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HISTOPLASMOSIS
DEFINICION

La histoplasmosis clsica, es una micosis sistmica descripta en ms de 60 pases, que afecta al sistema retculoendotelial de personas y animales. Est producida por el hongo dimrfico termal y nutricional Histoplasma capsulatum var. capsulatum, cuya fase saproftica filamentosa tiene un hbitat natural en suelo cuevas, minas y edificios deshabitados enriquecidos con excrementos de murcilagos, gallinas, palomas y otras aves. En estos sitios, cuando las condiciones de temperatura y humedad son ptimas, permiten que Histoplasma capsulatum establezca su nicho ecolgico. ETIOLOGIA Ubicacin taxonmica: Divisin: Ascomycota Clase: Euascomycetes Orden: Onygenales Familia: Onygenaceae Gnero: Ajellomyces Especie: capsulatus Estado anamrfico: o mitosprico: Histoplasma capsulatum Se han descripto tres variedades de H. capsulatum: la variedad capsulatum, endmica de Amrica y algunas zonas de frica, Asia y Europa, la variedad duboisii, la cual se ha aislado nicamente en frica; y por ltimo la variedad farciminosum, slo descripta como patgena de caballos y mulas en algunas zonas de Europa, frica y Asia. Las variedades capsulatum y duboisii son indistinguibles en su fase micelial, sin embargo, en tejidos animales las levaduras de la variedad duboisii son ovoides, ms grandes y de pared ms gruesas que las de la variedad capsulatum. La primoinfeccin por H. capsulatum es con frecuencia pulmonar, benigna, asintomtica o subclnica, producida por la inhalacin de conidias del agente etiolgico que vive

saprofticamente en el suelo. Esta forma primaria cura generalmente en forma espontnea y deja como secuela calcificaciones en el parnquima pulmonar y en los ganglios linfticos regionales. La histoplasmosis progresiva es mucho menos frecuente, se caracteriza por ulceraciones cutneomucosas, astenia, adelgazamiento, hepatoesplenomegalia, infartos ganglionares mltiples, lesiones pulmonares progresivas, anemia, leucopenia y fiebre irregular. El pronstico de esta ltima forma es grave y conduce frecuentemente a la muerte de no mediar un tratamiento adecuado.

DATOS HISTORICOS

La histoplasmosis fue descubierta por S. Darling en 1906 al efectuar la autopsia de tres pacientes que fallecieron en la zona del Canal de Panam. Su agente etiolgico inicialmente sealado como un protozoario, fue considerado un hongo brotante por Da Rocha Lima en 1912 y su naturaleza fngica se confirm definitivamente al obtener, De Monbreum (19331934), cultivos a partir de un material clnico. Este ltimo autor demostr, poco despus, que H. capsulatum es un hongo dimrfico, que crece a 28C y en medios comunes al estado de micelio filamentoso, en tanto que en agar-sangre a 37C lo hace en su forma levaduriforme brotante. En 1949, Emmons consigui el aislamiento de H. capsulatum del suelo, demostrando que sta es la fuente de infeccin ms importante para el hombre y los animales. Christie y Peterson (1945-1946), comenzaron sus estudios sobre la forma benigna de histoplasmosis al observar numerosos sujetos con focos de calcificacin pulmonar, tuberculino-negativos, y que reaccionaban fuertemente a la histoplasmina. La primera observacin sudamericana de histoplasmosis fue publicada en Buenos Aires por Balia y col. en 1941.

VIAS DE INFECCION

La infeccin es adquirida por va inhalatoria y el mecanismo de enfermedad es por infeccin primaria, reinfeccin o reactivacin de un foco latente. Presenta una gran variedad de manifestaciones clnicas, dependiendo del estado inmunitario del paciente y del tamao del inculo infectante. Tras su inhalacin, una vez instalado en el alvolo pulmonar, pasa a la forma levadura. Posteriormente se produce una intensa reaccin granulomatosa seguida de una caseificacin o calcificacin, similar a la tuberculosis. En algunos individuos, la infeccin es asintomtica, se resuelve espontneamente y se suele diagnosticar de manera retrospectiva. Se han descripto epidemias de neumona aguda causadas por H. capsulatum asociadas a la inhalacin de polvo conteniendo grandes cantidades de conidias. En los pacientes adultos con lesiones pulmonares subyacentes, la infeccin puede evolucionar a una enfermedad pulmonar crnica o a una diseminacin hematgena con lesiones mucocutneas crnicas. En pacientes con SIDA la enfermedad puede producirse por reactivacin de una infeccin latente o tras la inhalacin de conidios, produciendo en ambos casos una forma diseminada. Estudios de prevalencia realizados en Estados Unidos de Amrica (EUA) sobre pacientes residentes en reas endmicas indicaron que la incidencia en pacientes con SIDA oscilaba entre 2 y 26,7%. Los datos que se tienen de Argentina indican que la incidencia de esta

infeccin en pacientes con SIDA oscila entre el 6 y 7%. Esta enfermedad no es transmisible de hombre a hombre, ni de animales al hombre, en condiciones naturales. La elevada prevalencia de H. capsulatum es favorecida tanto por la multiplicacin de situaciones que conducen al paciente a la inmunodepresin, como as tambin la dificultad que existe de administrar una multiterapia adecuada al paciente infectado por HIV. Es lgico considerar que toda esta situacin tiene un marcado impacto en la Salud Pblica de Latinoamrica. FUENTE DE INFECCION Y DISTRIBUCION GEOGRAFICA

La histoplasmosis ha sido descripta en ms de 60 pases includos en zonas templadas o tropicales y hmedas de todo el mundo. La enfermedad ha sido registrada en zonas endmicas de Estados Unidos de Amrica (EUA) como ser los valles de los ro Ohio y Mississipi Mxico, Costa Rica, Honduras, Nicaragua, Panam, Uruguay, Colombia, Venezuela, Guyana Francesa, Islas del Caribe, Ecuador, Per, Chile, Brasil y Argentina. Se han descripto casos espordicos autctonos en frica, Asia y Europa. En Argentina la mayora de los casos notificados corresponden a la regin conocida como Pampa Hmeda que incluye Buenos Aires, Entre Ros, Sur y Centro de Santa Fe, Sur-Este de Crdoba y Este de La Pampa. Tambin se han notificado casos espordicos en Tucumn y Chaco, donde adems se han detectado zonas con un ndice de infeccin de un 50 y 10%, respectivamente.

El microorganismo se desarrolla preferentemente en el guano en descomposicin, mezclado con el suelo, ms que en los nidos de las aves. En este continente, los principales lugares para generar la histoplasmosis son los hbitat de pollos, gallina y otras aves de corral, y las cavernas de murcilagos y palomas. Estos proporcionan un excelente medio de cultivo para este hongo, permiten su desarrollo, el mantenimiento de su virulencia y su sobrevida frente a la competicin con otros microorganismos del suelo.
Las grutas habitadas por murcilagos, los lugares de explotacin del guano como fertilizante, los gallineros, o los silos donde se almacenan cereales, han sido reconocidos en numerosas oportunidades, como fuente de infeccin y a veces han dado origen a micro epidemias con primoinfecciones sintomticas de esta afeccin. Estas epidemias focales pueden ocurrir tanto dentro como fuera del rea endmica y tan slo en los EUA se han reconocidos ms de 40 brotes. Han sucedido otras epidemias en Mxico, Centroamrica, Venezuela, Per, Brasil y Suecia. Si bien la histoplasmosis ha sido considerada una enfermedad predominantemente rural, los habitantes de las reas urbanas no estn libres de la posibilidad de adquirirla. Se han sealado como fuentes de infeccin en las zonas urbanizadas, los jardines tratados con

fertilizantes que contienen materias fecales de aves, la tierra debajo de los rboles donde los pjaros dejan caer sus deyecciones y las construcciones viejas o galones habitados por murcilagos o palomas.

CAUSAS PREDISPONENTES.

Se

considera

un

hongo

patgeno

primario,

aunque

en

algunos

pacientes

inmunolgicamente comprometidos puede desarrollar una enfermedad crnica progresiva, similar a la tuberculosis, y en tales se considera como oportunista. Enfermedades que comprometen la inmunidad mediada por clulas tales como SIDA, Leucemias, Linfomas y tratamientos inmunosupresores severos en pacientes transplantados, son factores de riesgo para personas residentes en reas endmicas. En pacientes con SIDA, la histoplasmosis ha aumentado de frecuencia, presentndose como una importante infeccin junto con otras micosis como la candidiasis, la criptococosis y la neumocistosis. Las manifestaciones clnicas, en pacientes enfermos de Sida, son propias de la forma diseminada aguda, como consecuencia de una infeccin primaria, donde el microorganismo acta como oportunista o debido a una reactivacin de una infeccin subclnica de larga data.

FORMAS CLINICAS DE LA HISTOPLASMOSIS

Las formas clnicas de histoplasmosis pueden ser clasificada segn:

*Pulmonar El sitio de presentacin *Extrapulmonar o Diseminada

*Aguda La duracin de la infeccin *Subaguda *Crnica

*Primaria Tipo de infeccin *Reactivacin

Histoplasmosis pulmonar Histoplasmosis pulmonar primaria aguda

Puede presentarse en un hospedero inmunocompetente que se expone a un importante inculo. Debe buscarse antecedentes de la potencial exposicin al hongo en pacientes de zonas endmicas. La sintomatologa de esta patologa, la cual generalmente se parece a una enfermedad viral, es usualmente autolimitante. Las radiografas de trax tpicamente demuestran un infiltrado intersticial alveolar difuso o un patrn retculo

nodular. Estos cambios en los pulmones pueden resolverse completamente o dejar un fino patrn miliar de calcificacin. En pacientes con una histoplasmosis pulmonar activa, las clulas levaduriformes de H. capsulatum pueden ser observadas en el examen del esputo dentro de los macrfagos alveolares. Histoplasmosis cavitaria pulmonar crnica

Es una infeccin respiratoria progresiva en pacientes con una enfermedad pulmonar crnica de base. Estos pacientes son usualmente fumadores de larga data, masculinos, que han trabajado en zonas endmicas. Sufren un deterioro progresivo de la funcin pulmonar, probablemente debido a la combinacin de la enfermedad crnica subyacente y la histoplasmosis. Muchos casos de infeccin asintomtica por H.capsulatum tienen clnicamente una fungemia, evidenciada por las calcificaciones esplnicas, como as tambin por las calcificaciones asintomticas pulmonares que revelan las radiografas pulmonares. Esta diseminacin a mltiples rganos permite la subsiguiente reactivacin a sitios pulmonares o extrapulmonares, si el hospedero se convierte en

inmunocomprometido. Histoplasmoma

El histoplasmoma, como el tuberculoma y el coccidioidoma, es una masa fibrosa creciente que se desarrolla alrededor de un foco curado de infeccin primaria pulmonar. Durante su fase activa, la lesin original tiene un tamao de 2 a 4 mm; despus se cura por una encapsulacin fibrosa y calcificacin. La pared tiene alrededor de 1mm de espesor en el histoplasmoma; sin embargo, la fibrosis contina y se aaden capas concntricas de colgeno y calcificacin. Por lo regular, el ritmo de crecimiento anual es de 1mm a 2mm, y llega a ser de 3-4cm. al cabo de un perodo de 10 a 20 aos. La lesin no es problemtica en s, pero su crecimiento puede causar erosin de estructuras

vitales. Histolgicamente, esta reaccin consiste en acmulos de fibroblastos, linfocitos y clulas mononucleares. Es probable que la fibrosis continuada sea una respuesta al material antignico que proviene del centro de la lesin. Despus de algunos aos las capas centrales de colgeno se interrumpen y aparecen las calcificaciones concntricas. Esto da una imagen radiolgica precisa de calcificacin central (lesin primaria), con anillos circundantes de depsitos de calcio. Si el histoplasmoma no deja de crecer, puede necesitar intervencin quirrgica sobre todo si constituye una amenaza para alguna estructura adyacente importante.

Histoplasmosis extrapulmonar o diseminada

Hay un considerable espectro de caractersticas clnicas que dependen del grado de parasitismo de los macrfagos y la diseminacin de la enfermedad. Goodwin ha descripto tres presentaciones, definidas como aguda, subaguda y crnica. Histoplamosis aguda diseminada Esta presentacin est casi exclusivamente limitada a nios y jvenes. Los pacientes presentan fiebre alta, nuseas, vmitos y diarrea. En etapas ms tardas, se presenta con tos seca y dificultades para respirar. Puede existir tambin neutropenia como resultado secundario de una sepsis bacteriana. Al examen clnico hay hepatomegalia, que ocasionalmente se asocia con ascitis e ictericia. La linfoadenopata est presente en uno de cada tres casos. Tambin puede verse ocasionalmente ulceracin orofarngea. Los cultivos de sangre perifrica son positivos en casi todos los casos. Las biopsias de mdula sea o ganglios linfticos muestran gran cantidad de histiocitos cargados con clulas levaduriformes. La deteccin de anticuerpos y el test cutneo con histoplasmina tienen escaso valor diagnstico, sin embargo, un aumento mayor o igual a cuatro veces en el ttulo de fijacin del complemento es diagnstico. Histoplasmosis diseminada subaguda La mayora de los pacientes son adultos, los cuales presentan una fiebre moderada. El curso de la enfermedad abarca meses y los pacientes sufren prdida de peso y debilidad general durante este perodo. Usualmente sobreviene la infeccin focal, involucrando el tracto gastrointestinal (con perforacin ocasional), endocarditis, meningitis, insuficiencia adrenal y ulceracin orofarngea caracterstica. La hepatomegalia est casi siempre presente. Los cultivos de sangre son positivos en el 50% de los casos. Como en otras formas de histoplasmosis diseminada, la biopsia de hgado es positiva en el 80% de los casos. Las

biopsias de otros sitios afectados, particularmente las lceras orofarngeas, usualmente revelan al microorganismo. Histoplasmosis diseminada crnica Esta es la forma usual de la histoplasmosis diseminada vista en adultos sin aparente inmunosupresin. Aquellos que se convierten en inmunosuprimidos como consecuencia de una enfermedad subyacente o terapia, pueden sufrir un episodio de enfermedad aguda. Los pacientes tpicamente presentan sntomas leves con una progresiva prdida de peso, fatiga y fiebre intermitente, recurrente, que en algunos casos puede prolongarse durante 10-20 aos. La hepatomegalia ocurre en el 50% de los casos, siendo la esplenomegalia menos comn. Tambin se presentan ulceraciones orofarngeas. Los episodios de la infeccin incluyen endocarditis, meningitis deficiencia adrenal ulceracin intestinal y ndulos subcutneos y lesiones cutneas polimorfas. stas ltimas incluyen en un 6% ppulas, ndulos, lceras, abscesos y celulitis; en un 75% hay manifestaciones bucales: lceras bucofarngeas, ndulos en lenguas y encas. En la mayora de los pacientes con SIDA se observan lesiones cutneas o mucosas, as como sntomas generales: fiebre, prdida de peso, hepatoesplenomegalia y

pancitopenia. Los cultivos de sangre son raramente positivos y el diagnstico depende de la demostracin del microorganismo en biopsias y muestras de los sitios afectados. La fijacin del complemento es positiva en aproximadamente el 60% de los casos. Histoplasmosis diseminada progresiva Esta es otra forma de la enfermedad diseminada vista en pacientes inmunocomprometidos, que incluye aquellos con SIDA. La infeccin se caracteriza por una fiebre progresiva usualmente con compromiso pulmonar, a pesar que los sntomas y signos pulmonares son mnimos. Aproximadamente uno de cada tres pacientes sufren una prdida de peso significativo y alrededor de uno cada cuatro tienen esplenomegalia. Un subgrupo de pacientes puede sufrir una enfermedad fulminante con shock sptico, coagulopata diseminada y falla multiorgnica. El diagnstico se realiza frecuentemente por cultivos de sangre, de mdula sea, de ndulos linfticos o de los tejidos afectados en cada caso.

Localizaciones extrapulmonares como consecuencia de una enfermedad diseminada En piel y mucosas

La localizacin larngea, es observada en el 50% de los casos en Argentina en pacientes con histoplasmosis pulomonar crnica. Por sus caractersticas clnicas es confundida con la tuberculosis y el cncer. Las alteraciones asientan principalmente en la zona supragltica, ulceracin de la mucosa y formacin de granulomas. Loa pacientes refieren disfona, disfagia y con cierta frecuencia disnea obstructiva crnica. Las lesiones de las mucosas y semimucosas suelen asentar en la cavidad oral, en la faringe, nariz, genitales externos y ano. Inicialmente poseen un aspecto papulosos, luego se necrosan ulcerndose. Los bordes de las lceras son ntidos, el fondo es rojo vivo, cubierto parcialmente por secreciones blanquecinas y presenta su base poco o nada infiltrada. A veces el fondo de la lesin se torna mamelonado y vegetante. Las lesiones cutneas son de tipo ppulo pustuloso, papuloso o ulceradas. Las lceras son redondas u ovales, de bordes ntidos, fondo granulomatoso, cubiertas por secreciones blancoamarillentas y son ligeramente dolorosas. Con menor frecuencia su fondo se torna vegetante, se cubre de costras serohemticas y, presenta un aspecto papilomatoso. Pueden presenarse tambin ulceraciones nasales y destruccin del subtabique nasal y del tabique cartilaginoso, que recuerdan por su aspecto clnico las lesiones producidas por la leishmaniosis cutneo mucosa y la paracoccidioidomicosis. En tracto genitourinario Las manifestaciones clnicas que involucran el tracto genitourinario pueden ocurrir como parte de una enfermedad sistmica que sigue a una diseminacin aguda o aos ms tarde, siguiendo a una reactivacin con manifestaciones multifocales. Alternativamente, un paciente puede presentarse con una infeccin en el tracto genitourinario, como nica manifestacin de la enfermedad. Afortunadamente la infeccin genitourinaria por H. capsulatum es poco frecuente, sin embargo se han reportados lceras mucocutneas de pene y labios de vulva. La infeccin prosttica puede ser asintomtica o causar prostatitis aguda o crnica, incluyendo abscesos prostticos. En riones Se han notificado casos de insuficiencia renal, hematuria y proteinuria como resultado de la infeccin por H. capsulatum. Los antecedentes de un viaje o de residencia en reas endmicas de H. capsulatum deben buscarse siempre durante la evaluacin de un paciente transplantado renal. La reactivacin de una infeccin latente adquirida en aos anteriores al transplante, puede presentarse como una infeccin aguda cuando el paciente se convierte en inmunodeprimido. La infeccin inicial es por inhalacin de los conidios fngicos. La

infeccin en este tipo de pacientes tiene un alto grado de diseminacin y muerte consecuente. Esta patologa puede presentarse en cualquier momento luego del transplante, pero usualmente se observan dentro de los dos primeros aos posteriores a la intervencin quirrgica. La histoplasmosis en estos pacientes se presenta con fiebre, prdida de peso y tos. La mayora presenta infiltrados pulmonares en las radiografas torxicas y alrededor del 25% tiene un compromiso del sistema nerviosos central. El diagnstico se realiza por cultivo de los tejidos involucrados, sangre o aspirado de mdula sea. En aparato gastrointestinal Se describieron 94 casos de compromiso gastrointestinal que acompaaban a una infeccin diseminada. Los criterios para realizar el diagnstico fueron: presencia de microorganismos tpicos en el tejido involucrado, cultivos de sangre positivos y la presencia de granulomas obtenidos de tejido gastrointestinal. Adems, se encontraron 77 casos de compromiso nicamente gastrointestinal sin extensin a los ganglios linfticos. En pacientes con una infeccin diseminada, los sntomas predominantes fueron fiebre y debilidad, mientras que aquellos pacientes con compromiso nicamente gastrointestinal presentaron sntomas localizados en dicha zona. Las lesiones comunes son masas o lceras que se confunden con una enfermedad intestinal inflamatoria o carcinoma. Por lo cual, en pacientes inmunocomprometidos que se presentan con sntomas sugerentes de enfermedad intestinal inflamatoria o carcinoma colnico, el diagnstico de histoplasmosis debera ser seriamente considerado, an si no son residentes de reas endmicas. Es importante destacar que en zonas de Centroamrica, es muy frecuente la presentacin de una infeccin gastrointestinal como nica manifestacin de la histoplasmosis en nios menores de un ao, desnutridos y/o con poliparasitosis. En sistema nervioso central H. capsulatum puede causar meningitis en el 5-10% de pacientes que tienen SIDA. Esto es similar a lo estimado en pacientes no SIDA con enfermedad diseminada. La meningitis por H. capsulatum es crnica y no bien definida, dado que puede ser asintomtica o bastante variable en su presentacin. Por otra parte las punciones lumbares no se realizan de manera rutinaria y en los cultivos es difcil de recuperar el microorganismo. Todo esto conlleva a que muchas veces la meningitis no sea diagnosticada. En sistema ocular

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La asociacin entre histoplasmosis y enfermedad ocular est bien establecida. El H. capsulatum alcanza los ojos por diseminacin hematgena durante una histoplasmosis sistmica, generalmente en nios, y causa un granuloma discreto compuesto de macrfagos, clulas epiteloides y clulas gigantes. El granuloma cura por cicatrizacin, dejando reas depigmentadas plidas de atrofia corioretinal. El deterioro permanente de la visin puede ocurrir luego de varios aos, usualmente entre los 20 y 40 aos de edad. El fludo vtreo es tpicamente claro, y la prdida de la visin es debido a la neoformacin de vasos subretinales. Esto puede ser seguido por hemorragias subretinales y fibrosis.

DIAGNOSTICO DE HISTOPLASMOSIS

Examen clnico. El diagnstico clnico de esta enfermedad se basa en los antecedentes epidemiolgicos y profesionales, el cuidadoso estudio semiolgico, los exmenes radiolgicos del trax, endoscopas de laringe y bronquios, descripcin minuciosa de las lesiones cutneomucosas, etc. Siempre la sospecha clnica debe ser ratificada por los estudios de laboratorios.

Exmenes de laboratorio

Los estudios de laboratorio que contribuyen a certificar el diagnstico y a conocer el pronstico de esta micosis pueden dividirse en mtodos directos donde se trata de aislar el hongo desde los materiales clnicos que llegan al laboratorio y mtodos indirectos, que demuestran las alteraciones inmunoalrgicas producidas en el husped por H.capsulatum. H.

Mtodos directos Materiales biolgicos remitidos al laboratorio: Biopsias Esputo Lavado bronquioalveolar Puncin de mdula sea, hpatica o esplnica Sangre entera Lquido cefalorraqudeo Escarificaciones de lesiones cutneas o mucocutneas

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Examen directo: El procedimiento con KOH, que

por lo regular resulta til en otras

enfermedades fngicas, no lo es tanto en la histoplasmosis. En este caso el estudio se realiza por medio de extendidos teidos con el mtodo de Giemsa, MGG o Wright. Esta tcnica permite visualizar al hongo en los tejidos parasitados en forma de clulas esfricas u ovoides de 3 a 5 de dimetro, rodeada de una gruesa membrana que no toma los

colorantes comunes, lo cual indujo a considerarla como una cpsula. Algunos de estos elementos presentan un brote en uno de sus polos. Estos hongos parsitos se encuentran, en su mayor parte, en el interior de clulas del sistema retculoendotelial y poseen forma y dimensiones similares. En la coloracin con Giemsa presenta su pared celular sin teir, ofreciendo el aspecto de un halo claro, en el interior del citoplasma se aprecia una sola masa cromtica ms intensamente teida de color violeta o azul oscuro y que tiene forma semilunar, en tanto, el resto del citoplasma presenta un color celeste. Aunque se encuentran en forma predominante dentro de los macrfagos o monocitos, se pueden presentar clulas de levaduras extracelulares, debido a la destruccin de la clula fagocitaria. Cabe sealar que cuando se visualizan varios elementos tpicos dentro de un monocito, el diagnstico no ofrece dificultades y queda confirmado por el simple examen microscpico. (Figura1) En la coloracin de Gram el H. H.capsulatum es Gram positivo; nuevamente aqu la pared no se tie y simula una cpsula clara que rodea el elemento levaduriforme. Este hongo toma muy bien ciertos colorantes utilizados en histopatologa, tales como el P.A.S y la coloracin con plata de Gomori- Grocott. El H. H.capsulatum puede ser confundido con levaduras del gnero Cndida, cuya morfologa es parecida, pero sta presenta habitualmente mayor tamao, una tincin ms homognea y son extracelulares. La diferenciacin con las Leishmanias, puede ofrecer dificultades, pero estos protozoarios poseen dos masas cromticas, ncleo y blefaroplasto. Tambin las levaduras deben diferenciarse de Toxoplasma. Finalmente las formas pequeas e intracelulares de Paracoccidioides brasiliensis tambin pueden ser confundidas con H.capsulatum; pero la revisin cuidadosa de varios campos microscpicos permite descubrir alguna forma multibrotante o catenulada tpica de P.brasiliensis.

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Figura 1- Levaduras intracelulares en extendido de sangre compatibles con H.capsulatum var capsulatum. Tincin de Wright, 100x.

Cultivos a 28C: En medio de agar-Sabouraud-glucosa, incubado a 28C el H. capsulatum, produce al cabo de 15-20 das, un intenso desarrollo que cubre gran parte del medio de cultivo en los tubos de ensayo comunes. El micelio areo es abundante, algodonoso y blanco; en los cultivos de ms de un mes se torna algo parduzco. Se han descripto dos tipos morfolgicos de colonia: el tipo A (albino) y el tipo B (brown=marrn). (Figura 2)

Figura 2- H. capsulatum. Colonia color blanca o beige, algodonosa, de crecimiento denso.

Examen micoscpico de las colonias desarrolladas a 28C: Se observa un micelio filamentosos, ramificado y tabicado, hialino, de 2 a 5 de dimetro. La ramificacin puede

ser lateral o raramente dicotmica. La fructificacin est constituda por dos tipos de conidias. Las macroconidias, grandes, esfricas o piriformes, de 10 a 25 de dimetro, con

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una pared celular gruesa cuyo endosporio es liso y el exosporio est erizado en tubrculos con aspecto de expansiones digitiformes de 1 o ms de largo. Con colorantes especiales,

parece que son de naturaleza mucoplisacrida. Las macroconidias se encuentran en el micelio areo y asientan sobre una especie de conidiforo corto, simple o con 2 3 ramificaciones. Las microconidias son tipo aleuria, piriformes, con membrana fina, lisa o ligeramente rugosa y miden de 2 a 5 de dimetro. Estas microconidias son ssiles o se

disponen sobre cortos conidiforos tanto en el micelio areo como en el sumergido. Algunos cultivos presentan un tercer tipo de conidia, semejante a las macroconidias, pero de pared lisa, nacen sobre cortos pedculos y se los observa en el micelio sumergido. (Figura 3 y 4)

Figura 3- H.capsulatum. Aspecto microscpico donde se observa micelio fino, septado y gran cantidad de macroconidios equinulados. a) tincin de PAS contrastada; b) tincin con azul cotton.

Figura 4- Imagen obtenida en microscopio electrnico de centelleo de la fase conidial de H. capsulatum donde se observa muy bien las expansiones digitiformes del exosporio.

La morfologa de la colonia de H. H.capsulatum es indistinguible de la de algunos hongos contaminantes filamentosos y blancos, por lo que es necesario la demostracin de las macroconidias equinuladas y la conversin del microorganismo a su fase levaduriforme.

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Esta ltima se obtiene por incubacin en agar-sangre o en infusin cerebro-corazn a 37C. Chrysosporium spp y Sepedonium spp., tambin producen macroconidios tuberculados que pueden conducir a error; sin embargo, no forman levaduras a 37C, no dan positiva la prueba del exoantgeno , ni son patgenos para animales de laboratorio.

Cultivos a 37C: En agar-cistina-sangre o en agar sangre de conejo al 5%, incubado a 37C, presenta despus de los 4 a 5 das, el desarrollo de colonias cremosas, que crecen como un barniz en la superficie del medio de cultivo, blanquecinas, hemisfricas, de 2 a 3 mm de dimetro, superficie plegada, hmeda y brillante. Examen microscpico de las colonias desarrolladas a 37C: se observan elementos ovales o elpticos, de 2 a 5 de dimetro y brotantes. (Figura 5 y 6) En estos cultivos suelen

encontrarse formas de transicin con la fase filamentosa, observndose filamentos cortos, moniliformes con clamidoconidias intercalares, y, en algunos casos, brotes intercalares o terminales.

Figura 5: levaduras de H. H.capsulatum a partir de cultivos en medios enriquecidos a 37 C.

Figura 6: Imagen obtenida en microscopio electrnico de centelleo de levaduras de H. H.capsulatum donde es visible el cuello estrecho de la levadura en gemacin.

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INOCULACION DE ANIMALES Los animales habitualmente empleados para la inoculacin son el ratn y el cobayo y con menor frecuencia se recurre al hmster y la rata. El ratn es el ms sensible de todos ellos frente a H. H.capsulatum, su inoculacin por va venosa, intraperitoneal o intracerebral conduce a la muerte del animal en un perodo de tiempo que vara con la cantidad de hongo inoculada. Una vez inoculado el animal elegido, debe ser sacrificado al mes. Se hace autopsia, sacndoles hgado, bazo y suprarrenales. Estos rganos son sometidos a exmenes microscpicos y cultivos. Si bien esta tcnica puede ser usada para diagnstico (al inocular al animal con los materiales clnicos remitidos al laboratorio, haciendo una suspensin de los mismos en solucin fisiolgica ms antibitico), no se usa en la actualidad debido a que el diagnstico puede realizarse adecuadamente con las tcnicas descriptas anteriormente. No obstante, es importante realizar este procedimiento para recuperar la virulencia de una cepa.

PRUEBA ESPECIAL: TEST DE EXOANTIGENO

Esta es una tcnica que pone de manifiesto la presencia de antgenos solubles especficos para B. dermatitidis, C. immitis e H. H.capsulatum. Es particularmente til en identificar hongos patgenos cuya forma parasitaria es difcil de obtener o que presentan cultivos atpicos. En el caso de H. H.capsulatum es importante para diferenciarlo de los gneros Chrysosporium y Sepedonium, cuya conidiacin a 28C es semejante a la que presenta H. H.capsulatum. Esta tcnica consiste en agregar 30 ml de Infusin Cerebro-Corazn a los tubos del cultivo por identificar; se incuba en agitacin durante un perodo de tres a seis das; se retiran 15 ml del caldo de cultivo y se agrega timerosal 1% para matar al hongo, se centrifuga y se concentra 25 veces el volumen. El exoantgeno as preparado se procesa por medio de una Inmunodifusin, poniendo en el centro el suero positivo o control positivo anti-H. H.capsulatum, en los pocillos superior e inferior el antgeno de referencia y en los pocillos laterales el o los exoantgenos de las cepas por identificar. Las bandas de identidad entre el antgeno de referencia con las de los exoantgenos en estudio darn la determinacin si la o las cepas a identificar son compatibles con H. H.capsulatum.

Diagnstico molecular: En nuestro laboratorio se ha desarrollado una PCR anidada para detectar en muestras de sangre, mdula sea y biopsias la forma parasitaria de H.capsulatum, altamente especfico y sensible (detecta menos de 10 clulas de H.capsulatum) Bracca y col. 2003.

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Mtodos indirectos: Pruebas inmunolgicas La elevada resistencia natural a la infeccin por H. H.capsulatum, se comprueba por el hecho de que en la gran mayora de las personas infectadas, slo hay pocas que presentan algunos sntomas y la enfermedad se resuelve pronto. En casos de exposicin exagerada al hongo, la enfermedad se establece en todos los pacientes y tambin lo hace en pocos enfermos que slo tuvieron exposicin mnima. Estos ltimos casos pueden deberse a diferencias sutiles en la inmunidad o debilitacin ligera e incluso transitoria. No es frecuente que H. H.capsulatum se comporte como un hongo oportunista invasor en el sentido comn, lo cual tiende a hacer ms enigmtico el problema de la poblacin de pacientes en los que se desarrolla una enfermedad grave. En la actualidad, parece que la recuperacin de infecciones ligeras hace que el paciente adquiera resistencia a la reinfeccin. Los anticuerpos circulantes se consideran de poca implicancia en la inmunidad establecida despus de la resolucin de la infeccin. En experimentos en los que se ha usado cultivo de tejidos, se demostr que la fagocitosis y el desarrollo intracelular de las clulas de levadura de H.capsulatum no se afectaban por la existencia de suero que contena anticuerpos para el microorganismo. No obstante, Howard and col., demostraron que los fagocitos mononucleares de animales inmunizados restringan el desarrollo intracelular de las clulas de levaduras, en comparacin con los fagocitos de animales no inmunes. Entonces se concluye que la inmunidad a la infeccin se relaciona ms con las defensas celulares que con las humorales. Prueba cutnea: Las reacciones cutneas se efectan con la histoplasmina que es un antgeno obtenido por filtracin del desarrollo del H. H.capsulatum en el medio lquido sinttico de asparagina-sales propuesto por Smith a 28C, seleccionado por carecer de protenas o polipptidos que determinen reacciones inespecficas. La potencia antignica se determina en cobayos experimentalmente infectados y en reactores humanos conocidos, a fin de establecer la dilucin ptima para su empleo. Las reacciones se practican siguiendo la misma tcnica de la prueba de Mantoux, y la lectura se efecta a las 48 y 72 hs. Se considera positiva toda reaccin que presente ms de 5 mm de infiltracin y eritema; la intensidad de la prueba se mide en milmetros de infiltrado. Esta reaccin de hipersensibilidad retardada se torna positiva entre los 15 das y las 6 semanas siguientes a la infeccin; su positividad persiste durante muchos aos y an toda la vida. La reaccin cutnea positiva indica, por lo tanto, la existencia de una infeccin actual o pasada. Es de gran utilidad para delimitar las reas endmicas durante las campaas sanitarias, pero su valor diagnstico de enfermedad actual se limita a los siguientes casos: 1) cuando se comprueba en lactantes,

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2) cuando se asiste al viraje de la reaccin de negativa a positiva, 3) cuando se comprueba en una persona que no haba habitado hasta ese momento en zona endmica y que no presenta reacciones fuertemente positivas con otros antgenos fngicos. Pueden observarse falsas reacciones positivas debido a la existencia de antgenos comunes con otros hongos como ser el Coccidioides immitis, Blastomyces dematitidis y Paracoccidioides brasiliensis. Sin embargo, la frecuencia de las reacciones cruzadas disminuye utilizando los antgenos adecuados diludos. Los resultados de las pruebas cutneas poseen adems valor pronstico en los pacientes con diagnstico de histoplasmosis confirmado micolgicamente, pues su negatividad, en este tipo de enfermos, indica gravedad del proceso. La prueba cutnea negativa no descarta el diagnstico de histoplasmosis y afirma el valor pronstico de esta reaccin, ya que el viraje a la positividad coincide con la mejora o curacin clnica, tal cual sucede en la paracoccidioidomicosis. Walter y Price sostienen que la histoplasmina bruta posee tanto protenas como polisacridos, la purificacin de la fraccin proteica brinda reacciones ms intensa an que la histoplasmina bruta, en tanto que la fraccin polisacrida aislada carece de actividad antignica. Fijacin del complemento: Esta prueba srica es una de las ms sensibles y especficas para el diagnstico cuando se realiza en forma peridica, y tiene un gran valor pronstico en la enfermedad. Se emplean tres tipos de antgeno: la histoplasmina, una suspensin de elementos de la fase levaduriforme y el sobrenadante de clulas levaduriformes rotas por ultrasonidos u otro procedimiento mecnico de ruptura. En cuanto a la sensibilidad de los antgenos, cabe sealar que el antgeno de clulas levaduriformes es el ms sensible, pero este antgeno como el de clulas rotas presentan mayor frecuencia de reacciones cruzadas. Los anticuerpos fijadores de complemento comienzan a aparecer aproximadamente en la segunda semana despus de la infeccin y se mantienen todo el tiempo que la histoplasmosis est activa; despus de la curacin disminuyen progresivamente hasta desaparecer alrededor del noveno mes. Un ttulo igual o mayor a 1:16 indica generalmente una enfermedad activa o progresiva. Esta prueba es positiva en aproximadamente el 70% de los casos de histoplasmosis. Se ha comprobado que esta prueba puede presentar reacciones cruzadas con otras micosis, como ser paracoccidioidomicosis, blastomicosis y coccidioidomicosis. En estos casos el ttulo es en general bajo, 1:8 1:16 y se producen con mayor frecuencia cuando se emplean antgenos de la fase levaduriforme. Las reacciones con ttulos ms elevados tienen gran valor diagnstico, en especial si se comprueba ascenso o descenso de su nivel coincidiendo con el empeoramiento o la mejora clnica.

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Actualmente

esta tcnica de fijacin de complemento no se hace de rutina en los

laboratorios de diagnstico micolgico, debido a la dificultad de mantener en condiciones adecuadas y estandarizadas todas las variables y componentes de la misma. Inmunodifusin: La inmunodifusin en gel de agar, bsicamente la tcnica de Outcherlony, es uno de los mtodos ms usados por su sencillez. Puede utilizarse tanto como tcnica cualitativa como cuantitativa empleando diluciones del suero en progresin geomtrica. Es la prueba de eleccin para descubrir pacientes con histoplasmosis progresiva dentro de una gran masa de enfermos. Para su realizacin se emplean antgenos solubles semejantes a la histoplasmina. Es la prueba serolgica ms especfica y con un ndice muy bajo de reacciones cruzadas. Heiner introdujo la inmunodifusin en el diagnstico de la histoplasmosis y demostr la existencia de dos bandas especficas de precipitacin. La banda H se presenta en pacientes con formas crnicas progresivas en actividad, raramente es influenciada por la realizacin previa de la prueba cutnea y se encuentra ms cerca del pocillo que contiene el suero; y la banda M, que se presenta en personas que cursan la fase temprana o de recuperacin de la enfermedad, es frecuentemente afectada por las pruebas intradrmicas y se localiza ms prxima al pocillo que contiene el antgeno. Ambas, desaparecen 1 2 aos despus de la curacin clnica de la histoplasmosis; la banda M puede permanecer ms tiempo. (Figura 6)

Figura 7- Patrn de inmunodifusin con bandas especficas M y H. [H Ab]: suero con anticuerpos anti-H. capsulatum, [H ag]: histoplasmina concentrada de referencia, [B ag]: extractos negativos de dos B. dermatitidis que producen antgenos no relacionados a H y M. Se ha descripto tambin una banda C, la cual parece presentar antgenos compartidos con B. dermatitidis y C. immitis, principalmente. Tambin se pude realizar una contrainmunoelectroforesis.

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HISTOPATOLOGIA

Las lesiones histolgicas dependen del tiempo de evolucin, severidad y forma clnica de la enfermedad. Las levaduras de H. H.capsulatum fagocitadas por las clulas del sistema fagoctico mononuclear que se encuentran en hgado, bazo, mdula sea y ganglios linfticos, son factibles de observarse con las tinciones de Giemsa y de Wright, y an con Hematoxilina-eosina. En la forma aguda se observan numerosas levaduras dentro de los histiocitos, las cuales son gemantes, de tamao uniforme (aproximadamente 3 ), escasos neutrfilos, clulas plasmticas y linfocitos. Con las tinciones de Giemsa y Wright, las levaduras presentan el ncleo rojo y el citoplasma azul. Las levaduras deben diferenciarse de Leishmania y Toxoplasma. Tambin pueden teirse con PAS. En la forma menos aguda de la enfermedad se forman granulomas epiteloides que contienen clulas plasmticas, linfocitos, macrfagos, neutrfilos y clulas gigantes. Hay menor nmero de levaduras que en la forma aguda. En la forma cavitaria crnica se observa un escaso nmero de levaduras intracelulares en el revestimiento de material necrtico, ms que en el tejido profundo y rara vez se ven gemaciones. DIAGNOSTICO DIFERENCIAL

Los diagnsticos diferenciales que es necesario establecer en esta enfermedad varan con la forma clnica. La primoinfeccin pulmonar debe ser diferenciada de la tuberculosis y coccidioidomicosis primaria, de la neumona atpica viral, la fiebre Q y otras virosis respiratorias. La forma pulmonar crnica, por lo general cavitaria, es indistinguible, salvo por los estudios microbiolgicos, de la tuberculosis avanzada y la coccidioidomicosis cavitaria. Las diseminaciones crnicas se parecen radiolgicamente a la sarcoidosis. Las formas diseminadas graves, con hepatomegalia, fiebre, leucopenia, etc., pueden confundirse con la malaria crnica, la brucelosis, la enfermedad de Hodgkin y otros linfomas. Las lesiones ulcerosas cutneas o mucosas simulan las producidas por la leishmaniasis cutneomucosa, la paracoccidioidomicosis, la tuberculosis, el cncer, la sfilis terciaria y el molusco contagioso. TIPIFICACIN EPIDEMIOLOGICA DE H.CAPSULATUM

A pesar del incremento de las infecciones fngicas en los ltimos aos, el panorama epidemiolgico de las principales micosis sistmicas en el mundo ha sufrido pocos cambios y an persisten grandes vacos en su informacin, especialmente, en lo referente a la

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delimitacin de zonas de alta y baja prevalencia para ciertas micosis y en las contradicciones asociadas al foco infeccioso que permitiran definir el origen preciso de la fuente de infeccin. En las investigaciones sobre epidemiologa y patognesis, se ha utilizado una amplia variedad de tcnicas inmunolgicas, bioqumicas y genticas, las cuales han ayudado a identificar aislamientos de hongos obtenidos de casos clnicos y del ambiente. La tipificacin de estos aislamientos conduce a la caracterizacin fidedigna de ellos, y sirve para apoyar datos epidemiolgicos fehacientes. La utilizacin de una caracterstica particular, para tipificar aislamientos o cepas, est relacionada con la estabilidad y la diversidad de sta dentro de la misma especie. Hasta hace algn tiempo el estudio epidemiolgico de la enfermedad se restringa a informes de casos clnicos, a datos de inmunocontactos sensibilizantes con el agente etiolgico determinado por la prueba cutnea con el antgeno especfico histoplasmina, o bien por escasos aislamientos del hongo en la naturaleza. Con el advenimiento de las tcnicas moleculares y el subsiguiente empleo de stas en la epidemiologa de histoplasmosis capsulati, nombre actual de la enfermedad asociada a H. H.capsulatum var. capsulatum, se lograron mayores aportes y un importante incremento en la informacin sobre esta enfermedad, tanto en la ubicacin de nuevas zonas endmicas como en la relacin paciente-fuente de infeccin.

Tipificacin molecular Las tcnicas aplicadas actualmente al estudio epidemiolgico de H.capsultaum son A) Sondas para H. H.capsulatum B) Electroforesis en gel de campo pulsante C) Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) y anlisis ADN cromosomal por Southern blot. D) Polimorfismo del ADN amplificado al azar (RAPD) E) Secuenciacin de ADN de

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