Introduccin a la Enzimologa

Catlisis

Ea Ea DG DG

Reaccin no catalizada

Reaccin catalizada

Enzima: Protena dotada de actividad cataltica - Enzimas proteolticas - Desnaturalizacin de enzimas - Purificacin de enzimas - Sntesis completa de una enzima

A partir de 1982, se sabe que no todas las enzimas son protenas; existen molculas de RNA con actividad cataltica, las llamadas ribozimas

Las enzimas cumplen su papel cataltico gracias a: - Fijacin estereoqumicamente complementaria del substrato - Transformacin cataltica del mismo En ambas funciones participan: - Cadenas laterales de los aminocidos - Grupos o molculas no proteicas: - Grupos prostticos - Iones metlicos - Cofactores

En la catlisis qumica se distingue entre:

- Catlisis homognea, cuando catalizador y reactivos estn en la misma fase fsicoqumica: Por ejemplo, la hidrlisis cida de la sacarosa. - Catlisis heterognea, cuando catalizador y reactivos estn en distinta fase fsicoqumica: por ejemplo, la reaccin en fase gaseosa entre N2 y H2 para formar amonaco (proceso Haber), que es catalizada por metales (slidos)
La catlisis enzimtica tiene caractersticas de ambas

Los siguientes hechos: - Especificidad de la reaccin enzimtica - Carcter heterogneo de la catlisis enzimtica

Nos llevan a postular la existencia de un Centro Activo en la molcula de enzima, capaz de: - Fijar especficamente al substrato - Transformarlo catalticamente.

Lisozima y su substrato

Substrato: molcula(s) sobre la(s) que acta la enzima

Actividad enzimtica: velocidad a la que cursa la reaccin enzimtica Velocidad: variacin de la concentracin en la unidad de tiempo Unidades: katal: moles.s-1 U.I.: mmoles.min-1 (a 25C)

La velocidad es directamente proporcional de la concentracin de enzima; por tanto, la velocidad es una medida de la concentracin de enzima en una preparacin.

Activador: Agente que aumenta la actividad enzimtica Inhibidor: Agente que disminuye la actividad enzimtica

Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima:

E+I EI

Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima:

E+I E

Cofactor (Coenzima): tomo, ion o molcula que participa en el proceso cataltico sin ser enzima ni substrato.

Los cofactores participan de dos maneras distintas:

1. A travs de una fijacin muy fuerte a la protena y salen sin ser modificados del ciclo cataltico 2. Como un segundo substrato; salen modificados del ciclo cataltico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original.

Aminocido R CH COO- + O2 + H2O NH3+

LAO

Cetocido R CO COO- + H2O2 + NH4+

LAO: L-aminocido oxidasa: es una flavoprotena Las flavoprotenas tienen un grupo prosttico flavnico, que interviene en el proceso cataltico sin salir modificado del mismo
O H3C H3C N NH N NH O

Piruvato COOC O CH3 NADH + H+ NAD+

L-Lactato

LDH

COOHO C H CH3

LDH: Lactato deshidrogenasa

Utiliza como cofactor NADH, el cual sale de la reaccin oxidado a NAD+. La regeneracin a NADH requerira otra enzima.

Isoenzimas: formas moleculares distintas de una enzima dentro del mismo organismo Hexokinasa: Presenta, al menos, cuatro formas distintas - Heptica - Cerebral - Muscular - Eritrocitaria Las isoenzimas representan formas que tienen que ver con la diferenciacin celular, presentando distintas caractersticas funcionales.

Especificidad de las enzimas, 1

Especificidad absoluta:

COOCH CH COOFumarato (trans-)

H 2O

COOHO CH CH2 COOL-Malato

Enzima: Fumarato hidratasa Especfica para el ismero trans- por un lado y para el L- por otro.

Especificidad de las enzimas, 2

Especificidad de grupo:

R CO O R' + H2O Esterasa

R COOH + HO R'

Las carboxilesterasas hidrolizan todo tipo de steres, independientemente de la naturaleza de R o R

Otras caractersticas de la accin enzimtica Eficiencia cataltica En ocasiones llega a ser enorme; con nmeros de recambio del orden de 108 s-1 Las enzimas que han llegado a este lmite reciben el nombre de Enzimas plenamente evolucionadas, ya que un incremento en la actividad no tendra sentido al superar la velocidad de difusin de los substratos.

Teoras de la accin enzimtica, 1

Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)

Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecfica, de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.
Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se considera insuficiente al no explicar algunos fenmenos de la inhibicin enzimtica, por ejemplo

Teoras de la accin enzimtica, 2

Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)

Tanto la enzima como el substrato sufren una alteracin en su estructura por el hecho fsico de la unin. Est mucho ms de acuerdo con todos los datos experimentales conocidos hasta el momento.

Teoras de la accin enzimtica, 3 La teora del Ajuste Inducido se ampla en la actualidad definiendo la accin enzimtica como Estabilizacin del Estado de Transicin

Segn lo cual, el Centro Activo enzimtico es en realidad complementario no al substrato o al producto, sino al estado de transicin entre ambos.

Sitio activo un bolsillo profundo Por qu la energa requerida para alcanzar el estado de transicin es menor en el sitio activo?

Es un bolsillo mgico

+
CoE (1) (4) (2)

(3)

(1) Estabiliza transicin (2) Expele agua (3) Grupos Reactivos (4) Ayuda Coenzima

O R C O R'
Substrato: un ster

OR C O R' O-

Estado de transicin: intermediario tetradrico, inestable

O R C O
-

HO R'

Productos

Anlogo de Estado de Transicin

R P O R' O-

Derivado fosforilado, que no es substrato de la reaccin, pero que por su analoga estructural ocupa el centro activo de la enzima e inhibe fuertemente a la reaccin

Concentracin ES Constante en Estado Estax S

Concentracin

ES
Tiempo de Reaccin

Concepto de velocidad inicial

[ ]

d[ ] v = dt , t -> 0

s t

Variables que influyen en la velocidad de una reaccin enzimtica

1. Concentracin de enzima
2. Concentracin de substrato 3. pH 4. Temperatura

5. Efectores (Activadores e Inhibidores)

Efecto de la concentracin de enzima: relacin lineal v

. ..

. . .

. .

. . .

[E]

S
ES E EP
Una cintica lineal implica un proceso regenerativo, cclico

Ciclo cataltico de una enzima

Efecto de la concentracin de substrato

. . .

. . . . .

[s]

(en perodo fijo de tiempo)

S + E P

8 60
80 40

Producto

Aumento Concentracin Sustrato

20

Sustrato (mmoles)
4 6

Una cintica hiperblica implica un proceso saturante:

Hay un nmero limitado de sitios en la enzima para fijar substrato; una vez que estn ocupados todos, por mucho que aumente la concentracin de substrato, la velocidad permanecer constante tendiendo a un valor asinttico

E+S

k+1

ES

k+2

E+P

k-1

Hiptesis de Michaelis-Menten

Equilibrio rpido

E S es e0 xs Km ES x x
k 2 e0 s v Km s

e0 s x Km s

v k 2 x

k2e0 Vmax

Vmax s v Km s

dx 0 k 1es k 1 k 2 x dt

k1es k1e0 xs k1 k2 x
e0 s e0 s x k 1 k 2 Km s s k 1

v k 2 x

k2e0 Vmax

Vmax s v Km s

Hiptesis de estado estacionario

Tanto con las suposiciones de Michaelis-Menten como con Las de estado estacionario, llegamos a la ecuacin

v=

Vmaxs Km + s

La nica diferencia radica en el significado de Km: Km = k-1/k+1 en mecanismo de M.M. Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E.

Significado de la constante Km
1. Constante de equilibrio de disociacin del complejo ES (en condiciones de equilibrio rpido) 2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato (en condiciones de equilibrio rpido) 3. Mide la funcin de fijacin (en cond.de equilibrio rpido) 4. Concentracin de substrato para la que la velocidad se hace igual a la mitad de la mxima (s0.5) 5. Se define para una pareja enzima-substrato 6. Se mide en unidades de concentracin

Significado de la constante Vmax = k+2 e0

1. Velocidad asinttica para s

2. Directamente proporcional a la concentracin de enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima por k+2) 3. Mide funcin de transformacin cataltica 4. Se expresa en unidades de velocidad

Representacin directa

v
100 80

Vmax

60

40

Vmx s v Km s

20

s
0 0 20 40 60 80 100

Km

Representacin recproca doble (Lineweaver - Burk)

0.04

1/v
0.03

1/Vmax
-1/Km

0.02

0.01

1 Km 1 1 v Vmx s Vmx

0.00 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/s

Representacin s -s/v (Eadie - Hofstee)

1.2

s/v
1.0 0.8

0.6

0.4

-Km
0.2

s 1 Km s v Vmx Vmx

0.0 -20 0 20 40 60 80 100 120

Ejemplo de Cintica de Enzimat.

Sustrato Producto Velocidad Doble recproco [S] Absorbancia v (mmole/min) 1/S 1/v no 0.25 0.21 0.42 4 2.08 1 0.50 0.36 0.72 2 1.56 2 1.0 0.40 0.80 1 1.35 3 2.0 0.46 0.92 0.5 1.16 4
(1) El producto fue medido por espectrofotm a 600 nm (2) Tiempo Reaccin 10 min

Data

Double reciprocal

Direct plot

1.0

2.0

v
0.5

1/v
1.0

1.0
-3.8
-2 0 2 4

0 0 1 2

0 -4

[S]

1/[S]

Efecto del pH

1. Sobre la fijacin del substrato al centro activo: - Grupos disociables de la enzima - Grupos disociables del substrato 2. Sobre la transformacin cataltica del substrato

3. Sobre la estructura de la protena enzimtica

NH COO CH2 CH2 COO+ +

Arg

C H3N

NH CH

H 3N

Lys
CH

Succinato y centro activo de SDH pH 7

NH
+

COOH CH2 CH2 COOH

+

H 3N

NH CH

H 3N CH

Succinato y centro activo de SDH, pH 2

NH C COOCH2 CH2 COOH 2N CH

Succinato y centro activo de SDH, pH 13

H 2N

NH CH

Efecto de la temperatura
v

En el efecto de la temperatura hay dos componentes:

1. Aceleracin de la reaccin segn la ecuacin de Arrhenius k = A exp (-Ea/RT)
E ln K a ln A RT
ln v = ln k - Ea/RT
k(T): constante cintica (dependiente de la temperatura) A: factor preexponencial o factor de frecuencia. Refleja la frecuencia de las colisiones. Ea: energa de activacin, expresada en J/mol. R: constante universal de los gases. Su valor es 8,3143 JK-1mol-1 T: temperatura absoluta [K]

2. Desnaturalizacin trmica de la protena

Inhibicin Competitiva
Product Substrate Succinato C-OOC-H C-H C-OOC-OOH-C-H H-C-H C-OOCompetitive Inhibitor Glutarato C-OOH-C-H H-C-H H-C-H Malonato C-OOH-C-H C-OOOxalato C-OOC-OO-

C-OO-

Succinato Deshodrogenasa

Inhibition Enzimtica (Mecanismo)

I

Competitivo
Substrate
S

No-competitivo
S

Acompetitivo
S

E
S

E
I

I I

Ecuacin y Descripcin

Compete for Inhibitor active site

Different site

E + S ES E + P + I EI
[I] une slo la [E] libre, y compite con [S]; aumentando [S], se disminuye el efecto [I].

E + S ES E + P + + I I EI + S E I S
[I] une [E] libre o [ES] ; Al aumentar [S] no Disminuye inhibicin [I].

E + S ES E + P + I EIS
[I] se une a [ES] solamente, aumentando [S] se favorece inhibicin por [I].

InhibicinEnzimtica (Plots)
I

Competitiva
Vmax

No-competitiva
Vmax

Acompetitiva
Vmax

Directos Plots

vo

vo

Vmax

Vmax

Km Km

[S], mM

Km = Km

[S], mM

Km Km

[S], mM

Doble Reciproco

Vmax s/cambio Km aumenta 1/vo

Intersect at Y axis

Vmax disminuye Km s/cambio 1/vo

Ambas Vmax & Km aumentan 1/vo

Two parallel lines

I
Intersect at X axis

1/ Vmax 1/[S]

1/ Vmax 1/[S] 1/Km

1/ Vmax 1/[S]

1/Km

1/Km

Cooperatividad Enzimtica

Mecanismo y Ejemplo de Efecto Alostrico

Kinetics R = Relax (activa)
S

Models
Alosterico sitio

Cooperacin
R

vo

(+)
S

R R
(+) vo
S

[S]

Alosterico sitio

Homotropico (+) Concertedo

A
(+)

T
S

X
T

R
[S]

Heterotropico (+) Sequencial

T = Tensa (inactiva)

I
vo (-)
[S]

(-)

Heterotropico (-) Concertedo

Juang RH (2004) BCbasics

Enzyma Alostrica ATCase

aspartato transcarbamoilasa

forma Activa relajada Carbamoil fosfato Aspartato Carbamoil aspartato

O H2N-C-O-PO32=

COOCH2 HN-C-COOHH - - -

ATCase
ATP

COOO CH2 H2N-C- N-C-COOHH

Feedback inhibicin

Estructura Cuaternaria Subunid cataltica CCC R R R R R R Regulatoria subunid CCC Subunid cataltica

CTP CTP

CTP CTP

CTP CTP

Forma Inactiva

Metabolismo Acidos tensa Nucleicos

- - -

CTP

Regulacin de Activitidad Glicgeno Fosforilasa

Modificacin Covalente

A P

GP kinasa GP fosfatasa 1
A P

P P
A P

A P

espontanea

AMP

ATP Glc-6-P Glucosa Cafeina

No-covalente

Glucosa Caffeina

A A
P

A P

A P

A P

Regulacin enzimas por protelisis

Zimgeno Pepsinogen Chymotrypsinogen Trypsinogen Procarboxypeptidase Proelastase Prothrombin Fibrinogen Factor VII Factor X Proinsulin Procollagen Procollagenase

Enzima Activa

Funcin

Pepsin Chymotrypsin Trypsin Carboxypeptidase Elastase Thrombin Fibrin Factor VIIa Factor Xa Insulin Collagen Collagenase

digestin protenas digestin protenas digestin protenas digestin protenas digestin protenas Formacin cogulo Formacin cogulo Formacin cogulo Formacin cogulo plasma glucosea homeostasis component of skin and bone remodeling processes during metamorphosis, etc.

Regulacin Actividad Enzima

Inhibitor Proteolisis

o
S

or

x
I

I inhibidor

proteolisis
S

Regulacion Feedback

fosoforilacion

o
S

x
R

P
S

o
(+)

regulator effector Transduccion seal

fosforilacion
A

x
(-)

or
S

Regulatory subunit

cAMP or calmodulin

Va Metablica Principal
Etapa 1 Macromolcula Unidad Glucosa digestin

Gliclisis Glc-6-P
Kinase
P

Glc-1-P

Glycogen phosphorylase

Glicgeno

Almidn
Oxidacin de Carbono HH3-C-H 4 O 0

6 3
3

Mitocondria
Fosforilacin oxidativa
P
P

3H3-C-OH 1 2 H2-C=O 1 1 H-COOH 2 0 2 O=C=O

Cambio Nmero carbono

Acetyl CoA

2
A

$ $ $ NADH
Citric acid cycle
H2 O CO2

ATP

Piruvato

Piruvato

Etapa 2 molecula molecula pequea

Etapa 3 produccion Energa