MUDANDO DE MTODOS DE ANLISE

AVALIAO DE MEIOS DE CULTURA

DIRCE M.Y.YANO 14.06.10

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QUALIDADE EM LABORATRIOS DE ENSAIO ISO NBR ABNT 17025:2005

Garantia da Qualidade
Conjunto de aes planejadas e sistemticas para garantir que um produto ou um servio vai satisfazer os requisitos da qualidade.

Controle de Qualidade
Conjunto de tcnicas e atividades usadas para cumprir os requisitos da qualidade. Aes concretas no dia a dia.

PORQUE IMPLEMENTAR A ISO?

Melhorar os processos Aumentar segurana Melhorar qualidade global Aprimorar equipes de trabalho Oferecer maior confiana aos cliente Diminuir custos operacionais
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REQUISITOS DE GERNCIA
ORGANIZAO ANLISE CRTICA REVISES GESTO AES CORRETIVAS E PREVENTIVAS LABORATORIAL RESPONSABILIDADE ATRIBUIES E RESPONSABILIDADES

CONTROLE DE DOCUMENTOS E REGISTROS

AUDITORIAS NO CONFORMIDADES SUPRIMENTO DE BENS ATENDIMENTO AO CLIENTE SERVIOS

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REQUISITOS T TCNICOS
MTODOS DE ENSAIO CONDIES AMBIENTAIS FATORES HUMANOS

CONFIABILIDADE DOS RESULTADOS

EQUIPAMENTOS

RASTREABILIDADE

MANUSEIO DE ITENS

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ABNT NBR ISO/IEC 17025
Elemento 4.6 Aquisio de servios e insumos
Requisito 4.6.1 O laboratrio deve ter poltica e procedimentos para seleo e compra de servios e suprimentos utilizados que afetem a qualidade dos ensaios. Devem existir procedimentos para compra, recebimento e armazenamento de materiais de consumo do laboratrio que sejam importantes para os ensaios. Requisito 4.6.2 O laboratrio deve garantir que os suprimentos e materiais de consumo adquiridos que afetem a qualidade dos ensaios no sejam utilizados at que tenham sido inspecionados ou verificados de alguma outra forma... Devem ser mantidos registros das aes tomadas para verificar a conformidade.

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Elemento 4.6 Aquisio de servios e insumos Requisito 4.6.3 Os documentos de aquisio dos itens que afetam a qualidade do resultado do laboratrio devem conter dados que descrevam os servios e suprimentos solicitados. Estes documentos devem ter seu contedo tcnico analisado criticamente e aprovado antes da liberao. Requisito 4.6.4 O laboratrio deve avaliar os fornecedores dos materiais de consumo, suprimentos e servios crticos que afetem a qualidade de ensaios e calibraes e deve manter registros dessas avaliaes, e listar os que foram aprovados.

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AQUISIO DE INSUMOS Aquisio Registro Requisitos Procedimentos

informaes codificao no laboratrio manuteno estoque responsvel

Controle

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Desidratados
Comercialmente disponveis fornecedor avaliao validade lote garantia da qualidade

Formulados
insumos de qualidade pessoal qualificado controle de qualidade

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Meios prontos para o uso
Comercialmente disponveis fornecedor avaliao validade lote controle de qualidade
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NUTRIO MICROBIANA
Os microrganismos realizam reaes qumicas e organizam as molculas em estruturas especficas. A expresso final dessa organizao resulta no crescimento. Os microrganismos requerem em quantidades diferentes de macronutrientes e micronutrientes.
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MEIOS DE CULTURA

Definio Formulaes de substncias em forma slida, lquida ou semi slida que contm constituintes naturais ou sintticas para promover a multiplicao, crescimento e manter a viabilidade dos microrganismos.

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Quanto consistncia
Meios lquidos exemplo: caldo nutriente. Meios slidos quando acrescentamos um agente solidificante gar (carboidrato). Meios semi-slidos quando acrescentamos menos Agar no meio.

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Quanto funo Meios simples
permitem crescimento de bactrias de fcil crescimento.

Meios enriquecidos
bactrias de difcil crescimento exigem nutrientes especficos, como adio de vitaminas , ex: biotina, cido pantotnico.

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gar Baird-Parker gar m-Endo LES

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gar Levine
(Lactose Azul de metileno)

gar Seletivo para Pseudomonas CN

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gar XLD

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Alm de conhecer os meios de cultura, o microbiologista deve tambm saber como preparar corretamente. O xito do trabalho depende no somente da escolha do meio de cultivo, mas tambm das condies fsicas de cultivo (fatores ambientais) que so diferentes entre os microrganismos. Praticamente, a grande maioria dos meios comercialmente disponveis (usados na rotina do laboratrio) se encontram sob a forma de p, granulados, desidratados, tornando fcil o seu preparo.

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Norma ISO 11133-1/2009 e 11133-2/2004
Parmetros Tipos de Meios de Cultura

Checagem do pH Produtividade Seletividade

Slido Semi slido Lquido

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Mtodo
Quantitativo Qualitativo Os mtodos devem ser escolhidos pelo laboratrio, baseados em tcnicas aceitas.

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Meios slidos, semi slidos ou lquidos devem ser inoculados com uma alquota de microrganismos alvo (positivo) e no desejado (negativo). As diluies devem ser preparadas a partir de culturas de trabalho.

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Culturas de Trabalho - Contagem de clulas

A partir da cultura de trabalho (24h), utilizando a escala de MacFarland (0,5) = 108. Preparar os tubos de diluio (diluio decimal seriada) at 10-8. Semear 1mL das 5 ltimas diluies em profundidade em placas estreis. Distribuir aproximadamente de 15 a 20mL de gar PCA previamente resfriado e mantido a (46 1)C. (fazer duplicata). Homogeneizar bem. Deixar solidificar. Incubar as placas em posio invertida na temperatura apropriada do microrganismo por 24h. Fazer as contagens dentro do limite de especificao de contagem.

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Meios seletivos e no seletivos
Quantitativo Meios slidos Inoculao em profundidade Inoculao em superfcie Aps a incubao, contar as colnias das placas da diluio que proporcionar contagem entre os limites especificados pelo mtodo. A contagem ser sempre na mesma diluio para os dois meios (avaliao e de referncia).
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Meios Slidos
Inoculao em superfcie

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Meios Slidos
Inoculao em profundidade (pour plate)

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Clculo da Produtividade (P) Para calcular a produtividade a contagem dever corresponder mesma diluio para os dois meios. P = NA / NR

Exemplo Meio de Avaliao= 200 ufc/mL na diluio (-6) Meio de Referncia= 250 ufc/mL na diluio (-6) P= (200 / 250) = 0,8 A produtividade pode ser expressa em porcentagem (%). A Produtividade de um meio deve ser 0,7 por microrganismo, que pode crescer facilmente no meio.

NA= nmero total de colnias obtidas no Meio de Avaliao. NR= nmero total de colnias obtidas no Meio de Referncia.

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MEIOS SELETIVOS E NO SELETIVOS Qualitativo Meios lquidos
Inocular 1mL de cada diluio: 10-4, 10-5, 10-6 , 10-7 e 10-8 . Incubar os tubos na temperatura e tempo adequados para cada microrganismo. Aps a incubao observar a maior diluio com crescimento (turvao do meio).

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Clculo da produtividade (P)
P = DA / DR
DA= diluio com turbidez no Meio de Avaliao DR= diluio com turbidez no Meio de Referncia Exemplo Meio de Avaliao = 8 (ltima diluio com turvao: - 8) Meio de Referncia = 10 (ltima diluio com turvao: -10) TP = 8 = 0,8 10

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Para o mtodo qualitativo,o crescimento do microrganismo no desejado (negativo) no meio seletivo deve ser a inibio de crescimento.

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Mtodo qualitativo com um tubo ou um frasco Inocular com ala de 1L, o microrganismo alvo diretamente no meio a ser avaliado. Fazer o mesmo com microrganismo no desejado. Leitura Resultado
0 sem turbidez 1 pouca turbidez 2 bem turvo O valor para microrganismo alvo deve ser 2.
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Visual

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Clculo do ndice de Crescimento Absoluto (ICA)
Dividir a placa em quadrantes e identificar com a numerao 1, 2, 3, 4 e um trao no centro da placa correspondente ao nmero 5. Preparar a suspenso do inculo a 108UFC/mL. Proceder da mesma forma na placa com meio de referncia. Clculo= Cada estria dado um valor de 0,2. Multiplicar pelo nmero de estrias com crescimento. Crescimento na estria central dado o valor de 1. Clculo do ndice de Crescimento Relativo (ICR) O ICR para um determinado microrganismo a comparao entre o ICA do meio em avaliao e o ICA do meio de referncia. Avaliao Para todos os microrganismos em um meio de avaliao o ICA deve ser maior ou igual a 3,5.
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Exemplo de formulrio de Avaliao de Meio de Cultura

MR= meio de referncia AN= gar nutriente

Meio Tipo Funo Incubao Microrg. Controles MR Mtodo Critrio Caract.

Produtividade BairdBairdParker

24h24h-48h (35 2) 2)C

S. aureus ATCC 25923 E. coli ATCC 25922

TSA

Quantitativo

>70%

Colnias Negras Halo -

Slido Seletividade 48h (35 2) 2)C AN Qualitativo Inibi Inibio

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QUALIDADE DA GUA
Reservatrio de gua conservao, higienizao

Deionizador , Osmose Reversa registro.

controles

Controles

microbiolgico e fsico-qumico.
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REFERNCIAS
Brasil, Ministrio da Agricultura, Pecuria e do Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuria. Instruo Normativa n62 de 26/08/03.Mtodos Analticos Oficiais para Anlises Microbiolgicas para Controle de produtos de Origem Animal e gua. Braslia, 2003. EA/EURACHEM EA-04/10. Laboratories. 2002. Accreditation for Microbiological

ABNT NBR ISO/IEC 17025- Requisitos Gerais para a Competncia de Laboratrios de Ensaio e Calibrao. 2005. ISO. International Standard. ISO3696. Water for Analytical Laboratory Use Specifications and Test Methods. 1987.

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REFERNCIAS
EA/EURACHEM EA-04/10. Accreditation for Microbiological Laboratories. 2002. ABNT NBR ISO/IEC 17025- Requisitos gerais para a competncia de laboratrios de ensaio e calibrao. 2005. AOAC INTERNATIONAL. Official Methods of Analysis of AOAC International. 18th ed. 2005. ISO 11133. Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines on preparation and production of culture media Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory. 2009. Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media. ISO 11133-2004.

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REFERNCIAS
APHA American Public Health Association. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Washington DC. 2001. ISO. International Standard. ISO7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological examinations. 2007.

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