DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE KJELDAHL

INTRODUCCIN

El contenido total de protenas en los alimentos est conformado por una mezcla compleja de protenas. Estas existen en
una combinacin con carbohidratos o lpidos, que puede ser fsica o qumica. Actualmente todos los mtodos para
determinar el contenido protico total de los alimentos son de naturaleza emprica. Un mtodo absoluto es el aislamiento
pesado directo de la protena pero dicho mtodo se utiliza slo a !eces en in!esti"aciones bioqumicas debido a que es
difccultoso .poco prctico
En #$$% el in!esti"ador dans &ohann 'jeldahl desarroll el mtodo ms usado en la actualidad para el anlisis de
protenas (mtodo 'jeldahl) mediante la determinacin del nitr"eno or"nico. En esta tcnica se di"ieren las protenas
otros componentes or"nicos de los alimentos en una mezcla con cido sulf*rico en presencia de catalizadores. El
nitr"eno or"nico total se con!ierte mediante esta di"estin en sulfato de amonio. +a mezcla di"erida se neutraliza con
una base se destila posteriormente. El destilado se reco"e en una solucin de cido brico. +os aniones del borato as
formado se titulan con ,-l (o ,./01) estandarizado para determinar el nitr"eno contenido en la muestra.
El resultado del anlisis es una buena aproximacin del contenido de protena cruda del alimento a que el nitr"eno
tambin pro!iene de componentes no proticos.
El mtodo 'jeldahl ha sufrido !arias modificaciones. 0ri"inalmente se utiliz perman"anato de potasio para lle!ar a cabo el
proceso de oxidacin (di"estin), sin embar"o, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reacti!o se
descart. En #$$2 3ilforth encontr que se poda acelerar la di"estin utilizando cido sulf*rico a4adiendo un
catalizador. 5unnin" en #$$6 propuso a4adir sulfato de potasio que ele!a el punto de ebullicin del cido sulf*rico utilizado
en la di"estin para disminuir el tiempo de la reaccin.
En la actualidad se utiliza principalmente /ulfato de -obre penta hidratrado -u/01.2,.0 como catalizador.
REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MTODO DE KJELDAHL
DIGESTIN
catalizadores7
(#) n 8 - 89,. : m,./01 -0. : (9,1). /01 : /0.
protena calor7
NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN
(.) (9,.)/01 : . 9a0, 7 .9,% : 9a./01: .,.0
(%) 9,% : ,%;0% (cido brico) 7 9,1 : ,.;0%
8
(in borato)
TITULACIN
El anin borato (proporcional a la cantidad de nitr"eno) es titulado con ,-l (o ,./01) estandarizado<
(1) ,.;0%
8
: ,
: 7
,%;0%

MATERIAL

8# bureta
8# balanza analtica de precisin =
8# Unidad de di"estin (;loc >i"est) para ?, #. .@ plazas.
8# Unidad /crubber.
8# ;omba de circulacin de a"ua.

8# Aparato destilador 'jeldahl (Aro 9itro B, / o A).

8Baterial di!erso de laboratorio
REACTIVOS
Ceacti!os preparados<
Es aconsejable la utilizacin de reacti!os a preparados, especialmente el ,-l (o ,./01) de !aloracin. -ualquier error en
su preparacin puede afectar directamente al resultado de la determinacin.
Utilizar los si"uientes, o sus equi!alentes en otras marcas<
D Ecido ;rico (en pol!o) 66.2F AA9CEA- #1#@#2
D Gndicador mixto 1.$ ( 2) CH AA9CEA- .$%%@%
(Cojo metilo : Herde de ;romocresol)
D Gndicador mixto 1.1 CH AA9CEA- .$.1%@
(Cojo metilo : Azul de Betileno)
D ,-l @.#9 /H AA9CEA- #I#@.%
D ,-l @..29 /H AA9CEA- #$.%#$
D ,./01 @.#9 /H AA9CEA- #$#@?#
D ,./01 @..9 /H AA9CEA- #$.@##
D /odio ,idrxido 1@F CE AA9CEA- #I#..@
(Aara determinacin de 9)
D Acetanilida 66F (Aatrn para !alidacin) AA9CEA- #2#@@2
D Amonio sulfato (Aatrn para !alidacin) AA9CEA- #%##1@
D -atalizador 'jeldahl ?..2F -u tabl. $" AA9CEA- #I11.$
Areparacin de la solucin fijadora de amonaco
#.8 -on indicador Bixto 1.$ ( 2)
Areparar la solucin de la si"uiente frmula para # litro de solucin fijadora<
D Aesar #@" de Acido ;rico (en pol!o) AA9CEA- #1#@#2
D >isol!erlo en # litro de a"ua destilada.
D A4adir #2ml de Gndicador mixto 2. AA9CEA- .$%%@%
..8 -on indicador mixto 1.1
Areparar la solucin de la si"uiente frmula para # litro de solucin fijadora<
D Aesar #@" de Ecido ;rico (en pol!o) AA9CEA- #1#@#2
D >isol!erlo en # litro de a"ua destilada.
D A4adir #@ml de Gndicador mixto 1.1. AA9CEA- .$.1%@
PROCEDIMIENTO
REPARACIN DE LA MUESTRA
D Jriturar, homo"eneizar mezclar la muestra.
D Aesar entre # . "ramos de muestra.
D En muestras con contenidos de nitr"eno mu peque4o, tomar la muestra suficiente para conten"a como mnimo 2 m"
de nitr"eno.
DIGESTIN
D A4adir entre #@ #2 ml (tubo macro) de ,./01 6?86$F # tableta
($ "m) de catalizador. (Aara el tubo micro, el mximo de ,./01 es 2ml)
D Bontar un sistema para la extraccin de humos o scrubber con 9a.-0%.
D Cealizar la di"estin en tres pasos<
1. En funcin del contenido de a"ua de la muestra, empezar la di"estin e!aporando a"ua a #2@K- entre #2 %@ minutos.
2. Cealizar un se"undo paso entre .I@ %@@K- entre #2 o %@ minutos para reducir la produccin de humos blancos.
3. -ontinuar la di"estin a 1@@K- entre ?@ 6@ minutos.

Al"unos ejemplos<
Lueso o carne<
Aaso#K< #2@K- M %@N Aaso . < .I@K- M %@N Aaso %< 1@@K- M 6@N
-ereales<
Aaso#K< #2@K- M #2N Aaso . < %@@K- M #2N Aaso %< 1@@K- M ?@N
-ontrol Hisual< El resultado es un lquido transparente ntido con coloracin azul claro, !erde o amarillo dependiendo del
catalizador utilizado. 9o deben quedar restos ne"ros adheridos a la pared de tubo.
9ota< >urante la di"estin debe controlarse la produccin de espuma en las muestras. /i esta es excesi!a, debe alar"arse
el paso nK #.
DILUCIN
D /acar los tubos muestra del bloque di"estor dejar enfriar a JO ambiente. (Auede forzarse sumer"iendo los tubos,
cautelosamente, en un poco de a"ua)
D A4adir unos .2ml de a"ua destilada en cada tubo.
D A4adir el a"ua despacio mo!iendo el tubo sin dejar solidificar la muestra. /i es necesario calentar li"eramente el tubo
(por ejemplo introducindolo en el bloque di"estor toda!a caliente)
D >ejar enfriar de nue!o hasta JO ambiente.
D Aara e!itar prdidas de nitr"eno reacciones !iolentas no introducir el tubo toda!a caliente al destilador.
DESTILACIN
D /ituar un Erlenmeer de .2@ml a la salida del refri"erante con 2@ml de cido ;rico unas "otas de indicador.
D Aro"ramar una dosificacin de 2@ a I2 ml de 9a0,.
D Gntroducir el tubo con la muestra en el destilador.
D >estilar hasta reco"er .2@ml en el Erlenmeer (2@ml ;rico : .@@ml de destilado).
-ontrol Hisual< Una !ez se ha a4adido el 9a0,, la muestra debe tomar una coloracin azulada, de no ser as, a4adir ms
9a0,.
VALORACIN Y CLCULO
D Halorar el destilado con ,-l ,./01 hasta el cambio de color. (punto final< p, 1.?2)
Boles de ,-l P Boles de 9,% P Boles de 9 en la muestra
Boles de ,./01P .Boles de 9,% P .Boles de 9 en la muestra
D Cealizar el clculo<
m N ! N " V " 1#
>onde<
9 P 9ormalidad del cido de !aloracin
H P Holumen de cido consumido
#1 P Aeso atmico del nitr"eno.
D Aara pasar a contenido de protenas corre"ir por el factor adecuado se"*n la naturaleza de la muestra. (?..2 por defecto)
D Aeridicamente realizar un ensao en blanco restarlo del resultado.
$ P%&'()*+, ! P2 " 1-- " .
P-
>onde<
A.< 9itr"eno (m").
A@< Aeso de la muestra (m").
Q< Qactor protenico.
(?..2 por defecto)
Qactor protico de al"unos alimentos<
Almendras 2,#$
9ueces 2,%@
9ueces 8 cacahuetes 2,1#
5elatina 2,22
/oja 2,I#
-ebada, a!ena, centeno 2.$%
tri"o, harina entera 2,$%
,arinas (no entera) 2,I@
Arroz 2,62
Baz ?,.2
Jodos los otros alimentos ?,.2
/al!ado ?,%#
+eche lcteos ?,%$


VERI.ICACIN DE LA RECUPERACIN CON AMONIO SUL.ATO
Esta !erificacin es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del destilador.
/e trata de preparar una muestra cuo contenido de nitr"eno es conocido. Esta se destila, se !alora con ,-l @..29 se
calcula el 9itr"eno detectado.
El porcentaje de nitr"eno detectado sobre el de la muestra se denomina %(/01(%+/23* de 9itr"eno.
P%(1+%+% 4+ m0(,'%+5
C&*'(*26& 6( *2'%3(*& 6( 0*+ m0(,'%+ 6( Am&*2& ,047+'& 5
Qormula< (9,1). /01
Aeso molecular< #%..#1
Qactor< #1 R . M #%..#1 P @..#.
m" de 9itr"eno P @..#. R m" de Amonio sulfato
D Aesar unos #@@m" de amonio sulfato. El peso exacto ser A@
D +a cantidad exacta de 9itr"eno es<
P1 8m9 ! P- " -:212
D >estilar a4adiendo .2ml de 9a0,
D Una !ez destilado !alorado obtenemos el nitr"eno (m") detectado< A.

P2 ! N " V " 1#
D&*6(5
9 P 9ormalidad del cido de !aloracin (,-l @..2)
H P Holumen de cido consumido
#1 P Aeso atmico del nitr"eno.
D -alculamos la recuperacin<

R8$9 ! P2 ; P1 <1--
D +a recuperacin aceptable es entre 66.2 #@@.2 F.
S2 ,( 0'242=+ HC4 6( *&%m+426+6 627(%(*'( 1%(1+%+% m0(,'%+,5
9ormalidad Buestra de Amonio sulfato.
@,@2 .@ ... 1@ m"
@,# 1@ ... 6@ m"
@,.2 #@@ S .@@ m"
@,2 .@@ S 1@@ m"
VERI.ICACIN DE LA RECUPERACION CON ACETANILIDA
Esta !erificacin es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del proceso completo del anlisis del nitr"eno
'jeldahl que inclue las etapas de di"estin, destilacin !aloracin.
/e trata de preparar una muestra cuo contenido de nitr"eno es conocido. Esta se di"iere, se destila, se !alora se
calcula el 9itr"eno detectado.
El porcentaje de nitr"eno detectado sobre el de la muestra se denomina %(/01(%+/23* de 9itr"eno.
Aara realizar sta !erificacin se utiliza la Acetanilida.
P%(1+%+% 4+ m0(,'%+5
-ontenido de nitr"eno de una muestra de Acetanilida <
Qormula< -$,690
Aeso molecular< #%2.#I
Qactor< #1 M #%2.#I P @.#@%2
m" de 9itr"eno P @.#@%2 R m" de Acetanilida
D Aesar alrededor de .2@m" de acetanilida. El peso exacto ser A@
D +a cantidad exacta de 9itr"eno es<
P1 8m9 ! P- " -:1-3>
D2(,'23* 6( 4+ m0(,'%+5
D -olocar la acetanilida en un tubo, a4adir #@ml de cido sulf*rico 6$F una tableta de catalizador 'jeldahl.
D >i"erir a 1@@K- durante #h. (El resultado debe ser un lquido transparente con coloracin azul.)
D >ejar enfriar a4adir .2ml de a"ua destilada en cada tubo. Jomar precauciones para e!itar salpicaduras. +a reaccin del
a"ua sobre el cido sulf*rico es !iolenta.
D(,'24+%5
D >estilar a4adiendo I2ml de 9a0,. Utilizar ,-G @..29 para la !aloracin.
D Una !ez destilado !alorado, obtenemos el nitr"eno (m") detectado< A.
D&*6(5
9 P 9ormalidad del cido de !aloracin (,-l @..2).
H P Holumen de cido consumido.
#1 P Aeso atmico del nitr"eno.
P2 ! N " V " 1#
D -alculamos la recuperacin<
R8$9 ! P2 ; P1 <1--
D +a recuperacin aceptable es entre 66.2 #@@.2 F.

.UENTES DE ERROR
L+, 1%2*/21+4(, 70(*'(, 6( (%%&% ,&*5
E* (4 1%&/(,& 6( 62(,'23*5
#.8 +a inclusin de nitr"eno no protico (aunque la cantidad de este nitr"eno suele ser despreciable comparada con la del
nitr"eno protico)T
..8 +a prdida de nitr"eno durante la di"estin
El exceso de sulfato de sodio o potasio que se a4ade al cido para ele!ar el punto de ebullicin, puede producir una
descomposicin por calor por lo tanto prdida de nitr"eno.
Aor otro lado, el exceso de catalizador (de cobre "eneralmente) tambin puede producir prdidas de nitr"eno
%.8 +a di"estin incompleta de la muestra.
5eneralmente debida a falta de tiempo de reaccin o falta de cido sulf*rico.
D0%+*'( 4+ 6(,'24+/23*5
#.8 9eutralizacin incompleta de la mezcla di"erida. Es necesario a4adir suficiente 9a0, para neutralizar el exceso de
cido sulf*rico resultante de la di"estin as como transformar todo el amonio formado en la di"estin en amonaco.
..8 Aerdida de amonaco por fu"as en el circuito de destilacin.
%.8 Aerdida de amoniaco por refri"eracin insuficiente en el condensador.
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