Seleo assistida e utilizao de

marcadores moleculares no
melhoramento florestal (QTL).
.
Prof.Dr.CelsoL.Marino
IBB/UnespBotucatu
clmarino@ibb.unesp.br
CelsoLusMarino
Melhoramento Gentico
Aeficinciadomelhoramentogentico
dependebasicamentededuasaesdo
geneticista:
Criaodegentipossuperiores
Identificaodegentipossuperiores
Emambasaesaseleodesempenhapapel
fundamental.
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Seleo Assistida por Marcadores
Moleculares (MAS)
A seleo gentica tem sido praticada com
base em dados fenotpicos avaliados a
campo.
Uma primeira proposio realizada para
aumentar a eficincia desse procedimento
baseado em dados fenotpicos foi descrita
por Lande& thompson(1990), por meio da
seleo auxiliada por marcadores
moleculares (MAS).
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Seleo Assistida por
Marcadores Moleculares (MAS)
AMASutilizasimultaneamentedados
fenotpicosedadosdemarcadores
molecularesemligaognicaprximacom
algunslocoscontroladoresdecaractersticas
quantitativas(QTLs).
CelsoLusMarino
Melhoramento Gentico Florestal
Alm da expanso das reas plantadas, para
aumentar de forma sustentvel a
competitividade da eucaliptocultura nacional
frente ao mercado externo,
As tcnicas de melhoramento clssico
combinadas silvicultura intensiva clonal tm
tido um papel essencial para o aumento do
crescimento e melhoria da qualidade dos
plantios de Eucalyptus (Ferreira e dos Santos,
1997).
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Melhoramento Gentico Florestal
Os alvos do melhoramento florestal at a
dcada de 1990 eram basicamente os
caracteres silviculturais, como crescimento,
retido do tronco e volume de madeira, alm de
resistncia a fatores biticos e abiticos.
Em meados da dcada de 90, novos mtodos
no destrutivos possibilitaram a anlise dos
caracteres relacionados qualidade da madeira
em uma grande quantidade de rvores a um
custo relativamente baixo, permitindo que esses
caracteres fossem incorporados aos programas
de melhoramento (Raymond, 2002).
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Melhoramento Gentico Florestal
Para a indstria de papel e celulose, atributos
da madeira como o baixo teor de lignina e o
alto teor de celulose so importantes para a
extrao de polpa celulsica com alto
rendimento e qualidade (Raymond e Schimleck
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Incorporao da Biologia Molecular no
Melhoramento Florestal
Recentemente, com o avano nas reas de
biologia molecular e biotecnologia, existem
perspectivas de melhoria no entendimento de
como as variaes na seqncia de DNA
afetam o fentipo.
A partir desse conhecimento, poder-se-
selecionar aquelas seqncias que promovam
ganhos em caracteres de interesse atravs do
melhoramento molecular (Morgante e
Salamini, 2003).
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Incorporao da Biologia Molecular no
Melhoramento Florestal
O uso da biologia molecular e biotecnologia em
conjunto com o melhoramento florestal clssico
podem contribuir para a reduo do tempo
necessrio para completar cada ciclo de seleo
e recombinao, o que extremamente
desejvel em espcies perenes.
A seleo assistida e precoce por marcadores
til para os caracteres relacionados qualidade
da madeira que, em geral, so de difcil
mensurao, exigindo procedimentos caros,
laboriosos, e que s podem ser conduzidos em
idade avanada.
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Identificao de genes atravs
de marcadores moleculares
Marcadores moleculares
Um marcador molecular um polimorfismo (ou
variao) na molcula de DNA capaz de
distinguir dois indivduos.
Tais polimorfismos so frutos de vrios tipos
de mutaes, principalmente substituies de
bases, delees e inseres.
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Marcadores moleculares
Esses marcadores por serem compostos pela
molcula do DNA , so herdveis como
unidades discretas, aos moldes dos genes da
ervilha estudados por Mendel.
Dizemos, portanto, que marcadores
moleculares possuem herana mendeliana, o
que facilita muito acompanhar sua transmisso
de gerao a gerao.
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MarcadoresCodominantes
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MarcadoresDominantes
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Marcadores moleculares
Existem uma gama de marcadores que atendem por
diversos acrnimos tais como:
RFLP- restriction fragment length polymorpism
RAPD- randon amplified polymorphic DNA
AFLP- amplifed fragment polymorphism
SCAR- sequence charactrized amplified region
RGA- resistance gene analog
SSR- single nucleotide polymorphism
SNP- single nucleotide polymorphism
A diferena entre eles se deve essencialmente ao modo
pelo qual os polimorfismos so detectado
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51
49
24
22
20
Alelospara
CH
Alelos
normais
1
2
3 4
5 6 7
GenedacoriadeHuntington
(CAG)n
Primers
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SSR
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Identificao de genes atravs
de marcadores moleculares
Duas estratgias gerais podem ser utilizadas para identificao
dos genes responsveis pelo controle da variao fenotpica
quantitativa: a gentica reversa (reverse genetics) e a gentica
direta (forward genetics).
A estratgia reversa tem o foco principal na seqncia gnica,
analisando suas variaes naturais ou induzidas (mutagnese)
com o objetivo de encontrar associao com alguma alterao no
fentipo ou na fisiologia. Fazem parte das abordagens de
gentica reversa os estudos de mutagnese direcionada,
silenciamento gnico e super expresso.
A estratgia direta inicia-se com a anlise do fentipo seguido
da localizao de regies do genoma que contm genes que
controlam parte da variabilidade da caracterstica. Essa
estratgia baseada no mapeamento gentico e na clonagem
posicional (Peter et al., 2003).
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Gentica Reversa (Reverse Genetics)
A estratgia de gentica reversa se apia em parte no conhecimento da
seqncia genmica completa ou parcial do organismo em estudo.
Para espcies do gnero Eucalyptus existem poucas seqncias gnicas
depositadas em bancos de dados pblicos, embora bancos com grande
quantidade de etiquetas de seqncias expressas (ESTs) existam no
Brasil no mbito dos projetos Genolyptus e Forest (Grattapaglia, 2004).
Em Populus, a planta lenhosa modelo (Taylor, 2002), ESTs foram
seqenciados em larga escala (Sterky et al., 2004) e o primeiro
rascunho de sua seqncia genmica est em vias de publicao (Tuskan
et al., 2006). O grande desafio da genmica florestal a caracterizao
funcional dos genes anotados na seqncia genmica de Populus. Porm, o
tempo e o espao fsico necessrios para as anlises dos caracteres em
ensaios de campo, juntamente com as dificuldades de realizao de
mutagnese e/ou alteraes de expresso gnica nas espcies
florestais, limitam bastante a utilizao da gentica reversa em larga
escala.
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Defesa celular contra patgenos. Modificado de
Kuramae-Izioka et al., 2001
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Gentica Reversa (Reverse Genetics)
Pela dificuldade de utilizao da gentica reversa em larga
escala, a opo vivel a anlise funcional de genes candidatos.
As anlises de transcritos em diferentes tecidos, principalmente
em xilema (Paux et al., 2004), juntamente com os trabalhos
envolvendo anlises de expresso gnica em microarranjos (Kirst
et al., 2004; Paux et al., 2005) tm identificado candidatos, em
diversas rotas metablicas, para os processos de formao da
madeira.
Porm, ainda so poucos os genes de Eucalyptus analisados
funcionalmente para determinar o seu papel na xilognese
(Goicoechea et al., 2005). Em Pinus, Populus e principalmente em
Arabidopsis, anlises funcionais vm comprovando a funo de
vrios genes envolvidos na formao da parede celular (Mackay
et al., 1997; Reiter, 2002; Li et al., 2003; Zhang et al., 2003;
Karpinska et al., 2004; Brown et al., 2005).
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Gentica Direta (forward genetics)
Essa estratgia de gentica direta interessante por
no necessitar de conhecimento prvio da seqncia
de genes candidatos (Hirschhorn e Daly, 2005).
Os mapas genticos permitem definir com certa
probabilidade estatstica regies do genoma,
delimitadas por marcadores moleculares, que
controlam parte da variabilidade fenotpica.
Essas regies so comumente denominadas de locos
controladores de caracteres quantitativos
(Quantitative Trait Loci - QTL). As marcas ligadas
aos QTLs podem ser utilizadas em seleo assistida
por marcadores ou como guias visando a clonagem
posicional dos genes ou regies regulatrias envolvidos
no controle do carter.
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CelsoLusMarino
O cruzamento teste de trs pontos ( e mais) permitem que os
geneticistas avaliem a ligao entre trs genes em um
cruzamento.
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A recombinao entre genes ligados pode ser usada para
mapear sua distncia no cromossomo. A unidade de
mapeamento ( 1u.m.) definida como a freqncia de
recombinao de 1 por cento
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Gentica Direta (forward genetics)
Apesar de sua relevncia, o mapeamento gentico em espcies
perenes no trivial.
O clculo da freqncia de recombinao entre pares de locos
mais complexo em Eucalyptus do que em espcies anuais para as
quais factvel a obteno de linhagens endogmicas.
Com a estratgia de pseudocruzamento-teste (Grattapaglia e
Sederoff, 1994), onde os marcadores segregantes so analisados
separadamente para cada parental, a utilizao de genitores
heterozigticos para a construo de mapas de ligao tornou-se
possvel.
Com isso, vrios grupos identificaram regies genmicas
associadas a caracteres de interesse em Eucalyptus, tais como
altura, tamanho de folha e tolerncia geada em plntulas
(Byrne et al., 1997a; Byrne et al., 1997b), habilidade de
propagao vegetativa (Grattapaglia et al., 1995; Marques et al.,
1999), resistncia a doenas (Junghans et al., 2003),
crescimento e qualidade da madeira (Grattapaglia et al., 1996;
Verhaegen et al., 1997; Thamarus et al., 2004).
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Gentica Direta (forward genetics)
Como identificar poligenes com marcadores moleculares?
A lgica da identificao de genes por
meio de marcadores moleculares
simples e baseia-se na associao, por
algum mtodo estatstico, de duas
variveis, uma discreta e outra que pode
ser discreta ou continua, dependendo da
caracterstica em estudo.
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Gentica Direta (forward genetics)
A primeira varivel o gentipo de
plantas avaliado por marcador e a
segunda o fentipo destes indivduos,
por exemplo, seus nveis de resistncia a
determinado patgeno. No caso de
resistncia monognica, o fentipo
geralmente discreta( resistncia ou
suscetvel) e no caso de resistncia
polignica, o fentipo contnuo.
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Gentica Direta (forward genetics)
Quantitative Trait Loci - QTL
Com o desenvolvimento das teorias de gentica quantitativa, liderado
por Fisher (1918), reconheceu-se que os caracteres complexos ou
quantitativos so controlados pelos mesmos fatores hereditrios
descritos por Mendel, com a diferena de que vrios fatores, cada um
contribuindo com uma pequena parcela, esto envolvidos na expresso do
carter.
Muitos geneticistas quantitativos acreditavam ser impossvel a
individualizao dos locos que controlam as caractersticas
quantitativas.
Porm, j em 1923, Karl Sax encontrou associao entre o tamanho das
sementes (caracterstica complexa) e sua colorao (caracterstica
monognica) em populaes F
2
de feijo. Posteriormente, muitos outros
trabalhos reportaram a associao entre marcadores morfolgicos e
locos que controlam caracteres quantitativos (QTL do ingls
quantitative trait loci), mas esses se limitavam quelas espcies onde
existem marcadores morfolgicos em quantidade suficiente para
permitir uma razovel cobertura do genoma.
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Gentica Direta (forward genetics)
Quantitative Trait Loci - QTL
Na dcada de 80, com o surgimento das diversas classes de marcadores,
baseados tanto em hibridizaes com sondas marcadas como em reaes
da polimerase em cadeia (PCR), tornou-se possvel a busca de regies do
genoma responsveis por parte da variabilidade fenotpica em qualquer
espcie de interesse (Tanksley, 1993).
A disponibilidade de marcadores cobrindo todo o genoma permitiu a
construo de mapas genticos em diferentes espcies. O clculo das
freqncias de recombinao e o ordenamento dos marcadores
possibilitou a obteno de estimativas mais acuradas da localizao e do
efeito dos QTLs em estratgias de mapeamento de QTLs por intervalo
(Lander e Botstein, 1989; Haley e Knott, 1992), em que a informao dos
gentipos de ambos marcadores que flanqueiam um intervalo so
tomadas simultaneamente para estimao precisa desses parmetros.
Nova evoluo do ponto de vista estatstico ocorreu com a proposio do
mapeamento por intervalo composto (Zeng, 1993; Jansen, 1993; Zeng
1994), em que marcadores sabidamente relacionados a QTLs so
includos como variveis independentes no modelo de regresso mltipla,
diminuindo a varincia residual e, com isso, aumentando o poder do
teste.
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Gentica Direta (forward genetics)
Quantitative Trait Loci - QTL
Esses trabalhos permitem obter estimativa do nmero mnimo de locos
envolvidos no controle dos caracteres, a localizao genmica desses
locos, a quantificao das suas contribuies para a variao fenotpica
e a avaliao dos seus efeitos em diferentes ambientes e gentipos,
fazendo com que se tenha uma compreenso substancialmente melhor da
arquitetura desses caracteres complexos (Neale e Savolainen, 2004).
Porm, estes trabalhos so limitados pelo tamanho pequeno das
prognies empregadas, a restrita preciso das fenotipagens, o nmero
reduzido de cruzamentos testados e as limitaes inerentes aos tipos
de marcadores moleculares, pedigrees e mtodos estatsticos utilizados.
Dessa forma, o nmero real de QTLs, assim como suas posies precisas
e a magnitude de seus efeitos ainda so insuficientemente
compreendidos (Grattapaglia, 2004), fazendo com que, apesar de todos
os esforos no estudo dos caracteres complexos, ainda pouco se saiba
sobre suas bases moleculares (Flint e Mott, 2001).
CelsoLusMarino
Gentica Direta (forward genetics)
Em plantas, mesmo com a facilidade de obteno de grandes
prognies e replicao clonal para muitas espcies, poucos foram
os genes ou seqncias regulatrias identificados como
responsveis por parte da variao nesses caracteres (Margante
e Salamini, 2003; Paran e Zamir, 2003).
Tambm em espcies florestais, apesar dos vrios trabalhos de
mapeamento de QTL no s em Eucalyptus, como tambm em
Populus e Pinus, nenhum gene foi confirmado como responsvel
por algum QTL (Neale e Savolainen, 2004).
Outra limitao que a maioria desses trabalhos utilizou
marcadores dominantes (RAPD e AFLP) que no so normalmente
transferveis para outros cruzamentos, limitando o
compartilhamento interexperimental de dados e a possibilidade
de utilizao dos marcadores ligados a QTLs em outros
cruzamentos para a seleo assistida por marcadores (Brondani
et al., 1998).
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Gentica Direta (forward genetics)
Alm do mapeamento de QTLs aliado clonagem posicional, outra
abordagem utilizada para inferir se um determinado gene responsvel
por parte das variaes fenotpicas em caracteres de interesse o
mapeamento de genes candidatos, que so aqueles em que h evidncia
para um possvel papel na caracterstica em estudo.
Nesse sentido, Frewen et al. (2000) mapearam QTLs para a poca de
florescimento em Populus e correlacionaram, por meio da deteco de
polimorfismo em stios de restrio de fragmentos amplificados de
genes candidatos, um desses QTLs com um gene relacionado com a
percepo do fotoperodo e outro com um gene envolvido na transduo
do cido abcsico.
Em uma estratgia parecida, porm utilizando marcadores SSCP
(polimorfismo de conformao de fita-simples), Gion et al. (2000)
localizaram genes envolvidos na biossntese da lignina em um mapa
gentico de Eucalyptus grandis x E. urophylla.
Thamarus et al. (2002) mapearam genes envolvidos na formao da
madeira utilizando-os como sondas RFLPs e verificaram posteriormente
(Thamarus et al., 2004) que alguns desses genes co-localizaram com
QTLs para caracteres de qualidade da madeira.
CelsoLusMarino
Gentica Direta (forward genetics)
Kirst et al. (2004) verificaram a co-localizao de
um gene envolvido na biossntese de lignina com um
QTL que controla uma proporo da variao dos
seus nveis de transcritos (eQTL) e com outro QTL
que controla parte da variabilidade no dimetro das
rvores.
Goicoechea et al. (2005) verificaram a co-
localizao do fator de transcrio EgMYB2 com um
QTL para contedo de lignina da madeira. Milhares
de microssatlites foram encontrados em
bibliotecas de ESTs (expressed sequence tags) no
mbito do projeto Genolyptus e alguns foram
localizados no mapa gentico referncia
(Grattapaglia et al., 2005).
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Gentica Direta (forward genetics)
Essas seqncias simples repetidas tambm
foram encontradas nas bibliotecas ESTs do
projeto Forests (Ceresini et al., 2005), assim
como em outros vegetais (Eujayl et al., 2002;
Hackauf e Wehling, 2002; Thiel et al., 2003).
Esses microssatlites possibilitam o
mapeamento rpido e a um custo baixo dos
genes onde esto contidos. Muitos desses genes
podem vir a ser candidatos para uma
determinada caracterstica caso eles co-
localizem com os QTLs nos mapas de ligao.
CelsoLusMarino
Gentica Direta (forward
genetics)
Por fim, o mapeamento utilizando
marcadores microssatlites permite
identificar regies genmicas que
possuem genes envolvidos na regulao
de caracteres de relevncia e avaliar a
sintenia desses locos com QTLs
previamente mapeados em outros
trabalhos
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Bulked Segregant Analysis (BSA) Anlise de Misturas de DNA
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Investigao molecular de anomalias presentes
em mudas de E. grandis
75% normal 25% afetada
G1 X G2
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Marcador P08
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Foi realizado o teste em um nmero maior de indivduos da populao
segregante e com a utilizao de ambos os marcadores foi possvel
identificar o fentipo de 100% dos indivduos
Os marcadores tambm foram testados em amostras oriundas do
cruzamento entre os genitores P26xP27, que tambm apresentaram a
marca relacionada ao fentipo, assim como as plantas endogmicas do
genitor P27
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Lignotber de planta jovem de
eucalipto hbrido (grandis X
urophylla), originado de rebrota
natural
Identificao de Regies Genmicas Relacionada a Presena de Lignotuber
CelsoLusMarino
B1 B2 B3 B4 B5 B1 B2 B3 B4 B5
Quando analisados
separadamente os indivduos
componentes dos bulks, a banda
no estava presente em nenhum
ind. com lignotber.
J nos indivduos dos bulks 3 e 4:
B3: 2 com banda, 3 sem banda
B4: 1 com banda, 9 sem banda
2 indivduos grandis (sem lig.)
foram testados com o primer, e
ambos apresentaram a banda.
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Seleo Assistida por
Marcadores Moleculares (MAS)
AseleobaseadanaMASapresentaas
seguintescaractersticas.
Requeroestabelecimento(analisedeligao)
deassociaesmarcadoresQTLsparacada
famliaemavaliao,ouseja,essas
associaesapresentamutilidadepara
seleoapenasdentrodecadafamlia
mapeadaemespciesalgama.
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Seleo Assistida por
Marcadores Moleculares (MAS)
Parasertilprecisaexplicargrandepartedavariao
genticadeumacaractersticaquantitativa,que
governadapormuitoslocosdepequenoefeito.
Issonotemsidoobservadonaprtica,exatamente
emfunodanaturezapolignicaealtainfluncia
ambientalnoscaracteresquantitativos,fatoque
conduz detecoapenasdeumpequenonmeros
deQTLsdegrandeefeito,osquaisnoexplicam
suficientementetodaavariaogentica.
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Seleo Assistida por
Marcadores Moleculares (MAS)
S apresentasuperioridadeconsidervelem
relao seleobaseadaemdados
fentipicos,quandootamanhodefamlias
avaliadoegenotipado muitogrande(da
ordemde500oumais).
Emfunodessesaspectos,aimplementao
daMAStemsidolimitadaeosganhosem
eficnciamuitoreduzido(Dekkers,2004)
CelsoLusMarino
Genome Wide Selection-GWS
GWS definidacomoaseleosimultneapara
centenasoumilharesdemarcadores,osquais
cobremogenomadeumamaneiradensa,de
formaquetodososgenesdeumacarter
quantitativoestejamemdesequilbriodeligao
compelomenosumapartedosmarcadores.
Essesmarcadoresemdesequilbriodeligao
comsQTLs,tantodegrandesquantode
pequenosefeitos,explicaroquaseatotalidade
davariaogenticadeumcarterquantitativo.
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CelsoLusMarino
Uniodemapasdeligaoemapascitogenticosamapasmoleculares
CelsoLusMarino
Genome Wide Selection-GWS
Valoresgenticosgenmicos associadosa
cadamarcadoroualelosousadospara
fornecerovalorgenticogenmico globalde
cadaindivduo.
Metodo baseadonaMelhorprediolinear
noviciada(BLUP).
Celso Lus Marino