Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Ps-Graduao em Engenharia Ambiental Mestrado em Engenharia Ambiental

OTIMIZAO E VALIDAO DE EXTRAO LQUIDO-LQUIDO COM PARTIO EM BAIXA TEMPERATURA DE MICROCONTAMINANTES ORGNICOS EM AMOSTRAS DE ESGOTO E ANLISE POR CG-EM

Brbara Diniz Lima

Ouro Preto, MG 2013

Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Ps-Graduao em Engenharia Ambiental Mestrado em Engenharia Ambiental

Brbara Diniz Lima

OTIMIZAO E VALIDAO DE EXTRAO LQUIDO-LQUIDO COM PARTIO EM BAIXA TEMPERATURA DE MICROCONTAMINANTES ORGNICOS EM AMOSTRAS DE ESGOTO E ANLISE POR CG-EM

Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Engenharia Ambiental,

Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos necessrios para a obteno do ttulo de Mestre em Engenharia Ambiental. rea de Concentrao: Meio Ambiente Orientador: Prof. Dr. Robson Jos de Cssia Franco Afonso

Ouro Preto, MG Abril de 2013

L732o

Lima, Brbara Diniz. Otimizao e validao de extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura de microcontaminantes orgnicos em amostras de esgoto e anlise por CG-EM [manuscrito] / Brbara Diniz Lima. 2013. 104 f. : il. color.; tabs. Orientador: Prof. Dr. Robson Jos de Cssia Franco Afonso. Dissertao (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Cincias Exatas e Biolgicas. Ncleo de Pesquisas e Ps-Graduao em Recursos Hdricos. Programa de Ps-Graduao em Engenharia Ambiental. rea de concentrao: Meio Ambiente. 1. Microcontaminantes orgnicos - Teses. 2. Esgotos - Teses. 3. Extrao (Qumica) - Teses. 4. Derivatizao - Teses. 5. Cromatografia gasosa - Teses. 6. Espectrometria de massa - Teses. I. Afonso, Robson Jos de Cssia Franco. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Ttulo. CDU: 628.35:66.061.35

Catalogao: sisbin@sisbin.ufop.br

AGRADECIMENTOS Agradeo primeiramente a Deus por estar sempre me guiando e me propiciando graas. Aos meus pais, Vera e Jos Geraldo e meu irmos Gustavo e Caio, por terem abraado esse sonho comigo e me auxiliado em todos os momentos sendo sempre o meu porto seguro. Amo vocs! Ao meu orientador, Prof. Dr. Robson Jos de Cssia Franco Afonso, pela oportunidade, profissionalismo e por ser um verdadeiro mestre. Foi uma honra trabalhar com voc e poder usufruir dos seus ensinamentos e experincias. Aos professores da ps-graduao pela transmisso de conhecimentos e ao Prof. Dr. Maurcio Xavier Coutrim pela disposio em ajudar sempre que preciso e pela convivncia. Aos amigos do laboratrio de Caracterizao Molecular e Espectrometria de Massas e dos laboratrios parceiros: Amanda, Keila, Regiane, Jlia, Bruno, Diego, Marina, Andr, Cntia, Francine, Luide, Ramon, Tereza, Cludia, Daniela, Oscar, Rafaela, Dbora, Jssica e Carlcio, pelo companheirismo, ajuda e por tornarem os dias de trabalho mais agradveis. Ananda Lima Sanson por ter me ajudado em todas as etapas deste trabalho, pela pacincia, por ter sido uma co-orientadora. Alm de ter se tornado uma amiga querida. Muito obrigada! Taynara, Wanda e Jssica por estarem ao meu lado em todos os momentos de alegria e tristeza. Amigas queridas, meus maiores presentes de Ouro Preto. Amo vocs! amada Repblica Joselitas por ter sido meu lar nessa caminhada e a todas as Sem Noo. Foram ensinamentos dirios, momentos inigualveis e amizades para a vida toda. Obrigada por terem sido minha famlia em Ouro Preto! Aos amigos de Viosa e Sete Lagoas por estarem sempre na torcida mesmo de longe. Fapemig pela concesso da bolsa de estudos. Enfim, agradeo a todos que fizeram parte desse captulo da minha histria.

Tudo posso Naquele que me fortalece Filipenses 4:13

RESUMO
Os microcontaminantes emergentes so uma classe de contaminantes que vm chamando a ateno da sociedade cientfica quanto s consequncias que estes podem trazer para o meio ambiente mesmo em concentraes muito baixas (na faixa de ng/L e g/L). So vrias as substncias assim classificadas sendo: frmacos e produtos de higiene pessoal, medicamentos veterinrios, perturbadores endcrinos e nanomateriais. A rota de

contaminao ambiental passa, na maioria das vezes, pela ingesto, excreo e uso tpico por humanos e animais destas substncias, que atingem os esgotos e cursos dgua. As estaes de tratamento de esgotos (ETEs) podem no ser eficazes no tratamento e remoo destes compostos. O presente trabalho apresenta a otimizao do mtodo de extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura (ELL-PBT) de microcontaminantes dentre eles frmacos (cido acetilsaliclico, ibuprofeno, paracetamol, genfibrozila e diclofenaco), hormnios naturais e sintticos (estrona, estradiol, etinilestradiol e estriol) e fenis (bisfenol A, 4nonilfenol e 4-octilfenol) em amostras de esgoto domstico. Foram avaliadas condies de extrao como volume de solvente extrator, fora inica e pH da amostra atravs de um planejamento fatorial completo com ponto central. Com essa abordagem foi possvel determinar como melhores condies para maior recuperao da maioria dos analitos o ajuste do pH da amostra para 2, 4 mL de amostra de esgoto, adicionar a ela 3 pores de 3 mL de acetonitrila como solvente extrator e resfriamento por 3 horas para cada extrao. Os extratos foram secos em N2 gasoso e submetidos a reao de derivatizao com o reagente BSTFA+1% TCMS seguido de anlise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM). O mtodo foi validado pelos parmetros: linearidade com faixa de trabalho de 0,1 a 200 g/L (R2 > 0,98); limites de deteco e quantificao do mtodo (inferiores a 0,21 e 0,96 g/L, respectivamente); preciso com desvios padro relativos de 0,578 a 8,00%; exatido e efeito matriz foram avaliados a partir da amostra e spike de extratos. Amostras reais de esgoto bruto e efluentes UASB e FBP foram submetidas ao mtodo proposto onde foram encontrados cido acetil saliclico, paracetamol, bisfenol A, estrona e estriol. Palavras-chave: Microcontaminantes emergentes, extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura (ELL-PBT), cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM)

ABSTRACT
Emergent microcontaminants are substances that have been drawing the attention of the scientific society due to the consequences they may bring to the environment, even in very low concentrations (in the range of ng/L to g/L). There are several substances classified as emerging organic pollutants such as: drugs and personal care products, veterinary products, endocrine disruptors and nanomaterials. The environmental contamination route for these substances are, in most cases, due to the ingestion, excretion, topic use on humans and animals, leading to sewage and waterways. Sewage treatment plants (STPs) may not be effective in the treatment and removal of these compounds. This work presents an analytical optimized method using liquid-liquid extraction with low temperature partition (LLE-LTP) for emerging microcontaminants in domestic sewage samples, among them drugs (aspirin, ibuprofen, acetaminophen, diclofenac and gemfibrozil), natural and synthetic hormones (estrone, estradiol, ethinylestradiol and estriol) and phenols (bisphenol A, 4-octylphenol and 4-nonylphenol). The extraction conditions were assessed varying extractor solvents, the solvent volumes, ionic strength and sample pH, through a center point complete factorial experimental design. With this approach it was possible to determine the conditions for the best extraction recoveries for the majority of analytes. The optimized conditions where: sample pH = 2, 4 ml sewage samples, multistage 3 x 3 mL of acetonitrile as solvent extractor, 3 hours freezing for each extraction. The extracts were dried under nitrogen subjected to derivatization reaction with 70% BSTFA + 1% TCMS plus 30% pyridine, followed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS) analysis. The method was validated by the parameters: linearity, with working range from 0,1 to 200 g/L (R2 > 0,98); method detection and quantification limits (0,21 and 0,96 g/L, respectively); precision relative standard deviations in the range of 0,84 to 18,17%; accuracy and matrix effect was also evaluated through sample and extract spikes. Real samples of raw sewage and effluents from UASB and FBP treatment were analyzed by the proposed method, where acetyl salicylic acid, acetaminophen, bisphenol A, estrone and estriol were found. Keywords: emerging microcontaminantes, liquid-liquid extraction with low temperature partition (LLE-LTP), gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS)

1 2

NDICE INTRODUO ............................................................................................ 14 REVISO BIBLIOGRFICA ..................................................................... 16

2.1 Microcontaminantes Emergentes .................................................................................... 16 2.1.1 Frmacos ...................................................................................................................... 17 2.1.1.1 Anti-inflamatrios ................................................................................................. 18 2.1.1.2 Reguladores Lipdicos ........................................................................................... 19 2.1.1.3 Estimulantes .......................................................................................................... 20 2.1.2 Desreguladores Endcrinos ......................................................................................... 21

4-Nonilfenol (4NP) .................................................................................................... 26 4-Octilfenol (4OP) ..................................................................................................... 26 Bisfenol A (BPA) ........................................................................................................ 26 Estrona (E1) ............................................................................................................... 27 Estradiol (E2) ............................................................................................................ 27 Etinilestradiol (EE2) .................................................................................................. 28 Estriol (E3) ................................................................................................................ 30

2.2 Esgoto ............................................................................................................................. 30 2.3 Mtodos Analticos para Determinao de Microcontaminantes ................................... 31 2.3.2 Espectrometria de Massas (EM) .................................................................................. 40 2.3.3 Mtodos de preparao de amostras ............................................................................ 42 2.3.3.1 Extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura (ELL-PBT) .......... 43 2.3.4 Derivatizao ............................................................................................................... 45 2.3.4.1 Reao de sililao ............................................................................................... 46 2.4 Validao ........................................................................................................................ 47 2.5 Planejamento Experimental e Tratamento de Dados ...................................................... 51

3 4

OBJETIVOS ................................................................................................. 53
3.1 Objetivos especficos ...................................................................................................... 53

MATERIAIS E MTODOS ......................................................................... 54

4.1 Reagentes e vidrarias ...................................................................................................... 54 4.2 Filtrao e armazenamento das amostras ........................................................................ 55 4.3 Preparo das solues padro ........................................................................................... 55 4.3- Mltipla extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura (ELL-PBT) ..... 59

4.4- Derivatizao ................................................................................................................. 60 4.5- Condies Cromatogrficas e de Deteco ................................................................... 61 4.5.1 Relao Massa / Carga dos microcontaminantes .................................................... 63 4.6 Validao do mtodo de quantificao dos microcontaminantes ................................... 65 4.7 Anlise de amostras reais ................................................................................................ 67

RESULTADOS E DISCUSSO .................................................................. 69

5.1 Otimizao do mtodo de extrao ................................................................................. 69 5.2 Validao do mtodo ...................................................................................................... 74 5.2.1 Seletividade .............................................................................................................. 74 5.2.2 Curva analtica e ajuste ........................................................................................... 77 5.2.3 Limite de deteco e de quantificao ..................................................................... 82 5.2.4 Preciso .................................................................................................................... 83 5.2.5 Exatido e preciso do mtodo ................................................................................ 85 5.2.6 Efeito Matriz............................................................................................................. 87 5.3 Anlise de amostras reais ................................................................................................ 88

6 7 8

CONCLUSES ............................................................................................ 91 TRABALHOS FUTUROS ........................................................................... 92 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................... 93

LISTA DE FIGURAS Figura 2.1- Esquema das possveis rotas de entrada dos microcontaminantes no meio ambiente. Fonte: Adaptado de KUMAR et al (2012) .............................................................. 17 Figura 2.2- cido Acetilsaliclico ........................................................................................... 18 Figura 2.3- Ibuprofeno ............................................................................................................ 18 Figura 2.4- Naproxeno ............................................................................................................ 18 Figura 2.5- Diclofenaco Sdico............................................................................................... 18 Figura 2.6- Acetaminofeno...................................................................................................... 19 Figura 2.7- Genfibrozila .......................................................................................................... 20 Figura 2.8- Cafena .................................................................................................................. 20 Figura 2.9- Disfunes endcrinas: a) resposta natural, b) efeito agonista, c) efeito antagonista. Fonte: (GHISELLI e JARDIM, 2007). ................................................................ 22 Figura 2.10- Representao esquemtica da principal via de entrada de disruptores endcrinos hormonais em sistemas aquticos. Adaptado de Filho et al., 2006 ....................... 24 Figura 2.11- Estrutura qumica do 4-nonilfenol ...................................................................... 26 Figura 2.12- Estrutura qumica do 4-octilfenol ....................................................................... 26 Figura 2.13- Estrutura qumica do bisfenol A ......................................................................... 27 Figura 2.14- Estrutura qumica da estrona .............................................................................. 27 Figura 2.15- Estrutura qumica do estradiol ............................................................................ 28 Figura 2.16- Estrutura qumica do etinilestradiol .................................................................... 29 Figura 2.17- Estrutura qumica do estriol ................................................................................ 30 Figura 2.18- Diagrama de um espectrmetro de massas ......................................................... 41 Figura 2.19- Mecanismo genrico da reao de sililao, onde X varia de acordo com os diferentes derivatizantes. Fonte: (BECKER, 2012) ................................................................. 47 Figura 4.1- Esquema da extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura .......... 60 Figura 4.2 - Diagrama da seringa para reao de derivatizao on line .................................. 61

Figura 4.3- GCMS-QP2010 plus (Shimadzu) ....................................................................... 62 Figura 4.4- Esquema dos pontos de coleta .............................................................................. 68 Figura 5.1- Procedimento de preparao de amostra .............................................................. 74 Figura 5.2- Cromatograma e espectro de massa dos ons monitorados do ibuprofeno ........... 75 Figura 5.3- Cromatograma e espectro de massa dos ons monitorados do 4-octilfenol .......... 76 Figura 5.4- Cromatograma e espectro de massa dos ons monitorados da estrona ................. 77 Figura 5.5- Curva analtica para o cido acetil saliclico (0,1 a 200 g/L) ............................. 79 Figura 5.6- Curva analtica para o ibuprofeno (2,5 a 175 g/L) ............................................. 79 Figura 5.7- Curva analtica para o cido paracetamol (2,5 a 200 g/L) .................................. 79 Figura 5.8- Curva analtica para o 4-octilfenol (2,5 a 200 g/L) ............................................ 79 Figura 5.9- Curva analtica para o 4-nonilfenol (2,5 a 200 g/L) ........................................... 80 Figura 5.10- Curva analtica para a genfibrozila (2,5 a 200 g/L) .......................................... 80 Figura 5.11- Curva analtica para o bisfenol A (0,1 a 200 g/L) ............................................ 80 Figura 5.12- Curva analtica para o diclofenaco (2,5 a 200 g/L) .......................................... 80 Figura 5.13- Curva analtica para a estrona (0,1 a 200 g/L) ................................................. 81 Figura 5.14- Curva analtica para o estradiol (1 a 200 g/L) .................................................. 81 Figura 5.15- Curva analtica para o etinilestradiol (0,1 a 175 g/L) ....................................... 81 Figura 5.16- Curva analtica para o estriol (2,5 a 20 g/L) ..................................................... 81

LISTA DE TABELAS Tabela 2.1- Compostos desreguladores endcrinos, suas fontes e efeitos estudados em laboratrio. ................................................................................................................................ 23 Tabela 2.2- Substncias qumicas classificadas como DE ....................................................... 25 Tabela 2.3- Dados de monitoramento de microcontaminantes em amostras ambientais ......... 32 Tabela 4.1- Informaes e caractersticas fsico-qumicas dos microcontaminantes em estudo .................................................................................................................................................. 56 Tabela 4.2- Planejamento fatorial 23 com ponto central com os nveis codificados e decodificados. ........................................................................................................................... 59 Tabela 4.3- Condies da reao de derivatizao ................................................................... 61 Tabela 4.4- Parmetros e valores utilizados na metodologia de determinao de microcontaminantes por CG-EM.............................................................................................. 63 Tabela 4.5- Tempos de reteno e relao m/z dos analitos derivatizados .............................. 64 Tabela 5.1- Porcentagem de recuperao estimada pela razo das reas para os tempos de 1, 3 e 12 horas de resfriamento. ....................................................................................................... 69 Tabela 5.2- Valores dos efeitos e do parmetro p ( = 0,05) para cada varivel estudada no planejamento fatorial completo 23 com quadruplicata no ponto central. Os valores em destaque so os que se mostraram significativos de acordo com o valor de p (p < 0,05). ....... 70 Tabela 5.3- Porcentagem de extrao dos analitos em cada ensaio do planejamento fatorial completo 23. .............................................................................................................................. 73 Tabela 5.4- Faixa de trabalho de cada analito, mdia da razo da rea do microcontaminante pela rea do padro interno de 3 replicatas de injeo e coeficiente de variao dessa mdia 78 Tabela 5.5- Limites de deteco (LD) e limites de quantificao (LQ) do equipamento CGEM. ........................................................................................................................................... 82 Tabela 5.6- Limites de deteco (LDM) e limites de quantificao (LQM) do mtodo. ......... 83 Tabela 5.7- Valores do coeficiente de variao de cinco replicatas em trs nveis para cada microcontaminante ................................................................................................................... 84 Tabela 5.8- ndice de recuperao da ELL-PBT para trs nveis de concentrao .................. 85 Tabela 5.9- Efeito de matriz para cada analito em trs nveis de concentrao ....................... 87

Tabela 5.10- Concentraes dos analitos encontrados em amostras de esgoto bruto e efluentes UASB e FBP ............................................................................................................................. 89

LISTA DE NOTAES
Agency ESI: Electrospray Ionization 4-NP: 4-nonilfenol 4-OP: 4-octilfenol AAS: cido acetilsaliclico AINH: Anti-inamatrios no esgoto Atmospheric pressure (trimetilsilil) slida blanket UE: Unio Europeia UV: Ultra violeta MM: Massa molecular NPX: Naproxeno PI: Padro interno SCAN: Scanning on SIM: Selected ion monitoring PCT: Paracetamol Kow: Coeficiente de partio FBP: Filtro biolgico percolado GEN: Genfibrozila IBU: Ibuprofeno IE: Ionizao por impacto de ETE: Estao de tratamento de

hormonais APCI:

chemical ionization BPA: Bisfenol-A BSTFA: N,O-bis

eltrons IUPAC: International Union of

Pure and Applied Chemistry LD: Limite de deteco LQ: Limite de quantificao MEFS: Microextrao em fase

triuoroacetamida CAF: Cafena CAS: Chemical Abstracts Service CePTS: Centro de Pesquisa e

Treinamento em Saneamento CG: Cromatografia gasosa CLAE: Cromatografia lquida de

alta eficincia CV: Coeficiente de variao DCF: Diclofenaco DE: Desreguladores endcrinos E1: Estrona E2: Estradiol EE2: Etinilestradiol E3: Estriol EFS: Extrao em fase slida ELL: Extrao lquido-lquido EM: Espectrometria de massas EPA: Environmental Protection

octanol/gua PE: Ponto de ebulio POP: Poluentes Orgnicos

Persistentes PPCP: Produtos de Higiene Pessoal

e Produtos Farmacuticos TCMS: Trimetilclorosilano UASB: Upflow anaerobic sludge

Introduo
Atualmente, um dos tpicos mais relevantes na qumica ambiental a qualidade das

guas. A preocupao com micropoluentes (poluentes que esto presentes no meio ambiente em concentraes da ordem de g/L e ng/L) tem aumentado expressivamente nos ltimos anos. Frmacos, desreguladores endcrinos e poluentes orgnicos persistentes (POPs) so classes de substncias muito investigadas devido, principalmente, aos seus possveis efeitos no meio ambiente. Uma grande preocupao relacionada a essas classes de substncias que podem produzir efeitos adversos aos organismos expostos em concentraes muito baixas (BILA e DEZOTTI, 2007). Incluem no s as substncias originais, mas tambm seus subprodutos ou metablitos, ou seja, produtos da degradao qumica e biolgica dos compostos originais. Os microcontaminantes representam uma mudana no conceito tradicional sobre contaminao ambiental, pois muitos so produzidos industrialmente e esto dispersos no ambiente pelo uso domstico, comercial e industrial. A classe de Produtos de Higiene Pessoal e Produtos Farmacuticos (PPCPs) a mais diversa categoria de substncias emergentes. Nesta classe de microcontaminantes, se encontram as drogas de prescrio teraputica, medicamentos veterinrios, fragrncias, aditivos de cosmticos, protetores solares, agentes de diagnstico, nutracuticos (ex. vitaminas) e drogas ilcitas (anfetaminas, cocana, etc.). Muitos destes compostos so solveis em gua e so expostos aos compartimentos ambientais atravs de guas residurias (industriais e municipais), fossas spticas, drenagem do lodo de esgotos, estrume de animais, chorume e lixiviado de aterros sanitrios. A rota de contaminao passa, na maioria das vezes, pela ingesto e uso tpico por humanos e animais, ou pela exposio involuntria nas guas e nos alimentos. Devido s propriedades recalcitrantes e antibiticas destes compostos, as estaes de tratamento de esgotos (ETEs) podem no ser eficazes no seu tratamento e remoo (KMMERER, 2010). Os compostos classificados como desreguladores endcrinos so produtos qumicos hormonalmente ativos capazes de interferir no sistema endcrino de animais (KUMAR et al., 2012). Alm dos efeitos no desenvolvimento e na reproduo, h tambm uma crescente preocupao de que os distrbios metablicos na biota podem estar ligados com os desreguladores endcrinos. A taxa de obesidade global tem aumentado drasticamente ao longo das ltimas trs dcadas em adultos, crianas e adolescentes, especialmente em pases desenvolvidos. A obesidade frequentemente associada a distrbios metablicos (incluindo
14

diabetes tipo 2, sndrome metablica, complicaes pulmonares e cardiovasculares, alm de doenas do fgado), bem como outras questes de sade, como problemas psicolgicos e ou sociais, problemas reprodutivos e algumas formas de cncer (HATCH et al., 2010; SAAL et al., 2012). Pesquisadores do mundo inteiro vm se empenhando no desenvolvimento de mtodos analticos suficientemente sensveis, com limites de deteco na ordem de g/L e ng/L para deteco desses compostos em diversas matrizes ambientais. A preparao e concentrao de dos analitos das amostras so extremamente importantes quando se trata de anlise de traos. Dentre as tcnicas mais utilizadas a extrao em fase slida (EFS), microextrao em fase slida (MEFS) tm se destacado (BUENO et al., 2012; SHIN e OH, 2012; GOMES et al., 2011). Os equipamentos utilizados nestas determinaes, em geral, so bastante sofisticados e apresentam elevada detectabilidade, enquanto que os procedimentos de extrao e concentrao dos produtos farmacuticos e de higiene pessoal e dos possveis interferentes endcrinos so bastante minuciosos. Dentre os mtodos de anlise, a cromatografia gasosa e lquida acoplada a espectrometria de massas tm ganhado destaque. O presente trabalho prope o desenvolvimento de um mtodo de extrao simples, eficaz e de baixo custo para anlise de vrios compostos presentes em amostras de esgoto. A anlise simultnea de microcontaminantes em amostras de esgoto domstico foi realizada por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas.

15

Reviso Bibliogrfica
2.1 Microcontaminantes Emergentes Os microcontaminantes emergentes so uma classe de contaminantes que vm

chamando a ateno da sociedade cientfica quanto s consequncias que estes podem trazer para o meio ambiente aqutico mesmo em concentraes muito baixas (na faixa de ng/L e g/L). De acordo com a EPA, 2008 as substncias classificadas como microcontaminantes so: Poluentes orgnicos persistentes (POP) tais como teres difenlicos polibromados utilizados em retardantes de chama, plastificantes, assim como cidos orgnicos perfluorados; Frmacos e produtos de higiene pessoal incluindo os frmacos de uso humano com prescrio ou venda livre, bactericidas, protetores solares e fragrncias; Medicamentos veterinrios, como os antibiticos, antifngicos e hormnios; Perturbadores endcrinos que inclui hormnios naturais e sintticos, pesticidas, alquilfenois, etc; e Nanomateriais: nanotubos de carbono, dixido de titnio particulado em nano escala, etc. A figura 2.1 ilustra as vrias rotas de entrada dos microcontaminantes no meio ambiente.

16

Figura 2.1- Esquema das possveis rotas de entrada dos microcontaminantes no meio ambiente. Fonte: Adaptado de KUMAR et al (2012)

Dentre os microcontaminantes citados, uma reviso bibliogrfica acerca da ocorrncia e procedimentos analticos para alguns frmacos e perturbadores endcrinos avaliados neste trabalho apresentada. 2.1.1 Frmacos A indstria farmacutica cresce a cada ano e est presente no cotidiano da populao mundial. Com isso, estes microcontaminantes vm sendo cada vez mais detectados no meio ambiente. No entanto, pouco se sabe sobre seu impacto ambiental. A ocorrncia de medicamentos humanos e veterinrios no meio ambiente tem sido um assunto de preocupao, pois muitos destes contaminantes emergentes tm demonstrado persistncia no solo e na gua (CELIZ et al., 2009). Os frmacos chegam ao meio ambiente via excreo, parte em sua forma ativa e parte em forma de metablitos, alm de muitas vezes serem descartados de maneira inadequada no vaso sanitrio (KUMMERER, 2010). Efluentes de indstrias farmacuticas e efluentes rurais tambm contribuem, e muito, para a descarga desses contaminantes no meio ambiente. A baixa volatilidade dos produtos farmacuticos indica que a distribuio no ambiente ocorre, principalmente, pelo transporte aqutico e pelos alimentos na disperso de cadeia (FENT, 2006). Estudos recentes tm demonstrado que, apesar das concentraes relativamente baixas de medicamentos no meio ambiente, h a preocupao quanto aos efeitos adversos causados
no longo prazo, em humanos e animais expostos a esses compostos. Assim, vrios 17

pesquisadores esto investigando as condies operacionais na eficincia de remoo de produtos farmacuticos em guas residuais de modo a minimizar a sua liberao para os sistemas terrestres e aquticos. Alm disso, as avaliaes de riscos e monitoramento ambiental esto sendo realizados a fim de obter informaes suficientes que permitam o monitoramento e regulao de produtos farmacuticos (CELIZ et al., 2009). 2.1.1.1 Anti-inflamatrios Os anti-inamatrios no hormonais (AINH) fazem parte de um grupo de medicamentos dos mais comercializados em todo o mundo e esto entre os frmacos mais encontrados no meio ambiente (SANTOS et al., 2010). Os AINHs constituem um grupo heterogneo de compostos de um ou mais anis aromticos ligados a um grupamento cido funcional. So cidos orgnicos fracos que atuam, principalmente, nos tecidos inamados e ligam-se, signicativamente, albumina plasmtica (CHAHADE et al., 2008). As figuras 2.2 a 2.5 representam as estruturas qumicas dos AINHs estudados neste trabalho. Figura 2.2- cido Acetilsaliclico
OH O H3C O O

Figura 2.3- Ibuprofeno

O OH H3C CH3

CH3

Figura 2.5- Diclofenaco Sdico

O Na O
CH3

Figura 2.4- Naproxeno

O O HO

Cl

NH

Cl

18

acetaminofeno

(N-acetil-p-aminofenol,

4-acetamidofenol,

paracetamol),

apresentado na figura 2.6, um composto p-aminofenlico que apresenta atividades analgsica e antipirtica. Este frmaco no possui atividade anti-inflamatria, mesmo assim , provavelmente, o antipirtico-analgsico de segunda escolha, principalmente aos pacientes alrgicos ao cido acetilsaliclico ou que sofram de lceras ppticas (BECKER, 2012). Figura 2.6- Acetaminofeno

NH H3C O

OH

Gmez e colaboradores (2007) monitoraram uma estao de tratamento de esgoto (ETE) no sul da Espanha por um ano para anlise simultnea de 14 contaminantes orgnicos. Dentre os estudados, encontraram ibuprofeno, acetaminofeno e diclofenaco nas concentraes mdias de 84, 134 e 1,5 /L respectivamente, antes do tratamento. No efluente encontraram uma mdia de 7,1, 0,22 e 0,9 /L. As anlises foram feitas por cromatografia gasosa acoplada a espctrometria de massa (CG-EM). Tambm na Espanha, Bueno e colaboradores (2012) monitoraram 100 compostos orgnicos durante dois anos em cinco ETEs municipais. Dentre os compostos que representaram a maior parte da poluio do efluente, no apenas pelas concentraes, mas tambm pelo nmero de vezes em que foram detectados, esto os AINHs ibuprofeno, diclofenaco, naproxeno; o regulador lipdico genfibrozila e o estimulante cafena. 2.1.1.2 Reguladores Lipdicos Reguladores lipdicos so medicamentos que reduzem o nvel de colesterol total e de triglicrides e utilizados para o tratamento de doenas coronarianas e infarto do miocrdio. A figura 2.7 ilustra a estrutura qumica do regulador lipdico genfibrozila, que um cido fenoxipentanico no-halogenado, estudado neste trabalho.

19

Figura 2.7- Genfibrozila

CH3 CH3 CH3 O OH O

H3C

Bendz (2005) e colaboradores monitoraram vrios compostos farmacuticos ativos em uma ETE na Sucia. Dentre esse compostos a genfibrozila foi encontrada na concentrao de 0,71 g/L e sendo obtida uma eficincia de remoo de 75% da planta em questo deste composto. 2.1.1.3 Estimulantes Cafena A cafena um alcalide, identificado como 1,3,7-trimetilxantina, cuja estrutura contm um esqueleto de purina (Figura 2.8). Este alcaloide encontrado em grande quantidade nas sementes de caf e nas folhas de ch verde (Camilla sinensis). Tambm pode ser achado em outros produtos vegetais, particularmente no cacau (Theobroma cocoa), no guaran (Paullinia cupana) e na erva-mate (Ilex paraguayensis). Embora uma parcela pequena da populao consuma cafena na forma de frmacos, como, por exemplo, antigripais, grande parte deste alcalide ingerida na forma de bebidas. Uma xcara de caf pode conter em mdia cerca de 80 mg de cafena, enquanto uma lata de coca-cola em torno de 34-41 mg (MARIA e MOREIRA, 2007). Figura 2.8- Cafena
O H3C N N CH3 CH3 N N

O consumo de quantidades moderadas de cafena aumenta a disponibilidade de energia, aumenta o gasto energtico dirio, diminui a fadiga, diminui a sensao de esforo associado atividade fsica, melhora o desempenho fsico, aumenta a performance motora, melhora o desempenho cognitivo, diminui a fadiga mental, aumenta a preciso de reaes,
20

aumenta a capacidade de concentrao, aumenta a memria de curto prazo, aumenta a capacidade de resolver problemas que exigem raciocnio, aumenta a capacidade de tomar decises corretas e aumenta a capacidade de funcionamento cognitivo e de coordenao neuromuscular (GLADE, 2010). A cafena considerada por muitos autores um marcador qumico de contaminao antropognica (DANESHVAR et al., 2012; BUERGE et al., 2003). No entanto, tal funo limitada a reas em que no h relevantes fontes naturais e industriais de cafena (BUERGE et al., 2006). 2.1.2 Desreguladores Endcrinos H evidncias de que uma ampla gama de produtos qumicos presentes no meio ambiente so capazes de interferir no sistema endcrino de animais selvagens, incluindo aves, peixes, mamferos, rpteis e moluscos. Estes produtos qumicos hormonalmente ativos, conhecidos como desreguladores endcrinos (DE), podem atingir os sistemas ribeirinhos atravs de uma variedade de entradas, incluindo fluxos de resduos urbanos, rurais, industriais e de atividades de agricultura intensiva (KUMAR et al., 2012). Alguns efeitos citados na literatura, tais como diminuio na ecloso de ovos de pssaros, peixes e tartarugas; feminizao de peixes machos; problemas no sistema reprodutivo em peixes, rpteis, pssaros e mamferos e, alteraes no sistema imunolgico de mamferos marinhos, tm sido associadas exposio de espcies de animais aos desreguladores endcrinos. Em alguns casos esses efeitos podem conduzir ao declnio da populao. Em seres humanos esses efeitos incluem a reduo da quantidade de esperma, o aumento da incidncia de cncer de mama, de testculo e de prstata e a endometriose (BILA e DEZOTTI, 2007). Segundo a Unio Europeia (UE), os desreguladores endcrinos podem: danificar diretamente um rgo endcrino; alterar diretamente a funo de um rgo endcrino; interagir com um receptor de hormnios ou, alterar o metabolismo de um hormnio em um rgo endcrino. A USEPA (United States Environmental Protection Agency) prope uma definio mais detalhada que reflete a diversidade de mecanismos envolvidos na perturbao do sistema endcrino. De acordo com a agncia, um interferente endcrino um agente exgeno que interfere na sntese, secreo, transporte, ligao, ao ou eliminao de hormnios naturais que so responsveis pela manuteno da homeostase, reproduo, desenvolvimento e/ou comportamento (U.S. EPA, 1997).
21

Os estrognios ambientais podem causar respostas antagnicas e agnicas, por mecanismos de ao via receptores hormonais. A atividade agonista a capacidade de uma substncia acoplar-se ao receptor de hormnios esterides e elucidar uma resposta. Em contrapartida, a atividade antagonista a habilidade de uma substncia acoplar-se ao receptor de estrognio e bloquear a ao do ligante natural e, assim, sua resposta no ser elucidada (BILA e DEZOTTI, 2007). Figura 2.9- Disfunes endcrinas: a) resposta natural, b) efeito agonista, c) efeito antagonista. Fonte: (GHISELLI e JARDIM, 2007).

A tabela 2.1 mostra alguns efeitos causados por vrios compostos classificados como desreguladores endcrinos. Uma grande parte da evidncia dos possveis efeitos dessas substncias em seres humanos foi obtida a partir da experincia envolvendo mulheres grvidas que tomaram o estrognio sinttico dietilestilbestrol, prescrito para evitar o aborto espontneo e promover o crescimento do feto, no perodo entre 1948 e 1971. Muitas filhas dessas mulheres so hoje estreis, enquanto uma minoria tem desenvolvido um tipo raro de cncer vaginal. Os homens adultos mostram uma maior incidncia de anormalidade em seus rgos sexuais, apresentam contagem mdia de espermatozoides diminuda e podem sofrer um risco maior de desenvolver cncer nos testculos. (GHISELLI, 2006).

22

Tabela 2.1- Compostos desreguladores endcrinos, suas fontes e efeitos estudados em laboratrio. Classificao Hormnios naturais 17-estradiol (E2) Estrona (E1) ETA -sitosterol Isoflavonides Coumesterol Zearalenona Lignanas Genistena Dietilestilbestrol 17-etinilestradiol (EE2) Mestranol Nonilfenol (NP) Octilfenol Butilfenol Bisfenol A (BPA) Dietilhexilftalato Diciclohexilftalato Compostos Estriol (E3) Testosterona Fontes

Efeitos biolgicos Hermafroditismo e VTG em peixes

Fitoestrognios

EFPC, comida

Ligar a receptores estrognicos, alterar produo de esterides.

Hormnios sintticos

EFPC, tratamento mdico EFPC

Alquilfenis

Pentafenol

Efeito agonista e antagonista, VTG, estimular formao de vulo em peixes e caracis machos. Reduo da reproduo, produo de ovos, induo da VTG, hermafroditismo em peixes machos. Bisfenol F Dihexiftalato Diciclohexilftalato Lindano Permerina EFPC Lixiviao de plsticos ETA, regio agrcola

Fenis Ftalatos

Efeito agonista, hermafroditismo em peixes.

Efeito agonista e antagonista

Pesticidas Antrazina Dieldrin/Aldrin Endosulfan Adaptado de KUMAR et al., 2012

Hermafroditismo em peixes e sapos, produo de VTG, alterao nos nveis de hormnios de sapos.

ETA- Estao de tratamento de gua; EFPC- Efluente de Fbrica de Papel e Celulose; VTG- Protena Vitelogenina

23

Os hormnios excretados atravs da urina e fezes seguem para a rede coletora, adentrando depois ao ambiente. O lanamento de efluentes in natura ou mesmo processados so as principais vias de contaminao do ambiente aqutico, seja pelo dficit de infraestrutura em saneamento, seja pela ineficincia (tecnolgica e/ou operacional) das estaes de tratamento. Apesar de possurem meia-vida relativamente curta quando comparados a outros compostos orgnicos (como alguns pesticidas), os estrgenos naturais so continuamente introduzidos no ambiente o que lhes concede um carter de persistncia. Estudos relatam que at 40% das doses ministradas de estrgenos sintticos podem ser disponibilizadas para o ambiente. A Figura 2.10 exemplifica o modo de entrada destes contaminantes para os ecossistemas (FILHO et al., 2006). Figura 2.10- Representao esquemtica da principal via de entrada de disruptores endcrinos hormonais em sistemas aquticos. Adaptado de Filho et al., 2006

A tabela 2.2 abaixo apresenta alguns compostos classificados como desreguladores endcrinos e suas classes.

24

Tabela 2.2- Substncias qumicas classificadas como DE

Ftalatos dietil ftalato (DEP) di-iso-butil ftalato (DIBP) di-n-butil ftalato (DBP) butilbenzil ftalato (BBP) diciclohexilo ftalato (DCHP) di-2-(2-etil-hexil) ftalato (DEHP) di-n-octil ftalato (DOP) di-isooctil ftalato (DIOP) di-iso-nonil ftalato (DINP) di-iso-decil ftalato (DIDP Alquilfenis nonilfenol etoxilado octilfenol etoxilado Organoclorados Pesticidas Inseticida DDT (2,2 bis-p-clorofenil-1,1,1-tricloroetano) DDE (2,2 bis-p-clorofenil-1,1-dicloroetileno) deltametrina carbofurano Herbicidas atrazina linuron Fungicidas vinclozolina tridemorfos carbendazina procimidona penconazol epoxiconazol procloraz Pesticidas organoclorados Lindano (1,2,3,4,5,6-hexacloroexano)

nonilfenol octilfenol

dibenzo-p-dioxina TCDD (2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-p-dioxina) TCDF (2,3,7,8-tetraclorodibenzofurano) Bisfenol Bisfenol A Parabenos benzilparabeno isobutilparabeno butilparabeno n-propilparabeno etilparabeno metilparabeno Hidrocarbonetos aromticos policclicos Benzo[a]antraceno Naftalina Criseno Acenaftileno Benzo[b]fluoranteno Fluoreno Benzo[k]fluoranteno Fenantreno Benzo[a]pireno Antraceno Indeno[123-cd] pireno Fluoranteno Dibenzo[ah]antraceno Pireno Benzo[ghi]perileno Metais pesados Cdmio Mercrio Chumbo Zinco Agentes teraputicos e farmacuticos Dietilestilbestrol (DES) 17-etinilestradiol (EE2) Estrognios naturais Estrona (E1) 17-estradiol (E2) Estriol (E3)

Compostos orgnicos de estanho Tributilestanho (TBT) Trifenilestanho (TPT) Policlorados de bifenilas 2,4,4-triclorobifenil 2,2,5,5-tetraclorobifenol 2,2,4,5,5-pentaclorobifenil 2,3,4,4,5-hexaclorobifenil 2,23,4,4,5- hexaclorobifenil 2,2,4,4,5,5-hexaclorobifenil 2,2,3,4,4,5,5-heptaclorobifenil Retardantes de chama bromado Polibromobifenila( PPB) polibromobifenila( PPB) 2,2,4,4-tetrabromodifenil ter 2,2,4,4,5pentabromodifenil ter 2,2,4,4,6 pentabromodifenil ter 2,2,4,4,5,5-hexabromodifenil ter 2,2,4,4,5,6-hexabromodifenil ter 2,2,3,4,4,5,6-heptabromodifenil ter octabromodifenil ter (BDE octa) decabromociclodifenil ter (BDE 209) hexabromociclododecano (HBCD) tetrabromobisfenol A (TBBA) Fitoestrognios Isoflavona: daidzena e genistena Lignanas: metaresinol e enterodiol

Fonte: (BILA e DEZOTTI, 2007) Dentre os compostos apresentados no quadro acima alguns foram estudados neste trabalho.

25

4-Nonilfenol (4NP) A liberao do 4-nonilfenol para o meio ambiente pode ser resultante dos resduos de

vrios produtos uma vez que so utilizado na preparao de lubrificantes, aditivos de leo, resinas, plastificantes, agentes tenso ativos, antioxidantes para borrachas e plsticos, e como material de partida para a produo de resinas fenlicas. O 4-nonilfenol foi identificado em gua potvel, guas subterrneas, rios e lagos, estao de tratamento de efluentes, e um contaminante de destaque no lodo de esgoto (PUBCHEM, 2012). Figura 2.11- Estrutura qumica do 4-nonilfenol
HO

CH3

Liu e colaboradores (2012) confirmaram que desreguladores endcrinos, entre eles o 4-nonilfenol, se acumulam nos msculos de peixes quando estes so expostos a efluentes contendo este microcontaminantes. Esta acumulao pode explicar vrios efeitos biolgicos nas espcies em estudo. 4-Octilfenol (4OP) O 4-octilfenol, junto com o 4-nonilfenol, so produtos da degradao do dos alquilfenis etoxilados, que so surfactantes usados em formulaes de detergentes de uso industrial e domstico. Tambm so usados na produo de resinas fenlicas, como aditivos plsticos, emulsificantes, agentes umificantes e em formulaes de agrotxicos. A principal fonte desses compostos para o meio aqutico proveniente do uso domstico de surfactantes (RAIMUNDO, 2007). Figura 2.12- Estrutura qumica do 4-octilfenol
HO CH3

Bisfenol A (BPA) Bisfenol A utilizado principalmente na indstria como um intermedirio importante

na produo das seguintes resinas e polmeros: policarbonato, epxi, polisulfona, poliacrilato, polieterimida, polister insaturado e fenlicos. Pode ser encontrado em uma grande variedade
26

de materiais e produtos (por exemplo, garrafas, tubos, revestimentos, selantes dentrios, embalagens de alimentos, esmaltes e materiais retardadores de chama). Devido a sua ampla utilizao a populao humana pode facilmente entrar em contato com o BPA no dia-a-dia (ASIMAKOPOULOS et al., 2012). Figura 2.13- Estrutura qumica do bisfenol A
CH3 HO CH3 OH

Uma grave consequncia da exposio ao BPA foi relatada por Aldad e colaboradores (2011) que expuseram fmeas de macacos a este composto e comprovaram que o BPA, indiretamente, aumenta a ao de estrognios. Esse efeito pode explicar doenas como endometriose, hiperplasia do endomtrio, cncer, alm de poder estar associado a abortos espontneos. Estrona (E1) A estrona um estrognio natural mais potente que o estriol e menos que o estradiol. o principal estrgeno circulante aps a menopausa e a maior parte est conjugada sob a forma de sulfato. muito utilizada para avaliao do hipogonadismo, avaliao da puberdade precoce (completa ou parcial), diagnstico de tumores feminilizantes e acompanhamento de reposio hormonal na menopausa, em alguns casos (NOBEL, 2012). Figura 2.14- Estrutura qumica da estrona
O

HO

No trabalho de Salste et al (2007) a estrona foi o nico estrognio encontrado acima do limite de quantificao indicando que ele o principal contribuinte para a atividade estrognica do efluente de uma estao de tratamento da cidade de Turku, na Finlndia. Estradiol (E2) O 17-estradiol um estrgeno natural responsvel pelas caractersticas sexuais femininas secundrias e pela menstruao normal. Na menopausa seu nvel cai
27

consideravelmente. Alm disso, tambm responsvel pela manuteno dos tecidos do organismo, garantindo a elasticidade da pele e dos vasos sanguneos e a reconstituio ssea, entre outras funes (GOODMAN GILMAN, 2005). metabolizado principalmente no fgado, sendo os principais metablitos a estrona e o estriol e seus conjugados, os quais so consideravelmente menos potente do que o estradiol. A maior parte dos metablitos so excretados na urina como glucurondeos e sulfatos (BALFOUR, J.A. e HEEL, R.C.,1990) Figura 2.15- Estrutura qumica do estradiol
OH

HO

Estradiol e os seus steres semi-sintticos (valerato de estradiol, especialmente), so os principais estrognios utilizados no tratamento de perturbaes da menopausa. A sua utilizao tambm tem sido proposta para a preveno de doenas cardiovasculares (IARC, 2012). Devido ao uso do estradiol para tratamentos, alm de ser um estrognio natural, h a preocupao quanto a sua ocorrncia no meio ambiente. No trabalho de Svenson e colaboradores (2003) foi relatado que, em efluentes de estaes de tratamento de esgoto domstico da Sucia, havia compostos estrognicos correspondentes ao estradiol nas concentraes de 0,1-15 ng / L. Alm disso, baixos nveis de atividade estrognica tambm foram encontrados em um rio que recebe efluentes municipais, tomada a cerca de 3,5-35 km a jusante de uma estao de tratamento de esgoto. J em esgoto no tratado, as concentraes de estradiol estava em torno de 1-30 ng de estradiol / L. Etinilestradiol (EE2) O 17- etinilestradiol um estrognio sinttico amplamente utilizado em plulas contraceptivas (3050 g/plula/dia). Possui maior potencial estrognico quando comparado com o estradiol e seus metablitos, alm de ser mais resistente ao metabolismo. Tais fatos ocorrem devido a adio de um grupo etinil na sua estrutura (ANDREW et al., 2010; TOMKOV et al., 2012).

28

Figura 2.16- Estrutura qumica do etinilestradiol

HO CH

HO

O uso de medicamentos contendo estrgenos sintticos possuem muitos pontos negativos e entre os mais graves, o desenvolvimento e evoluo de cncer de mama. Tais compostos possuem maior potencial endcrino e so excretados na urina de mulheres que usam os contraceptivos (TOMKOV et al., 2012). Vrios estudos j comprovaram que a exposio de animais aquticos ao EE2, e outros estrgenos, causam mudanas no fentipo como falha nos rgo reprodutivos, feminizao (ou demasculinizao) de machos, formao de hermafroditas e aumento na produo da protena vitelogenina (protena sintetizada pelas fmeas durante a maturao ocita) (SUMPTER e JOHNSON, 2008). Kidd e colaboradores (2007) expuseram peixes da espcie Pimephales promelas, em uma lagoa experimental no Canad, a baixas concentraes de EE2 (5-6 ng/L) durante sete anos. Eles constaram a feminizao de machos da espcie devido a produo da protena vitelogenina, alteraes no desenvolvimento gonadal comprovada pela presena de peixes hermafroditas e mudanas na oognese de fmeas. Por fim, houve uma diminuio significativa da populao dos peixes no lago. Tompsett e colaboradores (2012) expuseram girinos da espcie Xenopus laevis a trs nveis de concentrao de EE2 (0,09, 0,84, ou 8,81mg/L) e em todos eles foi observado atrasos significativos no tempo de metamorfose. Houve um grande nmero de anfbios com gentipo masculino que exibia fentipo dos dois sexo (hermafroditismo), alm do aumento na produo da protena vitelogenina em ambos os sexos. Devido a esses fatos h a grande preocupao em avaliar a remoo desse contaminante nas estaes de tratamento de esgoto uma vez que os efluentes vo para rios e mananciais e podem chegar ao consumo humano.

29

Estriol (E3) O estriol um estrgeno natural, altamente sintetizado durante a gravidez e pode ser

originado pelo metabolismo do estradiol e da estrona sendo menos ativo que estes (RAIMUNDO, 2007). amplamente utilizado na reposio hormonal na menopausa uma vez que o estriol induz a normalizao do epitlio vaginal, cervical e uretral, ajudando a restaurar a microflora normal e o pH fisiolgico da vagina. Alm disso, aumenta a resistncia das clulas para inflamao e infeco (VOOJIS e GEURTS, 1995). Figura 2.17- Estrutura qumica do estriol

Em amostras do rio Dourados, no estado do Mato Grosso do Sul, que devido a criao extensiva de gado na regio pode receber excrementos destes animais, foram feitas anlises de estrgenos naturais. O estriol foi o encontrado em maior quantidade, com concentraes na faixa de 11 e 130 ng/L (ZOCOLO et al., 2010). 2.2 Esgoto A palavra esgoto costuma ser usada para definir tanto a tubulao condutora das guas servidas de uma comunidade, como tambm o prprio lquido que flui por estas canalizaes. Hoje este termo usado quase que apenas para caracterizar os despejos provenientes das diversas modalidades do uso e da origem das guas, tais como as de uso domstico, comercial, industrial, as de utilidades pblicas, de reas agrcolas, de superfcie, de infiltrao, pluviais, e outros efluentes sanitrios. Os esgotos costumam ser classificados em dois grupos principais: os esgotos sanitrios e os industriais. Os primeiros so constitudos essencialmente de despejos domsticos, uma parcela de guas pluviais, guas de infiltrao, e eventualmente uma parcela no significativa de despejos industriais, tendo caractersticas bem definidas. Os esgotos domsticos ou domiciliares provm principalmente de residncias, edifcios comerciais, instituies ou quaisquer edificaes que contenham instalaes de banheiros, lavanderias, cozinhas, ou qualquer dispositivo de utilizao da gua para fins domsticos.

30

Compem-se essencialmente da gua de banho, urina, fezes, papel, restos de comida, sabo, detergentes, guas de lavagem. Os esgotos industriais, extremamente diversos, provm de qualquer utilizao da gua para fins industriais, e adquirem caractersticos prprias em funo do processo industrial empregado. Assim sendo, cada indstria dever ser considerada separadamente, uma vez que seus efluentes diferem at mesmo em processos industriais similares (JORDO, 1995). O esgoto domstico uma matriz bastante complexa do ponto de vista analtico. Ele pode conter muitos compostos orgnicos tais como, cidos hmicos e flvicos, protenas, lipdeos, alm de detergentes do tipo alquilbenzeno-sulfonados de cadeia linear (LAS), surfactantes aninicos que so amplamente utilizados e esto no esgoto em altas concentraes (cerca de 10mg/L). Devido sua abundncia e atividade surfactante esses compostos so interferentes importantes encontrados na matriz esgoto, que podem competir com os analitos de interesse no sistema cromatogrfico. 2.3 Mtodos Analticos para Determinao de Microcontaminantes Os microcontaminantes entram no meio ambiente constantemente, porm em concentraes muito baixas na ordem de g/L e ng/L. As amostras ambientais (gua superficial, efluente de ETE, esgoto bruto), so amostras muito complexas fazendo necessrio o desenvolvimento de tcnicas eficientes de preparao e concentrao das mesmas (KOSTOPOULOU e NIKOLAOU, 2008). Tcnicas cromatogrficas, lquida e gasosa, so as mais utilizadas para anlises desses compostos. O acoplamento da espectrometria de massas a essas tcnicas o mais apropriado devido a sua grande seletividade. A cromatografia gasosa ainda exige um passo a mais que a derivatizao dos analitos para que seja possvel a adio de grupamentos que levam a diminuio do ponto ebulio, para que assim sejam passveis a esse tipo de anlise (GABET et al., 2007). A Tabela 2.3 apresenta alguns dados de monitoramento de microcontaminantes estudados neste trabalho em amostras ambientais encontrados na literatura.

31

Tabela 2.3- Dados de monitoramento de microcontaminantes em amostras ambientais

Matriz Analitos Preparo de Derivatizao amostra Anlise Instrumental Recuperao (%) LD e LQ (ng/L)

Concentrao encontrada (g/L)

Referncia

Esgoto e efluente de estao de tratamento PCT IBU DCF NPX GEN CAF

EFS: HLB (200 mg), MeOH ELL (2x hexano)

CLAE/EM: (coluna Zorbax C18 250 x 3,0 mm x 5 m; fase mvel (A) ACN e gua MilliQ com 0,1% de cido frmico e (B) ACN e gua MilliQ). CG/EM (coluna HP5MSi 15m x 0,25 mm x 0,25 m)

34 (PCT), 98 (NPX), 116 (IBU), 120 (DCF), 114 (GEN), 100 (CAF),

Esgoto: LD: 19,6 (PCT), 14,4 (NPX), 2,2 (IBU), 0,7 (DCF), 0,1 (GEN), 8,8 (CAF) LQ: 65,4 (PCT), 48,2 (NPX), 7,4 (IBU), 2,4 (DCF), 0,3 (GEN), 29,4 (CAF)

Esgoto: 19,3-180,5 (PCT), 14 (IBU), >59 (CAF) Efluente: 0,08-13,8 (PCT), 5 (IBU), 3,5 (DCF), 1,2 (NPX) 0,01-0,3 (GEN), <8 (CAF)

BUENO, 2012

Esgoto e efluente de estao de tratamento IBU PCT

CAF BPA

EFS: HLB (200 mg), acetato de etila

CLAE/ESI/EM: (coluna Zorbax C8 150 mm x 4,6 mm x 5 m; fase mvel metanol: gua (15%)) CG/EM (coluna ZB5 MS, 30 m 0,25 mm 0,25 m; He a 1 ml/min; EI a 70 eV)

83 (IBU), 75 (PCT), 94 (CAF), 85 (BPA)

LD: 23 (IBU), 32 (PCT), 1 (CAF), 7 (BPA)

Esgoto: 34-168 (IBU), 29-246 (PCT), 52-192 (CAF), 0,72-3.4 (BPA) Efluente: 0,24-28 (IBU), <LD-4,3 (PCT), 1.4-44 (CAF), 0,14-0,98 (BPA)

GMEZ et al,. 2007

32

Tabela 2.3- Dados de monitoramento de microcontaminantes em amostras ambientais (continuao)

Matriz Derivatizao Analitos Preparo de amostra Anlise Instrumental Recuperao (%)

LD e LQ (ng/L)

Concentrao encontrada (ng/L)

Referncia

Esgoto e efluente de estao de tratamento DCF CAF GEN IBU NPX EFS: RP-C18 PFBBr, MTBSTFA ou mistura de MSTFA, TMSI e DTE

CG/EM

Esgoto: 3,02 (DCF), 230 (CAF), 0,44 (NPX), ND (GEN e IBU) Efluente: 2,51 (DCF), 0,18 (CAF), 0,07 (GEN), 0,1 (IBU), 0,08 (NPX) CG/EM (coluna DB-5 30 m x 0,25 mm x 0,25 m; He a 1 mL/min; EI a 70 eV)

HEBERER, 2002

gua superficial DCF

IBU NPX ELL (2x de 20 mL diclorometano)

200 L de HCl 1,0 mol/L em metanol

102 (IBU), 99 (NPX), 98 (DCF)

gua do mar

CAF NPX IBU DCF GEN

EFS (resina XAD2 PSDVB, metanol)

CLUE/ESI/EM (coluna Acquityn HSS T3 (2,1 x 100 mm x 1,8 m; fase mvel: cido actico:gua 0,01M e cido actico:ACN 0,01M)

10,6 (CAF), 37,9 (NPX), 63 (IBU), 37,6 (DCF), 64,5 (GEN)

LD: 20 (IBU), 0,3 (NPX), 3,0 (DCF) LQ: 60 (IBU), 1 (NPX), 10 (DCF) LD: 8 (CAF), 12 (NPX), 7 (IBU), 4 (DCF), 6 (GEN) LQ: 26 (CAF), 40 (NPX), 23 (IBU), 13 (DCF), 20 (GEN)

ND (IBU), 4,5 (NPX), 310 (DCF)

SHIN e OH, 2012

51,2 (CAF), ND (NPX, IBU, DCF, GEN)

MAGNR et al., 2010

33

Tabela 2.3- Dados de monitoramento de microcontaminantes em amostras ambientais (continuao)

Preparo de amostra Derivatizao Anlise Instrumental
CLAE/ESI/EM (coluna Polaris C18 150mm x 2 mm x 3 m; fase mvel (A) gua MilliQ com 0,015% cido frmico + 5% metanol e (B) metanol) -

Matriz

Analitos

Recuperao (%)

LD e LQ (ng/L)

Concentrao encontrada (ng/L)

Referncia

Efluente de estao de tratamento EFS (HLB, metanol e acetato de etila)

DCF IBU NPX

PCT CAF GEN

LQ: 39 (CAF), 15 (DCF), 17 (GEN), 19 (IBU), 24 (NPX), 26 (PCT)

1,49 (DCF), ND (IBU, NPX, PCT, CAF, GEN)

NDLER et al., 2010

gua superficial e gua potvel

E1 E2 E3 EE2 BPA 4OP 4NP

EFS (HLB 500 mg, MeOH)

CLAE/ESI/EM (coluna (Zorbax SBC18 2,1 x 3 mm x 3,5 m; fase mvel (A) gua e (B) MeOH, ambos com 0,1% de hidrxido de amnio)

Esgoto e efluente de estao de tratamento IBU NPX

E1 E2

MEFS (fibra PDMS/DVB (polidimetilsiloxan o/divinilbenzeno)

ECF e soluo de EtOH e piridina

CG/EM (coluna Rtx5MS 15 m x 0,25 mm x 0,25 m; EI a 70 eV)

LD: 0,1 (E1), 0,2 (E2, E3), 1,0 (EE2), 0,4 (BPA), 0,04 81 (E1), 109 (E2), (4OP, 4NP) 140 (E3), 103 (EE2), 82 (BPA), LQ: 0,3 (E1), 98 (4OP), 72 (4NP) 0,6 (E2, E3), 3,1 (EE2), 1,2 (BPA), 0,1 (4OP, 4NP) LD: 105 (IBU), 160 (NPX), 160 (E1), 95,2 (E2) LQ: 500 (IBU, NPX, E1, E2)

gua superficial: <LQ (E1), 1,48 a 7,7 (E3), 2,76 a 11,4 (BPA), <LQ a 1,96 (4OF), 1,24 (4NF).

JARDIM et al., 2012

gua potvel: ND (E1, E2, E3, EE2), <LQ (BPA, 4OF, 4NF)

Nenhum analito > LQ

GOMES et al., 2011

34

Tabela 2.3- Dados de monitoramento de microcontaminantes em amostras ambientais (continuao)

Preparo de amostra Derivatizao
Derivatizao: 125 L piridina + 25 L BSTFA: 1 % TCMS

Matriz

Analitos

Anlise Instrumental

Recuperao (%)

LD e LQ (ng/L)

Concentrao encontrada (ng/L)

Referncia

gua de rio E1 E2,

EE2 MeEE2

EFS: HLB (200 mg), 2 4 mL acetato de etila

Esgoto

E1 E2 EE2

E3 BPA 4OP

EFS (HLB 200mg, metanol)

Esgoto e efluente de estao E1 E2

E3 EE2

EFS (diclorometano/MeOH (80/20))

LVI-PTV-CGEM (coluna LD: 0,07 HP5 MS, 30 m 129 (E1), 105 (E1), 0,05 0,25 mm (E2), 102 (EE2) (E2), 0,04 0,25 m; He a (EE2) 1,0 mL/min; EI a 70 eV) CLAE/ESI/EM (coluna Pursuit LD: 2,7 XRs Ultra-C18 (4NP), 50 mm x 2 mm 5,7 x 2,8 m; fase 82 (4NP), 79 (4OP), mvel (A) (4OP), 82 5,7 gua e (B) (BPA), 81 (E1), (BPA), MeOH, ambos 91 (E2), 88 4,0 (E1), com 0,1% (E3), 79 (EE2) 3,3 (E2), cido actico 3,7 (E3), glacial e 15 2,8 (EE2) mM de acetato de amnio. CLAE/ESI/EM (coluna Alltima Esgoto: 86 LQ: 0,6 25 mm x 4,6 (E3), 88 (E2), (E3), 0,6 mm x 5m); 86 (EE2), 91 (E2), 0,9 fase mvel (A) (E1) (EE2), ACN e (B) 0,2 (E3) gua

BIZKARGUENAGA et al., 2012

9,7 (4NP), 6,1 (4OP), 13,4 (BPA), 16,3 (E2), 15,5 (E1), 22,2 (E3), 9,3 (EE2)

VEGA-MORALES et al., 2010

Esgoto: 70 (E3), 22 (E2), 2,9 (EE2), 132 (E1) Efluente: 3,3 (E3), 2,9 (E2), 1,0 (EE2), 13 (E1)

BARONTI et al., 2000

35

Tabela 2.3- Dados de monitoramento de microcontaminantes em amostras ambientais (continuao)

Preparo de amostra Derivatizao
50 L piridina + 50 L BSTFA+1% TCMS (aquecimento 30 a 60-70 oC em banho ultrasnico)

Matriz

Analitos

Anlise Instrumental
CG/EM (coluna HP-5MS 30m x 0,25 mm x 0,25 m; He a 1,5 mL/min; EI)

Recuperao (%)
87,2 (4NP), 96 (BPA), 90,3 (E1), 96,3 (E2), 110,9 (EE2), 103,3 (E3)

LD e LQ (ng/L)

Concentrao encontrada Referncia (g/L)

Lodo ativado

E1 E2 E3

EE2 BPA 4NP

EFS (HLB 50 mg, 10 mL diclorometano/acetone (7:3))

LQ: 30,3 (4NP), 0,2 (BPA), 1,2 (E1), 0,8 (E2), 4 (EE2), 2,3 (E3)

199,8 (4NP), 135,3 (BPA), ND (E1, E2), 6,3 (EE2), 17,6 (E3)

NIE et al., 2009

Esgoto e efluente de estao de tratamento 4OP 4NP BPA E1 E2 EE2

EFS (HLB 0,2 g, 10 mL de acetato de etila)

50 L piridina + 50 L BSTFA+1% TCMS (aquecimento 30 a 60-70 o C)

CG/EM (coluna HP-5 30 m x 0,25 mm x 0,25 m; He a 1,0 mL/min)

Efluente: 71,2 (4OP), 85,5 (4NP), 75,3 (BPA), 76,5 (E1), 82,7 (E2), 84,7 (EE2)

Esgoto: 8-65 (4OP), 0,2-0,8 (4NP), 0,1-8 (BPA), 0,3-41 (E1), 10-22 (E2), 0,5-5 (EE2)

Efluente: 0,330(4OP), <0,2 (4NP), 0,1-12 (BPA), 0,3-17 (E1), 0,7-9 (E2), <0,5 (EE2)

ZHANG et al, 2006

36

Tabela 2.3- Dados de monitoramento de microcontaminantes em amostras ambientais (continuao) Preparo de amostra Derivatizao Anlise Instrumental Recuperao (%)

Matriz

Analitos

LD e LQ (ng/L)

Concentrao encontrada (ng/L)

Referncia

Esgoto e efluente de estao de tratamento EFS (HLB, 60 mg 3x 1 mL acetona) -

DCF IBU NPX CAF GEN

PCT E1 E2 EE2 E3

CLAE/DAD/Fl (coluna Zorbax Eclipse XDB-C18 150 mm x 4,6 mm x 5m; fase mvel (A) ACN e (B) soluo de 25 mM de dihidrognio fosfato de potssio)

Esgoto: LD: 323 (E1) LQ: 67 (EE2), 145 (E2),

Esgoto: 0,72 (DCF), 50,6 (IBU), 4,09 (NPX), 0,89 (CAF), <LQ (EE2, E1), 0,12 (E3), < LD (E1), 2,64 (GEN)

Efluente: LD: 162 (E1) LQ: 72 (E2)

Efluente de estao de tratamento

E1 E2 E3 PCT DCF IBU NPX GEN CAF

EFS (HLB, 10% MeOH/MTBE e MeOH)

CLAE/ESI/EM (coluna ZORBAX Eclipse XDBC18 4,6 x 150 mm x 3,5 m;

82 (BPA), 98 (OF), 72 (NF) 81 (E1), 109 (E2), 140 (E3), 103 (EE2),

LQ: 0,0885,07

Efluente: 0,53 (DCF), 3,74 (IBU), 2,58 (NPX), 0,24 (CAF), 0,12 (EE2), <LQ (E1), 0,59 (E3), <LD (E1), 3,07 (GEN) 0-27(PCT), 13-49 (DCF), 15-75 (IBU), 37-166 (NPX), 9-26 (GEN), 0-60 (CAF), 0-24 (E1), ND (E3, E2)

MARTN et al., 2012

BEHERA et al., 2011

37

Tabela 2.3- Dados de monitoramento de microcontaminantes em amostras ambientais (continuao)

Matriz Derivatizao Analitos Preparo de amostra Anlise Instrumental Recuperao (%)

Esgoto

IBU E1 PCT E2 NPX EE2 DCF E3 EFS (HLB 200mg, Strata, 6 mL MeOH)

50 L de piridina + 50 L BSTFA + 1% TCMS, 60oC por 30)

CG/EM (coluna Rtx-5 30 m x 0,25 mm x 0,25 m; He a 2,0 mL/min EI a 70 eV.)

102,4(IBU), 89,4 (PCT), 70,8 (NPX), 75,6 (DCF), 80,3 (E1), 68,2 (E2), 83,9 (EE2), 99,8 (E3)

LD e LQ (ng/L) LD: 6,6 (IBU), 7,6 (PCT), 16,9 (NPX), 52,9 (DCF), 8,5 (E1), 10 (E2), 8,1 (EE2), 6,8 (E3). LQ: 19,5 (IBU), 22,4 (PCT), 56,5 (NPX), 158,7 (DCF), 24,9 (E1), 29,3 (E2), 23,8 (EE2), 20 (E3)
EFS: Extrao em fase slida ELL: Extrao lquido-lquido MEFS: Micro extrao em fase slida PFBBr: brometo de pentafluorobenzil MTBSTFA: N-metil-N-(tercButildimetiltrifluoroacetamida) MSTFA: N-Metil-N-(trimetilsilil) trifluoroacetamida TMSI: trimetilsililimidazol DTE: dithioerytrol ECF: cloroformiato de etila BSTFA: N,O-bis (trimetilsilil) triuoroacetamida TCMS: trimetilclorosilano

Concentrao encontrada (ng/L)

Referncia

280 (IBU), 240 (NPX), 460 (DCF), 120 (EE2), <LD (PCT, E1, E2, E3)

MIGOWSKA et al., 2012

PCT: Paracetamol DCF Diclofenaco IBU: Ibuprofeno NPX: Naproxeno GEN: Genfibrozila CAF: Cafena BPA: Bisfenol A 4NP: 4-Nonilfenol 4OP: 4-Octilfenol E1: Estrona E2: 17 Esradiol EE2: 17- Etinilestradiol MeEE2: Mestranol E3: Estriol

CLAE/EM: Cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrometria de massas CG/EM: Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas ESI: Ionizao por eletrospray CLUE: Cromatografia lquida de ultra eficincia LVI: large volume injection PTV: programmed temperature vaporiser DAD: Detector de arranjo de diodos Fl: Fluorescncia LD: Limite de deteco LQ: Limite de quantificao

38

2.3.1 Tcnicas cromatogrficas Nos ltimos anos, muitos mtodos para a anlise de contaminantes emergentes em amostras de guas foram publicados. Dentre as tcnicas instrumentais disponveis para quantificao de perturbadores endcrinos e frmacos em amostras ambientais a cromatografia sem dvida a mais utilizada. A cromatografia uma tcnica fsico-qumica de separao. Ela est fundamentada na migrao diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interaes, entre duas fases imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria. A grande variedade de combinaes entre fases mveis e estacionrias a torna uma tcnica extremamente verstil e de grande aplicao (DEGANI et al, 1998). Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) o tipo mais verstil e mais amplamente empregado de cromatografia por eluio. Essa tcnica utilizada para separar e determinar espcies em uma grande variedade de materiais orgnicos, inorgnicos e biolgicos. Na cromatografia lquida, a fase mvel um solvente lquido, o qual contm a amostra na forma de uma mistura de solutos (SKOOG, 2005). Dentre os detectores para a CLAE podemos destacar absorbncia no UV/Vis, fluorescncia e, o mais recentemente usado, espectrmetros de massas. As principais fontes de ionizao empregadas em CLAE/EM so: ionizao por eletronebulizao (electrospray ionization, ESI), ionizao qumica presso atmosfrica (atmospheric pressure chemical ionization, APCI). No entanto, tais mtodos de ionizao so suscetveis a efeitos de matriz, principalmente quando se trata de matrizes complexas como as ambientais, levando aos efeitos de supresso ou aumento do sinal analtico. Tem sido relatado que a ionizao por APCI menos sensvel a efeitos de matriz que a ionizao por eletrospray (WICK et al., 2010; BUCHBERGER, 2011). Cromatografia Gasosa (CG)

Na cromatografia gasosa, os componentes de uma amostra vaporizada so separados em consequncia de sua partio entre uma fase mvel gasosa e uma fase estacionria lquida ou slida contida dentro da coluna. Ao realizar-se uma separao por cromatografia gasosa a amostra vaporizada e injetada na coluna cromatogrfica. A eluio feita por um fluxo de fase mvel gasosa inerte que, em contraste com muitos outros tipos de cromatografia, no

39

interage com as molculas do analito; sendo sua nica funo transportar o analito atravs da coluna (SKOOG, 2005). Essa tcnica recomendada para amostras volteis e termicamente estveis. No entanto, reaes de derivatizao podem ser feitas para compostos no volteis. A derivatizao consiste em uma reao em que o peso molecular da amostra aumentado pela substituio de um grupo proveniente do reagente derivatizante e seu ponto de ebulio ento diminudo pela reduo na polaridade, tornando-se passvel de anlise por CG. Dentre os vrios reagentes derivatizantes podemos citar o pentauorobenzil (PFBr), N,O -bis (trimetilsilil) triuoroacetamida (BSTFA) e o N-(tert-butildimetilsilil)-N-metiltriuoracetamida (MTBSTFA) que conduzem a formao de derivados contendo grupos trimetilsilil (TMS) e tributilsilil (TBS). Todavia, quando se deseja identificar e quantificar compostos, apenas a separao deles pela coluna cromatogrfica e comparao dos tempos de reteno no suficiente, tornando necessrio o emprego de um detector. Vrios so os detectores para a cromatografia gasosa os quais podemos citar: ionizao em chama, condutividade trmica, captura de eltrons, espectrmetro de massas, terminico, condutividade eletroltica, fotoionizao, infravermelho com transformada de Fourier. Neste trabalho foi adotada a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM). 2.3.2 Espectrometria de Massas (EM) Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa o espectrmetro de massas. No caso de um CG, a amostra est na forma de vapor e a entrada deve ser interfaceada entre a presso atmosfrica do sistema de CG e a baixa presso (105 a 108) do sistema do espectrmetro de massas. Um sistema complexo de vcuo necessrio para manter a presso baixa. No espectrmetro de massas, as molculas da amostra entram em uma fonte de ionizao para a consequente ionizao da mesma. As fontes de ionizao para a espectrometria de massas so energticas o suficiente para quebrar as ligaes qumicas das molculas da amostra, mas no suficientemente energticas para decompor as molculas da amostra em seus tomos constituintes, assim como acontece em espectrometria atmica (SKOOG, 2005).

40

Figura 2.18- Diagrama de um espectrmetro de massas

As fontes de ionizao em CG/EM produzem fragmentos, os quais podem tambm ser ionizados. Portanto, os ons das molculas da amostra, denominados ons moleculares, ons de fragmentos e molculas no-ionizadas, saem da fonte de ionizao. As molculas nocarregadas e os fragmentos so normalmente extrados da fonte de ons atravs de bombas de vcuo empregadas para produzir o ambiente de baixa presso. A prxima seo do espectrmetro de massas o estgio analisador. O analisador serve para selecionar os ons de acordo com seus valores de massa carga (m/z). Os ons separados so ento detectados e um grfico contendo a intensidade do sinal gerado pelo on versus m/z produzido pelo sistema de dados (SKOOG, 2005). A fonte de ionizao do espectrmetro de massas utilizado neste trabalho a ionizao por eltrons (IE). Nessa fonte, as molculas so bombardeadas com um feixe de eltrons de alta energia. Isso produz ons positivos (radicais ctions), ons negativos e espcies neutras. Os ons positivos so dirigidos para o analisador por repulso eletrosttica. Em IE, o feixe de eltrons to energtico que muitos fragmentos so produzidos. Esses fragmentos, contudo, so muito teis na identificao das espcies moleculares (SKOOG, 2005). O modo de varredura do espectrmetro de massas um requisito instrumental importante para que a anlise seja realizada. O mais conveniente a varredura em uma faixa de massas completa. Nesse modo SCAN, o espectrmetro realiza uma varredura sobre uma faixa de massas cobrindo todos os ons moleculares e fragmentos produzidos para uma amostra complexa de mltiplos componentes. Massas menores (50 Da) so excludas porque podem fazer parte do background do ar e do gs de arraste. O limite superior baseado na volatilidade dos analitos. Muitos compostos acima da massa molecular de 600 Da, com a exceo de derivados volteis especificamente preparados, tm presso de vapor insuficiente para as anlises. Por isso, para muitos espectrmetros isso representa o mximo da faixa de massas ao usar uma coluna capilar, porque o uso de velocidades de varredura de 0,5 seg/scan tornam-se mais difceis acima dessa faixa (BECKER, 2012).
41

Outro modo de varredura muito utilizado o monitoramento seletivo de on (SIM). Nesse mtodo o analisador de massas pode ser programado para amostrar um ou mais valor de m/z no decorrer da separao cromatogrfica. No monitoramento de apenas um valor de m/z, a sensibilidade aumentada em trs ordens de magnitude, dependendo da faixa de massas, assim o aparelho no gasta tempo no registro de razes m/z que no correspondem aos compostos de interesse. Essa tcnica til pata anlise quantitativa de compostos alvos onde o pico base do anlito normalmente escolhido para o monitoramento de m/z. A anlise por SIM sintetiza a seletividade e sensibilidade do CG-EM (BECKER, 2012). A espectrometria de massa acoplada cromatografia gasosa e lquida so tcnicas ideais para a determinao de contaminantes orgnicos em guas residuais devido ao recurso de separao do CG e CLAE atrelado a seletividade e sensibilidade do espectrmetro de massas. Este acoplamento da cromatografia com deteco de massa seletiva permite a determinao de muitos contaminantes em concentraes por partes por trilho (ppt) ou inferiores (KANDA e GLENDINNING, 2011). 2.3.3 Mtodos de preparao de amostras Embora o uso de EM permita aumentar a sensibilidade, um procedimento de prconcentrao do analito quase sempre necessrio para atingir limites de deteco baixos o suficiente para determinar os nveis residuais em que os contaminantes emergentes esto presentes no ambiente (RODRIGUEZ-MOZAZ et al., 2007). As tcnicas mais utilizadas para extrao ou pr-concentrao de compostos so: extrao lquido-lquido (ELL) ou liquid-liquid extraction (LLE), extrao em fase slida (EFS) ou solid phase extraction (SPE), microextrao em fase slida (MEFS) ou solid phase microextraction (SPME) e extrao com fluido supercrtico (EFS) ou supercritical fluid extraction (SFE). A EFS baseia-se principalmente na imobilizao fsica ou adsoro de certos compostos orgnicos na superfcie de alguns slidos orgnicos ou inorgnicos modificados ou no que so os suportes que preenchem o cartucho de extrao. A seleo dos suportes geralmente baseada nas propriedades dos analitos de interesse a serem extrados (DAS et al., 2012). O ajuste do pH da amostra muitas vezes necessrio para que haja protonao ou desprotonao dos compostos tornando-os compatveis com o recheio e, consequentemente, aumentando a eficincia da extrao (BUCHBERGER, 2011). Quando se trata de matrizes complexas alguns componentes destas podem coeluir com os analitos de interesse durante a
42

extraao. Por isso, em alguns casos, necessria a etapa de clean-up da amostra (BIZKARGUENAGA et al., 2012). A microextrao em fase slida (MEFS) uma tcnica recentemente usada para anlise de multirresduos em amostras ambientais. O princpio da tcnica a extrao de compostos a partir da adsoro destes em uma fibra (polmero ou slido adsorvente) que recobre um tubo de fibra de vidro capilar. A quantidade do composto captada pela fibra proporcional sua concentrao na amostra medida que o equilbrio atingido com auxlio de agitao. Aps a extrao, a fibra de MEFS transferida para a porta de injeo do CG, onde os compostos so dessorvidos (FATTA-KASSINOS et al., 2011). Para compostos volteis feita a extrao indireta (headspace), j que a fibra no entra em contato direto com a soluo. A amostra aquecida e os componentes volteis so extrados para a fibra pelo processo de soro ou partio (OLIVEIRA et al., 2008). O princpio da extrao lquido-lquido (ELL) de dois lquidos imiscveis (fase aquosa e fase orgnica) para a extrao da substncia de interesse se d pelo coeficiente de partio do analito entre as duas fases imiscveis. A eficincia da extrao, portanto, depende da afinidade do soluto pelo solvente extrator e da razo entre as duas fases. No entanto, a ELL tem vrias limitaes tais como baixa recuperao, necessidade de um grande volume de amostra, baixa seletividade alm da limitao para a extrao de compostos hidroflicos (KOLE et al., 2011). Uma variao da ELL convencional foi desenvolvida utilizando baixas temperaturas para facilitar a partio de fases com polaridades prximas. 2.3.3.1 Extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura (ELL-PBT) A partio em baixa temperatura foi primeiramente relatada por Anglin e McKinley (1960) que extraram cera utilizando acetona a -70 oC durante o clean up de extratos de plantas para determinao de DDT (Dicloro-Difenil-Tricloroetano). Em 1997, Juhler extraiu organofosforados em matizes gordurosas da mesma forma, no entanto, a temperatura utilizada foi de -10 oC. Em 2008, Goulart desenvolveu uma metodologia simples e de baixo custo, para anlise de deltametrina e cipermetrina em leite. Este mtodo denominado extrao lquidolquido e purificao por precipitao a baixa temperatura, consiste em colocar a amostra lquida ou slida em contato com um solvente menos denso que a gua e com ponto de fuso abaixo de -20 oC. O sistema agitado e levado ao freezer. Aps um determinado perodo de tempo a fase aquosa congelada e o solvente orgnico ainda na fase lquida separado e
43

analisado por cromatografia. Esta tcnica permitiu determinar piretrides em leite por cromatografia gasosa, sem a necessidade de etapas de clean up. Segundo Goulart 2004, foram avaliados alguns parmetros relevantes na recuperao dos analitos. O solvente acetonitrila proporcionou recuperao maior que 70% para cipermetrina e deltametrina. A proporo amostra/solvente que obteve melhores resultados foi 1:2 (20 mL de leite para 40 mL de acetonitrila). Segundo ele, outros solventes e mesmo as extraes mltiplas no melhoraram a eficincia da extrao. O tempo de contato do solvente com a amostra tambm foi avaliado durante agitao em mesa agitadora. Os resultados indicaram melhores recuperaes no tempo de 20 minutos de agitao a 175 oscilaes por minuto. Alm disso, observou-se que entre 6 h e 48 h de congelamento no houve diferena na recuperao dos analitos. Posteriormente, Vieira et al., (2007) otimizou a tcnica de ELL-PBT para a extrao simultnea de quatro piretrides: -cialotrina, permetrina, deltametrina e cipermetrina, em amostra de gua previamente contaminada com padres dos piretrides. Na otimizao foi empregado um planejamento fatorial completo, 23, para avaliao do comportamento simultneo de trs fatores: proporo entre o volume de gua e acetonitrila (1:1 e 1:2), fora inica pela adio de sal (0,020 mol/L e 0,100 mol/L de NaCl) e tempo de extrao (15 min e 30 min). Pela anlise cromatogrfica, baseando em porcentagem de recuperao, o mtodo otimizado consistiu em proporo amostra/solvente de 1:2, adio de sal na concentrao de 0,020 mol/L, uma vez que o aumento da fora inica dificultou a separao das fases. E por ltimo, os tempos de extrao estudados no tiveram contribuio considerveis para os resultados, portanto optou-se pelo tempo de 15 minutos. Os extratos obtidos do procedimento de purificao por precipitao a baixa temperatura apresentam um aspecto limpo, o que pode ser observado por simples inspeo visual. Outro ponto a ser considerado o menor nmero de etapas necessrias para se obter um extrato adequadamente limpo para anlise cromatogrfica. Isto permite reduzir os riscos de contaminao e perdas de amostras, proporcionando um nvel mais alto de recuperao e de forma mais reprodutiva quando comparado com os procedimentos tradicionais (GOULART, 2004). Em 2010, Goulart analisou trs tipos de carbamato (aldicarbe, carbofuran e carbaril) em gua. Foi utilizado um planejamento fatorial completo 23 para definir as melhores condies da tcnica de extrao. As variveis estudadas foram tempo de extrao em banho ultrassnico (2 min e 10 min), fora inica (0% m/v e 1,5% m/v) e proporo de volume de
44

amostra/solvente (1:1 e 1:2). Aps anlise cromatogrfica (CLAE-UV) as condies que tiveram melhores porcentagens de recuperao (> 90%) foram banho ultrassnico por 10 minutos, fora inica 1,5% m/v de NaCl e proporo de amostra/solvente 1:2 (2 ml de amostra para 4 ml de acetonitrila). A tcnica foi ento validada e aplicada em amostras de gua mineral de diferentes marcas e amostras de gua de rio da regio da Zona da Mata. A ELL-PBT foi utilizada por Magalhes e colaboradores (2012) para anlise em LCMS de diazepnicos em urina de usurios destas drogas. O mtodo foi otimizado levando em conta trs variveis relevantes do mtodo: (1) tipo de congelamento (1 h no freezer e 8 s em nitrognio lquido), (2) fora inica da soluo (0 mol/L e 2,0 mol/L de NaCl) e (3) proporo de volume amostra /solvente (1:1 e 2:1). Os resultados obtidos indicaram que para varivel (1) o tipo de congelamento mais lento obteve recuperao mais elevada. Para a varivel (2) o aumento da fora inica aumentou a recuperao para todos os analitos. J para a varivel (3) foi concludo que a proporo 1:1 de amostra/solvente foi a otimizada uma vez que a proporo 2:1 (1 mL de urina para 0,5 mL de acetonitrila) no proporcionou separao das fases. O mtodo otimizado foi ento validado e aplicado em amostras de urina de usurios dos diazepnicos. Os resultados demonstram claramente que a metodologia proposta simples, rpida e sensvel o suficiente para ser usado como um procedimento de rotina para a determinao de benzodiazepnicos na urina. 2.3.4 Derivatizao A anlise de frmacos por CG muitas vezes inviabilizada devido a algumas caractersticas dessas molculas como polaridade acentuada, baixa volatilidade e instabilidade trmica, o que faz da CLAE a tcnica de escolha. Entretanto a tcnica de CG por ser mais simples, possuir elevado poder de resoluo, sensibilidade adequada, reprodutibilidade e baixo custo se mostra como interessante alternativa para as anlises de frmacos. Para que isso seja possvel necessrio converter molculas polares ou no volteis em suas formas volteis, sendo necessrios processos de derivatizao (XU, et al., 2009). Compostos que contm grupos funcionais tais como carboxila (-COOH), hidroxila (OH), tiol (-SH), amino (-NH2) e imino (=NH) so de difcil anlise por CG, pois no apresentam volatilidade suficiente alm da possibilidade de interaes com os grupos silanis remanescentes da fase estacionria ou at mesmo com as impureza do sistema cromatogrfico, resultando em pior resoluo bem como menor deteco (SCHUMMER et al., 20b09).
45

A derivatizao a substituio dos hidrognios livres ativos das funes qumicas citadas por grupamentos mais apolares que no apresentam a caracterstica de formao de ligaes de hidrognio. Essa substituio resulta em modificaes da estrutura qumica do analito e tambm do perfil de fragmentao do mesmo, possibilitando assim anlise por CG. Com isso, a introduo de alguns elementos ou grupos atravs de derivatizao qumica pode aumentar a resposta do detector ou gerar espectros de massa teis para a elucidao das caractersticas estruturais dos analitos e tambm melhorar a deteco dos analitos em amostras complexas (SEGURA et al., 1998). Apesar dos processos de derivatizao, em geral, serem demorados e onerosos, tcnicas de derivatizao in situ ou online podem ser feitas sem consumo adicional de tempo, visto que estas envolvem simplesmente a adio do reagente na amostra lquida ou a injeo simultnea do derivatizante no cromatgrafo (FERNANDES et al., 2008; XU et al., 2010). A derivatizao crucial para muitas aplicaes em qumica analtica, por exemplo, para assegurar que o analito seja convertido em sua forma adequada anlise, tornando possvel ou aumentando sua detectabilidade (XU et al., 2009). A reao de derivatizao pode ser realizada aps o processo de extrao (derivatizao ps-extrao), isto , converter os analitos em suas formas compatveis com os processos de separao e deteco subsequentes. Esse processo pode ser feito tanto fora do cromatgrafo a gs (derivatizao off-line) quanto dentro do sistema cromatogrfico (derivatizao online). Nessa configurao a derivatizao feita, na maioria das vezes, injetando simultaneamente o derivatizante e a amostra extrada, e pode ser chamado de Injection port derivatization ou on-column derivatization (BASHEER e LEE, 2004; ZHANG e LEE, 2006; MIKI et al., 2008; ZHANG e LEE, 2009). A derivatizao no injetor (online) tem como grande vantagem a reduo significativa do volume de reagente derivatizante que normalmente entre 25 e 200 L para reaes off line. Alm disso, o tempo gasto para esta reao eliminado (MIGOWSKA et al., 2012; ZHANG et al., 2006; NIE et al., 2009). Os principais derivatizantes utilizados em processos de derivatizao no injetor so agentes de sililao como N,O-bis-(Trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA) (DOCHERTY e ZIEMANN, 2001; BAI-JUAN et al., 2007; WU et al., 2009; TZING e DING, 2010) e de trifluoroacetilao como o n-metil bistrifluoroacetamida (MBTFA) (HIDVGI et al., 2006; MIKI et al., 2008). 2.3.4.1 Reao de sililao
46

A sililao o mtodo mais comumente utilizado na derivatizao de compostos orgnicos que possuem hidrognio ativo, sendo que compostos de trimetilsilil (TMS) so os mais utilizados. Essas reaes caracterizam-se por serem simples, rpidas, reprodutveis, em nica etapa e por apresentarem alto rendimento sob condies brandas. Ao realizar uma sililao, bloqueia-se stios prticos, havendo uma reduo de interaes do tipo dipolodipolo, elevando a volatilidade dos compostos, resultando em picos estreitos e simtricos (BECKER, 2012). A reao ocorre atravs de um ataque nucleoflico do tipo SN2. A figura 2.18 representa o mecanismo genrico da reao de sililao. Diferente da derivatizao por acilao, a sililao geralmente no exige o passo de purificao e os derivados podem ser injetados diretamente no CG (SCHUMMER et al., 2009). Figura 2.19- Mecanismo genrico da reao de sililao, onde X varia de acordo com os diferentes derivatizantes. Fonte: (BECKER, 2012)

O reagente derivatizante BSTFA (N,O-bis-(Trimetilsilil) trifluoroacetamida) largamente utilizado uma vez que reage rapidamente com os compostos que possuem hidrognio ativo, tanto o BSTFA quanto seus subprodutos possuem elevada volatilidade resultando em no-coeluio dos primeiros picos eludos e baixa degradao trmica. Alm disso, solvel em solventes orgnicos comumente utilizados nas reaes de derivatizao (HERNANDO et al., 2004). 2.4 Validao O bom desempenho de qualquer tcnica analtica depende crucialmente de dois parmetros: a qualidade das medidas instrumentais e a confiabilidade estatstica dos clculos envolvidos no seu processamento. Uma forma de assegurar a aplicabilidade e o alcance de um mtodo durante as operaes de rotina de um laboratrio estabelecendo os limites destes parmetros por meio da estimativa das figuras de mrito, numa etapa conhecida como validao (RIBEIRO et al., 2008). A validao de determinado procedimento analtico objetiva demonstrar que o mesmo adequado aos objetivos propostos, ou seja, que os parmetros de desempenho avaliados atendem aos critrios de aceitao preconizados. Trata-se de um estudo experimental e
47

integralmente documentado. Alm disso, visa garantir a qualidade metrolgica dos resultados analticos, conferindo-lhes rastreabilidade, comparabilidade e confiabilidade para a tomada de decises (MAPA, 2011). Segundo Ribani e colaboradores (2004) existem dois tipos de validao: a validao no laboratrio, que consiste das etapas de validao realizadas dentro de um laboratrio; e a validao completa, cujo estudo realizado interlaboratorial. Para a validao no laboratrio, a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) confeccionou um guia denominado Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis (THOMPSON, M. et al., 2002), o qual foi selecionado para a validao do mtodo proposto neste trabalho, sendo tomadas as devidas adequaes de acordo com o ambiente operacional. Os parmetros a serem utilizados no decorrente trabalho seguem abaixo: Aplicabilidade Um protocolo deve ser elaborado com identificao dos analitos, a faixa de concentrao utilizada durante a validao, bem como a matriz estudada. Deve estar descrito todo o aparato experimental utilizado desde o armazenamento das amostras at a anlise das mesmas, deixando claro qualquer cuidado especial que se deve ter. Seletividade a garantia de que o mtodo analtico capaz de quantificar com preciso os analitos de interesse na presena de interferentes. No entanto, quando se utiliza o espectrmetro de massas como detector, este garante a seletividade. Curva analtica e linearidade A linearidade corresponde capacidade do mtodo em fornecer resultados diretamente proporcionais concentrao da substncia em exame, dentro de uma determinada faixa de aplicao. No entanto, apenas o coeficiente de correlao no indica a qualidade de ajuste. Pode-se avaliar a linearidade tambm por meio da distribuio do rudo (que o valor do erro entre o valor estimado e o medido). Sendo a distribuio deste rudo homognea, pode-se afirmar que o mtodo tem homocedasticidade, ou seja, que a distribuio dos seus erros homognea. Caso a distribuio seja heterognea, afirma-se que os dados de calibrao so heterocedsticos e, portanto, devem ser analisados por uma regresso ponderada para garantir uma reduo do erro na faixa baixa de concentrao.
48

Para a construes da curva analtica so necessrios: Seis ou mais nveis de calibrao Os nveis de calibrao devem estar uniformemente espaados na faixa de concentrao A faixa de concentrao deve ser de 0 a 150% ou de 50 a 150% do valor de concentrao esperado em amostras reais, e Os nveis de calibrao devem ser analisado em, no mnimo, duplicatas e preferencialmente em triplicatas ou mais nmeros de repetio. A quantificao do composto de interesse em validao pode ser obtida atravs dos mtodos de padronizao externa; padronizao interna; superposio de matriz; adio padro. Neste trabalho foi utilizado o mtodo de padronizao interna que consiste na preparao das solues padro de concentraes conhecidas da substncia de interesse, s quais se adiciona uma quantidade conhecida de um composto chamado padro interno (PI). Aps anlise dessas solues, constri-se um grfico, relacionando a razo de reas dos picos cromatogrficas (rea da substncia/rea do padro interno, que tem concentrao constante) com a concentrao (variada) da substncia. A amostra tambm analisada aps a adio da mesma quantidade conhecida do padro interno. Idealmente, a substncia usada como padro interno deve ser similar substncia a ser quantificada, ter tempo de reteno prximo a esta substncia, no reagir com a substncia ou outro componente da matriz, no fazer parte da amostra e, quando cromatografada, ficar separada de todas as demais substncias presentes na amostra. Porm, quando se trata de uma anlise de mltiplos compostos, o uso de um PI por analito muitas vezes invivel, ainda mais levando em considerao que o PI ideal para este tipo de amostra o padro deuterado do analito em estudo e, este tipo de PI tem custo elevado (RIBANI et al, 2004). Efeito matriz Adicionam-se os compostos de interesse em uma matriz, de preferncia ausente destes compostos, e analisa-a para verificar o comportamento das respostas dos analitos na mesma em relao aos padres em solvente.

49

Exatido Para verificar se o mtodo capaz de quantificar a concentrao real presente na

amostra, realiza-se a verificao da sua exatido. Esta confirmao pode ser realizada de trs maneiras: anlise de material certificado, o qual contm uma concentrao definida dos analitos de interesse e se compara a resposta obtida pelo mtodo em validao com os valores naturais; uma amostra pode ser analisada pelo mtodo em processo de validao e seu resultado comparado com a anlise da mesma amostra por outro mtodo de referncia; e quando no h disponvel um material certificado, nem um mtodo de referncia, pode-se mensurar a exatido realizando a adio de uma concentrao conhecida em uma amostra e verificando se o mtodo capaz de retornar o resultado com o valor verdadeiro adicionado. Esta tcnica de conferncia tambm denominada de adio e recuperao. Preciso Esta caracterstica confere a proximidade entre as medies realizadas pelo mtodo. O valor que indica uma maior ou menor preciso o desvio padro ou o desvio padro relativo (tambm conhecido como coeficiente de variao (C.V.)). A ratificao desta figura de mrito deve ser calculada das seguintes maneiras: repetitividade ou preciso intra-dia: observa-se a variao (C.V.) em replicatas de amostra analisada no mesmo dia.

Limite de deteco (LDM) e Limite de quantificao (LQM) O limite de deteco do equipamento (LD) refere-se menor concentrao do analito

que pode ser distinguida do zero (ou do branco); enquanto o limite de quantificao (LQ) do equipamento indica a menor concentrao que pode ser analisada com uma preciso e exatido dentro dos limites aceitveis. Estes limites podem ser calculados por trs maneiras:

50

 mtodo visual: solues padro diludas so injetadas e visualmente observa-se e constata-se como LD a menor concentrao que pode ser detectada e que se difere do sinal analtico rudo, e o LQ como a menor concentrao quantificvel; mtodo da relao sinal-rudo: aplicado para procedimentos que possuam rudo na linha de base. Sua estimativa feita analisando injees de amostra branco, e admitese o LD como tendo uma relao sinal-rudo de 3:1 ou 2:1, e o LQ com relao de 10:1; e mtodo baseado em parmetros da curva analtica: neste caso o LD ser 3,3 vezes o desvio padro / coeficiente angular da curva analtica, enquanto o LQ ser 10 vezes. Para definir os limites de deteco (LDM) e quantificao (LQM) do mtodo necessrio considerar o fator de concentrao do procedimento de extrao e o ndice de recuperao da extrao, o LD e LQ do equipamento e o efeito matriz. 2.5 Planejamento Experimental e Tratamento de Dados Otimizao e modelo experimental so ferramentas que so usadas para examinar, sistematicamente, diferentes tipos de problemas que surgem no mbito, por exemplo, da investigao, do desenvolvimento e da produo. Quando experimentos so realizados aleatoriamente os resultados obtidos tambm sero aleatrios. Portanto, necessrio planejar os experimentos para que sejam obtidas informaes estatisticamente consistentes. Quando as variveis a serem investigadas so definidas, um modelo experimental escolhido de forma que estime a influncia das diferentes variveis sobre os resultados (LUNDSTEDT, 1998). No estudo de triagem, as interaes entre as variveis, interaes principais e de segunda ordem, podem ser obtidas, normalmente, pelos planejamentos fatoriais completos ou fracionrios. Esse tipo de planejamento experimental de extrema importncia para a compreenso do comportamento de sistemas (TEFILO, 2006). Em um planejamento fatorial so investigadas as influncias de todas as variveis experimentais de interesse e os efeitos de interao na resposta ou respostas. Normalmente, os nveis dos fatores quantitativos (i.e. concentraes de uma substncia, valores de pH, etc.) so nomeados pelos sinais (menos) para o nvel mais baixo e + (mais) para o nvel mais alto, porm o que importa a relao inicial entre o sinal dado e o efeito obtido, no sendo um critrio definido a nomeao dos sinais (TEFILO, 2006). Em muitos casos, a realizao de repeties autnticas pode ser algo inconveniente por diversas razes. Para contornar este infortnio e obter uma boa estimativa dos erros, um
51

experimento normalmente includo no centro do planejamento em que o valor mdio dos nveis de todas as variveis empregado. So os conhecidos experimentos no ponto central (nvel zero). O ponto central recomendado, pois o risco de perder a relao no linear entre os intervalos minimizado e possvel estimar um modelo razovel e verificar se h falta de ajuste. Logicamente no h como fugir das repeties, mas o nmero destas, na maioria dos casos, significativamente reduzido (TEFILO, 2006). Aps a realizao dos experimentos de triagem, os fatores significativos so selecionados e uma metodologia para a otimizao das condies experimentais pode ser executada, por exemplo, anlise de superfcies de respostas. Neste sentido, otimizar significa encontrar os valores das variveis que iro produzir a melhor resposta desejada, isto , encontrar a regio tima na superfcie definida pelas influncias dos fatores. A metodologia de superfcie de resposta baseia-se na construo de modelos matemticos empricos que geralmente empregam funes polinomiais lineares ou quadrticas para descrever o sistema estudado e, consequentemente, possibilitam condies de explorar (modelar e deslocar) o sistema at sua otimizao. Dentre os planejamentos de superfcie de resposta o Composto Central (CCD Central Composite Design) e Doehlert so os mais utilizados para ajustar modelos quadrticos (TEFILO, 2006).

52

Objetivos
O presente trabalho teve como principal objetivo a anlise simultnea de 14

microcontaminantes em amostras de esgoto domstico extrados utilizando a tcnica de extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura (ELL-PBT) e analise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. Os analitos alvo foram frmacos (cido acetilsaliclico, ibuprofeno, paracetamol, genfibrozila naproxeno e diclofenaco), hormnios naturais e sintticos (estrona, estradiol, etinilestradiol e estriol), fenis (bisfenol A, 4-nonilfenol e 4-octilfenol) e cafena. 3.1 Objetivos especficos Otimizar, atravs de planejamento experimental, a tcnica de extrao ELL-PBT Validar a tcnica ELL-PBT utilizando as condies cromatogrficas adequadas para os analitos em questo,. Aplicar a tcnica validada em amostras reais de esgoto bruto e efluentes a fim de avaliar a remoo dos microcontaminantes em vrias etapas de um sistema de tratamento de esgoto (ETE).

53

Materiais e Mtodos
Em todas as etapas do desenvolvimento analtico deste trabalho foram empregados

procedimentos fundamentados no uso de tcnicas com baixo ndice de contaminao, como o manuseio dos materiais com luvas de ltex. Todas as vidrarias foram previamente lavadas com o detergente no inico Extran 12,5 % com o auxlio de uma escova, enxaguadas exaustivamente com gua corrente e, em seguida, enxaguadas com quantidade suficiente de gua ultrapura para retirar os vestgios de gua de torneira. Aps esta etapa, todas as vidrarias foram mantidas imersas, durante 24 h, em soluo de cido ntrico 10 % e, em seguida, enxaguadas exaustivamente com gua ultrapura. As vidrarias no volumtricas foram levadas estufa para sua secagem e as vidrarias volumtricas secaram-se naturalmente em uma bancada limpa. 4.1 Reagentes e vidrarias Padres: 4-nonilfenol, 4-octilfenol, bisfenol A, cafena, diclofenaco, estradiol, etinilestradiol, estriol, estrona, genfibrozila, ibuprofeno, naproxeno, cido acetil saliclico e paracetamol; todos Sigma ou Fluka. Padro interno: 4-nonilfenol deuterado (4-nnonylphenol-2,3,5,6-d 4 ,OD) CDN isotopes. Reagentes (grau HPLC): acetonitrila (J. T. Backer), metanol (J. T. Backer), hidrxido de amnio (Synth), cido clordrico (Proquimios),

bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida com 1% de trimetilclorosilano (BSTFA: 1% TMCS, Sigma), piridina (Merck). Frascos de vidro mbar de 22 mL e 1.000 mL com tampa e batoque em teflon. Sistema para filtrao vcuo (funil de vidro, base suporte em vidro esmerilhado, conexo para vcuo, grampo em alumnio e erlenmeyer (2000 mL)), Phox; Filtros de membrana de celulose (25 m e 8 m), Unifil; Filtros de fibra de vidro (1,2 m), Sartorius; Micropipetas de volumes variados (5,000 mL, 1,000 mL, 200,0 L e 20,00 L) (Eppendorf); pHmetro digital (Tecnal); Coluna cromatogrfica ZB-5HT Inferno - (5 % fenil 95 % dimetil polisiloxano, 30 m 0,25 mm 0,10 m);

54

 Cromatgrafo a gs acoplado ao espectrmetro de massas CG/EM- Shimadzu QP2010S Plus (Shimadzu), equipado com amostrador automtico e controle eletrnico de fluxo; 4.2 Filtrao e armazenamento das amostras As amostras de esgoto bruto coletadas na ETE da bacia do ribeiro Arrudas em Belo Horizonte foram filtradas em um sistema a vcuo em papis de filtro de celulose de 25 m seguidos dos de 8 m para retirar os particulados de maior dimetro. Depois disso, usou-se o filtro de fibra de vidro de 1,2 m. Foram adicionados 10 mL de metanol a cada 1 litro de amostra filtrada a fim de evitar a degradao microbiolgica dos analitos de interesse e armazenadas na geladeira at o momento da extrao. 4.3 Preparo das solues padro Para realizar as anlises e construir as curvas de calibrao analtica foram preparadas solues dos padres de microcontaminantes, listados na tabela 4.1, em metanol, sendo a concentrao da soluo estoque de 1000 mg/L e, a partir desta, foram realizadas diluies para solues de trabalho. O 4-nonilfenol deuterado, usado como padro interno, foi preparado em piridina uma vez que esse foi o solvente escolhido para ressuspender o extrato da amostra para posterior derivatizao e anlise.

55

Tabela 4.1- Informaes e caractersticas fsico-qumicas dos microcontaminantes em estudo

Nome (IUPAC)1 Sigla
HO

CAS2

Estrutura1

M. M. (g)1 220,35046
CH3

pKa2

P. E. (a 760 mmHg)3

Log Kow2

4-nonilfenol (4-nonylphenol) 4-NP 10806-264

HO

104-40-5

10,28

330,64 C

5,76

4-octilfenol (4-octylphenol) 4-OP Bisfenol A (4-[2-(4hydroxyphenyl)propan-2yl]phenol) BPA 80-05-7 Cafena (1,3,7-trimethylpurine-2,6dione) CAF Ibuprofeno (2-[4-(2methylpropyl)phenyl]propanoic acid) Naproxeno ((2S)-2-(6-methoxynaphthalen2-yl)propanoic acid)

CH3

206,32388
CH3

10,38

314,57 C

5,50

HO CH3

OH

228,28634
O H3C N

10,20

400,84 C

3,32

CH3 N

50-08-2
O N CH3
O OH

194,19060
N

10,40

416,79 C

- 0,09

IBU

15687-271

H3C CH3

206,28082
CH3

4,91 5,20
O

319,64 C

3,97

NPX

22204-531

O HO

CH3

230,25916

4,15

403,89 C

3,18

56

Tabela 4.1- Informaes e caractersticas fsico-qumicas dos microcontaminantes em estudo (continuao).

Nome (IUPAC)1 Sigla
O O Na

CAS2

Estrutura1

M. M. (g)1

pKa2

P. E. (a 760 mmHg)3

Log Kow2

Diclofenaco (sodium 2-[2-(2,6dichloroanilino)phenyl]acetate) DCF

Cl

15307-86-5

NH

318,13047
Cl

4,15

411,97 C

4,51

OH

cido acetil saliclico (2-acetyloxybenzoic acid) AAS

67-72-7

H3C O

180,15742

3,504

287,13 C

2,26

Paracetamol (N-(4hydroxyphenyl)acetamide) PCT Genfibrozila (5-(2,5-dimethylphenoxy)-2,2dimethylpentanoic acid) Estrona ((8R,9S,13S,14S)-3-hydroxy13-methyl-7,8,9,11,12,14,15,16octahydro-6Hcyclopenta[a]phenanthren-17one)

103-90-2

NH H3C O

OH

151,16256
CH3 CH3 O

9,38

387,83 C

0,46

GEN

25812-30-0
H3C

CH3 O

OH

250,33338

4,50

394,73 C

4,77

E1

53-16-7
HO

270,36608

10,77

445,17 C

3,13

57

Tabela 4.1- Informaes e caractersticas fsico-qumicas dos microcontaminantes em estudo (continuao).

Nome (IUPAC)1 Sigla Estradiol ((8R,9S,13S,14S,17S)-13-methylE2 6,7,8,9,11,12,14,15,16,17decahydrocyclopenta[a]phenanthrene3,17-diol) Estriol ((8R,9S,13S,14S,!6R,17R)-13-methyl0E3 6,7,8,9,11,12,14,15,16,17decahydrocyclopenta[a]phenanthrene3,16,17-triol) Etinilestradiol ((8R,9S,13S,14S,17R)-17-ethynyl-13EE2 methyl-7,8,9,11,12,14,15,16-octahydro6H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17diol) pKa: constante de dissociao M.M.: massa molar log Kow: coeficiente de partio octanol / gua CAS: Chemical Abstracts Service P.E.: temperatura de ebulio 50-28-1
HO

CAS2

Estrutura1
OH

M. M. (g)1

pKa2

P. E. (a 760 mmHg)3

Log Kow2

272,38196

10,20

445,92 C

4,01

50-27-1

288.38136

10,21

445,92 oC

2,45

HO

CH

57-63-6
HO

296,40336

10,40

457,22 C

4,12

1. (The PubChem Project, 2012) 2. (ChemSpider, 2012) 3. (Toxnet, 2012)

58

4.3- Mltipla extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura (ELLPBT) A tcnica de extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura trata de uma tcnica simples, de fcil execuo e de menor custo, quando comparada a tcnicas comumente usadas para extrao de microcontaminantes. Alm do mais, no relatado na bibliografia o uso da mesma para anlise destes compostos em amostras de esgoto e efluentes. A partir de testes preliminares alguns parmetros puderam ser definidos. Entre eles a escolha da acetonitrila como solvente extrator e a adaptao da tcnica para mltipla extrao utilizando 3 extraes consecutivas sendo cada uma delas realizadas aps 3 horas de resfriamento. Portanto, na etapa de triagem, foi realizado um planejamento fatorial completo 23 com ponto central onde algumas variveis consideradas importantes para que houvesse boa recuperao puderam ser avaliadas, bem como suas interaes. As variveis estudadas foram: V(1) volume do solvente extrator, V(2) fora inica e V(3) pH da amostra. A tabela 4.2 ilustra o planejamento realizado. Tabela 4.2- Planejamento fatorial 23 com ponto central com os nveis codificados e decodificados.
Volume do solvente Fora inica (Na2HPO4) (mL) (mol/L)

Ensaio

pH

1 2 3 4 5 6 7 8 9

- (3) + (4) - (3) + (4) - (3) + (4) - (3) + (4) 0 (3,5)

- (0) - (0) + (0,02) + (0,02) - (0) - (0) + (0,02) + (0,02) 0 (0,010

- (2) - (2) - (2) - (2) + (10) + (10) + (10) + (10) 0 (6)

O ensaio 9, correspondente ao ponto central, foi realizado em quadruplicata. A figura 4.1 ilustra o esquema da extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura. O solvente extrator, acetonitrila, adicionado 3 vezes no intervalo de 3 horas de resfriamento e aps a extrao da fase orgnica.

59

A tcnica de extrao consistiu, ento, no ajuste do pH de 4,0 mL de amostra em 2, 6 ou 10; adio de 0, 0,01 ou 0,02 mol/L de Na2HPO4 amostra, e adio de acetonitrila no volume de 3,0, 3,5 ou 4,0 mL. A mistura agitada em vrtex por 30 segundos e levado ao freezer por 3 horas. Aps o tempo de resfriamento a fase orgnica recolhida e mais uma poro de acetonitrila no volume correspondente ao ensaio adicionada amostra, novamente agitada e levada ao freezer. Essa etapa realizada trs vezes. Aps o recolhimento total da fase orgnica, aproximadamente 9 mL, a mesma seca sob fluxo de nitrognio. Ao frasco seco adicionando 1 mL de metanol e agitado por 1 minuto em vrtex afim de ressuspender o extrato seco, concentrando os analitos. Essa soluo , ento, transferida de 100 em 100 L e seca sob nitrognio em um vial contendo um insert no volume de 200 L. Essa etapa necessria para concentrar ainda mais os analitos e para realizar a reao derivatizao. Aps secar todo o volume no insert adiciona-se os reagentes derivatizantes e o vial levado estufa durante 30 minutos a 80 oC para posterior anlise cromatogrfica. Figura 4.1- Esquema da extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura

4.4- Derivatizao O reagente derivatizante bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), adicionado de uma pequena quantidade (1%) do catalisador trimetilclorosilano (TCMS) para aumentar a eficincia da reao, um dos mais utilizados para anlise de microcontaminantes em

60

amostras ambientais (JIANG et al., 2005; HUANG et al., 2011; STANFORD e WEINBERG, 2007). As condies de derivatizao (tabela 4.3) para os analitos deste estudo foi a otimizada em trabalho anterior no laboratrio em que a pesquisa foi desenvolvida (SANSON, 2012). Tabela 4.3- Condies da reao de derivatizao
Volume do reagente derivatizante Volume do solvente Temperatura 75 L BSTFA + 1% TCMS 25 L Piridina 80 oC Tempo 30 min

A piridina foi selecionada como solvente por solubilizar bem todos os analitos estudados e por ser usada em vrias referncias como Migowska et al., 2012, Zhang et al., 2006 e Vallejo et al., 2010. O volume adicionado j continha o 4-nonilfenol deuterado, utilizado como padro interno, de modo que sua concentrao final nos 100 L fosse 50 g/L. Foram realizados testes utilizando derivatizao on line e bons resultados foram obtidos. Para isso o modo de injeo foi modificado para que amostra e reagente derivatizante fossem injetados simultaneamente permitindo que a reao ocorresse no injetor. A figura 4.2 ilustra o diagrama da seringa para esse tipo de reao. Figura 4.2 - Diagrama da seringa para reao de derivatizao on line

No entanto, devido a contaminaes na coluna cromatogrfica provenientes da anlises de cidos graxos na mesma, no foi possvel continuar utilizando esse mtodo de derivatizao e o procedimento off line foi retomado. 4.5- Condies Cromatogrficas e de Deteco Os microcontaminantes foram analisados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM) utilizando o equipamento GCMS-QP2010 plus, (Shimadzu). As condies cromatogrficas (Tabela 4.4) utilizadas nesta pesquisa foram as mesmas otimizadas no trabalho de Sanson (2011) para esses mesmos analitos.

61

Figura 4.3- GCMS-QP2010 plus (Shimadzu)

62

Tabela 4.4- Parmetros e valores utilizados na metodologia de determinao de microcontaminantes por CG-EM Parmetro Cromatgrafo a gs Injetor Temperatura Modo de injeo Tempo de splitless Forno da coluna Coluna Rampa de Temperatura Fase Mvel Gs de arraste Modo de controle da vazo Presso Vazo Total Vazo da coluna Velocidade linear Razo de diviso Espectrmetro de massas Fonte de ionizao Interface Tempo de corte do solvente Voltagem do detector Tempo total de anlise 250 oC 280 oC 10,5 min 1,07 kV 28,67 min Hlio Velocidade Linear ~ 109,1 kPa 55,3 mL/min 1,46 mL/min 45,0 cm/s 20 ZB-5HT (30 m 0,25 mm 0,10 m) 40C (1 min), aumento para 200 C a 10 C/min; aumento para 260 C a 15 C/min; e aumento para 280 C a 3 C/min (1 min) 280 oC Splitless 0,5 min Valor

4.5.1 Relao Massa / Carga dos microcontaminantes Para identificao e quantificao dos analitos em estudo foram selecionados os valores da razo m/z de cada um, para a anlise no modo de monitoramento de ons SIM, bem como os tempos de reteno. Os ons monitorados foram selecionados atravs do software da Shimadzu e a biblioteca do National Institute of Standards and Technology (NIST). Os ons
63

de maior intensidade foram escolhidos para a quantificao e outros dois monitorados para a identificao (Tabela 4.5). A figura 4.4 ilustra o cromatograma completo dos ons de quantificao. Tabela 4.5- Tempos de reteno e relao m/z dos analitos derivatizados Analito AAS IBU PCT 4-OP 4-NP deuterado 4-NP GEN BPA E1 DCF E2 EE2 E3 Tempo de reteno (min) 12,1 13,3 13,5 15,5 16,5 16,5 16,6 19,1 19,2 19,5 21,9 22,7 23,5 m/z para quantificao 267 160 206 179 183 179 201 357 342 214 416 425 504 m/z para identificao 209; 249 263; 234 280; 116 180; 278 281; 296 292; 277 122; 194 372; 207 257; 218 277; 242 285; 326 300; 285 311; 345

64

Figura 4.4- Cromatograma dos ons de quantificao dos doze analitos estudados.

4.6 Validao do mtodo de quantificao dos microcontaminantes Seletividade: Como a espectrometria de massas garante a seletividade do mtodo, a

mesma foi obtida a partir da comparao dos tempos de reteno e dos cromatogramas dos trs ons selecionados para monitoramento. Curva analtica e ajuste: a curva analtica foi resultante de trs injees de padres

derivatizados nas concentraes de 0,1 g/L a 200 g/L e o padro interno na concentrao fixa de 50 g/L. A linearidade foi obtida plotando-se a mdia das replicatas de cada ponto, com a demonstrao do coeficiente de variao (CV) das replicatas, bem como a verificao do coeficiente de correlao. Efeito matriz: o efeito matriz foi avaliado adicionando a 450 L do extrato da amostra

um volume de 50 L de padro na concentrao de 100 g/L, que aps ser seco sob nitrognio foi ressuspendido para o volume de 100 L. Deste modo a concentrao final adicionada (spiked) foi de 50 g/L. O efeito matriz sobre o analito foi calculado a partir do fator de correo do efeito matriz (FEM). As equaes 1 e 2 indicam como os clculos foram realizados.
65

Onde, Aspike = rea do pico do analito no extrato fortificado com 50 g/L de padro Aamostra = rea do pico do analito no extrato da amostra A
padro de 50 g/L

= rea do padro na concentrao de 50 g/L em solvente, isento da

matriz FEM = Fator de correo do efeito matriz Exatido: a exatido do mtodo foi verificada por adio e recuperao do mtodo de

extrao em trs nveis de concentrao sendo os nveis baixo (10 g/L) e alto (100 g/L) em triplicata e o nvel mdio (50 g/L) realizado em sete replicatas. Considerando a indisponibilidade de um branco da matriz esgoto isenta dos analitos, o ndice de recuperao da extrao foi obtido pela relao da rea do pico no extrato da amostra adicionado de padro (Aamostra) descontada da rea do pico do analito no extrato da amostra sem adio de padro (Abranco) comparada com a rea da soluo padro (Asoluo padro) correspondente ao nvel corrigida do efeito matriz. A equao 3 expressa a frmula utilizada.

Onde, Aamostra = rea do pico do analito no extrato da amostra Abranco = rea do pico do analito no extrato da amostra sem adio de padro Asoluo padro = rea da soluo padro correspondente ao nvel em solvente, isenta de matriz FEM = Fator de correo do efeito matriz Preciso: a preciso do aparelho foi verificada pelo coeficiente de variao de triplicatas de injeo realizadas no mesmo dia, pelo mesmo analista e no mesmo aparelho, em curto espao de tempo. Limite de deteco do mtodo (LDM) e limite de quantificao do mtodo (LQM) Para estabelecer os limites de deteco (LD) e limites de quantificao (LQ) do equipamento CG-EM foram injetadas concentraes decrescentes dos padres. Para a
66

determinao do LD utilizou-se o mtodo da relao sinal-rudo pelo software CG-EM solutions em que se considerou os valores de concentrao cujo sinal analtico fosse trs vezes o rudo. O LQ foi definido como a menor concentrao cujo sinal analtico fosse 10 vezes o rudo. Para determinar os limites de deteco do mtodo (LDM) e limites de quantificao do mtodo (LQM) foi considerado o fator de concentrao e ndice de recuperao do procedimento de extrao, e o efeito matriz. Os LD e LQ foram tomados como valores de referncia assim como os ndices de recuperao do menor nvel de concentrao (10 g/L) estudado. Como descrito na equao 3, para o clculo do ndice de recuperao foi considerado o efeito matriz na resposta dos analitos. Tais consideraes foram feitas de acordo com a equao 4.

Onde, L = Limite de deteco ou limite de quantificao do equipamento FC = Fator de concentrao do procedimento de extrao (neste caso FC = 40) %R = ndice de recuperao do menor nvel de concentrao estudado 4.7 Anlise de amostras reais As amostras de esgoto foram coletadas do Centro de Pesquisa e Treinamento em Saneamento (CePTS) da UFMG, contgua estao de tratamento de esgotos (ETE) da bacia do ribeiro Arrudas, em Belo Horizonte. Foram analisadas amostras de esgoto bruto (P1) e de efluentes UASB (P2) seguido de filtro biolgico percolado (P3) com rotosponge como material de suporte (Figura 4.4). Foi feita apenas uma coleta para verificar a eficincia do mtodo validado bem como avaliar a eficincia de remoo dos microcontaminantes nos tratamentos citados.

67

Figura 4.5- Esquema dos pontos de coleta

As amostras coletadas foram filtradas como descrito no item 4.2, extradas pelo mtodo validado, derivatizadas e analisadas por CG/EM.

68

Resultados e Discusso
5.1 Otimizao do mtodo de extrao Na literatura, o mtodo de extrao de microcontaminantes em matrizes ambientais

mais comumente usado a extrao em fase slida (EFS). Buscando o desenvolvimento de um mtodo simples, de fcil execuo e de menor custo, foram feitos testes preliminares para a execuo do mtodo de extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura (ELLPBT). Na maioria dos trabalhos em que foi utilizada a tcnica ELL-PBT, o solvente extrator que obteve melhores recuperaes foi a acetonitrila (GOULART, 2004; VIEIRA et al, 2007, GOULART et al, 2010; MAGALHES et al, 2012). Em 2010, Pinho e colaboradores extraram pesticidas (clorpirifs, cialotrina, cipermetrina e deltametrina) em amostras de mel utilizando a ELL-PBT. No entanto, o melhor solvente extrator foi a misturas de 4,33 : 1 de acetonitrila e acetato de etila. O acetato de etila um excelente solvente extrator e, por ser menos polar (log Kow = 0,73) que a acetonitrila (log Kow = -0,34), a mistura de ambos uma boa opo. Neste trabalho optou-se por no utilizar o acetato de etila por se tratar de amostras de esgoto e, portanto, muito complexas, podendo ser extrados interferentes dos analitos de interesse e componentes da amostra que poderiam comprometer a corrida cromatogrfica. Foi avaliado previamente o tempo de resfriamento da extrao. Foram testados os tempos de 1, 3 e 12 horas no freezer para extrao dos analitos na concentrao de 12,5 g/L em 4 mL de amostra e 8 mL de acetonitrila. Os extratos foram derivatizados como descrito no item 4.4 e analisados por CG-EM. Os resultados da porcentagem de recuperao para os trs tempos esto apresentados na tabela 5.1. Tabela 5.1- Porcentagem de recuperao estimada pela razo das reas para os tempos de 1, 3 e 12 horas de resfriamento. Analito AAS IBU PCT 4-OP CAF NPX 4-NP GEN 1h 36,2 33,9 50,1 42,0 40,9 33,8 72,5 -4,7 3h 32,2 31,4 39,3 44,8 43,1 29,4 62,7 30,3 12 h 31,9 32,0 39,1 47,4 32,2 31,6 64,8 31,5
69

Tabela 5.1- Porcentagem de recuperao estimada pela razo das reas para os tempos de 1, 3 e 12 horas de resfriamento (continuao) Analito BPA DCF E1 E2 EE2 1h 61,2 72,6 62,7 61,6 54,2 3h 55,6 66,7 59,7 56,3 51,6 12 h 63,3 66,6 55,2 56,9 50,2

possvel observar que no houve grande diferena na recuperao dos analitos para os trs tempos de resfriamento estudado, exceto para a genfibrozila que no foi extrada no tempo de 1 hora. Porm, para esse mesmo tempo, houve dificuldade na extrao da fase orgnica cujo volume foi bem menor do que dos outros dois tempos. A partir disso, com o objetivo de obter uma melhor recuperao de todos os analitos, foi decidido utilizar o mtodo de extrao mltipla. Foi posto que seriam realizadas trs extraes e cada uma delas com tempo de resfriamento de 3 horas. Foi realizado o planejamento fatorial completo 23 com ponto central para o estudo mais completo de variveis que poderiam influenciar na extrao dos analitos. O volume de amostra de esgoto utilizado foi fixo em 4 mL e contaminado com padro de todos os analitos obtendo uma concentrao de 10 g/L. A tabela 5.2 apresenta quais varveis so significativas para cada analito. Tabela 5.2- Valores dos efeitos e do parmetro p ( = 0,05) para cada varivel estudada no planejamento fatorial completo 23 com quadruplicata no ponto central. Os valores em destaque so os que se mostraram significativos de acordo com o valor de p (p < 0,05).
V1 (volume de solvente) 0,5394 0,1978 -0,3803 0,2768 -1,915 -0,05535 0,1860 V2 (fora inica) -0,7236 -0,2077 0,6306 0,04561 0,1194 -0,1593 -0,2923 V3 (pH da amostra) 1,232 0,08622 -0,4494 0,09025 -0,7902 -0,2155 -0,2322

Analito AAS IBU 4-OF CAF 4-NF GEN NPX

Mdia 2,748 1,085 2,842 1,013 4,307 2,020 1,736

p 0,0008 8E-05 1E-06 3E-06 1E-06 8E-06 2E-05

p 0,5107 0,2864 0,0619 0,0123 0,0012 0,7564 0,3853

p 0,3882 0,2664 0,01300 0,5147 0,6363 0,3930 0,2008

p 0,1749 0,6206 0,0384 0,2306 0,0278 0,2654 0,2910 70

Tabela 5.2- Valores dos efeitos e do parmetro p ( = 0,05) para cada varivel estudada no planejamento fatorial completo 23 com quadruplicata no ponto central. Os valores em destaque so os que se mostraram significativos de acordo com o valor de p (p < 0,05) (continuao).
V1 (volume de solvente) -0,1185 -0,2746 -0,09351 -0,1513 0,01620 -0,08897

Analito

Mdia 8,188 0,8338 1,852 1,851 0,6540 1,362

p 1E-06 0,0001 1E-05 6E-07 2E-06 4E-07

p 0,7919 0,1077 0,6148 0,1301 0,6947 0,1622

V2 (fora inica) -0,3154 -0,3680 -0,2073 -0,2035 -0,1451 -0,2556

p 0,4947 0,05040 0,2937 0,06290 0,01940 0,00790

V3 (pH da amostra) -1,131 -0,6058 -0,1556 -0,1815 -0,09111 -0,1950

p 0,05460 0,01040 0,4157 0,08470 0,07650 0,01990

BPA DCF E1
E2 E3 EE2

Para que uma extrao lquido-lquido seja eficiente a proporo amostra/volume do solvente um fator de grande importncia. Espera-se que quanto maior o volume de solvente extrator usado maior ser a quantidade de analito extrado. No entanto, possvel observar pela tabela acima que a varivel 1 volume de solvente se mostrou significativa para apenas dois analitos, sendo para a cafena significativa no nvel positivo (maior volume de solvente) e para o 4-nonilfenol no nvel negativo (menor volume de solvente). A fora inica uma varivel interessante de ser estudada uma vez que a presena de sal diminuiria a solubilidade do solvente em gua devido o efeito de solvatao das molculas de gua pelos ons de sal. Com isso, os analitos de interesse seriam extrados com maior eficincia devido a maior disponibilidade de solvente extrator. No entanto, esta varivel se mostrou significativa para apenas trs analitos, sendo que para dois deles foi significativa no nvel negativo (sem adio de sal). Por fim, o pH teve influncia para quatro analitos e para todos eles no nvel negativo (pH baixo). Para definir quais seriam as condies timas de extrao bem como analisar se haveria necessidade de realizar um planejamento mais aprofundado, como uma superfcie de resposta, por exemplo, tambm foi calculada a porcentagem de extrao dos analitos em cada ensaio realizado no planejamento. Esse clculo foi realizado comparando as reas dos analitos extrados com as reas de um padro na concentrao de 400 g/L considerando o fator de concentrao do mtodo de extrao de 40 vezes. Um branco de cada ensaio foi feito para que pudesse ser descontado nos valores das reas antes de realizar o clculo. A tabela 5.3 mostra
71

as porcentagens encontradas. Cabe ressaltar que os valores de ndice de recuperao so relativos, pois, no consideraram o efeito da matriz na resposta dos analitos nos extratos de esgoto quando comparados com solues em solvente. O paracetamol no est representado na tabela abaixo devido ao fato de que o mesmo no obteve resposta cromatogrfica quando as anlises foram realizadas. Mais tarde, no entanto, foi possvel analis-lo.

72

Tabela 5.3- Porcentagem de extrao dos analitos em cada ensaio do planejamento fatorial completo 23.
Ensaio/Analito 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 AAS 83,3 100,0 43,4 59,6 100,8 111,5 97,5 114,2 58,3 53,4 51,1 48,6 IBU 75,0 76,0 42,3 66,1 67,1 75,0 62,2 74,8 55,5 55,9 50,0 46,8 4OP 52,9 45,5 47,2 31,4 35,4 12,3 39,6 64,0 40,1 40,7 35,5 43,4 CAF 46,2 69,2 61,8 82,6 69,0 81,2 58,5 74,6 66,8 63,9 56,8 61,5 4NP 82,4 39,3 61,9 34,1 51,1 24,2 48,1 58,3 46,1 50,0 43,0 51,2 GEN 94,2 74,0 71,3 74,4 69,0 72,7 68,1 73,6 67,0 64,7 63,2 63,6 NPX 56,6 58,8 39,7 51,1 45,0 48,9 42,9 45,0 41,8 38,7 38,2 41,3 BPA 90,8 82,8 76,4 88,2 77,5 71,5 74,1 71,8 84,4 79,2 73,7 70,3 DCF 65,3 55,6 67,7 60,0 53,8 49,0 27,2 -8,2 43,5 25,5 42,4 42,2

E1 97,1 84,5 80,3 80,6 85,7 79,5 74,1 76,8 75,6 68,1 68,4 69,3

E2 85,9 70,8 60,5 66,8 66,9 62,0 68,5 60,4 69,6 63,6 62,0 62,5

EE2 103,5 82,8 76,1 75,9 80,8 78,2 65,9 69,2 75,7 75,4 72,9 72,8

E3 90,1 79,8 60,9 70,3 71,6 71,0 55,8 64,1 71,2 70,6 67,2 58,7

73

Segundo a tabela acima possvel observar que o ensaio 1 obteve maiores recuperaes para a maioria dos analitos. Tal ensaio foi realizado com todas as variveis no nvel negativo, ou seja, menor volume de solvente extrator estudado, sem adio de sal e amostra com pH cido. Este resultado coerente com a anlise da influncia das variveis, que na maioria das vezes, se apresentaram significativas no nvel mais baixo. Portanto, no se fez necessrio um estudo mais detalhado das variveis e considerou-se como condies timas para o mtodo de mltipla extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura em amostras de esgoto: 4 mL de amostra com pH 2, trs pores de 3 mL de acetonitrila e sem adio de sal, cujo procedimento est exposto na figura 5.1. Figura 5.1- Procedimento de preparao de amostra

5.2 Validao do mtodo Para que o mtodo de extrao de microcontaminantes em amostras de esgoto apresente confiabilidade foi realizada a validao do mesmo. Abaixo seguem os parmetros avaliados. 5.2.1 Seletividade O trabalho foi desenvolvido utilizando espectrometria de massas que, por si s, garante a seletividade do mtodo levando em conta os tempos de reteno dos analitos e a relao entre os ons selecionados para monitoramento como descritos na tabela 4.5.

74

As figuras 5.2, 5.3 e 5.4 indicam os cromatogramas e os espectros de massa dos ons monitorados para p ibuprofeno, 4-octilfenol e estrona, respectivamente. Figura 5.2- Cromatograma e espectro de massa dos ons monitorados do ibuprofeno

75

Figura 5.3- Cromatograma e espectro de massa dos ons monitorados do 4-octilfenol

76

Figura 5.4- Cromatograma e espectro de massa dos ons monitorados da estrona

5.2.2 Curva analtica e ajuste As curvas analticas e ajuste foram obtidas atravs da injeo de padres derivatizados em faixas de concentraes especficas para cada analito. Foi adicionada a cada padro a concentrao de 50 g/L do 4-nonilfenol deuterado usado como padro interno. As curvas foram construdas relacionando a mdia da razo da rea do analito pela rea do PI pela concentrao dos analitos em g/L. A tabela 5.4 mostra a faixa de concentrao usada para cada analito bem como as mdias das razes reas e o coeficiente de variao destas.

77

Tabela 5.4- Faixa de trabalho de cada analito, mdia da razo da rea do microcontaminante pela rea do padro interno de 3 replicatas de injeo e coeficiente de variao dessa mdia Parmetros estatsticos 0,1 1,0
0,082 2,7 0,0095 2,2 0,0069 0,84 0,021 3,0 0,049 4,7 0,0079 6,0 0,039 2,47 0,12 3,2 0,0012 2,1 1,9 0,82 0,0058 3,3 0,0071 2,8 2,1 7,2 0,0098 6,4 0,0099 7,7 0,0029 1,9 0,20 3,8 0,0036 5,0 2,2 3,0 0,038 5,2 0,023 8,5 0,019 4,0 0,13 7,5 0,15 0,85 0,042 8,0 0,52 1,6 0,0072 8,7 0,037 4,5 0,03 5,4 0,10 5,2 0,22 0,45 0,22 1,9 0,14 1,4 0,092 16,6 0,54 1,6 0,62 1,3 0,12 5,2 0,99 4,7 0,035 7,0 3,7 1,3 0,16 1,9 0,037 7,3 0,03 4,9 0,045 5,5

Concentraes utilizadas (g/L) 2,5 5 10 15 25 50

0,31 2,5 0,27 2,2 0,24 7,3 1,1 1,6 1,3 1,0 0,32 3,4 1,9 0,83 0,087 4,6 3,9 2,2 0,32 0,97 0,01 2,4 0,070 2,9

Analitos AAS IBU PCT 4OP 4NP GEN BPA DCF E1 E2 EE2 E3 Mdia CV (%) Mdia CV (%) Mdia CV (%) Mdia CV (%) Mdia CV (%) Mdia CV (%) Mdia CV (%) Mdia CV (%) Mdia CV (%) Mdia CV (%) Mdia CV (%) Mdia CV (%)

75
0,52 0,94 0,41 4,8 0,38 4,6 1,5 0,47 1,9 0,88 0,49 0,98 2,8 1,6 0,14 4,8 4,3 2,6 0,46 2,9 0,14 3,2 0,11 1,6

100

125

150

175

200

0,63 2,5

1,2 0,76

1,6 2,6

0,58 3,2

0,73 4,4

0,90 0,36

0,98 0,57

0,63 2,5

0,74 3,9

0,97 2,6

0,84 1,5

1,38 8,0

2,1 0,69

2,6 0,74

3,2 0,61

4,5 1,2

2,5 0,89

3,3 0,088

3,9 0,87

4,1 0,96

5,4 0,35

0,67 1,8

0,89 0,47

1,1 0,90

1,2 0,18

1,5 0,55

3,7 1,0

5,0 2,7

5,7 2,0

6,0 1,2

7,6 2,1

0,22 1,3

0,27 4,1

0,35 2,7

0,38 2,0

6,0 5,8

7,0 1,8

7,4 1,7

8,2 5,0

0,63 1,9

0,85 4,0

1,0 2,9

1,0 1,1

1,3 2,1

0,20 5,3

0,27 10,9

0,36 0,66

0,41 3,4

0,15 2,1

0,20 3,3

0,24 5,7

0,26 1,1

0,34 3,0

78

As figuras 5.5 a 5.16 mostram as curvas de calibrao bem como as equaes lineares ou quadrticas dependendo do analito e os valores de coeficiente de correlao (R2).

Figura 5.5- Curva analtica para o cido acetil saliclico (0,1 a 200 Figura 5.6- Curva analtica para o ibuprofeno (2,5 a 175 g/L) g/L)
250 200 150 100 50 0 y = -33.638x2 + 185.54x - 12.789 R = 0.9921 0 0.5 1 rea/rea PI 1.5 2 200 Concentrao (g/L) 150 Concentrao (g/L)

y = 169.3x + 2.3259 R = 0.9974

100
50 0 0

0.5 1 rea/rea PI

1.5

Figura 5.7- Curva analtica para o cido paracetamol (2,5 a 200 g/L)
250 Concetrao (g/L) 200 150 100 50 0 0 0.5 rea/rea PI 1 1.5 y = -32.56x2 + 185.28x + 4.8897 R = 0.9983

Figura 5.8- Curva analtica para o 4-octilfenol (2,5 a 200 g/L)

Concentrao (g/L) 250 200 150 100 50 0 0 1

y = 44.92x + 3.993 R = 0.9962

2 3 rea/rea PI

79

Figura 5.10- Curva analtica para a genfibrozila (2,5 a 200 g/L) Figura 5.9- Curva analtica para o 4-nonilfenol (2,5 a 200 g/L)
250 250 Concentrao (g/L) 200 150 100 50 0 0 rea/rea PI 1 2 3 4 5 6 y = 38.327x + 2.3559 R = 0.9938 Concentrao (g/L) 200 150 100 50

y = 136.98x + 5.6423 R = 0.9942

0
0 0.5

1.5

rea/rea PI

Figura 5.11- Curva analtica para o bisfenol A (0,1 a 200 g/L)

250 Concentrao (g/L) 200 150 100 50 0 0 2 4 rea/rea PI 6 8 y = 26.922x - 0.6742 R = 0.995

Figura 5.12- Curva analtica para o diclofenaco (2,5 a 200 g/L)

200 Concentrao (g/L) 150 100 50

y = 418.17x + 8.526 R = 0.9937

0
0 0.1 0.2

0.3

0.4

0.5

rea/rea PI

80

Figura 5.14- Curva analtica para o estradiol (1 a 200 g/L) Figura 5.13- Curva analtica para a estrona (0,1 a 200 g/L)
250 Concentrao (g/L) Concentrao (g/L) 250 200 150 100 50 0 1 3 5 7 9 y = 1.9873x2 + 11.706x - 28.529 R = 0.9827 200 150 100 50 0 0 0.5

y = 149.69x + 1.9264 R = 0.9942

rae/rea PI

1.5

rea/rea PI

Figura 5.15- Curva analtica para o etinilestradiol (0,1 a 175 g/L)

Concentrao (g/L) 200 150 100 50 0 0 0.1 0.2 0.3 rea/rea PI 0.4 0.5 y = -367.38x2 + 568.98x - 1.5091 R = 0.9967

Figura 5.16- Curva analtica para o estriol (2,5 a 20 g/L)

250
Concentrao (g/L) 200 150 100 50

y = 603.88x + 5.9811 R = 0.9911

0
0 0.1

0.2

0.3

0.4

rea/rea PI

81

Foram obtidas regresses lineares ou quadrticas dependendo do analito em questo. Os coeficientes de correlao (R2) encontrados foram sempre maiores que 0,98 para todos os analitos, o que atende ao critrio de linearidade do INMETRO que aceita um valor maior que 0,90. 5.2.3 Limite de deteco e de quantificao Para verificar os limites de deteco e de quantificao do equipamento CG-EM foram injetadas solues padro na faixa entre 0,1 e 10 g/L. O limite deteco estimada foi estabelecido pelo calculo da relao sinal/rudo. A confirmao do LD e LQ do equipamento foi feita pela diluio dos padres at a concentrao estimada, sendo considerada para LD a menor concentrao em que o sinal observado do analito fosse trs vezes maior que o rudo da linha de base. J o limite de quantificao foi estabelecido como sendo a menor concentrao cujo sinal analtico fosse dez vezes maior que o rudo. A tabela 5.5 aponta os limites de deteco e de quantificao do equipamento. Tabela 5.5- Limites de deteco (LD) e limites de quantificao (LQ) do equipamento CGEM. Analito AAS IBU PCT 4-OP 4-NP GEN BPA DCF E1 E2 EE2 E3 LD (g/L) 0,036 0,21 1,02 0,18 0,41 0,49 0,074 0,33 0,0020 0,031 0,024 0,1 LQ (g/L) 0,12 0,70 3,4 0,60 1,4 1,6 0,25 1,1 0,0066 0,10 0,078 0,33

Para os limites de deteco e quantificao do mtodo foi levado em considerao o fator de concentrao de 40 vezes da ELL-PBT, o ndice de recuperao e o efeito matriz. Os valores de LD e LQ do aparelho foram usados como referncia para o clculo, bem como os valores de recuperao e efeito matriz encontrados para o menor nvel de concentrao estudado (10 g/L). A tabela 5.6 mostra os valores encontrados para limites de deteco e quantificao do mtodo.
82

Tabela 5.6- Limites de deteco (LDM) e limites de quantificao (LQM) do mtodo. Analito AAS IBU PCT 4-OP 4-NP GEN BPA DCF E1 E2 EE2 E3 LDM (g/L) 0,00060 0,0064 0,0031 0,0038 0,0038 0,0021 0,0013 0,00053 0,000089 0,00095 0,00041 0,0045 LQM (g/L) 0,0020 0,021 0,011 0,013 0,013 0,0070 0,0046 0,0018 0,00030 0,0032 0,0014 0,015

Os resultados obtidos de LDM e LQM so satisfatrios quando comparados com algumas literaturas. Gomes e colaboradores (2011) obtiveram para o ibuprofeno, estrona e estradiol em amostras de esgoto e efluentes analisados em CG/EM valores de limites de deteco de 0,105, 0,16 e 0,0952 g/L, respectivamente e limite de quantificao de 0,5 g/L para todos eles. Os hormnios estrona, estradiol, etinilestradiol e estriol, tambm analisados por CG/EM, foram estudados por Migowska e colaboradores 2012 que encontraram limites de deteco, em g/L, de: 0,0085 (E1), 0,010 (E2), 0,0081 (EE2) e 0,0068 (E3). 5.2.4 Preciso Para avaliar a preciso do equipamento foi calculado o coeficiente de variao de cinco replicatas de injeo de padro dos microcontaminantes em trs nveis de concentrao de acordo com a faixa de trabalho utilizada para cada analito. Os padres foram preparados e injetados pelo mesmo analista, no mesmo dia, no mesmo equipamento e em curto espao de tempo. Os resultados obtidos esto apresentados na tabela 5.7.

83

Tabela 5.7- Valores do coeficiente de variao de cinco replicatas em trs nveis para cada microcontaminante Analito Concentraes (g/L) 200 75 2,5 175 75 2,5 200 75 2,5 200 75 2,5 200 75 2,5 200 75 2,5 200 75 2,5 175 75 2,5 200 75 2,5 200 75 2,5 175 75 2,5 200 75 2,5 Mdia (rea/rea PI) 1,60 0,52 0,082 0,98 0,41 0,0095 1,38 0,38 0,0069 4,53 1,53 0,021 5,36 1,89 0,049 1,48 0,493 0,0079 7,57 2,76 0,119 0,389 0,141 0,0012 8,24 4,34 2,08 1,34 0,46 0,0098 0,409 0,14 0,0099 0,34 0,10 0,0032 C.V. (%) 2,59 0,94 2,65 0,57 4,81 2,14 8,00 4,58 0,84 1,23 0,466 2,95 0,35 0,88 4,66 0,559 0,982 5,98 2,07 1,61 3,19 2,01 4,83 2,29 4,99 2,64 7,19 2,14 2,87 6,36 3,44 3,16 7,71 2,96 1,61 1,86

AAS

IBU

PCT

4-OP

4-NP

GEN

BPA

DCF

E1

E2

EE2

E3

84

Para todos os analitos foi obtido C.V. variando de 0,578 a 8,00 e, portanto, menor que 20% para os trs nveis estudados o que est de acordo com o critrio de preciso do INMETRO. 5.2.5 Exatido e preciso do mtodo Quando no h disponvel um material de referncia certificado, nem um mtodo de referncia, pode-se mensurar a exatido realizando a adio de uma concentrao conhecida em uma amostra e verificando se o mtodo capaz de retornar o resultado com o valor verdadeiro adicionado. Esta tcnica de conferncia tambm denominada de adio e recuperao (THOMPSON et al., 2002). Para tanto foram avaliadas as recuperaes do mtodo de extrao em trs nveis sendo os nveis baixo e alto realizados em triplicata e o nvel mdio em sete replicatas. A recuperao mdia, calculada de acordo com a equao 3, e o coeficiente de variao das replicatas do mtodo para cada analito nos nveis de 10, 50 e 100 g/L esto apresentados na tabela 5.8. Tabela 5.8- ndice de recuperao da ELL-PBT para trs nveis de concentrao Analito Concentrao (g/L) 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 Recuperao mdia (%) 148,70 121,04 103,11 82,45 45,24 64,78 811,86 109,68 40,00 115,96 29,34 29,95 263,64 47,38 38,67 582,20 70,41 61,42 C.V. (%) 3,09 9,18 3,08 2,99 18,17 7,37 7,22 13,20 7,60 1,24 14,83 2,17 0,84 17,01 5,73 2,795 12,92 13,71 n 3 7 3 3 7 3 3 7 3 3 7 3 3 7 3 3 7 3

AAS

IBU

PCT

4-OP

4-NP

GEN

85

Tabela 5.8 ndice de recuperao da ELL-PBT para trs nveis de concentrao (Continuao). Analito Concentrao (g/L) 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 Recuperao mdia (%) 135,87 26,96 34,06 1536,08 146,82 299,34 55,37 18,79 45,65 82,46 18,37 21,97 141,08 63,50 81,62 55,52 21,17 29,67 C.V. (%) 2,41 14,28 6,97 0,872 7,11 5,68 5,27 12,23 5,70 16,71 15,81 14,24 9,51 16,17 8,70 9,29 15,40 11,16 n 3 7 3 3 7 3 3 7 3 3 7 3 3 7 3 3 7 3

BPA

DCF

E1

E2

EE2

E3

Os valores de C.V. encontrados esto variando entre 0,84 at 18,17sendo todos abaixo de 20% descrito como ideal pelos guias de validao. possvel observar que para a maioria dos analitos foi obtida uma recuperao satisfatria uma vez que se trata de extrao simultnea de compostos com caractersticas fsico-qumicas distintas. Alm disso, trata de uma amostra muito complexa em que pode haver preferncia por interferentes pelo solvente extrator. ndices de recuperao maiores que 100 % podem ser atribudos ao efeito da matriz na transferncia de massa do liner do injetor para a coluna cromatogrfica. No trabalho de Erney e colaboradores (1993), em que analisaram pesticidas organoclorados em matrizes gordurosas, foi observado um aumento nas respostas dos analitos no extrato da matriz em relao s respostas em solvente puro. Isso pode ser explicado pelo fato de que quando os analitos esto no extrato da matriz a adsoro no liner afetada pela competio com coextrativos matriciais. Com isso, quantidades maiores de analitos so transferidos para a coluna cromatogrfica resultando em maior resposta pelo detector.
86

O mesmo fato foi observado por Pinho e colaboradores (2012) que estudaram o a resposta de dois pesticidas, clorpirifs e deltametrina. Eles relataram que, na presena da deltametrina, a resposta do clorpirifs aumentada. Apesar da deltametrina ser a menos polar dos dois pesticidas ela tem maior peso molecular e temperatura de ebulio, fazendo com que ela seja adsorvida preferencialmente nos componentes do injetor (liner, l de vidro e incio da coluna). Desta forma, levando a menor interao do clorpirifs com os componentes do injetor. 5.2.6 Efeito Matriz

O efeito de supresso ou aumento do sinal cromatogrfico conhecido como efeito matriz muito discutido na anlise de traos em amostras complexas. Em cromatografia gasosa componentes da matriz tendem a bloquear locais ativos, principalmente grupos silanis livres, na coluna cromatogrfica e na entrada do CG ocasionando um aumento na resposta (MASTOVSKA et al., 2005). Para determinar o efeito de matriz e seu fator de correo (FEM) foi realizado um spike no extrato da amostra, ou seja, foi adicionada uma concentrao de 50 g/L de padro aos extratos das amostras que foram inicialmente fortificadas para obterem as concentraes finais dos nveis utilizados na etapa de exatido. Quando o efeito matriz maior que 1 indica um efeito aumentativo e se menor que 1 um efeito supressivo. A tabela 5.9 indica os valores do fator de correo de efeito de matriz e o efeito para cada analito em trs nveis de concentrao. Tabela 5.9- Efeito de matriz para cada analito em trs nveis de concentrao Analito Concentrao (g/L) 10 50 100 IBU 10 50 100 10 50 100 FEM
1,61 1,99 2,04 1,29 1,34 1,76 1,97 1,13 0,79

AAS

Supresso ou aumento do sinal Aumento de 61% Aumento de 99% Aumento de 104% Aumento de 29% Aumento de 34% Aumento de 76% Aumento de 97% Aumento de 13% Supresso de 21%
87

PCT

Tabela 5.9 Efeito de matriz para cada analito em trs nveis de concentrao (Continuao) Analito 4-OP Concentrao (g/L) 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 50 100 E1 10 50 100 10 50 100 10 50 100 10 E3 50 100 EM 1,03 1,07 1,20 1,06 1,05 1,14 0,98 0,99 1,36 1,18 1,05 1,43 1,68 1,92 2,78 0,97 0,71 1,26 0,89 0,72 1,03 1,49 1,25 1,95 0,99 0,86 1,33 Supresso ou aumento do sinal Aumento de 3% Aumento de 7% Aumento de 20% Aumento de 6% Aumento de 5% Aumento de 14% Supresso de 2% Supresso de 1% Aumento de 36% Aumento de 18% Aumento de 5% Aumento de 43% Aumento de 68% Aumento de 92% Aumento de 178% Supresso de 3% Supresso de 29% Aumento de 26% Supresso de 11% Supresso de 18% Aumento de 3% Aumento de 49% Aumento de 25% Aumento de 95% Supresso de 1% Supresso de 14% Aumento de 33%

4-NP

GEN

BPA

DCF

E2

EE2

Para a maioria dos analitos, nos trs nveis de concentrao estudados, foi observado um aumento do sinal cromatogrfico devido a matriz. O esgoto domstico uma matriz bastante complexa constituda de muitos componentes que competem com os analitos de interesse no sistema cromatogrfico causando tais resultados. 5.3 Anlise de amostras reais As amostras de esgoto foram coletadas do Centro de Pesquisa e Treinamento em Saneamento (CePTS) da UFMG, contgua estao de tratamento de esgotos (ETE) da bacia
88

do ribeiro Arrudas, em Belo Horizonte. Foram analisadas amostras de esgoto bruto (P1) e de efluentes UASB (P2) seguido de filtro biolgico percolado (P3) com rotosponge como material de suporte. Os filtros biolgicos percoladores so sistemas aerbios de tratamento de esgotos, podendo ser aplicados como etapa de ps-tratamento de efluentes de reatores UASB. Assumindo a etapa de ps-tratamento, o efluente do reator UASB distribudo na parte superior do Filtro Biolgico Percolador (FBP), onde o fluxo de esgoto passa a ter uma trajetria descendente atravs de um material de enchimento. A biomassa presente no volume reacional de filtros biolgicos percoladores se desenvolve caracteristicamente aderida ao meio suporte e assume importante papel na converso de constituintes presentes nos esgotos. O FBP aberto no possui compartimento de decantao, sendo que o biofilme desprendido do meio suporte sai junto com o efluente tratado. No h tambm paredes laterais e laje de fundo falso, proporcionando economias adicionais de concreto. Uma das grandes vantagens de utilizao dos filtros percoladores reside no fato de que a transferncia de oxignio ocorre naturalmente, a partir da circulao do ar atmosfrico pelo material de enchimento, sem a necessidade de equipamentos mecnicos. No FBP aberto, a circulao de ar maior devido inexistncia de paredes (CEPTs, 2012). A tabela 5.10 mostra as concentraes dos analitos encontrados em cada amostra. Tabela 5.10- Concentraes dos analitos encontrados em amostras de esgoto bruto e efluentes UASB e FBP Analito AAS PCT BPA E1 E3 Esgoto bruto (g/L) 72,64 237,49 10,71 436,46 8,10 UASB (g/L) 14,23 9,02 55,30 7,62 FBP (g/L) 6,74 5,00 54,16 7,01

Foi possvel detectar nas amostras de esgoto bruto os frmacos cido acetilsaliclico (AAS) e paracetamol (PCT) que so medicamentos largamente utilizados sem prescrio; o plastificante bisfenol A (BPA) que est presente em embalagens plsticas em geral; e os hormnios naturais estrona (E1) e estriol que metablito da estrona e do estradiol (E3). No primeiro tratamento (UASB) houve reduo significativa do AAS e da E1, alm de no ter sido encontrado o PCT. No entanto, se mostrou pouco eficiente para o BPA e E3. O segundo
89

tratamento (FBP), que ocorre depois do UASB, se mostrou pouco eficiente para a remoo destes compostos uma vez que foram encontrados nesse efluente em concentraes prximas s do efluente anterior. Os demais microcontaminantes no foram encontrados em nenhuma amostra analisada.

90

Concluses
Os microcontaminantes tm despertado a ateno da sociedade cientfica quanto a

ocorrncia destes em amostras ambientais e os efeitos causados sade da biota. A entrada destes compostos no meio ambiente recorrente de vrias rotas humanas e pouco se sabe sobre a remoo nos sistemas de tratamento de esgoto domstico. O fato de estarem em concentraes muito baixas e se tratarem de compostos com variadas caractersticas fsicoqumicas importante obter um mtodo de concentrao e extrao eficiente para a anlise simultnea. Neste trabalho foi desenvolvido o mtodo de mltipla extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura (ELL-PBT) para anlise simultnea em CG-EM de doze microcontaminantes (AAS, IBU, PCT, 4-OP, 4-NP, GEN, DCF, BPA, E1, E2, EE2 e E3) em amostra de esgoto domstico. O mtodo consiste em ajuste do pH da amostra para 2, 3 pores de 3 mL de acetonitrila como solvente extrator e resfriamento por 3 horas para cada extrao. O extrato ento seco em N2, ressuspenso em 1 mL de metanol e seco novamente em vial com insert de 100 L. A esse vial adiciona-se 25 L de piridina e 75 L de BSTFA + 1% TCMS e a mistura levada para a estufa a 80 oC durante 30 minutos para a reao de derivatizao necessria para tornar os analitos passveis de anlise em CG. O extrato foi ento analisado e os microcontaminantes identificados e quantificados por CG-EM nas condies previamente otimizadas. O mtodo foi validado e aplicado em amostras reais de esgoto bruto e efluentes tornando possvel a avaliao da remoo de alguns microcontaminantes encontrados durante o tratamento.

91

Trabalhos Futuros
A partir deste trabalho temos como sugestes para trabalhos futuros Testar outros solventes e misturas destes como solvente extrator; Analisar outras classes de microcontaminantes que sejam passveis de derivatizao; Utilizar a derivatizao on line a fim de consumir o mnimo de reagente derivatizante possvel bem como diminuir o tempo do preparo de amostra; Usar o mtodo de extrao para anlise em CLAE-EM.

92

Referncias Bibliogrficas

ALDAD, T. S.; RAHMANI, N.; LERANTH, C.; TAYLOR, H. S. Bisphenol-A exposure alters endometrial progesterone receptor expression in the nonhuman primate. Fertility and Sterility, v. 96, n. 1, p. 175-179, jul 2011. ANDREW, M. N.; OCONNOR, W. A.; DUNSTAN, R. H.; MACFARLANE, G. R. Exposure to 17-ethynylestradiol causes dose and temporally dependent changes in intersex, females and vitellogenin production in the Sydney rock oyster. Ecotoxicology, v. 19, n. 8, p. 1440-1451, 11 ago 2010. ANGLIN, C.; MCKINLEY, W. P. Procedure for Cleanup of Plant Extracts Prior to Analyses for DDT and Related Pesticides. Agricultural and Food Chemistry, v. 8, n. 3, p. 186-189, 1960. ASIMAKOPOULOS, A. G.; THOMAIDIS, N. S.; KOUPPARIS, M. A. Recent trends in biomonitoring of bisphenol A, 4-t-octylphenol, and 4-nonylphenol. Toxicology Letters, v. 210, n. 2, p. 141-54, 25 abr 2012. BAI-JUAN, Y.; FENG-HUA, J.; XIAO-QIN, X.; JUN-HUI, C.; LEE, F. S. C. Determination of Alkylphenols in Water by Solid-Phase Extraction with On-column Derivatization Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Chinese Journal os Analytical Chemistry, v. 35, n. 5, p. 633-637, 2007. Balfour, J.A. & Heel, R.C. (1990) Transdermal estradiol: A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic efficacy in the treatment of menopausal complaints. Drugs, 40, 561582 BARONTI, C.; CURINI, R.; ASCENZO, G. D. et al. Monitoring Natural and Synthetic Estrogens at Activated Sludge Sewage Treatment Plants and in a Receiving River Water. Environmental Science & Technology, v. 34, n. 24, p. 5059-5066, 2000. BASHEER, C.; LEE, H. K. Analysis of endocrine disrupting alkylphenols, chlorophenols and bisphenol-A using hollow fiber-protected liquid-phase microextraction coupled with injection port-derivatization gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 1057, p. 163-169, 2004. BEAMAN, J.; CO-CHAIR, W.; EIGNOR, D.; HUFF, L. AQUATIC LIFE CRITERIA FOR CONTAMINANTS OF EMERGING CONCERN. Environmental Protection, 2008.
93

BECKER, R. W. Determinao de anti-inflamatrios em efluente urbano na regio de Porto Alegre-RS por SPE, derivatizao e GC-MS. [S.l.]: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2012. BEHERA, S. K.; KIM, H. W.; OH, J.-E.; PARK, H.-S. Occurrence and removal of antibiotics, hormones and several other pharmaceuticals in wastewater treatment plants of the largest industrial city of Korea. The Science of the total environment, v. 409, n. 20, p. 435160, 15 set 2011. BENDZ, D.; PAXUS, N. A.; GINN, T. R.; LOGE, F. J. Occurrence and fate of pharmaceutically active compounds in the environment, a case study: Hoje River in Sweden. Journal of Hazardous Materials, v. 122, p. 195-204, 2005. BILA, D.; DEZOTTI, M. Frmacos no Meio Ambiente. Qumica Nova, v. 26, n. 4, p. 523530, 2003. BILA, D.; DEZOTTI, M. Desreguladores Endcrinos no Meio Ambiente: Efeitos e Consequncias. Qumica Nova, v. 30, n. 3, p. 651-666, 2007. BIZKARGUENAGA, E.; ROS, O.; IPARRAGUIRRE, A. et al. Solid-phase extraction combined with large volume injection-programmable temperature vaporization-gas

chromatography-mass spectrometry for the multiresidue determination of priority and emerging organic pollutants in wastewater. Journal of Chromatography. A, v. 1247, p. 10417, 20 jul 2012. BUCHBERGER, W. W. Current approaches to trace analysis of pharmaceuticals and personal care products in the environment. Journal of chromatography. A, v. 1218, n. 4, p. 603-18, 28 jan 2011. BUENO, M. M. J.; GOMEZ, M. J.; HERRERA, S. et al. Occurrence and persistence of organic emerging contaminants and priority pollutants in five sewage tratment plants of Spain: Two years pilot survey monitoring. Environmental Pollution, v. 164, p. 267-273, 2012. BUERGE, I. J.; POIGER, T.; MULLER, M. D.; BUSER, H.-RUDOLF. Caffeine , an Anthropogenic Marker for Wastewater Contamination of Surface Waters. Production, v. 37, n. 4, p. 691-700, 2003.

94

BUERGE, I. J.; POIGER, T.; MULLER, M. D.; BUSER, H.-RUDOLF. Combined Sewer Overflows to Surface Waters Detected by the Anthropogenic Marker Caffeine. Environmental Science & Technology, v. 40, n. 13, p. 4096-4102, 2006. CELIZ, M. D.; TSO, J.; AGA, D. S. Pharmaceutical Metabolites in the Environment: Aanalytical Challenges and Ecological Risks. Environmental Toxicology, v. 28, n. 12, p. 2473-2484, 2009. CEPTS. Centro de Pesquisa e Treinamento em Saneamento. [S.l: s.n.], [S.d.]. p. 31, 2012 CHAHADE, W. H.; DALVA, R.; GIORGI, N.; SZAJUBOK, J. C. M. Antiinflamatrios no hormonais. Einstein, v. 6, n. Supl 1, p. 166-174, 2008. ChemSpider. .Disponvel em: <http://www.chemspider.com>. Acesso em: 26/12/2012 DANESHVAR, A.; ABOULFADL, K.; VIGLINO, L. et al. Evaluating pharmaceuticals and caffeine as indicators of fecal contamination in drinking water sources of the Greater Montreal region. Chemosphere, v. 88, n. 1, p. 131-9, jun 2012. DAS, D.; GUPTA, U.; DAS, A. K. Recent developments in solid phase extraction in elemental speciation of environmental samples with special reference to aqueous solutions. TrAC Trends in Analytical Chemistry, v. 38, p. 163-171, set 2012. DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: um breve ensaio. Qumica Nova na Escola, v. 7, p. 21-25, 1998. DOCHERTY, K. S.; ZIEMANN, P. J. On-line, inlet-based trimethylsilyl derivatization for gas chromatography of mono- and dicarboxylic acids. Journal of Chromatography A, v. 921, p. 265-275, 2001. ERNEY, D. R.; GILLESPIE, A. M.; GILVYDIS, D. M. Explanation of the matrix-induced chromatographic response enhancement of organophosphorus pesticides during open tubular column gas chromatography with splitless or hot on-column injection and flame photometric detection. Journal of Chromatography, v. 638, p. 57-63, 1993. FATTA-KASSINOS, D.; MERIC, S.; NIKOLAOU, A. Pharmaceutical residues in environmental waters and wastewater: current state of knowledge and future research. Analytical and bioanalytical chemistry, v. 399, n. 1, p. 251-75, jan 2011.

95

FENT, K.; WESTON, A. A; CAMINADA, D. Ecotoxicology of human pharmaceuticals. Aquatic toxicology (Amsterdam, Netherlands), v. 76, n. 2, p. 122-59, 10 fev 2006. FERNANDES, C.; HOECK, E. VAN; SANDRA, P.; LANAS, F. M. Determination of fluoxetine in plasma by gas chromatography-mass spectrometry using stir bar sorptive extraction. Analytica Chimica Acta, v. 614, n. 2, p. 201-7, 5 maio 2008. FILHO, R. W. R.; ARAJO, J. C.; VIEIRA, E. M. Hormnios Sexuais Estrgenos: Contaminantes Emergentes. Qumica Nova, v. 29, n. 4, p. 817-822, 2006. GABET, V.; MIGE, C.; BADOS, P.; COQUERY, M. Analysis of estrogens in environmental matrices. Trends in Analytical Chemistry, v. 26, n. 11, p. 1113-1131, dez 2007. GISLAINE GHISELLI. Avaliao da Qualidade das guas Destinadas ao Abastecimento Pblico na Regio de Campinas: Ocorrncia e Determinao dos Interferentes Endcrinos ( IE ) e Produtos Farmacuticos e de Higiene Pessoal ( PFH P ) Aluna: Gislaine Ghiselli Orientador: Wilson. [S.l.]: Universidade Estadual de Campinas, 2006. GHISELLI, G.; JARDIM, F. W. Interferentes Endcrinos no Ambiente. Qumica Nova, v. 30, n. 3, p. 695-706, 2007. GLADE, M. J. Caffeine-Not just a stimulant. Nutrition (Burbank, Los Angeles County, Calif.), v. 26, n. 10, p. 932-8, out 2010. GOODMAN GILMAN, A. Goodman & Gilman, As bases farmacolgicas da teraputica. 10a ed. Mc Graw Hill, 2005. GOMES, P. C. F. DE L.; BARLETTA, J. Y.; NAZARIO, C. E. D. et al. Optimization of in situ derivatization SPME by experimental design for GC-MS multi-residue analysis of pharmaceutical drugs in wastewater. Journal of separation science, v. 34, n. 4, p. 436-45, fev 2011. GMEZ, M. J.; BUENO, M. M. J.; LACORTE, S.; FERNNDEZ-ALBA, A. R.; AGUERA, A. Pilot Survey monitoring pharmaceuticals and related compounds in a sewage treatment plant located on the Mediterranean coast. Chemosphere, v. 66, p. 993-1002, 2007.

96

GOULART, S. M.; QUEIROZ, M. E. L. R. DE; NEVES, A. A.; QUEIROZ, J. H. DE. Lowtemperature clean-up method for the determination of pyrethroids in milk using gas chromatography with electron capture detection. Talanta, v. 75, n. 5, p. 1320-3, 15 jun 2008. GOULART, S. M.; ALVES, R. D.; NEVES, A. A. et al. Optimization and validation of liquid-liquid extraction with low temperature partitioning for determination of carbamates in water. Analytica chimica acta, v. 671, n. 1-2, p. 41-7, 25 jun 2010. HATCH, E. E.; NELSON, J. W.; STAHLHUT, R. W.; WEBSTER, T. F. Association of endocrine disruptors and obesity: perspectives from epidemiological studies. International journal of andrology, v. 33, n. 2, p. 324-32, abr 2010. HEBERER, T. Tracking persistent pharmaceutical residues from municipal sewage to drinking water. Journal of Hydrology, v. 266, n. 3-4, p. 175-189, set 2002. HERNANDO, M. D.; MEZCUA, M.; GMEZ, M. J. et al. Comparative study of analytical methods involving gas chromatographymass spectrometry after derivatization and gas chromatographytandem mass spectrometry for the determination of selected endocrine disrupting compounds in wastewaters. Journal of Chromatography A, v. 1047, p. 129-135, 2004. HIDVGI, E.; PTER, F.; HIDEG, Z.; SOMOGYI, G. GCMS determination of amphetamines in serum using on-line triuoroacetylation. Forensic Science International, v. 161, p. 119-123, 2006. HUANG, B.; PAN, X.-J.; WAN, X. et al. Simultaneous Determination of Steroid Endocrine Disrupting Chemicals in Water by Solid Phase Extraction-Derivatization-Gas

Chromatographic-Mass Spectrometry. Chinese Journal of Analytical Chemistry, v. 39, n. 4, p. 449-454, 2011. IARC, ESTROGEN-ONLY MENOPAUSAL THERAPY. IARC Monographs, 2012. INMETRO- Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial. DOQCGCRE-008: Orientaes sobre validao de mtodos analticos. Rio de Janeiro, n.3, p.1-20 2010.

97

JARDIM, W. F.; MONTAGNER, C. C.; PESCARA, I. C. et al. An integrated approach to evaluate emerging contaminants in drinking water. Separation and Purification Technology, v. 84, p. 3-8, jan 2012. JIANG, J. Q.; YIN, Q.; ZHOU, J. L.; PEARCE, P. Occurrence and treatment trials of endocrine disrupting chemicals (EDCs) in wastewaters. Chemosphere, v. 61, n. 4, p. 544-50, out 2005. JORDO, E.P; PESSOA, C.A. Tratamento de Esgotos Domsticos. 3.ed., Rio de Janeiro: Associao Brasileira de Engenharia Sanitria ABES, 1995 681 p. JUHLER, R. K. Optimized method for the determination of organophosphorus pesticides in meat and fatty matrices. Journal of chromatography. A, v. 786, n. 1, p. 145-53, 24 out 1997. KANDA, R.; GLENDINNING, R. Mass spectrometry for environmental and wastewater monitoring. Spectroscopy Europe, v. 23, n. 5, 2011. KIDD, K. A.; BLANCHFIELD, P. J.; MILLS, K. H. et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Procedings of the Nacional Academy of Sciences, v. 104, n. 21, p. 8897-8901, 2007. KOLE, P. L.; VENKATESH, G.; KOTECHA, J.; SHESHALA, R. Recent advances in sample preparation techniques for effective bioanalytical methods. Biomedical chromatography: BMC, v. 25, n. 1-2, p. 199-217, jan 2011. KOSTOPOULOU, M.; NIKOLAOU, A. Analytical problems and the need for sample preparation in the determination of pharmaceuticals and their metabolites in aqueous environmental matrices. Trends in Analytical Chemistry, v. 27, n. 11, p. 1023-1035, dez 2008. KUMAR, A.; WILLIAMS, M.; WOODS, M. et al. Treated effluent in the aquatic environment: impact assessment of endocrine disrupting chemicals. [S.l: s.n.], 2012. KMMERER, K. Pharmaceuticals in the Environment. Annual Review of Environment and Resources, v. 35, n. 1, p. 57-75, 21 nov 2010. LIU, J.; WANG, R.; HUANG, B. et al. Biological effects and bioaccumulation of steroidal and phenolic endocrine disrupting chemicals in high-back crucian carp exposed to wastewater treatment plant effluents. Environmental Pollution, v. 162, p. 325-31, mar 2012.
98

LUNDSTEDT, T.; SEIFERT, E.; ABRAMO, L. et al. Experimental design and optimization. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, v. 42, n. 1-2, p. 3-40, ago 1998. MAGALHES, E. J.; NASCENTES, C. C.; AUGUSTI, R. et al. Fast Determination of Benzodiazepines in Human Urine via Liquid-Liquid Extraction with Low Temperature Partitioning and LC-HRMS. American Journal of Analytical Chemistry, v. 03, n. 02, p. 118-124, 2012. MAGNR, J.; FILIPOVIC, M.; ALSBERG, T. Application of a novel solid-phase-extraction sampler and ultra-performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass spectrometry for determination of pharmaceutical residues in surface sea water. Chemosphere, v. 80, n. 11, p. 1255-60, set 2010. MAPA. Validao e Controle de Qualidade Analtica: frmacos em produtos para alimentaao e medicamentos veterinrios. [S.l: s.n.], 2011. p. 72 MARIA, C. A. B.; MOREIRA, R. F. A. Cafena: reviso sobre mtodos de anlises. Qumica Nova, v. 30, n. 1, p. 99-105, 2007. MARTN, J.; CAMACHO-MUOZ, D.; SANTOS, J. L.; APARICIO, I.; ALONSO, E. Occurrence of pharmaceutical compounds in wastewater and sludge from wastewater treatment plants: Removal and ecotoxicological impact of wastewater discharges and sludge disposal. Journal of hazardous materials, v. 239-240, p. 40-7, 15 nov 2012. MARTN, J.; CAMACHO-MUOZ, M. A D.; SANTOS, J. L.; APARICIO, I.; ALONSO, E. Distribution and temporal evolution of pharmaceutically active compounds alongside sewage sludge treatment. Risk assessment of sludge application onto soils. Journal of Environmental Management, v. 102, p. 18-25, 15 jul 2012. MASTOVSK, K.; LEHOTAY, S. J.; ANASTASSIADES, M. Combination of Analyte Protectants To Overcome Matrix Effects in Routine GC Analysis of Pesticide Residues in Food Matrixes. Analytical Chemistry, v. 77, n. 24, p. 8129-8137, 2005. MIGOWSKA, N.; CABAN, M.; STEPNOWSKI, P.; KUMIRSKA, J. Simultaneous analysis of non-steroidal anti-inflammatory drugs and estrogenic hormones in water and wastewater samples using gas chromatography-mass spectrometry and gas chromatography with electron capture detection. The Science of the total environment, v. 441, p. 77-88, 15 dez 2012.

99

MIKI, A.; KATAGI, M.; ZAITSU, K.; NISHIOKA, H.; TSUCHIHASHI, H. Development of a two-step injector for GC-MS with on-column derivatization, and its application to the determination of amphetamine-type stimulants (ATS) in biological specimens. Journal of Chromatography. B, v. 865, n. 1-2, p. 25-32, 1 abr 2008. NIE, Y.; QIANG, Z.; ZHANG, H.; ADAMS, C. Determination of endocrine-disrupting chemicals in the liquid and solid phases of activated sludge by solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry. Journal of chromatography. A, v. 1216, n. 42, p. 707180, 16 out 2009. NOBEL. Disponvel em http://laboratorionobel.com.br Acesso em 27/12/2012 NDLER, K.; LICHA, T.; BESTER, K.; SAUTER, M. Development of a multi-residue analytical method, based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry, for the simultaneous determination of 46 micro-contaminants in aqueous samples. Journal of chromatography. A, v. 1217, n. 42, p. 6511-21, 15 out 2010. OLIVEIRA, A. R. M.; MAGALHES, I. R. DOS S.; SANTANA, F. J. M.; Bonato, P. S. Microextrao em Fase Lquida (LPME): Fundamentos da Tcnica e Aplicaes na Anlise de Frmacos em Fluidos Biolgicos. Qumica Nova, v. 31, n. 3, p. 637-644, 2008. PINHO, G. P.; SILVRIO, F. O.; NEVES, A. A.; QUEIROZ, M. E. L. R. DE. Evaluation of pesticide adsortion in gas chromatographic injector and column. Qumica Nova, v. 35, n. 4, p. 738-742, 2012. RAIMUNDO, C. C. M. Ocorrncia de interferentes endcrinos e produtos farmacuticos nas guas superficiais da bacia do rio Atibaia. [S.l.]: Universidade Estadual de campinas, 2007. RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.; MELO, L. F. C. Validao em Mtodos Cromatogrficos e Eletroforticos. Qumica Nova, v. 27, n. 5, p. 771780, 2004. RIBEIRO, F. A. DE L.; FERREIRA, M. M. C.; MORANO, S. C.; SILVA, L. R.; SCHNEIDER, R. P. Planilha De Validao: Uma Nova Ferramenta para Estimar Figuras de Mrito na Validao de Mtodos Analticos Univariados. Fabiana Alves de Lima Ribeiro e Mrcia Miguel Castro Ferreira*. Qumica Nova, v. 31, n. 1, p. 164-171, 2008.

100

RODRIGUEZ-MOZAZ, S.; LOPEZ DE ALDA, M. J.; BARCEL, D. Advantages and limitations of on-line solid phase extraction coupled to liquid chromatography-mass spectrometry technologies versus biosensors for monitoring of emerging contaminants in water. Journal of Chromatography. A, v. 1152, n. 1-2, p. 97-115, 8 jun 2007. SAAL, F. S. VOM; NAGEL, S. C.; COE, B. L.; ANGLE, B. M.; TAYLOR, J. A. The estrogenic endocrine disrupting chemical bisphenol A (BPA) and obesity. Molecular and cellular endocrinology, v. 354, n. 1-2, p. 74-84, 6 maio 2012 SALSTE, L.; LESKINEN, P.; VIRTA, M.; KRONBERG, L. Determination of estrogens and estrogenic activity in wastewater effluent by chemical analysis and the bioluminescent yeast assay. The Science of the Total Environment, v. 378, n. 3, p. 343-51, 1 jun 2007. SALVIA, M.-V.; VULLIET, E.; WIEST, L.; BAUDOT, R.; CREN-OLIV, C. Development of a multi-residue method using acetonitrile-based extraction followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of steroids and veterinary and human drugs at trace levels in soil. Journal of chromatography. A, v. 1245, p. 122-33, 6 jul 2012. SANTOS, L. H. M. L. M.; ARAJO, A N.; FACHINI, A. et al. Ecotoxicological aspects related to the presence of pharmaceuticals in the aquatic environment. Journal of hazardous materials, v. 175, n. 1-3, p. 45-95, 15 mar 2010. SANSON, A. L. Metodologia para Determinao Simultnea de Microcontaminantes Orgnicos em gua Superficial por CG-EM e Quimiometria. [S.l.]: Universidade Federal de Ouro Preto, 2012. SEGURA, J.; VENTURA, R.; JURADO, C. Derivatization procedures for gas chromatographic-mass spectrometric determination of xenobiotics in biological samples, with special attention to drugs of abuse and doping agents. Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications, v. 713, n. 1, p. 61-90, 21 ago 1998. SCHUMMER, C.; DELHOMME, O.; APPENZELLER, B. M. R.; WENNIG, R.; MILLET, M. Comparison of MTBSTFA and BSTFA in derivatization reactions of polar compounds prior to GC/MS analysis. Talanta, v. 77, n. 4, p. 1473-82, 15 fev 2009.

101

SHIN, H.-S.; OH, J.-A. Simultaneous determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs in river water by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Separation Science, v. 35, n. 4, p. 541-7, fev 2012. SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J. Fundamentos de Qumica Analtica. 8. ed. [S.l: s.n.], 2005. p. 1124 STANFORD, B. D.; WEINBERG, H. S. Isotope dilution for quantitation of steroid estrogens and nonylphenols by gas chromatography with tandem mass spectrometry in septic, soil, and groundwater matrices. Journal of chromatography. A, v. 1176, n. 1-2, p. 26-36, 28 dez 2007. SUMPTER, J. P.; JOHNSON, A. C. 10th Anniversary Perspective: Reflections on endocrine disruption in the aquatic environment: from known knowns to unknown unknowns (and many things in between). Journal of environmental monitoring, v. 10, n. 12, p. 1476-85, dez 2008. SVENSON, A.; ALLARD, A. S.; EK, M. Removal of estrogenicity in Swedish municipal sewage treatment plants. Water Research, v. 37, n. 18, p. 4433-43, nov 2003. TEFILO, R. F.; FERREIRA, M. M. C. Quimiometria II: Planilhas Eletrnicas para Clculos de Planejamentos Experimentais, Um Tutorial. Qumica Nova, v. 29, n. 2, p. 338-350, 2006. The PubChem Project. Disponvel em: <http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/>. Acesso em: 26/12/2012 THOMPSON, M.; ELLISON, S. L. R.; WOOD, R. HARMONIZED GUIDELINES FOR SINGLE- LABORATORY VALIDATION OF METHODS OF ANALYSIS. Pure and Applied Chemistry, v. 74, n. 5, p. 835-855, 2002. TOMKOV, H.; AUFARTOV, J.; SOLICH, P. et al. High-sensitivity analysis of femalesteroid hormones in environmental samples. Trends in Analytical Chemistry, v. 34, p. 3558, abr 2012. TOMPSETT, A. R.; WISEMAN, S.; HIGLEY, E. et al. Effects of 17-ethynylestradiol on sexual differentiation and development of the African clawed frog (Xenopus laevis). Comparative bBochemistry and Physiology, Part C, v. 156, n. 3-4, p. 202-10, nov 2012. Toxnet. Disponvel em: <http://toxnet.nlm.nih.gov/>. Acesso em: 26/12/2012.
102

TZING, S.-H.; DING, W.-H. Determination of melamine and cyanuric acid in powdered milk using injection-port derivatization and gas chromatographytandem mass spectrometry with furan chemical ionization. Journal of Chromatography A, v. 1217, p. 6267-6273, 2010. U.S. EPA. Special Report on Environment Endocrine Disruption: An Efects Assessment and Analysis. 1997. U.S. EPA. Method 1694: Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water , Soil , Sediment , and Biosolids by HPLC / MS / MS. 2007. VALLEJO, A; FERNNDEZ, L. A; OLIVARES, M. et al. Optimization of large volume injection-programmable temperature vaporization-gas chromatography-mass spectrometry analysis for the determination of estrogenic compounds in environmental samples. Journal of Chromatography. A, v. 1217, n. 52, p. 8327-33, 24 dez 2010. VEGA-MORALES, T.; SOSA-FERRERA, Z.; SANTANA-RODRGUEZ, J. J.

Determination of alkylphenol polyethoxylates, bisphenol-A, 17-ethynylestradiol and 17estradiol and its metabolites in sewage samples by SPE and LC/MS/MS. Journal of hazardous materials, v. 183, n. 1-3, p. 701-11, 15 nov 2010. VIEIRA, H.; NEVES, A.; QUEIROZ, M. Otimizao e validao da tcnica de extrao lquido-lquido com partio em baixa temperatura (ELL-PBT) para piretrides em gua e anlise por CG. Qumica Nova, v. 30, n. 3, p. 535-540, 2007. VOOJIS, G. P.; GEURTS, T. B. P. Review of the endometrial safety during intravaginal treatment with estriol. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, v. 62, p. 101-106, 1995. WICK, A.; FINK, G.; TERNES, T. A. Comparison of electrospray ionization and atmospheric pressure chemical ionization for multi-residue analysis of biocides, UV-filters and benzothiazoles in aqueous matrices and activated sludge by liquid chromatographytandem mass spectrometry. Journal of chromatography. A, v. 1217, n. 14, p. 2088-103, 2 abr 2010. WU, J.; HU, R.; YUE, J.; YANG, Z.; ZHANG, L. Determination of fecal sterols by gas chromatographymass spectrometry with solid-phase extraction and injection-port

derivatization. Journal of Chromatography A, v. 1216, p. 1053-1058, 2009.

103

XU, L.; BASHEER, C.; LEE, H. K. Chemical reactions in liquid-phase microextraction. Journal of chromatography. A, v. 1216, n. 4, p. 701-7, 23 jan 2009. XU, L.; JIANG, M.; LI, G. Injection port derivatization following sonication-assisted ion-pair liquid-liquid extraction of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Analytica Chimica Acta, v. 666, n. 1-2, p. 45-50, 7 maio 2010. ZHANG, Z. L.; HIBBERD, A; ZHOU, J. L. Optimisation of derivatisation for the analysis of estrogenic compounds in water by solid-phase extraction gas chromatography-mass spectrometry. Analytica chimica acta, v. 577, n. 1, p. 52-61, 1 set 2006. ZHANG, J.; LEE, H. K. Application of liquid-phase microextraction and on-column derivatization combined with gas chromatography-mass spectrometry to the determination of carbamate pesticides. Journal of chromatography. A, v. 1117, n. 1, p. 31-7, 2 jun 2006. ZHANG, J.; LEE, H. K. Application of dynamic liquid-phase microextraction and injection port derivatization combined with gas chromatography-mass spectrometry to the determination of acidic pharmaceutically active compounds in water samples. Journal of Chromatography. A, v. 1216, n. 44, p. 7527-32, 30 out 2009. ZOCOLO, G. J.; SOUSA, A. C.; LOPES, M. N. T.; MARCHI, M. R. R. Determination of estrogens (estriol, estradiol, estrone and ethynylestradiol) in river water from a rural area in Midwest Brazil. Toxicology Letters, v. 196, n. 2010, p. S62-S63, jul 2010.

104