TECNOLOGA MDICA BIO-125 GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

HISTOLOGA GENERAL PRIMER SEMESTRE 2014

No basta examinar; hay que contemplar: impregnemos de emocin y simpata las cosas observadas; hagmoslas nuestras, tanto por el corazn como por la inteligencia. Santiago Ramn y Cajal Histlogo espaol (1852-1934) Premio novel de Fisiologa y medicina-1906

PROFESORES: Dra. CUPERTINA ORELLANA S Dra. RAQUEL CASTELLANOS G (Coordinacin) rcastellanos@unab.cl 1

INTRODUCCIN La histologa como disciplina morfolgica, investiga las propiedades microscpicas estructurales de los rganos y tejidos animales y vegetales y su relacin de dependencia con la funcin que desempean. Un tejido es un conjunto de clulas acompaadas por la sustancia intercelular o matriz extracelular generada por ellas mismas, asociadas para cumplir determinada funcin. Estas clulas presentan el mismo origen embrionario. Las clulas que constituyen los tejidos miden entre 5 m y 150 m de dimetro, siendo por lo tanto visibles nicamente mediante el microscopio. Esta gua de trabajos prcticos tiene como finalidad servir como elemento de ayuda para el estudiante, guindolo en el estudio del material histolgico y estimulando un trabajo independiente y organizado. Para esto resulta indispensable manejar los conceptos tericos relacionados con la actividad prctica a realizar. Cada unidad temtica tratada en las secciones prcticas de laboratorio (TPM) programadas segn calendario, deber estar apoyada con la presente gua, por lo cual resulta obligatorio presentarla al momento de ingresar al laboratorio. Para cada unidad se ha considerado: Una introduccin general de los contenidos de la actividad Indicaciones para un adecuado procedimiento de observacin de los preparados. Preguntas e imgenes relacionadas con la unidad y el rgano o tejido a estudiar

Se recomienda preparar con anticipacin sus TPM, analizando e intentando identificar los elementos contenidos en las imgenes y contestando los cuestionarios. Esta gua adquiere un mayor valor en la medida que se vea complementada con la bibliografa sugerida en el programa del curso. Se recomienda asistir al paso prctico con un texto-atlas que pueda servirle de apoyo. Su compromiso de asistencia y puntualidad en la actividad, junto a su creatividad y esfuerzo personal constituyen un requisito fundamental para el logro de nuestros objetivos en comn: aprendizaje y obtencin de buenas calificaciones. Sus profesores les dan la bienvenida a este curso.

MATERIALES Y MTODOLOGA PARA EL BUEN DESARROLLO DEL TRABAJO PRCTICO DE MICROSCOPA PTICA. MATERIALES OBLIGATORIOS 1. Gua de trabajos prcticos. 2. Delantal blanco 3. Cuaderno de croquis doblado, de 40 o 60 hojas. Con la identificacin del estudiante (Nombre y seccin). NO SE ADMITE EL USO DE CROQUERAS 4. Lpices de colores 5. Lpiz grafito o portaminas, goma para borrar, sacapuntas, etc. 6. Lpiz pasta azul o negro para el control 7. Apuntes de la clase terica. MATERIALES OPCIONALES SUGERIDOS 1. Texto-atlas de histologa. MATERIAL DE USO EXCLUSIVO EN EL LABORATORIO 1. Un microscopio de luz asignado al estudiante para su uso durante el semestre. 2. Preparados histolgicos. NOTA: cualquier dao a este material ser de responsabilidad exclusiva del estudiante que lo utiliz, debiendo ste cubrir los costos de su reparacin o reposicin total. EVALUACIONES 1. Cada sesin de laboratorio comienza con un control escrito del tema a desarrollar. Segn consta en la calendarizacin de las actividades de laboratorio, tambin realizaremos controles acumulativos, donde se controlarn los contenidos de prcticos anteriores. Para el desarrollo de este tipo de control, se realizarn preguntas respecto a una preparacin, ya sea directamente en el microscopio o de una imagen histolgica, fotografiada, esquematizada o proyectada. Los estudiantes que no lleguen a tiempo para rendir el control y quienes no asistan a la actividad prctica, sern calificados con nota 1. En caso de inasistencia y solamente una vez que sta haya sido justificada, la nota 1 ser eliminada. Esta asignatura no considera la posibilidad de rendir controles recuperativos. 2. Cada estudiante debe mantener su cuaderno de prctico al da y ordenado, indicando el prctico correspondiente, tema y fecha de realizacin. Durante cada sesin prctica le ser solicitado por el profesor, para su revisin. Debe contener la descripcin de cada preparado histolgico (protocolo que aparece en la gua), y a continuacin de ste, un esquema, grande y claro, y debidamente rotulado, del tejido u rgano estudiado, as como el clculo del aumento final de la muestra, segn el lente objetivo utilizado para la observacin.

Con cada revisin, el cuaderno ser aprobado o reprobado por el profesor. Cada reprobacin determinar que al estudiante se le descuente 1 punto en el control que rinda en el laboratorio siguiente. 3. Durante el semestre acadmico realizaremos dos pruebas prcticas parciales que incluirn todos los preparados histolgicos estudiados de cada perodo. 4. Los estudiantes que cumplan con los requisitos de presentacin de notas y no cumplan con los requisitos para la eximicin, debern rendir un examen prctico de carcter global. 5. Todas las instancias de evaluacin son de carcter INDIVIDUAL.

ASISTENCIA A LAS ACTIVIDADES DE LABORATORIO Los estudiantes deben informarse con la anticipacin debida, acerca de la seccin de prctico en la que estn inscritos. Slo pueden ingresar al laboratorio los estudiantes que figuren en la lista oficial de cada seccin. Cualquier cambio posterior de seccin, deber ser resuelto por su escuela. Todas las actividades prcticas de microscopa en laboratorio son de asistencia obligatoria en un 100%. Los estudiantes que no asistan tienen como mximo 48 horas para justificar su inasistencia. El coordinador de su escuela es el encargado de recibir los justificativos y de informar al respecto al Departamento de Morfologa, encargado de regular las actividades de la asignatura de Histologa. Ms de dos inasistencias (aunque estn justificadas) sern causa de reprobacin de la asignatura.

NORMAS DE COMPORTAMIENTO
1. Exigiremos puntualidad al ingresar al laboratorio. Hasta 15 minutos de atraso, el estudiante ingresa a clase, pero no puede rendir el control, por lo tanto su nota ser 1. 2. Los estudiantes deben ingresar con su delantal puesto y abotonado. 3. Las mochilas, ropa de abrigo, lentes de sol, gorros u otros elementos no necesarios para el prctico deben permanecer con llave en sus casilleros, fuera del laboratorio. 4. No se permite ingresar al laboratorio con reproductores de sonidos o video ni telfonos celulares. 5. No est permitido ingresar al laboratorio con alimentos o bebidas. 6. Una vez ingresados al laboratorio, los estudiantes slo podrn salir una vez finalizada la sesin prctica. Cualquier situacin especial deber ser consultada con el profesor a cargo. 7. Los estudiantes sorprendidos comportndose en forma inapropiada debern salir del laboratorio, quedando como inasistentes. 8. Los estudiantes podrn revisar todas sus evaluaciones y las notas obtenidas, siendo obligatoria su devolucin al finalizar la revisin. 9. Al trmino de la sesin prctica, los estudiantes deben dejar su microscopio en posicin de descanso, entregar los preparados y dejar su puesto de trabajo limpio y ordenado.

RECOMENDACIONES: Organizacin del tiempo disponible: Tenga en cuenta que debe completar la observacin de la totalidad de las lminas asignadas en cada practico en un tiempo determinado. Cada sesin prctica dura 90 minutos, de los cuales deber tener en cuenta el tiempo que se utiliza en la realizacin del control de entrada, ubicacin en su microscopio y la realizacin de una breve explicacin inicial, debiendo distribuir en forma adecuada el tiempo restante para observar y dibujar entre 3 y 4 preparaciones. Reconocimiento del microscopio: idealmente se le asignar un microscopio que utilizar durante todo el semestre. Deber cerciorarse de que todas sus piezas estn en correcto estado al ingresar al laboratorio, y en caso contrario deber llamar al profesor o al encargado de la sala. BIBLIOGRAFA OBLIGATORIA -Histologa de Finn Geneser (para preparacin previa de la clase prctica) BIBLIOGRAFA SUGERIDA - Atlas de Histologa

TRABAJO PRCTICO N 1
MICROSCOPIO PTICO Y TECNICA HISTOLGICA Objetivos: 1. Identificar cada una de las partes del microscopio ptico (MO) 2. Conocer la secuencia correcta para la observacin histolgica. 3. Analizar las etapas de preparacin del material para su observacin y conocer algunas tcnicas de tincin histolgica de rutina y especiales. 4. Definir los conceptos de basofilia y acidofilia. Aplicar estos conceptos en la identificacin de estructuras celulares (ncleo y citoplasma) y matriz extracelular. 5. Identificar diferentes tipos de cortes histolgicos 6. Calcular tamaos relativos de clulas y elementos celulares.

INTRODUCCIN AL ESTUDIO HISTOLGICO

INTERPRETACIN DE LOS CORTES HISTOLOGICOS

Para una adecuada interpretacin de un corte observado al microscopio ptico, deben considerarse los siguientes factores: 1) El plano de corte. Este aspecto es fundamental, pues se debe reconstruir la estructura tridimensional de clulas, tejidos y rganos a partir de cortes bidimensionales. Es importante considerar que los cortes que se estudiarn corresponden a rganos tubulares, rganos macizos o secciones corporales. 2) Tincin empleada. sta nos puede revelar u ocultar informacin sobre la estructura de un determinado tejido. Es importante establecer las correlaciones entre estructura y funcin de lo observado, tratando de transformar mentalmente las condiciones estticas del corte en las dinmicas de la vida. 3) Artefactos. Durante la preparacin de los cortes histolgicos, pueden presentarse alteraciones denominadas artefactos, que deben ser reconocidos y diferenciados de reas bien conservadas de tejidos. Generalmente, se deben a errores en la preparacin del tejido, defectos en la cuchilla, que se traducen en muescas en la preparacin, errores de montaje

como pliegues y arrugas y a contaminacin ambiental como polvo y pelusas. Al analizar cortes de tejido, debe tenerse en cuenta que estos muestran en un plano bidimensional las estructuras tridimensionales que forman los tejidos y rganos. La figura muestra los posibles cortes que se pueden obtener de un tubo curvado.

MICROSCOPIO PTICO DE LUZ O DE CAMPO CLARO

El microscopio ptico, de luz o de campo claro es el ms utilizado en los laboratorios. Por esta razn es indispensable conocer sus componentes y la funcin de cada uno de ellos. Presenta un sistema mecnico o estativo, un sistema ptico y un sistema de iluminacin. Cada sistema est constituido por diversas piezas, y a continuacin detallaremos su funcin. Pie o base: pieza encargada de dar soporte y estabilidad al aparato. Columna: soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micromtrico.

Tornillos de Ajuste (macro y micromtrico): permiten el desplazamiento de la platina en sentido vertical, lo que permite el enfoque. El tornillo macromtrico permite realizar movimientos rpidos y fuertes, en cambio el tornillo micromtrico permite enfocar a travs de movimientos suaves y finos. Tubo: en su extremo superior se encuentran las lentes oculares, y en el inferior, las lentes objetivos. Corresponde a un cilindro metlico cuyo interior se encuentra pintado de negro, lo que evita la reflexin de la luz. Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el preparado a observar, tiene un orificio central que permite el paso de la luz. Sobre ella se encuentra el carro que permite el desplazamiento de la muestra. Asociada al carro se encuentra una la pinza de ajuste. Tornillos o perillas coaxiales: permiten desplazar el carro hacia delante y hacia atrs, y hacia la derecha e izquierda. Subplatina: sostiene al condensador y permite desplazarlo en sentido vertical. Revlver o Tambor: Pieza giratoria ubicada en el extremo inferior del tubo que, por rotacin moviliza los diferentes lentes objetivos. Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se encuentra en la platina. Asociado a l se encuentra el diafragma o iris que regula la cantidad de luz que llega al condensador. Fuente de Luz: es una lmpara que est ubicada en la base. Ocular: es un tubo cilndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la superior se denomina lente ocular y la inferior lente colectora. Lentes Objetivas: estn formadas por un sistema de pequeas lentes ubicadas muy cercanas una de la otra, la que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser objetivos en seco (no hay ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u objetivos de inmersin (entre la lente frontal y el preparado se coloca una sustancia cuyo ndice de refraccin es muy similar al del vidrio).

Propiedades de las lentes objetivas Escala de reproduccin: relacin lineal que existe entre el tamao del objeto y su imagen, por ejemplo, 4:1, 40:1, 400:1, etc. Poder de definicin: es la capacidad del objetivo de formar imgenes de contornos ntidos. Lmite de resolucin: es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan visualizarse por separado. Mientras menor sea el lmite de resolucin, mayor es el poder del microscopio (mayor es su poder de resolucin). Poder de resolucin: es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles ms finos. Est en relacin inversa con el lmite de resolucin. Aumento total: Debemos notar que el ocular tambin tiene un aumento, por lo tanto el aumento total de la imagen que observamos, es el producto entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproduccin es 40:1 y nuestro ocular tiene un aumento de 10x, entonces el aumento total ser 40 x 10 = 400.

TCNICAS HISTOLGICAS

Se denominan tcnicas histolgicas, a los procedimientos a los cuales se someten los tejidos, previo a su observacin al microscopio. Los tejidos animales requieren de esta preparacin previa para su observacin, para aumentar el contraste de las estructuras tisulares y preservarlas a travs del tiempo. Las etapas del proceso consisten normalmente en: Fijacin. Deshidratacin. Diafanizacin o aclaramiento Inclusin o impregnacin. Corte. Desparafinado o rehidratacin Tincin. Montaje

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A.- Fijacin: Inmediatamente despus de remover un tejido de su rgano de origen, comienza un proceso de destruccin celular, denominado autolisis, el cual es proporcional a su actividad metablica in vivo. La fijacin tiene por objeto preservar el tejido en la forma ms parecida al estado natural. Mediante este proceso los constituyentes celulares son tratados qumica y/o fsicamente, quedando en un estado que impide una distorsin celular significativa y permitiendo el tratamiento posterior con diversos reactivos. Los mtodos de fijacin pueden ser: Fsicos : calor fro. Qumicos : sales en general, formaldehdo, glutaraldehido.

El reactivo empleado como fijador, debe penetrar en el tejido rpidamente, su accin tiene que ser instantnea y de naturaleza isotnica. Tambin, debe ocasionar un mnimo de alteraciones de los componentes celulares, debe ser econmico, estable y fcil de manejar. El formaldehdo, comnmente llamado formalina en solucin acuosa, es uno de los fijadores ms empleados en procedimientos histolgicos de rutina, ya que presenta buena penetracin, estabiliza las protenas y sus grupos aldehdos permiten variadas reacciones con los componentes del tejido. Se utiliza formalina comercial en concentracin de un relacin con el tamao de la muestra debe estar en proporcin de 1:10. Algunos fijadores como el alcohol, coagulan las protenas en los tejidos, alterando la estructura normal, por lo tanto, slo deben ser empleados como recurso en caso de emergencia, procediendo a su reemplazo a brevedad posible. El trozo de tejido a fijar no debe ser de un tamao superior a 1,0 x 0,5 cm, obtenindose entre 6 y 7 trozos desde la periferia al centro del rgano o masa a estudiar. El tiempo de fijacin depender del tamao del trozo a fijar y de su consistencia, por ejemplo un tejido pequeo o blando requerir unas pocas horas, en tanto que un trozo de mayor tamao o dureza requerir entre 24 y 48 horas o an ms. 37%, diluyndose esta en agua destilada en proporcin de 1:10. El volumen de lquido fijador en

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Finalidades de la fijacin: 1) Preservacin de las estructuras celulares, con un mnimo de alteracin. 2) Proteger las estructuras contra su ruptura o alteracin espacial. 3) Preparar las estructuras para su tratamiento posterior. 4) Endurecer los tejidos. 5) Detener los procesos metablicos, evitando la autolisis. 6) Accin antisptica. 7) Impedir la prdida de elementos en los tratamientos posteriores.

B.-

Deshidratacin:

Una vez fijado el tejido, debe ser incluido o impregnado en un material que le otorgue consistencia para permitir cortes delgados, que no alteren o distorsionen la disposicin espacial de los elementos celulares. La mayora de estos materiales de inclusin son qumicamente anhidros. Esto hace indispensable extraer y reemplazar paulatinamente el agua del tejido, con sustancias que tengan cierta afinidad con el medio acuoso en que estn las clulas. Una de las sustancias qumicas ms empleadas concentraciones crecientes de 70 a 100. es el alcohol etlico, utilizado en

C.-

Aclaramiento o diafanizacin:

Luego de deshidratar el tejido, se somete a una sustancia que es miscible, tanto con el alcohol como con el medio de inclusin a utilizar. En la mayora de los casos se utiliza como medio de inclusin Parafina lquida. La sustancia comnmente utilizada para aclarar es el Xilol. El xilol slo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente, esto se debe a que cambia su ndice de refraccin. Inclusin:

D.-

Consiste en el reemplazo en el material biolgico, del ltimo solvente usado en la deshidratacin, por un material que de la consistencia necesaria para permitir realizar cortes

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delgados que no distorsionen, ni alteren la distribucin espacial de los elementos celulares del tejido. En microscopa ptica el medio de inclusin ms empleado es la parafina slida. Esta debe calentarse a una temperatura superior al de su punto de fusin, sumergiendo el tejido para reemplazar el tejido intracelular desplazado durante la deshidratacin. Por lo general se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60-64 C, colocando la muestra en una estufa. Debido al calor, el xilol se evapora y los espacios anteriormente ocupados por l, son ahora ocupados por la parafina. Despus se coloca la muestra y un poco de parafina fundida en un molde de metal de forma cuadrada o rectangular (Placas de ecklar) y se deja solidificar a temperatura ambiente, formndose un bloque slido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco. Otros medios de inclusin para microscopio ptico son la gelatina y la celoidina. La inclusin para microscopa electrnica, requiere materiales ms resistentes, ya que los cortes son ms delgados y requieren exponerse a un haz de electrones, para su visualizacin. Los medios ms empleados son resinas polimerizadaso epoxi como: el epon, la araldita, el spurr y los metacrilatos.

E.-

Corte:

El bloque slido obtenido en el proceso anterior, es cortado en un aparato llamado micrtomo, el cual utiliza navajas de acero. El grosor del corte en microscopa ptica, oscila entre 3 y 10 m, con un promedio de 5 m; en microscopa electrnica se utiliza un aparato llamado ultramicrtomo, con un grosor de corte de 600 a 1500 . Los cortes deben ser pegados sobre un portaobjetos, utilizando albmina de huevo como pegamento.

F.-

Desparafinado:

Consiste en la eliminacin del medio de inclusin del tejido, mediante un proceso inverso al empleado previo a la inclusin. Los cortes de tejido son inmersos en xilol y luego en alcohol etlico en graduaciones decrecientes, para su posterior tincin.

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G.-

Tincin:

La tincin de los cortes permite visualizar y estudiar las caractersticas del tejido y sus constituyentes celulares, ya que los componentes tisulares presentan distinta afinidad por los colorantes, debido a su variada estructura y composicin fsico-qumica. En la tincin, la clula y sus estructuras se combinan mediante uniones moleculares con el agente colorante activo. Los colorantes son sales solubles en agua y dependiendo del radical libre presente, el colorante a obtener; por ejemplo NaCl, donde el Na+ (catin), corresponde al radical bsico libre y el Cl(anin), corresponde al radical cido libre. Los radicales bsicos, se unen a cidos estructurales (basfilos), por ejemplo ncleo (ADN) y retculo endoplsmico rugoso, ribosomas (ARN) coloracin morado-violeta. Los radicales cidos se unen a elementos bsicos (acidfilos), por ejemplo protenas, citoplasma coloracin rojo-rosada. La tincin de una clula depender de la funcin que esta desarrolle en el organismo. Por ejemplo una clula pancretica, salival o heptica, que posee una actividad secretora importante con abundante retculo endoplsmico rugoso (RER), muestra un citoplasma que se tie de color morado intenso. Las clulas con baja capacidad de secrecin o en reposo, presentan un citoplasma plido o rosado. La Hematoxilina posee coloracin azul-morada y sus radicales son bsicos (colorante bsico). La Eosina en cambio, posee radicales cidos (colorante cido), que confiere a las estructuras afines una tonalidad rojiza- rosada. Otras tinciones utilizadas, permiten visualizar estructuras o componentes ms especficos, por ejemplo la orcena que tie las fibras elsticas de color anaranjado-castao; la impregnacin argntica (sales de plata) permite visualizar la lmina basal y tejido neuronal;

H.- Montaje: Posterior a la tincin, los preparados se cubren con una gota de resina, por ejemplo blsamo de Canad o un sustituto sinttico como Entellan (flotex) y sobre ellos se monta un cubreobjetos, con el fin de proteger la muestra y conservarla por tiempo prolongado.

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ACTIVIDAD PRCTICA 1) UTILIZANDO EL ESQUEMA DEL MICROSCOPIO PTICO (MO)

IDENTIFIQUE LAS PARTES SEALADAS. RECUERDE LA FUNCIN DE CADA PARTE.

Inicio de la observacin previo al uso del microscopio: Comience la observacin con el examen macroscpico de la preparacin (observacin a simple vista). De esta forma obtendr informacin inicial acerca de la muestra: tamao, localizacin en el porta objeto, si es un rgano canalicular o macizo, coloracin predominante, etc. 2) EMPLEO DEL MICROSCOPIO La manipulacin del microscopio, requiere tener presente las siguientes instrucciones bsicas:

I.

Encendido e iluminacin: Antes de enchufar el MO verifique que el encendido est en OFF y la intensidad de la luz est al mnimo.

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Luego enchfelo y encindalo. Y de toda la intensidad de la luz Abra completamente el diafragma. El condensador de luz debe topar la platina. Slo modificaremos su posicin en caso de necesitar dar contraste a nuestra muestra. Colocacin de la preparacin:

II.

Cercirese de que la lente objetiva 4x (lente topogrfica) est en posicin de enfoque y la platina abajo. Verifique siempre que el cubreobjetos de la muestra est hacia arriba. Para ello basta con pasar suavemente la yema de un dedo. Es recomendable que se acostumbre a realizar este procedimiento con cada preparado porque si usted lo coloca invertido, podr observar con los objetivos de 4x y 10x sin inconvenientes (ya que estas lentes hacen foco ms o menos a un centmetro de la preparacin, pero cuando usted pase al objetivo de 40x, el foco ptimo se logra a un milmetro de la preparacin, por lo cual al intentar enfocar correctamente la imagen, corre el riesgo de romper el preparado o daar el lente objetivo (dado que el portaobjeto tiene un grosor superior y la distancia focal queda dentro del mismo vidrio que constituye el portaobjeto).

Coloque la preparacin en el borde anterior de la platina y abra la pinza. Luego deslcela hasta el fondo del carro y ajuste la pinza con suavidad. Utilizando los tornillos coaxiales, centre la muestra, desplazndola hasta que la zona teida quede justo donde la luz atraviesa el orificio de la platina.

III.

Enfoque de la preparacin: Utilice el tornillo macromtrico, para subir la platina hasta el tope. Mire por las lentes oculares. La imagen deber ser borrosa pero es posible apreciar un campo de visin de forma circular. En caso de observar dos campos de visin deber ajustar la distancia entre ambas lentes oculares. Proceda a enfocar su preparacin de la siguiente manera : a) Cierre el ojo izquierdo y observe con el ojo derecho a travs del ocular. Al mismo tiempo baje la platina lentamente utilizando el tornillo macromtrico hasta observar una imagen con nitidez.

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b) Cierre el ojo derecho y observe con el ojo izquierdo, girando el ocular izquierdo hasta que la imagen sea ntida. c) Abra ambos ojos. Debera observar una imagen ntida.

IV.

Estudio de la preparacin: Utilizando la lente objetiva 4x y utilizando los tornillos coaxiales, se puede recorrer la muestra y obtener una visin general de ella. Para observar con mayor aumento, no suba o baje la platina, slo cambie al lente objetivo 10x moviendo el revlver o tambor, de este modo la preparacin quedar enfocada y slo deber mover el tornillo micromtrico para obtener mayor nitidez en la imagen. Para obtener una imagen detallada de algn tejido o estructura se debe centrar la muestra (mover los tornillos coaxiales) en la zona de inters y luego se gira el revlver para cambiar al lente objetivo 40x. Para enfocar slo se puede utilizar el tornillo micromtrico, l que debe ser girado lentamente, primero en un sentido, y, si la imagen no es ntida, nuevamente se gira pero en sentido contrario. Para cambiar de preparacin debe girar el revlver, retrocediendo en orden (10x y luego 4x) hasta la posicin inicial. Luego saque con cuidado la muestra ya observada y coloque la siguiente. Todo esto sin subir o bajar platina. Luego se mira por fuera la muestra, y si no est centrada, se ajusta su posicin moviendo los tornillos coaxiales. Ahora slo queda mover el tornillo micromtrico para dar nitidez y luego continuar el estudio de la muestra cambiando de lentes objetivas.

V.

Finalizacin de la observacin microscpica: Girar el revlver a la posicin inicial y quitar la muestra. Bajar la platina con el tornillo macromtrico. Verificar que el diafragma est abierto y el condensador al tope de la platina Bajar la intensidad de la luz al mnimo y luego apagarlo Desenchufar el cable y enrollarlo. Asegurar la posicin del microscopio en el mesn y dejar limpias las lentes.

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3) OBSERVACION DE LAS MUESTRAS AL MICROSCOPIO

PREPARACIN N 1 a) Material biolgico: b) Objetivo: Piel delgada Observar la organizacin de la piel. Reconocer diferentes tejidos presentes en la piel considerando las caractersticas histolgicas reveladas al emplear una tincin de rutina Indeterminado Hematoxilina y Eosina (H - E)

c) Tipo de corte: d) Tincin:

La imagen A corresponde al preparado de piel que usted est observando al emplear la lente objetiva 4x. Esto significa que usted est viendo la imagen aumentada 40 veces su tamao real. Note que slo por las caractersticas tincionales se pueden reconocer varios tipos de tejido. En su microscopio recorra la muestra e intente encontrar una zona parecida a la observada y luego centre la muestra en la zona indicada con un recuadro y cambie a lente objetiva 10x.

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B
La imagen B corresponde a la zona marcada con un recuadro en la imagen A, observada con lente objetiva 10x. Ahora se reconocen cuatro zonas diferentes, aunque en realidad slo hay tres tipos de tejidos. El tejido 1 corresponde a un epitelio estratificado plano cornificado, el 2 a un tejido conectivo laxo y el 3 a un tejido conectivo denso desordenado. Centre la muestra en el tejido 1, en una zona parecida a la del recuadro y cambie a la lente objetiva 40x. Analice las caractersticas de este tejido en cuanto a su composicin: a) Observe la tincin de sus clulas. Los ncleos se tien de color morado y los citoplasmas ms rosados. Esto se debe a que se emple un colorante morado, llamado hematoxilina; y un colorante rojizo, llamado Eosina. Estudie cul es el fundamento qumico y elctrico de esta reaccin tincional. b) Observe la forma que tienen las clulas. Observe la forma de los ncleos (esfricos, aplanados, etc.) y relacinelos con la forma celular. c) Observe los lmites celulares. En las clulas de ubicacin basal, debido a un efecto artefactual, se puede inferir la forma celular. Esto se debe a que las clulas tienden a separarse durante el empleo de la tcnica histolgica, pero se mantienen unidas por uniones intercelulares en sus caras laterales, observndose una delgada lnea de separacin en los preparados histolgicos. El MO no permite resolver la membrana citoplasmtica por lo que realmente no se pueden observar los lmites celulares. d) Observe la capa superficial del tejido epitelial. Su composicin es de tipo proteica y esto explica sus caractersticas tincionales. Estudie cul es el fundamento de esta aseveracin.

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2 C
La imagen C corresponde a la zona del recuadro de la imagen B. Compare el tejido 1 con el tejido 2 en relacin a: a) Cantidad de clulas. b) Separacin de las clulas c) Tincin de ncleos y citoplasma d) Matriz extracelular. Investigue a qu se deben las caractersticas tincionales en el tejido 2.

PREPARACIN N 2 a) Material biolgico: b) Objetivo: Frotis sanguneo Observar clulas sanguneas. Analizar la forma de sus ncleos, volumen y tincin de su citoplasma, y tamao relativo. No se realiza corte. Es un extendido del material sanguneo, por lo cual las clulas se observan enteras. May Grnwald-Giemsa

c) Tipo de corte: d) Tincin:

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Las imgenes muestran algunos tipos celulares sanguneos: 1 y 4= neutrfilos; 2= plaquetas (son fragmentos celulares); 3= eritrocito con centro plido; 5= eosinfilo; 6= linfocito; 7= eritrocitos en pilas de moneda

1- Recorra la preparacin con menor aumento y dirjase a la zona alejada de la etiqueta, donde observar que las clulas ms numerosas (eritrocitos) se encuentran ms separadas y son de fcil identificacin. Luego cambie a 10x y busque elementos basfilos que corresponden a ncleos celulares. Centre la muestra en alguno de ellos y cambie a 40x. 2-Ahora con el aumento mayor vuelva a recorrer la muestra e intente ubicar las clulas y elementos que aparecen en las imgenes. Fije su campo visual en una zona donde abunden las clulas nucleadas. 3.- En relacin a las clulas nucleadas observadas en su campo visual observe y compare sus diferencias en cuanto a: 1. Relacin volumen ncleo-citoplasma 2. Forma del ncleo 3. Tincin citoplasmtica 4. Tamao relativo (utilice como parmetro mtrico el dimetro de un eritrocito que es de 7 m) 5. Cantidad relativa de cada clula (pocas, muchas, etc.) Actividad: Realice el clculo del aumento final con que observ la muestra.

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TRABAJO PRCTICO N 2
EPITELIOS DE REVESTIMIENTO Objetivos a) Reconocer diferentes tipos de epitelios de revestimiento de acuerdo a su organizacin b) Relacionar estructura y funcin de los diferentes epitelios de revestimiento y aprender a clasificar los distintos tipos de acuerdo al nmero de capas, formas celulares y especializaciones apicales.

PREPARACIN N 1 a) Material biolgico: b) Objetivo: c) Tipo de corte: d) Tincin: Glndula Partida Observar epitelio simple plano, epitelio simple cbico y epitelio estratificado cbico. Indeterminado HyE

Observando a simple vista el tejido podemos identificar que se trata de un rgano macizo. Al observar con aumento topogrfico (4X) y recorrer la lmina, llama la atencin de la presencia de distintos tejidos de diferentes coloraciones. Comenzaremos centrndonos en el sector que posee coloracin ms basfila y ocupa gran parte de la muestra. La misma comprende una glndula exocrina que se encuentra subdividida en lbulos y lobulillos por tabiques de tejido conectivo. En ella analizaremos distintos tipos de epitelios de revestimiento. Al colocar ms aumento (10X), observaremos que inmersos en la glndula y en los tabiques de tejido conectivo se reconocen conductos de excrecin de distintos tamaos. Los ms pequeos corresponden a cortes transversales u algo oblicuos, en los que es posible observar un lumen central. Colocar el mayor aumento (40X) y reconocer como est constituido el revestimiento de estos conductos, el mismo esta formado por un epitelio simple cbico. Sus clulas se encuentran dispuestas en una sola capa con los ncleos redondeados y un citoplasma amplio en la zona apical celular. Si nos dirigimos hacia los tabique de tejido conectivo que limitan los lbulos, encontraremos conductos de mayor tamao, muchos de los cuales presentan un revestimiento epitelial cbico estratificado (poseen por lo menos 2 capas de clulas cbicas). Ahora dirjase a las zonas que rodean la glndula recin observada, en los sectores de tejido

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conectivo es posible encontrar estructuras vasculares grandes. Ellas se identifican porque poseen un lumen grande central y la pared de estas estructuras es de coloracin eosinfila bastante homognea. En esta estructura observaremos el tejido que reviste la superficie luminal. Observe con mximo aumento y compruebe que a ese nivel se reconoce un tejido epitelial simple plano, es decir se observan clulas con ncleo basfilo aplanado y paralelo a la superficie (el citoplasma de stas clulas es prcticamente imperceptible). Ms adelante aprenderemos que siempre el revestimiento interno o luminal de todas las estructuras vasculares esta constituido por un epitelio simple plano. Contine recorriendo la muestra e intente identificar los distintos tipos de epitelios mencionados que aparecen a lo largo de la muestra. Actividad: Realice un esquema a 40X, que incluya los tres tipos de epitelios analizados. Puede observarlos cada uno por separado pero colocarlos en el mismo esquema uno la lado del otro.

PREPARACIN N 2 a) Material biolgicos: b) Objetivo: c) Tipo de Corte: d) Tincin: Trquea Observar el epitelio seudoestratificado cilndrico ciliado con clulas caliciformes. Transversal Hematoxilina y Eosina (H - E)

1.- Antes de colocar la muestra sobre la platina obsrvela a simple vista. Se trata de un rgano tubular de lumen (luz) amplio y de forma regular. Luego colquela sobre la platina, recrrala con aumento menor y cntrela en el tejido que reviste la superficie interna (lumen). Tome la precaucin de dejar la superficie hacia la parte superior de su campo visual. 2.- Con aumento mayor observe en detalle las caractersticas de este epitelio. Distinga diversos tipos celulares (fjese en la forma y ubicacin de los ncleos). Observe el abundante citoplasma apical y la presencia de cilios en las clulas cilndricas. Intente reconocer las clulas caliciformes (cromfobas). Observe la disposicin paralela de la membrana basal en relacin a la superficie epitelial. Observe las caractersticas del tejido conectivo laxo de ubicacin subyacente al epitelio. 3.- Bajo el epitelio de revestimiento, rodeados por tejido conectivo laxo, se encuentran estructuras tubulares con epitelio simple cbico (glndulas traqueales) y estructuras tubulares con epitelio simple plano (vasos sanguneos) Actividad: Realice un esquema a 40X que represente el tejido de revestimiento analizado en esta muestra y el tejido conectivo subyacente marcando las diferencias entre ambos tejidos. Rotule todo lo esquematizado.

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PREPARACION N 3 a) Material biolgico: b) Objetivo: c) Tipo de corte: d) Tincin: Raz lingual Observar el epitelio estratificado plano no cornificado. Transversal (en el sector posterior) Hematoxilina y Eosina (H-E)

Cuando se analiza la muestra a simple vista y sobre un fondo blanco se observa que una de las superficies aparece remarcada y de coloracin ms fuerte. Esta superficie debe quedar hacia nosotros cuando la coloquemos sobre la platina, de forma que al mirar al microscopio, aparezca hacia arriba. Al recorrer la muestra con el aumento topogrfico (4X) se observar que la zona superficial consta de una epitelio de revestimiento (ms marcado) y una zona por debajo del epitelio, llamada corion (as se llama en la distintas porciones del sector digestivo) y que es ms plida que el revestimiento. Esta zona de la superficie es irregular y presenta sobre elevaciones llamadas papilas que presentan un eje de corion revestido por epitelio. Observe con atencin el epitelio de revestimiento y coloque ms aumento en alguna regin para identificar que se trata de un epitelio estratificado plano no cornificado. Si bien es difcil determinar los lmites entre las clulas, podemos guiarnos por la forma de los ncleos para diferenciar las distintas capas que lo constituyen. 123zona basal: es la capa ms profunda y cercana al corion subyacente. Las clulas presentan ncleos alargados, de orientacin perpendicular a la lmina basal. Son clulas columnares en una o dos capas generalmente. zona media: localizada por encima de la anterior, formada por varias capas de clulas polidricas con ncleos redondos. Zona superficial: aparecen varias capas de clulas con ncleos alargados, cuyo eje mayor es paralelo a la superficie, (clulas aplanadas o pavimentosas), tanto ms aplanadas cuanto ms superficiales.

El corion que se encuentra por debajo del epitelio de revestimiento, est constituido por un tejido conectivo bastante denso (en las reas de la lengua cubiertas por epitelio cornificado, este conectivo es ms denso an). Por debajo del corion se reconocen variados tejidos. Entre el tejido conectivo se observa tejido adiposo blanco, haces de fibras musculares estriadas esquelticas distribuidas en distintas direcciones, glndulas, as como numerosas estructuras vasculares y nerviosas, que analizaremos en otros prcticos. Actividad: Realice un esquema a 40X .Represente el epitelio de revestimiento de la lengua e incluya un pequeo sector de corion subyacente remarcado las diferencias en cantidad, tipos de clulas y coloracin de los tejidos.

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TRABAJO PRCTICO N 3
EPITELIOS GLANDULARES Objetivos: a) Definir el concepto de epitelio glandular. Reconocer distintos tipos glandulares y las diferentes formas de clasificarlas. b) Relacionar el tipo de glndula con la funcin que desempea

PREPARACION N 1 a) Material biolgico: b) Objetivo: Labio de conejo Estudiar la organizacin de la piel. Observar y clasificar su epitelio de revestimiento y las glndulas exocrinas; sudorparas y sebceas, ubicadas en la dermis de la piel del labio. Sagital Hematoxilina y Eosina (H E).

c) Tipo de corte: d) Tincin:

1.- Con menor aumento recorra la muestra y ubique la piel del labio (cercirese de que la capa superficial o epidermis, quede hacia arriba en su campo visual). Cambie al mayor aumento y, observe, analice y clasifique al epitelio que constituye esta capa. Luego centre la muestra en la capa media de la piel, llamada dermis y cambie a aumento medio. 2.- Observe el abundante tejido conectivo presente en esta capa. Luego ubique folculos pilosos (fcil de reconocer por sus caractersticas epiteliales similares a la epidermis). Asociada a los folculos pilosos se encuentran las glndulas sebceas, que se reconocen por su aspecto plido y formas redondeadas de sus porciones secretoras. Centre la muestra en algn adenmero y cambie al aumento mayor. Observe que el epitelio basal es simple cbico bajo y sus clulas presentan ncleos intensamente basfilos. Observe la secrecin de tipo celular que se encuentra dentro del adenmero; los citoplasmas son plidos debido a su contenido lipdico. 3.- Vuelva al aumento medio y en zonas ms profundas ubique cortes transversales de estructuras tubulares, que corresponden a glndulas sudorparas. En este caso se trata generalmente de una sola glndula, cuya porcin secretora ha sido cortada varias veces, debido a que se dispone de forma enrollada. Observe su epitelio de tipo simple cbico alto, su lumen pequeo y la ausencia de secrecin en su interior. 4.- El tejido conectivo en el que se encuentran inmersas las glndulas sebceas y sudorparas es de tipo denso desordenado. Actividad: Realice un esquema a 40X de cada una de las estructuras glandulares analizadas. Pueden localizarse en el mismo esquema aunque no se hayan reconocido en el mismo campo

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microscpico. Rotule todo lo esquematizado.

PREPARACION N 2 a) Material biolgico: b) Objetivo: c) Tipo de corte: d) Tincin: Glndula sublingual Estudiar un tipo de glndula exocrina que se clasifica por el tipo de secrecin en mixta, mucosa y serosa Indeterminado Hematoxilina y Eosina (H E)

En la observacin a simple vista se trata de un rgano parenquimatoso. Con aumento topogrfico (4X) observe que el mismo, est rodeado de una cpsula de tejido conectivo que se contina hacia el interior constituyendo tabiques que subdividen rgano en lbulos y lobulillos. Coloque mayor aumento en alguno de estos lobulillos y observe la presencia de adenmeros o acinos glandulares. stos estn compuestos de grupos de 4 a 6 clulas que conforman una estructura ms o menos redondeada. Cada clula posee una base dispuesta hacia la periferia y una zona ms estrecha dispuesta hacia el lumen (en el centro del grupo de clulas). Poseen citoplasma espumoso y claro, el ncleo es aplanado y localizado cercano a la base de la clula. Comprenden a acinos de tipo mucoso. Observe que en gran parte de estos adenmeros se observan grupos de clulas que se superponen sobre un sector del acino mucoso y describen forma de media luna. Estas ltimas constituyen clulas de tipo seroso, que presentan citoplasma intensamente coloreado y ncleos reondeados. Estas clulas tambin vierten su producto de secrecin hacia el lumen del mismo adenmero, comprenden a acinos de tipo mixtos sero-mucosos. Observe adems que cada uno de los acinos est rodeado por clulas de ncleos aplanados que comprenden a clulas mioepiteliales. Reconozca adems los componentes del sistema de conductos excretores (ya que estamos en presencia de una glndula exocrina). Los ms pequeos, en corte transversal, son similares en

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tamao a los adenmeros (ductos intralobulillares). Estn constituidos por un epitelio simple cbico, con clulas de citoplasma acidfilo y ncleo redondeado. Otros conductos estn localizados en el espesor de los tabiques de tejido conectivo (ductos interlobulillares e interlobulares). El epitelio de dichos conductos vara de acuerdo al tamao: los ms pequeos presentan un epitelio cbico biestratificado (dos capas) y los mayores presentan epitelio cbico estratificado pero con 3 o ms hileras de clulas (siendo las superficiales siempre de forma cbica). Actividad: realice un esquema, a 40 X, de: 1- un adenmero mixto, 2- un conducto pequeo intralobulillar y 3- un conducto interlobulillar o interlobular. Rotule todo lo esquematizado.

PREPARACIN N 3 a) Material biolgico: b) Objetivo: Glndula sublingual Estudiar un tipo de glndula que se clasifica por el tipo de secrecin en mixta, mucosa y serosa con una tcnica que pone de relieve la presencia de secrecin de tipo mucosa Indeterminado Hematoxilna- Eosina - Alcian Blue

c) Tipo de corte: d) Tincin:

Identifique la misma glndula analizada en la muestra anterior. Localice el parnquima de la glndula reconociendo los adenmeros mucosos que aqu destacan redondeados y de coloracin celeste fuerte. Busque y analice un adenmero de tipo mixto (una acino de coloracin celeste con una medialuna de clulas de ncleos redondeados y citoplasma eosinfilo). Cul es la explicacin de las diferentes coloraciones del citoplasma de estas clulas? Reconozca tambin distintos tipos de conductos, por qu poseen material de coloracin celeste en su interior? En uno de los extremos de la muestra aparecen varias estructuras con una cavidad, de contenido celeste, a qu pueden corresponder? Y cmo est constituido el epitelio que los reviste? Actividad: buscar un adenmero mixto con esta coloracin y realizar un esquema a 40X. Rotule

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