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EFECTO COOPERATIVO El efecto cooperativo ocurre en enzimas oligomricas que poseen varios sitios para la unin de sustrato y es el fenmeno

por el cual la unin de un ligando a una enzima influye sobre la unin de molculas subsiguientes. Cuando el ligando afecta la unin de otras molculas del mismo ligando, el efecto se conoce como homotrpico. Cuando lo que se ve afectada es la unin de un ligando de naturaleza diferente (por ejemplo un activador que afecta la unin del sustrato de una enzima), se est en presencia de un efecto cooperativo heterotrpico. En el caso de una enzima, cuando la unin de una molcula de sustrato facilita la unin de la siguiente molcula de sustrato mediante un aumento en las afinidades de los sitios vacantes, el fenmeno se denomina cooperatividad positiva o respuesta homotrpica positiva . Cuando la unin del sustrato produzca una disminucin de afinidad de los sitios no ocupados, se habla de cooperatividad negativa. El fenmeno cooperativo se evidencia a travs de una curva de velocidad vs [S] que no se ajusta a la cintica de Michaelis-Menten (hiperblica) sino a una que se trata de una curva sigmoide (Figura 1). En consecuencia la representacin de Lineweaver-Burk (doble recproca) no resulta una lnea recta (Figura 2). Se han propuesto varios modelos para explicar el fenmeno de la cooperatividad y permitir el anlisis de las diferentes situaciones experimentales en que aparece cooperatividad. Dos de los principales son el de interaccin secuencial y el concertado o de simetra. Modelo de interaccin secuencial: supone cambios secuenciales o progresivos en las afinidades de los sitios vacantes a medida que los sitos se van ocupando. Es decir que en una misma molcula de enzima pueden existir sitios con diferente afinidad. Para el caso simple de un dmero pueden existir entonces 3 estados: ambos sitios con baja afinidad, un estado con un sitio en alta y otro en baja afinidad, o ambos sitios con alta afinidad (Figura 3). 1/[S] 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 1/v 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Figura 2 [S] 0 200 400 600 800 v 0 2 4 6 8 10 12 Figura 1 Cooperatividad positiva No cooperativa (hiprbola) Cooperatividad positiva (no lineal) No cooperativa (lineal) Cooperatividad negativa Cooperatividad negativa (no lineal) Efecto cooperativo 2 Enzimologa Modelo concertado o de simetra: supone que la enzima preexiste como una

mezcla en equilibrio de un oligmero de alta afinidad y un oligmero de baja afinidad. Los ligandos, includo el sustrato, actan desplazando el equilibrio a favor de uno u otro estado. Durante la transicin, la conformacin de todas las subunidades cambia al mismo tiempo. En este caso existen dos poblaciones diferentes de enzima, una con todos sus sitios con alta afinidad y otra con todos sus sitios con baja afinidad (Figura 3). Aunque ambos modelos se ajustan a diferentes situaciones observadas, es el segundo, el concertado, el modelo ms general, en el sentido que explica la cooperatividad negativa. La figura 4 muestra de que manera se explican ambos tipos de cooperatividad (negativa o positiva) en el modelo concertado, para el caso hipottico de una enzima cooperativa dimrica. La enzima puede existir en dos estados bsicos, una forma T de baja afinidad y una forma S de alta afinidad. Ambas formas pueden interconvertirse. La unin del sustrato procede entonces con diferentes constantes de disociacin Ks para la forma T o R, independientemente del nmero de molculas de sustrato unidas. La unin de un ligando, por ejemplo el sustrato, a una forma, desplaza el equilibrio en el sentido de esa forma. En la figura, la primera molcula de S puede unirse a la forma T o R. Como tiene ms afinidad por la forma R, se una preferentemente a sta y desplaza el equilibrio hacia ese lado. Cuanto ms sustrato haya, ms enzima habr en la forma R de mayor afinidad, hay cooperatividad positiva. Los efectos heterotrpicos tambin se explican mejor con este modelo. Un activador se unir mejor (o exclusivamente) a la forma R, desplazando el equilibrio hacia la forma de ms afinidad. Un inhibidor se unir preferentemente (o exclusivamente) a la forma T, desplazando el equilibrio hacia la forma de menos afinidad, dando cooperatividad negativa. Secuencial Concertado Figura 3 Efecto cooperativo 3 Enzimologa El desarrollo matemtico de estos modelos lleva a ecuaciones que son capaces de describir numerosos sistemas experimentales. Sin embargo, en la prctica se recurre a una ecuacin mucho ms sencilla desarrollada por Hill. Ecuacin de Hill Hill consider un sistema para la unin de n molculas de S a una enzima en un paso: E + n S ? ESn y dedujo la siguiente ecuacin donde: n= nmero de sitios de unin al sustrato por molcula de enzima K S = constante de disociacin global (1) [ ] [ ]n S n max K S S V v + = (2) S S S S S S Ks r Ks t Ks

r Ks t Forma T (baja afinidad) Forma R (alta afinidad) Figura 4 Enzimologa Efecto cooperativo 4 La constante K S en la ecuacin anterior no es igual a la concentracin de sustrato que produce una velocidad semimxima, excepto cuando n=1, en cuyo caso esta ecuacin se reduce a la ecuacin de Michaelis-Menten. Cuando v = 0,5 Vmax De esta manera, la ecuacin (2) puede escribirse: En esta ecuacin entonces, S0,5 define la concentracin de sustrato que da una velocidad semimxima, y corresponde al punto de inflexin de la curva sigmoidea. En la cooperatividad positiva, n ser mayor que 1, y menor que 1 si es negativa. La ecuacin de Hill puede convertirse en una recta til para el clculo de parmetros aplicando logaritmo a la ecuacin (7) La forma de esta ecuacin es: As la representacin de v/ Vmax-v frente al log [S] es una recta con pendiente n. Cuando log v/( Vmax -v)= 0, v/( Vmax -v)= 1 y la posicin correspondiente sobre el eje log [S] nos dar el log [S] 0,5 . K puede calcularse a partir de la ecuacin (6). (3) [ ] [ ]n [ ]n 0,5 n max S S S V v + = (7) [ ] [ ] 0,5 (V v) n log S n log S v log - = ?? ? ?? ? - (8) [ ] [ ]n (4) 0,5 n 0,5 s 0,5K + S = S [ ]n (5) 0,5 s K = S [ ] n (6) S 0,5 = Ks Enzimologa Efecto cooperativo 5 n = 4 n = 1 n = 0,5 Figura 5 log [S] 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 log (v/Vmax-v)

-2 -1 0 1 2 n = 2 Si la cooperatividad no es muy alta, la ecuacin de velocidad no se reducir a la ecuacin de Hill. Sin embargo, las curvas de velocidad pueden expresarse en trminos de la ecuacin de Hill, aunque n ya no ser igual al nmero de sitios. En este caso n ser nap (aparente) o nH (de Hill). Por ejemplo si la cooperatividad es tal que las especies mayoritarias son ES4 y ES3 (enzima con 4 o 3 molculas de S unido) se puede lograr que la velocidad ajuste a la ecuacin de Hill usando un n no entero (por ejemplo 3,6). Esto quiere decir que la enzima acta como si tuviera un nmero de sitios igual a 3,6 con una cooperatividad muy fuerte aunque el nmero real de sitios es por lo menos 4, pero podra haber ms. Una de las dificultades en el empleo del grfico de Hill es que es necesario conocer la velocidad mxima para emplearlo. No existe una manera obvia de calcularla ya que los mtodos usuales de grficos lineales darn curvas. Si observamos atentamente la ecuacin de Hill veremos que estos grficos daran rectas si en lugar de [S] empleramos [S]n, sin embargo ya que n es el valor que estamos buscando el empleo de estos grficos es impracticable Una manera de proceder es usar cualquiera de los grficos lineales para una estimacin gruesa de la Vmax empleando slo las concentraciones ms altas de sustrato. Luego usar este valor aproximado para hacer el grfico de Hill. Este grfico nos dar un valor aproximado de n. A continuacin usar este valor para representar el grfico doble recproco pero usando [S]n en lugar de [S]. Este log [S] = 2 ? [S]0,5 = 100 Efecto cooperativo 6 Enzimologa grfico debera ajustar mejor a una recta. Con el valor de Vmax obtenido de este grfico, regraficar Hill. Indice de cooperatividad La forma de la curva de v vs [S] puede expresarse en funcin de la relacin entre dos concentraciones de sustrato necesarias para que la velocidad sea dos fracciones cualesquiera de Vmax por ejemplo 0,9 Vmax y 0,1 Vma. Esta relacin depende de n como se ve a continuacin. cuando v = 0,9 Vmax cuando v = 0,1 Despejando las concentraciones de sustrato y dividindolas A este cociente se lo denomina Rs, o ndice de cooperatividad. Si la enzima es no cooperativa (n = 1), este ndice ser de 81. Valores mayores a 81 indican cooperatividad negativa y valores menores cooperatividad positiva. En el ejemplo anterior, a un n = 0,5 le corresponde un Rs de 6561, mientras que para un n = 4 el Rs es de 3. Una ventaja clara de este parmetro como medida de cooperatividad es que de valores de importancia para medir la relevancia de una enzima en una va metablica, dado que da una idea de la respuesta de la misma a cambios en el nivel de sustrato (o efector).

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