BIOLOGIA MOLECULAR

Extraccion de ADN En PCR, el acido desoxirribonucleico (ADN) es el analito. Por tanto, una buena muestra implica siempre un correcto proceso de obtencin de esta molcula a partir de material biolgico. El concepto b sico de la extraccin del ADN se puede di!idir en cinco pasos ("a!ala, #$$%)& '. Ruptura de las clulas& Es casi !irtualmente posible obtener ADN de todas las clulas (ue se conocen, inicialmente tendr (ue adaptarse a las necesidades ) *acilidades para escoger los mtodos de lisis celular. Entre los m s utili+ados est n& a. Detergentes& entre los (ue se encuentran el laur)l sul*ato (,ar-os)l) utili+ado .asta el $.%/ de concentracin *inal. El uso de detergentes es 0til para extraer ADN especialmente de par sitos, clulas en culti!o ) te1ido. ("a!ala, #$$%) b. En+imas& cuando se trata de extraccin de ADN (total o pl smidos) en bacterias, se utili+a la lisosima (ue es una en+ima (ue se encuentra en !arias secreciones del cuerpo .umano como l grimas ) moco, ) en la clara del .ue!o. Act0a desestabili+ando la pared celular bacteriana (bacterias 2ram negati!as) cuando rompe las uniones glucos3dicas entre los polisac ridos N4acetil4glucosamina (NA2) ) cido N4acetilmur mico (NA5). ("a!ala, #$$%)

#. Eliminacin de prote3nas& Para eliminar las prote3nas se utili+an en+imas proteol3ticas, como la pronasa, la cual es acti!a contra un amplio espectro de prote3nas naturales. 6a pronasa de debe autodigerir a 789C por lo menos una .ora antes de utili+arla, )a (ue suele contener contaminantes entre lso (ue se pueden encontrar nucleasas. :na !e+ .ec.a la digestin pre!ia se puede utili+ar a temperaturas de 78 a %$9C a una concentracin de $,% a ' mg;ml de reaccin para degradar las prote3nas de la muestra. :na alternati!a es la Proteinasa <, la cual tiene la !enta1a de no necesitar la autodigestin, pero la des!enta1a de ser m s costosa. 6a proteinasa < traba1a a 789C a una concentracin de $,% mg;ml. ("a!ala, #$$%) 7. Eliminacin del ARN& :na !e+ concluida la digestin con las proteasas, se reali+a una digestin con una RNasa para eliminar en su totalidad la presencia de ARN. 6a RNasa se utili+a a una concentracin de '$$ mg;ml a una temperatura de %$9C (aun(ue la ma)or3a de los manuales indican una incubacin con RNasa a 789C, se .a comprbado (ue es mas e*ecti!a la incubacin a %$9C por una .ora). ,e recomienda reali+aruna nue!a

incubacin con pronasa (o proteinasa <) para eliminar la RNasa antes de pasar a la extraccin con *enol. ("a!ala, #$$%)

=. Extraccion de prote3nas& 6a eliminacin de las prote3nas de la muestra se termina utili+ando sol!entes org nicos como el *enol. El *enol utili+ado en la extraccin de las prote3nas debe ser bidestilado o ultrapuro, ) se utili+a en una relacin '&' !ol0men por !olumen con la muestra (ue se pretende limpiar. 2eneralmente se recomienda reali+ar una extraccin con *enol, seguida de una extraccin de *enol& cloro*ormo ('&') ) por 0ltimo una 0ltima extraccin con cloro*ormo para limpiar toda tra+a de *enol. ("a!ala, #$$%) %. Precipitacin del ADN Para poder concentrar el ADN despus de la eliminacin de las prote3nas se utili+an una serie de sales entre las (ue se encuentran el acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio, ) cloruro de litio entre las m s usadas. :na !e+ (ue el ADN .a estado en contacto con los cationes seleccionados se precipita con # !ol0menes de etanol absoluto o ' !ol0men de isopropanol ba1o las siguientes condiciones ("a!ala, #$$%)& 5 s de dos .oras a 4#$9C De '% a 7$ minutos a 48$9C De '$ a '% minutos en .ielo seco con etanol

,e recomienda precipitar con etanol por ser m s !ol til ) se puede eliminar de la muestra m s * cilmente, con una incubacin a 4#$9C cuando la muestra es mu) escasa o el ADN es mu) pe(ue>o. Despus la muestra se centri*uga ) se resuspende en el amortiguador elegido para ser cuanti*icado. ("a!ala, #$$%) Protocolo de extraccin de ADN Considerando los enunciados anteriores, todas las tcnicas de extraccin de ADN son precidas, ) 0nicamente deben ser adaptadas a las condiciones re(ueridas en el an lisis. ("a!ala, #$$%) '. Recolectar los microorganismos por centri*ugacin a %$$x durante '$ minutos a una temperatura de =9C (para aproximadamente %x'$ '' clulas). Decantar el sobrenadante ) obtener una pastilla. #. Remo!er sua!emente la pastilla utili+ando una !arilla de cristal pre!iamente libre de ARNasa, para lo cual dic.a !arilla se pasa ligeramente al mec.ero ) se deposita en un tubo de ensa)o libre (es una !arilla por cada muestra).

7. 6a!ar la pastilla obtenida dos !eces con % ml de ,,C (Citrato de ,odio salino (amortiguador)) '?, centri*ugando cada !e+ a %$$x durante '$ minutos ) resuspendiendo la 0ltima pastilla en ' ml de ,E *r3o. =. Adicionar ,ar-os)l para una cocnentracin *inal de $.%/ ) %$$ mg;ml de Pronasa (pre!iamente incubada a 789C por una .ora), e incubar una .ora a %$9C a ba>o 5ar3a. %. Adicionar '$$@g;ml de ARNasa A e incubar una .ora a %$9C a ba>o 5ar3a. A. Adicionar nue!amente %$$@g;ml de Pronasa e incubar 7$ minutos a %$9C 8. A>adir # ml de *enol e(uilibrado en Bris $.'5 pC D.# (solucin amortiguadora) ) agitar sua!emente sobre .ielo .asta emulsi*icar bien la muestra ) luego centri*ugar a E$$$x durante '$ minutos. E. Extraer sua!emente con pipeta la *ase acuosa donde se encuentra el ADN, de1ando las prote3nas (es la capa balnca (ue se obser!a). D. Repetir el proceso con& ' !olumen de *enol;cloro*ormo '&' (' !e+), ) un !olumen de cloro*ormo. 6os !ol0menes utili+ados para las extracciones son iguales a los !ol0menes del sobrenadante obtenido en cada extraccin. '$. Brans*erir el 0ltimo sobrenadante a tubos eppendor* ) precipitar con 6iCl (Cloruro de 6itio) $.E5 (de acuerdo con el !olumen obtenido) ) dos !ol0menes de alco.ol absoluto (etanol DD/) por dos .oras a 4#$9C. ''. Centri*ugar a '=.$$$ rpm en microcentr3*uga eppendor* por '$ minutos ) resuspender la pastilla en '$$ml de agua desioni+ada con $.$% m5 de EDBA. Recientemente .a salido al mercado una gran !ariedad de -is para aislar ADN de di*erentes or3genes, teniendo el com0n denominador de utili+ar el agente caotrpico isotiocianato de guanidina, el cual in.ibe la acti!idad en+im tica incluso de la ARNasa por lo (ue los .ace de muc.a utilidad cuando se re(uiere aislar ARN. ("a!ala, #$$%) Secuenciacion de ADN 6a tcnica m s utili+ada en laboratorios de microbiolog3a para la determinacin de la secuenciacin del ADN de una muestra en la reaccin en cadena de la polimerasa (RCP por sus siglas). 6a reaccin en cadena de la polimerasa *ue desarrollada por <ar) 5ullis en los a>os oc.enta. Al igual (ue la tcnica de secuenciacin del cido desoxirribonucleico (ADN), la RCP .a re!olucionado la gentica molecular, .aciendo posible el estudio ) an lisis de una amplia gama de genes, (ue incluso pueden obtenerse a partir de un genoma comple1o, como es el de los mam3*eros donde pueden existir alrededor de cien mil genes. (Borres F Gaca, 'DD%) 5uc.as de las tcnicas en gentica molecular son mu) costosas ) laboriosas. 6a ma)or3a de ellas tiene (ue !er con la clonacin ) los mtodos (ue est n dise>ados para detectar

secuencias especi*icar de ADN. En cambio, la tcnica de RCP permite producir un enrome n0mero de copias de una secuencia de ADN espec3*ica (ampli*icarla) sin recurrir a la clonacin. (Borres F Gaca, 'DD%)

La reaccin en cadena de la polimera a El mtodo se basa en las caracter3sticas de la estructura (u3mica del ADN ) su replicacin semiconser!ati!a. Es decir, de acuerdo con el modelo de Hatson ) Cric-, el ADN es un pol3mero *ormado por dos cadenas complementarias (cadenas antiparalelas), constituido por unidades de desoxirribonucletidos de cuatro bases nitrogenadas adenina, guanina, citosina ) timina unidas al a+0car desoxirribosa. (Borres F Gaca, 'DD%) 6a parte (ue no !ar3a en la molcula del ADN consiste en desoxirribosas unidas por grupos *os*ato. Espec3*icamente el .idroxilo 7I del a+0car de un desoxirribonucletido se une al .idroxilo %I del siguiente a+0car a tra!s del puente *os*odister. Para duplicarse, el ADN se separa en sus dos cadenas complementariasJ asi, cada una de ellas sir!e de molde o plantilla. Al *inal del proceso se obtendr n dos molculas de ADN, cada una de ellas *ormada por una cadena original ) una cadena complementaria (ue .a sido sinteti+ada Kde no!oL. 6a en+ima (ue reail+a este proceso se denomina ADN polimerasa. Esta en+ima a>ade los nucletidos en el .idroxilo 7I terminal de la cadena de ADN paterna. En otras palabras, se re(uiere una cadena con un grupo 7I MC disponible, el cual es el iniciador, para *ormar el enlace co!alente *os*odister 7I4%I. 6a reaccin de alargamiento, catali+ada por la ADN polimerasa, consiste en un ata(ue nucleo*ilico del atomo de *os*oro del desoxirribonucletido (dNBP) al 7I MC del iniciador, para *ormar la unin co!alente *os*odister. (Borres F Gaca, 'DD%)

Estructura de la cadena de ADN (Borres F Gaca, 'DD%)

El aspecto m s importante de la doble .lice de ADN es la especi*icidad de apareamiento de las bases del modelo de Hatson ) Cric-, (uieres dedu1eron (ue la adenina debe aparearse con la timina, ) la guanina con la citosina, debido a las uniones .idrgeno (ue se establecen entre las bases ) a la restriccin estrica (ue se produce. 6as dos cadenas de ADN se separan * cilmente cuando las uniones .idrgeno de las bases se rompen. Esto se reali+a cuando una solucin de ADN es calentada entre 88 ) '$$9C. 6as bases complementarias se reasocian espont neamente para *ormar la doble .lice cuando la temperatura desciende. Este proceso de renaturali+acion se denomina alineamiento. 6a *acilidad con la cual la dobel .lice puede separarse ) reasociarse es crucial para las *unciones biolgicas del ADN. (Borres F Gaca, 'DD%) El mtodo RCP emplea ciclos repetidos de s3ntesis in vitro del ADN dirigida por un oligonucletido iniciador. 6as secuencias de los oligonucletidos iniciadores se determina en base a una parte conocida de la secuencia del ADN molde, )a (ue deben ser complementarias a cada una de las cadenas del ADN, de1ando libres los lados opuestos para poder ser ampli*icados. Dic.os oligonucletidos sir!en como iniciadores para la s3ntesis in vitro del ADN, la cual es catali+ada por la en+ima ADN polimerasa, ) ellos tambin determinan los extremos del *ragmento del ADN *inal (ue se obtiene. (Borres F Gaca, 'DD%) 6a distancia entre los oligonucletidos iniciadores es determianda emp3ricamente ) depende de muc.os *actores. 6a longitud entre los oligonucletidos iniciadores para ensa)os de diagnstico puede ser entre %$ ) '.%$$ bases de nucletidos. G sicamente, cada ciclo de RCP consiste en tres etapas (Borres F Gaca, 'DD%)& N) En la primera etapa el ADN molde es incubado a alta temperatura (D#4DE9C, de 7$4 D$ segundos), para separar las cadenas complementarias, desnaturali+acin del ADN ) as3 .acerlas accesibles al apareamiento con el iniciador especi*ico NN) 6a etapa de alineamiento, en la cual la me+cla de reaccin es en*riada para permitir (ue los oligonucletidos iniciadores se alineen o .ibriden las secuencias complementarias del ADN blanco. NNN) 6a reaccin de extensin, generalmente lle!ada a cabo a una temperatura intermedia, en la cual la ADN polimerasa copia el ADN entre las secuencias correspondientes a los oligonucletidos iniciadores. El ciclo de la RCP. 6a muestra de ADN es calentada para separar las .ebras de ADN (desnaturali+acin inicial), ) entonces la me+cla de reaccin reali+a ciclos repetiti!os (ue inclu)en el alineamiento con los iniciadores, s3ntesis del ADN. (Borres F Gaca, 'DD%)

Estas tres etapas de la reaccin constitu)en un ciclo trmico. :n protocolo t3pico de la RCP inclu)e de 7$ a %$ ciclos. Cuando cada ciclo trmico se completa, los *ragmentos recientemente sinteti+ados sir!en como ADN blanco, ) en unos pocos ciclos m s, el producto predominante ser3a una 0nica clase de *ragmento de ADN cu)a longitud corresponde a la distancia enter los oligonucletidos iniciadores. Asi, la repeticin del ciclo origina una acumulacin geomtrica de las secuencias ampli*icadas. (Borres F Gaca, 'DD%)

Reaccin en cadena de la polimerasa. En la *igura se muestran los pasos de la RCP, as3 como la ampli*icacin resultante de la copias de ADN de la regin blanco (Borres F Gaca, 'DD%)

Lo componente de la reaccin '. 6a ADN polimerasa& inicialmente se emple la ADN polimerasa de Escherichia coli, como en+ima polimeri+adora, pero debido a su inestabilidad trmica era necesario agregarla en cada ciclo, .aciendo mu) costosa la prueba. Bomando en cuenta la serie de problemas tcnicos (ue se presentaban al usar en+imas (ue perd3an su acti!idad por las altas temperaturas, se puri*ic una en+ima termoestable a partir de bacterias Thermus aquaticus, (ue actualmente se conoce como Ba( ADN polimerasa. Esta en+ima tiene un peso molecular cercano a los D7,D'$ Da ) su temperatura ptima, en (ue se obser!a su acti!idad m xima, es entre 8% ) E$9CJ su tasa de incorporacin de nucletidos, <cat, es de unos '%$ nucletidos;seg;en+ima. (Borres F Gaca, 'DD%) #. El ADN molde& la concentracin de ADN molde en la reaccin depende de la *uente utili+ada, e idealmente se re(uieren aproximadamente de 7$$ nanogramos a ' microgramo de ADN genmico. En el caso de usarse genes clonados en

pl smidos, de #% a '$$ nanogramos de su ADN son m s (ue su*icientes. (Borres F Gaca, 'DD%) 7. 6os oligonucletidos sintticos iniciadores& se deben seleccionar dos oligonucletidos, (ue .ibriden con rgiones del ADN molde ) (ue estn locali+ados en los extremos de la regin de inters. 6a longitud de los oligonucletidos es de '% a 7$ nucletidos ) su secuencia debe presentar la ma)or similitud posible con la secuencia del ADN blanco, )a (ue de ello depende el xito ) la especi*icidad de la ampli*icacin. ,e recomienda (ue la complementariedad entre el oligonucletido ) la secuencia molde sea cercana al '$$/, en las 0ltimas % a A bases del extremo 7I del oligonucletido, para asegurar la ampli*icacin. ,e debe e!itar la complementariedad entre los dos oligonucletidos, para (ue no se *ormen d3meros o concaten meros, adem s de e!itar oligonucletidos (ue *a!ore+can la *ormacin de estructuras secundarias (ue inter*ieren con el alineamiento correcto. Ndealmente, en cada '$$ @l de reaccin, la concentracin aceptable de cada oligonucletido oscila entre $.$% ) '.$ @5. (Borres F Gaca, 'DD%) =. 6os desoxirribonucletidos de tri*os*ato, dNBPIs& 6as cocnentraciones m3nimas de dNBPIs disminu)en el 3ndice de incorporacin errnea de los nucletidos, mientras (ue concentraciones mu) altas disminu)en la especi*icidad de la reaccin, por lo (ue la concentracin debe optimi+arse. Concentraciones entre #$ ) #$$ @5 proporcionan resultados ptimos, debindose igualar la concentracin de cada uno de los cuatro dNBPIs en concentraciones e(uimolares. (Borres F Gaca, 'DD%) Contaminacin de la reaccione de RCP Debido a (ue el RCP puede generar trillones de copias de ADN de la secuencia molde, al contaminacin con productos de una reaccin pre!ia, )a sea con ADN exgeno o con otro material celular, puede crear problemas tanto en la in!estigacin como en la aplicacin diagnstica. En general, la atencin debe ser mu) cuidadosa en el procedimiento del laboratorioJ tan es as3, (ue la +ona de preparacin de la reaccin debe estar separada del rea de an lisis del producto de la reaccin ), de esta *orma, se minimi+ar el riesgo de contaminacin. Adem s, se debe tener a la mano un sinn0mero de controles negati!os para monitorear ) re!elar los contaminantes. ,e debe pre!enir la *ormacin de aerosoles e incluir tambin un testigo positi!o, particularmente en el caso de reacciones con *ines diagnsticos. (Borres F Gaca, 'DD%) An!li i del producto de una RCP Despus de la ampli*icacin, al *inali+ar la reaccin, el ADN de inters puede ser colocado en un gel de agarosa (menos de la dcima parte del !olumen obtenido), reali+ar el corrimiento electro*ortico, te>irlo ) obser!ar en lu+ ultra!ioleta el producto de la RCP. El an lisis *ino ) la caracteri+acin se reali+an empleando metodolog3as adecuadas para cada caso en particular como es el an lisis electro*ortico en geles de poliacrilamida, digestiones con en+imas de restriccin, .ibridacin con detectores

espec3*icos (genes clonados) o secuenciacin nucleot3dica, por mencionar solo algunas. (Borres F Gaca, 'DD%) Aplicacione de la RCP Clonacin& En el campo de la biolog3a molecular, el RCP se utili+a para la clonacin molecular de genes ) su secuenciacin nucleot3dica. El RCP *a!orece la clonacin se se incorporan regiones de restriccin (sitios espec3*icos donde las en+imas endonucleasas de restriccin, cortan espec3*icamente el ADN), en los extremos %I, cuando se sintetian los oligonucletidos, de tal manera (ue es posible clonar los *ragmentos (ue se ampli*i(uen al apro!ec.ar estos sitios de restriccin del !ector. (Borres F Gaca, 'DD%) An lisis ) cuanti*icacin de la expresin gentica, basado en el estudio de la cantidad de ARN mensa1ero (ARNm). En estos casos se re(uiere de la s3ntesis de un ADN copia (ADNc), a partir del ARN muestra, por medio de la en+ima transcriptasa re!ersa (en+ima replicasa !iral (ue sinteti+a ADN a partir del ARNm). Este ADNc se utili+a como molde para ampli*icar los oligonucletidos adecuados. (Borres F Gaca, 'DD%) Diagnstico cl3nico. En este campo, la RCP se usa en la gentica mdica para el diagnstico de en*ermedades .ereditarias ) de algunas cromosomopat3as comunesJ en el campo de la inmunolog3a se emplea para determinar asociaciones entre el comple1o ma)or de .istocompatibilidad ) la predisposicin gentica para el desarrollo de en*ermedades autoinmunesJ en el campo de la oncolog3a, para probar mutaciones acti!adoras de oncogenes o supresoras de antioncogenes, para detectar arreglos cromosmicos presetnes en procesos neopl sicos ) para la deteccin de !irus ) de las secuencia oncognicas. (Borres F Gaca, 'DD%) 6a ampli*icacin por RCP tambin permite la deteccin de ADN de poco menos de '$$ clulas por '$$ gramos de muestra, ) es usado en la ingenier3a gentica de microorganismos ) el monitoreo de poblaciones indicadoras ) patgenas en suelo, agua ) sedimentos. El producto de la RCP puede ser cuanti*icado, permitiendo la estimacin de microorganismos ) de ARNm espec3*ico en muestras del medio ambiente. Mtro uso es la medicin de la expresin gentica de los microorganismos !iables. 6a RCP es usada para clonar genes, permitiendo la secuenciacin de los mismos aun de a(uellos microorganismos ambientales importantes (ue toda!3a no .an podido ser culti!ados. (Borres F Gaca, 'DD%) En nuestro caso en particular, se aisl la secuencia de la bacteria Pseudomona putida, exactamente del gen Citocromo P4=%$, un gen presente en muc.os procariotas ) eucariotas, en!uelto en una pltora de biotrans*ormaciones, como el procesamiento de .ormonas esteroides, acti!acin carcingena, desintoxicacin ) solubili+acin de xenobiticos lipi*ilicos ) numerosas rutas catablicas peri*ricas (:nger, 2unsalus, F ,ligar, 'DEA). Est encargado de la .idroxilacin estereoespeci*ica del metileno del alcan*or como el primer paso en el catabolismo de compuestos como el 0nico recurso de

carbono. Desde (ue el citicromo P4=%$ es una en+ima soluble obtenible en cantidades relati!amente altas ) de alta pure+a, .a sido extensi!amente usado como modelo para in!estigar los mecanismos (u3micos ) bio*3sicos para la cat lisis dependiente de P4=%$. Esta es la secuencia (:nger, 2unsalus, F ,ligar, 'DEA)&

6a completa secuencia nucleot3dica del gen citocromo P4 =%$ ) una porcin %I del gen putidaredoxin reductasa. (:nger, 2unsalus, F ,ligar, 'DEA)

GNG6NM2RAONA

Borres, A., F Gaca, E. ('DD%). Reaccin en cadena de la polimerasa. Elementos, Ciencia y Cultura No. 23 , 'A4#'. :nger, G., 2unsalus, N., F ,ligar, ,. ('DEA). Nucleotid ,e(uence o* t.e Pseudomonas putida C)tocrome P4=%$cam gene and its expression in Esc.eric.ia coli. The Journal of Biolo ical Chemistry , ''%E4''A7. "a!ala, P. E. (#$$%). 5anual de Bcnicas G sicas de Giolog3a 5olecular, Qolumen 8. En P. E. "a!ala, !anual de T"cnicas B#sicas de Biolo $a !olecular, %olumen & (p gs. 7'47%). Rucat n & Ediciones de la :ni!ersidad Autnoma de Rucat n.