earle). Cependant, certains milieux utilisent un tampon CO2 bicarbonate (pour les tampons bass sur les sels de Hanks) ne ncessitant pas de CO2 supplmentaire, mais ce tampon doit tre utilis dans des rcipients scells (pas de bote ni de plaque). Pour plus d'informations sur ce sujet, consulter l'article : The Gaseous Environment of the Cell in Culture (L'environnement gazeux des cellules en culture) par W.F. McLimans dans Growth, Nutrition and Metabolism of Cells in Culture (1972, Rf. 5).
L'examen de la morphologie de ces flacons roulants colors (contenant des fibroblastes humains MRC-5) est une bonne faon de vrifier si les cellules sont "heureuses". La bouteille de gauche a tourn trop vite, entranant une mauvaise adhrence et une mauvaise croissance et des cellules trs "malheureuses".

l'examen microscopique des cellules qui met en vidence des images d'adhrence ou de croissance cellulaires dgrades ou inhabituelles. En cas de suspicion de problme, une coloration des rcipients de culture au violet de mthyle ou avec un autre colorant histologique simple peut montrer des images de croissance indiquant un problme. Ces problmes de croissance sont dcrits en dtails dans le bulletin technique Corning : Guide gnral d'identification et de rsolution des problmes courants d'adhrence et de croissance de cellules en culture (Rf. 8). Le comptage cellulaire et autres mthodes d'estimation du nombre de cellules, d'un autre ct, permettent de dterminer la vitesse de croissance, qui est sensible aux changements majeurs de l'environnement de la culture. Ceci permet de concevoir des expriences permettant de dterminer quel ensemble de conditions (milieu de culture, substrat, srum, ustensiles en plastique) est meilleur pour les cellules, c'est dire les conditions induisant la meilleure vitesse de croissance. Ces mmes techniques ou similaires peuvent tre utilises pour mesurer la survie ou la mort cellulaires et sont souvent utilises pour les tests de cytotoxicit in vitro. L'efficacit d'ensemencement est une mthode de test dans laquelle de petites quantits de cellules (20 200) sont places dans un rcipient de culture ; le nombre de colonies qu'elles forment est ensuite compt. Le pourcentage de cellules formant une colonie est une mesure de la survie, alors que la taille de la colonie est une mesure de la vitesse de croissance. Cette mthode de test est similaire l'analyse de la vitesse de croissance dans son application mais est plus sensible aux petites variations des conditions de culture. La dernire caractristique, l'expression des fonctions spcialises, est gnralement la plus difficile observer et mesurer. Il convient gnralement d'utiliser des dosages et tests biochimiques et immunologiques. Alors que les cellules cultives peuvent trs bien pousser en conditions suboptimales, les fonctions hautement spcialises ncessitent gnralement des conditions de culture proches de la perfection et sont souvent rapidement perdues lorsque les cellules sont places en culture.

Enfin, l' osmolarit (pression osmotique) du milieu de culture est importante car elle aide rguler le flux de substances qui entrent et sortent de la cellule. Elle est contrle par l'addition ou la soustraction de sels dans le milieu de culture. L'vaporation du milieu de culture dans les rcipients de culture ouverts (botes, etc.) conduit rapidement une augmentation de l'osmolarit, entranant un stress, une dgradation ou la mort des cellules. Pour les systmes de culture ouverts (non scells), les tuves niveau d'humidit lev sont essentielles pour rduire l'vaporation. Pour plus d'informations, consulter l'article de C. Waymouth : Osmolality of Mammalian Blood and of Media for Culture of Mammalian Cells (Osmolarit du sang des mammifres et des milieux de culture de cellules de mammifres) (1970, Rf. 6).

Une colonie de cellules de fibroblastes humains fixes et colores.

Comment savoir si des cellules cultives sont "heureuses"?

L'valuation de l'tat de sant gnral ou du "bonheur" d'une culture est gnralement base sur quatre caractristiques cellulaires importantes : morphologie, vitesse de croissance, efficacit d'talement et expression de fonctions particulires. Ces mmes caractristiques sont galement largement utilises pour valuer les rsultats exprimentaux.

Les plaques Transwell-24 HTS sont utilises pour les tests de toxicit et les tudes de transport de mdicaments.

La morphologie ou forme de la cellule est la plus facile dterminer mais elle est galement souvent la moins utile. Bien que des changements de morphologie soient frquemment observs en culture, il est souvent difficile de lier ces observations aux conditions qui les ont provoqus. C'est galement une caractristique trs difficile quantifier ou mesurer avec prcision. Souvent, le premier signe que quelque chose tourne mal dans une culture apparat

 quoi servent les cultures de cellules?

La culture cellulaire est devenue un des outils majeurs utiliss en biologie cellulaire et molculaire. Certains des domaines importants dans lesquels la culture cellulaire joue actuellement un rle majeur sont brivement dcrits ci-dessous:

Systmes de modles
Les flacons roulants Corning sont largement utiliss pour produire des vaccins antiviraux.

Les cultures cellulaires fournissent de bons systmes de modles pour tudier 1) la biologie et la biochimie cellulaires de base, 2) les interactions entre les cellules et les agents induisant des maladies, 3) les effets des mdicaments sur les cellules, 4) le processus et le dclenchement du vieillissement et 5) les tudes nutritionnelles.

Tests de toxicit
Les cellules en culture sont largement utilises seules ou en conjonction avec des tests sur les animaux pour tudier les effets de nouveaux mdicaments, cosmtiques et produits chimiques sur la survie et la croissance d'une grande varit de types de cellules. Les cultures de cellules drives du foie et des reins sont particulirement importantes.

Le systme de bioracteur CellCube de Corning est idal pour la production de masse de cellules adhrentes.

duits importants, trois domaines se sont montrs plus intressants. Le premier est la production grande chelle de virus pour une utilisation en production de vaccins. Ceci comprend les vaccins contre la polio, la rage, la varicelle, l'hpatite B et la rougeole. Le deuxime est la production grande chelle de cellules gntiquement modifies pour produire des protines prsentant une valeur mdicale ou commerciale. Ceci inclut les anticorps monoclonaux, l'insuline, les hormones, etc. Le troisime est l'utilisation de cellules en remplacement de tissus et d'organes. La peau artificielle utilise pour le traitement de brlures et d'ulcres est le premier produit disponible dans le commerce. Toutefois, des tests sont en cours sur des organes artificiels comme le pancras, le foie et les reins. Une rserve potentielle de cellules et tissus de remplacement peut ressortir de travaux en cours raliss avec des cellules souches adultes et embryonnaires. Ce sont des cellules qui ont le potentiel de se diffrencier en plusieurs types cellulaires diffrents. Apprendre contrler le dveloppement de ces cellules reprsente un espoir pour de nouvelles approches de traitements pour une large varit de pathologies. Conseil gntique L'amniocentse, une technique diagnostique qui permet aux mdecins de prlever des cellules ftales sur des femmes enceintes et de les cultiver, a mis la disposition des mdecins un outil important pour le diagnostic prcoce d'affections f?tales. Ces cellules peuvent tre examines pour rechercher des anomalies dans leurs chromosomes et gnes l'aide de caryotypes, chromosome painting et autres techniques molculaires. Gnie gntique La capacit de transfecter ou de reprogrammer les cellules en culture par du nouveau matriel gntique (ADN et gnes) a fourni un outil prcieux aux biologistes molculaires dsireux d'tudier les effets cellulaires de l'expression de ces gnes (nouvelles protines). Ces techniques peuvent galement tre utilises pour produire ces nouvelles protines en grande quantit dans les cellules en culture pour les tudier. Les cellules d'insectes sont largement utilises comme usines cellulaires miniatures pour exprimer des quantits substantielles de protines qu'elles fabriquent aprs avoir t infectes par des baculovirus gntiquement modifis.

Recherche sur le cancer

Les cellules normales et les cellules cancreuses pouvant toutes deux tre cultives, les diffrences de base entre elles peuvent tre tudies de prs. De plus, il est possible, en utilisant des produits chimiques, virus et rayonnements, de convertir les cellules cultives normales en cellules cancreuses. Ceci permet ainsi d'tudier les mcanismes conduisant ce changement. Les cellules cancreuses cultives servent galement de systme de test pour dterminer les mdicaments et mthodes adaptes pour dtruire slectivement certains types de cancers.

Les flacons Erlenmeyers Corning sont souvent utiliss pour cultiver des cellules d'insectes en suspension.

Virologie
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Les microplaques Corning sont largement utilises pour les tests de criblage de molcules.

Une des utilisations les plus prcoces et les plus importantes des cultures cellulaires a t la rplication de virus dans les cultures cellulaires ( la place des animaux) pour les utiliser dans la production de vaccins. Les cultures cellulaires sont galement largement utilises en dtection clinique et isolement de virus, ainsi qu'en recherche fondamentale pour tudier comment ils se dveloppent et infectent les organismes.

La cellule comme usine de production

Alors que les cellules cultives peuvent tre utilises pour produire de nombreux pro7

Thrapie gnique La capacit de modifier gntiquement des cellules a galement conduit leur utilisation en thrapie gnique. Les cellules peuvent tre prleves sur un patient souffrant d'une dficience dans une gne fonctionnel, et le gne manquant ou endommag peut alors tre remplac. Les cellules sont cultives un moment puis rimplantes dans le patient. Une approche alternative consiste placer le gne manquant dans un vecteur viral puis "d'infecter" le patient par le virus en esprant que le gne manquant sera exprim dans les cellules du patient. Dcouverte de mdicaments L'importance des tests bass sur des cellules a considrablement augment dans l'industrie pharmaceutique, pas seulement pour les tests de cytotoxicit, mais galement pour le criblage haut dbit (HTS) de composs pouvant prsenter une utilit potentielle comme mdicament. l'origine, ces tests de culture cellulaire taient raliss dans des plaques de 96 puits, mais les plaques de 384 et 1536 puits sont maintenant de plus en plus utilises.

3. Cell and Tissue Culture (1975) John Paul, 5th edition, Churchill Livingstone, Edinburgh. 4. Animal Cell Culture Methods, Volume 57, (1998) J. Mather and D. Barnes, eds. Methods in Cell Biology, Academic Press, San Diego, 1998. 5. Growth, Nutrition and Metabolism of Cells in Culture (1972) G. H. Rothblat and V. J. Cristofalo eds. Volumes 1-3 by Academic Press, New York. 6. Osmolality of Mammalian Blood and of Media for Culture of Mammalian Cells, (1970) C. Waymouth, In Vitro, Volume 6: 109-127. 7. Understanding and Managing Cell Culture Contamination Corning Life Sciences Technical Bulletin. This is available on the Corning Life Sciences web site at www.corning.com/lifesciences. 8. General Guide for Identifying and Correcting Common Cell Culture Growth and Attachment Problems Corning Life Sciences Technical Bulletin. This is available on the Corning Life Sciences web site at www.corning.com/ lifesciences. 9. General Guide for Cryogenically Storing Animal Cell Cultures Corning Life Sciences Technical Bulletin. This is available on the Corning Life Sciences web site at www.corning.com/lifesciences. 10. Endotoxins and Cell Culture Corning Life Sciences Technical Bulletin. This is available on the Corning Life Sciences web site at www.corning.com/lifesciences.

Rfrences
1. Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (1994) R. Ian Freshney, 3rd edition, Alan R. Liss, Inc., New York. 2. Methods in Enzymology: Cell Culture, Vol. 58, (1979) W. B. Jacoby and I. H. Pasten, eds. Academic Press, New York.

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A S I E / PA C I F I Q U E Australie t 61 2-9416-0492 f 61 2-9416-0493 Chine t 86 21-3222-4666 f 86 21-6288-1575 Hong Kong t 852-2807-2723 f 852-2807-2152

Corning, CellCube et Transwell sont des marques commerciales dposes de Corning Incorporated, Corning, New York, USA. Discovering Beyond Imagination, le logo de la flamme de la dcouverte, CellSTACK, Snapwell et Netwell sont des marques commerciales de Corning Incorporated, Corning, NY, USA. Corning Incorporated, One Riverfront Plaza, Corning, New York 14831-0001, USA

2007 Corning Incorporated

Inde t 91-124-235 7850 f 91-124-401 0207 Japon t 81 (0) 3-3586 1996/1997 f 81 (0) 3-3586 1291/1292 Core t 82 2-796-9500 f 82 2-796-9300 Singapour t 65 6733-6511 f 65 6861-2913

Taiwan t 886 2-2716-0338 f 886 2-2716-0339 EUROPE France t 0800 916 882 f 0800 918 636 Allemagne t 0800 101 1153 f 0800 101 2427 Royaume-Uni t 0800 376 8660 f 0800 279 1117

Pays-Bas & tous les autres pays europens t 31 (0) 20 659 60 51 f 31 (0) 20 659 76 73 A M R I Q U E L AT I N E Brsil t (55-11) 3089-7419 f (55-11) 3167-0700 Mxique t (52-81) 8158-8400 f (52-81) 8313-8589

Printed in E.U.

6/05 KP 5M

CLS-AN-042 Franais REV1

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