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Avaliao de Mutaes dos Genes Bax e Bak e Expresso em cncer de mama

Anlises genticas tm fornecido evidncias que sugerem que Bax e Bak so os genes
essenciais para a apoptose em clulas de mamferos. Este estudo teve como objetivo a busca
de biomarcadores em cncer de mama a serem utilizados como marcadores prognsticos para
a doena. Os Bak e Bax genes expresses foram analisados em 23 pacientes com cncer de
mama pela tcnica de RT-PCR. SSCP foi utilizado para detectar a mobilidade do fragmento de
anormal em Bak exon 4. PCR para Bax promotor foi digerido com uma enzima de restrio Tau
para identificar um nico polimorfismo G (-248) A. A expresso do gene Bak est relacionada a
vrios fatores clnicos de cncer de mama. A anlise de RNA mostrou Bax 4 isoformas de Bax
com diferentes distribuies nos tecidos normais e tumorais. Estas isoformas foram Bax , d,
, and . Exon 4 tinha um padro normal em todos os casos de cncer de mama. Houve
diferena estatisticamente significativa na distribuio de freqncia da G (-248)A gentipos
nos tecidos de cncer de mama com grau 3 + alto, fase T2, lobular + outro, e PR-ve subgrupos.
Neste estudo, a expresso de Bak parece conduzir ao desenvolvimento de cancro da mama e
afecta a progresso da doena. Alm disso, Bax d e Bax pode ser usado como factor de risco
e de biomarcadores de cancro da mama com a distribuio de G284A.

1. Introduction

No mundo, o cncer de mama a quinta causa mais comum de morte por cncer
(depois do cncer de pulmo, cncer de estmago, cncer de fgado e cncer de clon).
Segundo a instituio cncer nacional egpcia, os principais tipos de cncer em pacientes
egpcios so a bexiga urinria (32,67%), do trato gastrointestinal (22,24%), mama (13,15%) e
linfoma (9,8%). A apoptose o processo de morte celular programada que pode ocorrer em
organismos multicelulares. A apoptose de grande relevncia clnica, pois a apoptose
desregulada causado pela supresso, a superexpresso ou mutao de reguladores
apoptticos chave contribui significativamente para inmeras doenas humanas. Bax e Bak so
a porta de entrada para a via mitocondrial de apoptose. As clulas que so duplamente
deficiente em dois multidomain pr-apopttica Bax e Bak no conseguem libertar o citocromo
c e so resistentes a todos os estmulos apoptticos que activam a via intrnseca. A ativao da
Bax e Bak durante a apoptose involvesmultiple mudanas conformacionais que so
companhadas por sua homooligomerization intramembranosa mitocondrial. O gene codifica
Bax diversas variantes de Bax, a forma principal Bax . O gene Bax pode produzir protenas
diferentes atravs de mecanismos de splicing alternativo de RNAm, incluindo , , e
isoformas de Bax. As funes de algumas destas protenas variantes podem ser diferentes
das formas mais abundantes de Bax p21-Bax-a. Exon 4 codifica a regio de BH3. A regio de
fixao da membrana tambm foi demonstrado ser importante para a actividade apopttica
de Bak. Em estudos utilizando molculas Bak truncadas, foi relatado que a molcula truncada,
que inclui BH3 mas no a regio de ancoragem membrana, mantm a capacidade de ligao
a Bcl-xL, mas exibe uma funo de morte celular reduzida devido localizao subcelular
alterada. A transferncia de genes mediada elevaes nos nveis de protena BAK acelerar a
apoptose induzida pelo fator de crescimento privao linfide inmurine, cncer de pulmo, e
as clulas de cncer de mama. Funes Bak principalmente como um promotor de apoptose.
Saxena et al., mencionam que, encontraram um polimorfismo singlenucleotide (SNP), um G
para A transio, 125 nucleotdeos a montante do incio da transcrio, e de 248 nucletidos a
partir do incio de traduo da protena Bax. Este SNP foi associado com expresso reduzida de
protena, maior estgio da doena, e falha para atingir a resposta completa ao tratamento de
pacientes com CLL. As mutaes no promotor e as regies de codificao do gene Bax foram
mostrados para afetar a expresso e funo de protenas, em muitos cancros.

2. Material e Mtodo

2.1. Pacientes e amostras
Os tecidos normais e tumorais foram obtidas na altura da resseco cirrgica de 23 pacientes
com cancro da mama. As informaes clnicas obtidas a partir dos pronturios mdicos dos
pacientes; a principal idade deles era de 52,7 11,7. Os temas incluem 23 tecidos normais
(fibroadenose) e 22 tecidos tumorais. Todas as possveis espcimes cirrgicos de cncer de
mama foram coletadas em N2 nitrognio lquido e submetidos a isolamento de RNA e DNA. O
protocolo do estudo foi aprovado pelo comit de tica em pesquisa mdica do Centro
Nacional de Pesquisa.

2.2. Transcrio Reversa-PCR.
O ARN total foi obtido usando o reagente Biozol (BioFlux) Biozol ARN-Kit e quantificado por
espectrofotometria, e ADNc foi preparado utilizando RevertAid primeiro kit de cadeia de
sntese de cDNA (Fermentas), a 42 C.
A amplificao por PCR da expresso de Bak e Bax isoformas foram feitas a partir de 100 ng de
DNAc, utilizando os iniciadores: Bak F 3ACGCTATGACTCAGAGTTCC5, Bak R
3CTTCGTACCACAAACTGGCC5 Bax F 5ATGGACGGGTCCGGGGAGCA3, and Bax R
5CCCAGTTGAAGTTGCCGTCA3. Bak F 3ACGCTATGACTCAGAGTTCC5, Bak R
3CTTCGTACCACAAACTGGCC5 Bax F 5ATGGACGGGTCCGGGGAGCA3, and Bax R
5CCCAGTTGAAGTTGCCGTCA3. Como controle, a amplificao do gene GPDH arrumao foi
feito. Os produtos foram electroforese em gis de agarose a 2% corados com brometo de
etdio. O nvel de expresso do gene Bak foi quantificada por documentao gel e
normalizados contra a expresso GAPDH controle interno. As isoformas de Bax foram
detectados pelo seu tamanho molecular. Software solues Kapelan Bio-Imaging foi usado
para medir a expresso de Bak e o comprimento das isoformas Bax, verso
2.7.2 (http://www.LabImage.com/) 1999-2005, na Alemanha.

2.3. Extrao de DNA
Tecidos normais e tumorais de 43 indivduos (23 normais e 22 tumores) foram coletadas em
N2 lquido. O DNA foi extrado por salting out tcnica como descrito por.

2.4. Bax 5 No Traduzidas (Promotor) Regio G (-248) A Anlise de Polymerase Chain
Reaction.

Um fragmento de 280 pares de bases da regio Bax 5_-no traduzida (promotor) foi
amplificada utilizando o par de iniciadores seguinte: 5_TTAGAGACAAGCCTGGGCGT-3 and
5_CAATGAGCATCTCCCGATAA-3_. A mistura de reaco em cadeia da polimerase (PCR)
continha tampo de reaco de PCR 10x, 10x dNTPs, e 200 ng de cada primer. Aps
desnaturao inicial a 95 C durante 5 minutos, foram realizados 35 ciclos de amplificao,
consistindo de desnaturao a 95 C durante 30 segundos, emparelhamento a 48 cfor de 30
segundos, e extenso a 72 C durante um minuto, com uma extenso final passo de 72 C
durante 7 minutos. Uma alquota de 12 uL de cada produto de PCR foi digerido com uma
unidade de Tau1 enzima de restrio (MBI Fermentas, Helena Biosciences, Sunderland, Reino
Unido) a 55C durante 15 minutos. A enzima Tau1 reconhece o GCSGC sequncia, e a presena
do alelo A resultados na sequncia ACSGC, abolindo assim o local de restrio. Os produtos
digeridos foram submetidos a electroforese sobre um gel de agarose a 2%, corados com
brometo de etdio e visualizados usando ultravioleta. A enzima de restrio Tau 1 digest
produziu trs padres de bandas possveis. O alelo normal foi completamente digerida para
dar duas bandas, 234pb e 46pb; o alelo mutante foi sem cortes e deu uma nica banda de
280pb, e todas as trs bandas estavam presentes em pacientes apresentando
heterozigosidade do G(-248)A polimorfismo.

2.5. Deteco de Mutao em Bak Exo 4.
Exon 4 de Bak foi amplificada a partir de DNA genmico atravs de reaces em cadeia de
polimerase em 35 mL da mistura de reaco contendo 2,5 U / mL de Taq polimerase
(polimerase Dynazyme II de DNA), 10x tampo de reaco de PCR, dNTP 10x, e 200 ng de cada
iniciador de Bak exo 4 F 5GGCAGGGTATGGTATGGTTG3 and Bak exon 4 R
5TCCCGACTGCCTGGTTACTG3. Aps desnaturao inicial a 95 C durante 5 minutos, foram
realizados 35 ciclos de amplificao, consistindo de desnaturao a 95 C durante 1 minuto,
hibridao a 55 C durante 1 minuto e extenso a 72 C durante 1 minuto, com um etapa de
extenso final de 72 C por 7 minutos. A mobilidade do fragmento anormal do exo 4 foi
detectada pela tcnica de SSCP em que 10 uL de cada produto de PCR foi desnaturado a 95 C
durante 10 minutos e a electroforese durante 4 horas a 300 V em 10% de gel de
poliacrilamida. Aps a electroforese, o gel foi corado com uma soluo de 0,5 mg de brometo
de etdio durante 20 minutos e, em seguida, lavou-se com gua durante cinco minutos. O
brometo de etdio bandas coradas foram visualizadas usando uma caixa de visualizao
ultravioleta 340 nm.

2.6. Anlise Estatstica
A anlise estatstica dos resultados foi realizada pelo programa de SPSS (Statistical Package for
Social Science), autor de EcoSoft Inc. V.. S (1995). A anlise foi realizada utilizando t-teste
bicaudal, ANOVA (one way) anlise e qui-quadrado. Nvel significativo foi aceite na P 0,05. Os
indivduos so divididos por vrias formas, de acordo com trs critrios diferentes: divididos de
acordo com os tipos de tecidos ao normal (N) e os tecidos tumorais (N), divididos de acordo
com os factores clnicos para dar quatro grupos, e dividido de acordo com as hormonas
receptores estado .

3. Results

3.1. Bak teve maior expresso nos tecidos tumorais do que os normais.
Para explorar o possvel envolvimento de Bak em cancro da mama, com referncia aos
factores clnicos, o modelo representativo da expresso de Bak, medido por RT-PCR,
mostrado nas Figuras 1 e 2. Os nveis de expresso foram quantificadas pelo programa de
documentao de gel e normalizada contra a expresso de GAPDH de controlo interno. Em
primeiro lugar, o valor mdio da expresso de Bak em tecidos normais foi de 0,350. A mdia
de expresso de Bak em tecidos tumorais> 0,350 foi significativamente mais elevada do que a
dos tecidos de tumor <0,350 e tecidos normais. Na anlise de lcus nico, os tecidos tumorais>
0,350 tinha uma expresso Bak alta significativa (0,019).
Os nveis de expresso do gene de Bak pode estar relacionada com vrios factores
clnicos de cancro da mama, como mostrado na Tabela 1. No houve uma diferena
estatisticamente significativa em Bak expresso significa em cada grupo de fatores clnicos.
Tambm no caso de receptores hormonais grupos de status, no houve uma diferena
significativa na expresso Bak dizer.
Na anlise local nico, a mdia de expresso de Bak foi significativamente mais
elevada em tecidos com o grau 3 ou superior do que os tecidos normais ( = 0,006) conforme
apresentado na Tabela 1. Alm disso, as expresses mdios foi significativamente maior no n
2 ( = 0,02) do que nos tecidos normais. No estgio 4, ER expresses negativas positivas e PR
de Bak eram altas, mas com no significativa ( = 0,1). No houve correlao significativa entre
a expresso de Bak e carcinoma invasivo.
Curiosamente, um padro diferente de Bak foi aparecendo como fita dupla, Figura 2, e
tambm um caso no tem qualquer expresso Bak em tudo e notavelmente os dois casos
foram palco T3.

3.2. Bax Gene Expression Mostra que Bax e Bax d Tive uma associao significativa nos
tecidos tumorais do que as outras isoformas.
A expresso da protena Bax foi analisado por RT-PCR de ARNm em tecidos normais e
tumorais. Quatro bandas eram evidentes com tamanhos moleculares, 322 pb, 270 pb, 175 pb
e 132 pb.

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