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Anlisis

Abstracto
Un mtodo original de HPLC acoplado a un detector de fluorescencia es presentado para el
anlisis simultaneo en muestras de sangre seca (DBS) de cocana y dos metabolitos importantes,
llamados (metabolito principal) y cocaethyleno ( el metabolito activo formado en presencia de
alcohol) el anlisis cromatografico se llev a cabo en una columna C8. Usando una fase mvil que
contena tampn de fosfato (pH: 3,0) acetonitrilo (85/15 v/v) . el analito nativo fue monitoreado
a 315 nm mientras su excitacin fue a 215nm. Un tratamiento previo de la muestra rpida y
viable fue implementado por extraccin con disolventes obteniendo un buen rendimiento de
extraccin. (>91%). Y unos valores de precisin satisfactorios (RSD < 4,8 %), el mtodo fue
aplicado con xito a muestras DBS. Colectada de algunos consumidores de cocana, con o sin
ingesta de alcohol. Los resultados fueron de acuerdo a los obtenidos a partir de muestras de
plasma sometidas a un procedimiento de extraccin en fase slida original en cartuchos C8. El
mtodo ha demostrado ser adecuado para el monitoreo de cocana/etanol usado por medio de
pruebas DBS o plasma. Los ensayos estn en curso para aplicar este mtodo en la calle, para el
control de los sujetos sospechosos de conducir bajo la influencia de sustancias psicotrpicas.}

1. introduccin
La cocana (metil ( 1R , 2R , 3S , 5S ) -3 - . ( Benzoiloxi ) - 8 - metil - 8 - azabiciclo [ 3.2.1 ]
octano - 2 -carboxilato de etilo , COC , la figura 1a ) es actualmente el segundo ilcito ms
extendida de drogas en los pases occidentales , despus de Cannabis [ 1 ] . En Europa , en
particular , su uso ha ido en aumento en los ltimos aos , siguiendo un patrn similar a la
de los EE.UU. en la dcada de 1980 [ 2 ] .
Esta tendencia ha atrado mucho la atencin de los gobiernos y las agencias de salud y
est creando mucha preocupacin por su impacto negativo en las personas, y en particular
en los jvenes de los adolescentes, la salud [ 3 ] .
Entre los muchos posibles efectos negativos de la COC , el deterioro de conduccin es sin
duda uno de los ms importantes : en los pases industrializados , los accidentes de trfico
son la principal causa de muerte entre los jvenes de 15 a 19 aos y la segunda entre las
personas en la edad de 20-25 soporte [ 4 ] . Algunos estudios recientes han encontrado
que el 1-15 % de todos los conductores conduce bajo la influencia de una o ms drogas [ 5
] , y que hasta el 25 % de ellos fue positiva para COC [ 6 ] . Esta sustancia es bien conocida
para inducir una sensacin de omnipotencia y el aumento de confianza en s mismo , as
como el deterioro sensorial en algunas circunstancias (por ejemplo , deslumbramiento
debido a dilatacin de la pupila , lo que provoca una visin " blanca " ) [ 7 ] , lo que puede
explicar fcilmente el papel de consumo COC como un posible factor que contribuye a
muchos accidentes de vehculos de motor. Dado que el metabolismo de COC es bastante
rpido , lo que lleva a la produccin de metabolitos inactivos , la prueba del uso de COC se
adquiere generalmente mediante la deteccin de su principal metabolito ,
benzoilecgonina ( 3 - benzoiloxi - 8 - metil - 8 - azabiciclo [ 3.2.1 ] octano - 4-carboxlico ,
BEG , fig. 1b). De hecho , BEG se encuentra en la orina de las usuarias de AOC hasta por
una semana o ms despus del consumo (a diferencia de 1-2 das para la COC) [ 8 ] .
El uso concomitante de COC y las bebidas que contienen etanol significa que las vas
metablicas habituales producen su transesterificacin a etileno de cocana (acetato de (
2R, 3S ) - 3 - benzoiloxi - 8 - metil - 8 - azabiciclo [ 3.2.1 ] octano - 2 - carboxilato , CET , fig.
1c ) , as como la hidrlisis simple a BEG . CET tiene estimulante, euforizante, anorxico,
simpaticomimtico y propiedades anestsicas locales y parece producir ms euforia y de
poseer una mayor duracin de accin que COC . Algunos estudios informan que HEC
tambin puede tener una alta toxicidad cardiovascular [ 9 ] . Por otra parte, ya que el
alcohol es una de las fuentes ms conocidas de la incapacidad y las causas de los
accidentes de coche de conduccin, es fcilmente comprensible que su asociacin con el
COC tiene el potencial para multiplicar su peligrosidad , con un mecanismo sinrgico . Por
ejemplo , se ha encontrado que las concentraciones de COC de plasma son
significativamente ms altos durante COC y la administracin de etanol que durante la
administracin de COC sola en dosis equivalentes [ 10 ] . Aunque no es una droga en s
ilcito ( que no est incluido en las listas de sustancias controladas ), la presencia CET en los
tejidos del cuerpo es , por supuesto, una prueba de la ingesta simultnea de COC y etanol.
Teniendo en cuenta todos estos hechos preocupantes sobre el abuso de COC , es evidente
la necesidad de mtodos analticos fiables y de fcil aplicacin para la determinacin de
COC , BEG y CET en abusadores , con especial atencin para los casos de personas
sospechosas de conducir bajo la influencia de drogas . Una de las partes ms
problemticas de las pruebas de drogas es la eleccin de la matriz y su muestreo . De
hecho , los anlisis de orina es el procedimiento ms frecuente , ya que no es invasiva ,
pero es muy propenso a la adulteracin de la muestra y no una prueba concluyente de
deterioro de conduccin , debido a la larga permanencia en la orina de BEG , que es
inactivo . Por otra parte , el muestreo de sangre es indicativa de real , intoxicacin actual y
no adulterado con facilidad, pero es invasiva . Por otra parte, el almacenamiento de
sangre y / o la direccin es un paso crucial que puede influir fuertemente en el resultado
de anlisis y es una fuente potencial de problemas : si las muestras no se manejan con
cuidado, constantemente refrigerada y centrifugada dentro de un corto perodo de
tiempo , hemlisis y otros fenmenos de degradacin puede ocurrir , con efectos
potencialmente perturbadores en los resultados analticos . Dado que las muestras de
sangre no se pueden congelar sin una amplia hemlisis , algunos procesos metablicos en
relacin COC y compuestos relacionados (por ejemplo , hidrlisis de ster ) pueden
progresar mientras que la muestra se transporta , almacena y se procesa para obtener las
muestras de plasma . Incluso si se obtiene inmediatamente el plasma , se requiere de
refrigeracin constante . Por el contrario , la prdida de agua que se produce en un corto
tiempo en manchas de sangre , se detiene la actividad enzimtica y por lo tanto preserva
la integridad de analito . Por estas razones , el uso de muestras de sangre seca (DBS)
representa una alternativa muy atractiva para el muestreo de sangre convencional , ya
que es tcnica de muestreo aminimally invasiva , fcilmente almacenado y transportado
sin la necesidad de refrigeracin ( la tarjeta manchado con el DBS puede ser simplemente
poner en un sobre y se enva al laboratorio de anlisis ) . Obviamente , el muestreo de DBS
requiere la misma consentimiento informado como el muestreo de sangre , sin embargo
los procedimientos manuales son mucho ms simples y los riesgos infecciosos son mucho
ms bajos para el primero que para este ltimo . Por otra parte , el uso de DBS es atractivo
por varias otras aplicaciones en las que el consentimiento informado es implcita o
previamente obtenido : por ejemplo, las pruebas en el entorno del lugar de trabajo , o el
seguimiento de los programas de tratamiento de drogadiccin . Un mtodo de anlisis
original se presenta aqu para el anlisis simultneo de
COC , BEGand CET inDBSby medio de HPLC con deteccin por fluorescencia, los resultados
obtenidos a partir de DBS se han comparado con los obtenidos cuando se utiliza muestras
de sangre para determinar las concentraciones plasmticas de los mismos analitos . Unos
documentos se pueden encontrar en la literatura para el anlisis ofDBSto determinar la
ingesta de cocana [ 11-14 ] . Sin embargo , todos ellos tratan slo con COC [ 11 ] o BEG [
12-14 ] . A lo mejor de nuestro conocimiento , ningn mtodo ha sido desarrollado para el
anlisis simultneo de COC , BEG y CET en DBS y el plasma , y tampoco para los solos CET.
Por lo tanto , el mtodo propuesto es una mejora significativa sobre los mtodos
existentes y permite la evaluacin rpida, sencilla y fiable de uso de AOC , as como la de
COC concomitante y la ingesta de etanol . Su utilidad tambin se destaca por el hecho de
que el uso de DBS permite la toma de muestras de fcil , el almacenamiento y el
transporte de una matriz hemtica tambin en situaciones difciles, como en las calles para
el control de los conductores de vehculos de motor, mientras se mantiene la fiabilidad y
la importancia de la extraccin de sangre tradicional por flebotoma.
2 . experimental

2.1 . Productos qumicos y soluciones
Soluciones madre metanlica de COC , BEG y HEC ( 1 mg / ml) fueron adquiridos de las
Normas LGC ( Teddington, Reino Unido ) . . Venlafaxina ( ( 1 - [ 2 - ( dimetilamino ) -1 - ( 4 -
metoxifenil ) etil ] ciclohexanol ) utilizado como patrn interno (IS, Fig. 1d ) fue
proporcionada por Wyeth (Madison, NJ, EE.UU. ) , sus soluciones madre ( 1 mg / ml ) se
prepararon en metanol .
Acetonitrilo y metanol de grado HPLC ( > 99,8 % ) , 85 % ( w / w ) de cido fosfrico y
fosfato monobsico de potasio puro para anlisis ( > 99 % ) se adquirieron de Sigma -
Aldrich ( Miln, Italia ) . Se aadi trietilamina pura para anlisis ( > 99,5 % ) se adquiri de
Fluka ( Buchs, Suiza ) . Agua ultrapura ( ? Cm 18.2M ) se obtuvo por medio de un aparato
de MilliQ por Millipore ( Milford , EE.UU. ) . Las soluciones estndar se obtuvieron por
dilucin de las soluciones madre con la fase mvil . Las soluciones madre se mantuvieron
estables durante al menos 2 meses cuando se almacena a -20 C ( segn la evaluacin de
ensayos de HPLC ) , las soluciones estndar se preparan fresco cada da.
2.2 . Condiciones de Instrumentacin y HPLC
El sistema cromatogrfico se compone de un Jasco ( Tokio , Japn ) de la PU - 2089 PLUS bomba
cromatogrfica y un Jasco FP- 2020 detector de espectrofluorimtrico fijado en ? Exc = 230 nm , ?
Em = 315 nm . Las separaciones se obtuvieron en un Varian ( Walnut Creek , EE.UU. ) columna
Microsorb MV C8 ( ID 250 mm 4,6 mm , 4 ? M ) mantuvieron a temperatura ambiente . La fase
mvil estaba compuesta de tampn de fosfato de potasio - acetonitrilo ( pH 3,0 ; 50 mM ) ( 15:85 ,
v / v ) . La fase mvil se filtr a travs de un filtro de Phenomenex de membrana (membrana de 47
mm , tamao de poro de 0,2 ? M , de nylon ) y se desgasific por un bao de ultrasonidos . La tasa
de flujo fue de 1,5 ml / min y las inyecciones se llevaron a cabo a travs de un 50 - bucle ul . El
procesamiento de datos fue realizada por medio de un software Jasco Borwin 3.0. Whatman (
Maidstone, Reino Unido ) 903 Protena Ahorro de tarjetas se utilizaron para la recoleccin de
muestras de DBS . Extraccin en fase slida ( SPE ) se llev a cabo en un aparato Varian Vac Elut .

2.3 . La recogida de muestras y preparacin
Para el anlisis de DBS, cada sujeto fue pinchado en un dedo y el 10 u L de sangre fueron extradas
con una micropipeta. La sangre era entonces de inmediato y cuidadosamente transferida a una
tarjeta de ahorro de protenas, prestando atencin de no tocar la tarjeta con la punta de la pipeta
o ir fuera de los crculos de pre- marcadas. La sangre se deja secar durante 2 h en la oscuridad, en
un lugar fresco y seco. Para el anlisis en plasma, se tomaron muestras de sangre del mismo sujeto
en un vial que contiene EDTA como anticoagulante. La sangre se centrifug a 1.400 g durante 10
min y el plasma sobrenadante se separ, se transfiri a viales de polipropileno y congelados. Las
muestras "reales" eran de usuarias de COC y la utilizacin para fines forenses ya fue autorizada en
el momento de la toma de muestras. DBS en blanco y las muestras de plasma para la validacin
del mtodo se obtuvieron de voluntarios sanos y se trataron y se almacenan en la misma forma
que las muestras reales. Todos los procedimientos se llevaron a cabo utilizando el vidrio de alta
actnica, es decir, vidrios polarizados, que absorbe la radiacin infrarroja y ultravioleta ms de luz
natural y artificial.
2.3.1. DBS pretratamiento
Un crculo de pre-marcado con 10 mm de dimetro, que contiene 10 u L DBS, se perfor de la
tarjeta y se coloca en un vial con 500 ul de metanol. El vial se agita en vrtex durante 30 s y se
centrifuga a 1400 g durante 10 min. El sobrenadante se llev a sequedad al vaco (evaporador
rotatorio), se volvi a disolver con 100 ul de fase mvil y se inyect en el HPLC.

2.3.2. Muestra de plasma pre-tratamiento
El procedimiento de la SPE se llev a cabo en cartuchos Varian BondElut C8 (50 mg, 1 ml). Los
cartuchos se activaron mediante el paso a travs del cartucho 1 ml de metanol dos veces y luego
acondicionado haciendo pasar 1 ml de agua ultrapura dos veces. Una alcuota de 400u L de plasma
se carg en el cartucho. Fue luego se lav secuencialmente dos veces con 1 ml de agua ultrapura y
una vez con 1 ml de agua / metanol (90:10, v / v). Los analitos se eluyeron luego con 1 ml de
metanol. El eluato se sec bajo vaco, se volvi a disolver con 100uL de fase mvil y se inyect en
el sistema HPLC.
2.4 . La validacin del mtodo
2.4.1 . Las curvas de calibracin
Las alcuotas de 5 uL de soluciones estndar del analito en siete concentraciones diferentes, que
contienen el SI a una concentracin constante, se aadieron a 10 u L DBS , prestando atencin de
no tocar la superficie de la tarjeta con la punta de la pipeta o ir fuera de la sangre roja spot. Un
volumen de 20 u L de las soluciones estndar del analito en siete concentraciones diferentes, que
contienen el SI a una concentracin constante, esta en 400 u L de plasma en blanco. Las muestras
de plasma spikedDBSor resultantes se sometieron a los procedimientos de pre - tratamiento
descritos anteriormente y, finalmente, inyectar en el HPLC . El procedimiento se llev a cabo por
triplicado para cada concentracin . El analito / IS proporciones de picos de rea obtenidos
(nmeros sin dimensiones ) se representaron frente a las concentraciones correspondientes de los
analitos ( expresado como ng / ml) y las curvas de calibracin establecidos por medio del mtodo
de los mnimos cuadrados . Los valores del lmite de cuantificacin ( LOQ ) y el lmite de deteccin
(LOD ) se calcularon de acuerdo con USP [ 15 ] Directrices como las concentraciones de analito ,
que dan lugar a picos cuyas alturas son 10 y 3 veces el ruido de la lnea de base , respectivamente.

2.4.2 . Rendimiento de extraccin ( recuperacin absoluta )
El procedimiento fue el mismo que el descrito en " curva de calibracin " anterior, excepto los
puntos estaban en 3 concentraciones diferentes , correspondiente al lmite inferior, un punto
medio y alto valor de cada curva de calibracin . Las reas de los picos del analito se compararon
con los obtenidos mediante la inyeccin de soluciones estndar en las mismas concentraciones
tericas y se calcularon los valores de rendimiento de la extraccin .
2.4.3. precisin
Los ensayos descritos en "Rendimiento de extraccin" se repitieron seis veces en el mismo da
para obtener repetibilidad (precisin intrada) y seis veces ms de seis das diferentes para
obtener la precisin intermedia (precisin entre das), ambos expresados como valores de
desviacin estndar relativa (RSD%) .

2.4.4. selectividad
Blank DBS o muestras de plasma de seis voluntarios diferentes se sometieron al procedimiento de
pre-tratamiento de las muestras y se inyectaron en el HPLC. Los cromatogramas resultantes se
revisaron para la posible interferencia a partir de compuestos endgenos. El criterio de aceptacin
no estaba interfiriendo pico ms alto que un pico del analito correspondiente a su lmite de
deteccin. Adems, las soluciones estndar de varios compuestos diferentes activos sobre el
sistema nervioso central se inyectaron en el sistema de HPLC. La concentracin de cada estndar
solucin era igual a 5 veces el lmite superior de linealidad de las soluciones estndar del analito
(es decir, 10? g / ml).

2.4.5. precisin
La precisin se evalu por medio de ensayos de recuperacin como es requerido por la
Conferencia Internacional de Armonizacin (ICH) [16] y por los EE.UU. Food and Drug
Administration (FDA) [17]. Los ensayos descritos en "Rendimiento de extraccin" se llevaron a
cabo la adicin de las soluciones estndar del analito y el IS para DBS real o muestras de plasma de
los sujetos que resultaron positivos para COC y cuyo contenido de los analitos ya se determin. Los
ensayos se repitieron tres veces durante el mismo da para obtener la recuperacin (%) y los datos
SD.
3 . Resultados y discusin
3.1 . ensayos preliminares
COC y sus dos metabolitos BEG y CET todos poseen fluorescencia nativa , hecho que permite su
determinacin simultnea y sin la necesidad de procedimientos de derivacin de aquellos
complicados y lentos , pero con una buena sensibilidad y selectividad. Nuestro estudio anterior en
el anlisis de COC en el cabello humano [ 18 ] nos llev a desarrollar un mtodo cromatogrfico
adecuado para la separacin de los tres analitos . Las mismas condiciones cromatogrficas de
columna ( Hydro -RP , fase mvil compuesta
de / tampn fosfato metanol acetonitrilo / cido) se ensayaron inicialmente para separar COC ,
BEG y CET , sin embargo , la retencin fue alta ( tiempos relativamente de largo plazo ) y se
observ una superposicin parcial entre COC y BEG . Por esta razn , un tipo diferente de fase
estacionaria se trat , a saber, un sorbente C8 . Esta eleccin dio tiempos de retencin ms cortos ,
pero an con cierta superposicin entre COC y BEG . Por ltimo , la fase mvil se simplifica con la
eliminacin de metanol , manteniendo constante el porcentaje de acetonitrilo ; con esta
composicin de la fase mvil , la retencin de analito era aceptable y los compuestos de inters
fueron la lnea de base separada en menos de 12 min . Se observ tambin que la simetra del pico
se mantiene aunque trietilamina fue eliminado de la fase mvil ; este cambio fue mantenida por la
sencillez y bajo costo . La venlafaxina fue elegido como el IS , ya que posea propiedades fsico -
qumicas similares a las de los analitos y no alargar los tiempos de ejecucin .
3.2 . Anlisis de soluciones estndar
Buena linealidad ( r2 > 0,9998 ) se obtuvo en el intervalo de concentraciones 2-2000 ng / mL para
el COC y BEG y sobre el rango de concentracin de 1,2 a 2000 ng / mL para el CET. Los LOQ y los LD
, respectivamente , fueron de 2 ng / mL y 0,7 ng / ml para la COC y BEG y 1,2 ng / mL y 0,4 ng / ml
para la CET. Ensayos de precisin se llevaron a cabo en tres niveles diferentes ( 2 , 750 y 1000 ng /
mL para el COC y BEG y 1.2 , 750 y 1000 ng / mL para CET ) y dieron buenos resultados : los valores
de la RSD de repetibilidad (precisin intrada) eran siempre inferior a 2,2 % ( 2,0 % para el SI ) .
Intermedio ( interdiaria ) precisin fue satisfactoria , con valores de la RSD siempre inferior a 2,9 %
( 3,3 % para el SI ) .

3.3 . Desarrollo de los procedimientos de tratamiento previo de la muestra
La complejidad de matrices biolgicas (como la DBS y plasma ) por lo general requiere el desarrollo
de procedimientos de tratamiento previo de la muestra adecuadamente selectivos y fiables.
Sin embargo , la adsorcin de DBS en el papel puede ser visto como una especie de pre -
tratamiento , que puede retener varios compuestos de la matriz , mientras que la liberacin de los
analitos cuando el papel se trata con un disolvente adecuado . Por esta razn , los ensayos
preliminares se llevaron a cabo mediante el tratamiento de pas de DBS con diferentes disolventes
o mezclas (bferes de cidos, metanol, acetonitrilo, mezclas de solvente orgnico tampn);
bferes puramente acuosos demostraron ser inadecuado para eliminar los analitos del peridico,
mientras que los disolventes orgnicos puros y mezclas acuosas / orgnicas dio resultados
prometedores. Metanol, finalmente, fue encontrado para proporcionar la mejor muestra de
limpieza, mientras tambin daba casi completa (> 91%) extraccin rinde para todos los
compuestos de inters. El cromatograma de una muestra DBS en blanco y de la misma muestra
que se enriquecieron con los analitos y los se muestran en la Fig. 2a y b, respectivamente. Como se
puede ver, no hay interferencia est presente en el espacio en blanco en tiempos
correspondientes a los de los analitos y los de retencin.Por el contrario, las muestras de plasma
normal, que no estn sujetos a adsorcin sobre papel, necesitan estar convenientemente tratadas
previamente. Entre las distintas posibilidades, SPE fue elegido: varias clases de adsorbentes fueron
consideradas por el procedimiento de SPE, tales como C8, C18, estratos-X (equilibrio hydrophilic
lipophilic), Ph (phenilic), certificar (basados en slice modo mixto lipoflico fuerte intercambio
catinico). Entre stos, los cartuchos C18 dieron lugar a muchas interferencias en el
cromatograma, mientras estratos-X sorbente causado rendimientos de extraccin baja de BEG y
CET. Ph y certificar los cartuchos dieron resultados aceptables; Sin embargo, el sorbente C8
demostr para otorgar mejores resultados en trminos de ambas muestra limpieza y analito rinde
en esta matriz. Este ltimo fue elegido por lo tanto para todos los ensayos posteriores. El paso de
lavado se realiz inicialmente usando slo 1mL de agua dos veces. Para obtener una matriz de
limpiador, se analizaron las mezclas agua/metanol. Se obtuvieron los mejores resultados en
trminos de rendimientos de extraccin y purificacin con 1 mL de metanol 10%. Elucin con
metanol puro probado con xito, permitiendo tambin la sequedad fcil y re-disolucin de la
muestra para fines de preconcentracin: desde 400 L de plasma se cargan en el cartucho y el
efluente es re disuelto en 100 L de la fase mvil, este tratamiento concentra los analitos 4 veces
con respecto a la solucin inicial.
El cromatograma de una muestra de plasma en blanco y el de la misma muestra que se
enriquecieron con los analitos y la cual, despus de SPE, se muestran en la Fig. 2 c y d,
respectivamente. Como se puede ver, en la muestra en blanco la lnea de base es
extraordinariamente limpio, sin ninguna interferencia en tiempos corresponden a los de los
analitos y los de retencin. Picos son simtricos y base resolvi en la muestra con pinchos.
3.4. validacin del metodo
Teniendio as haba probada la idoneidad del procedimiento de tratamiento previo de la muestra,
las curvas de calibracin se establecieron en las matrices en blanco. Soluciones estndar de los
analitos a diferentes concentraciones y el IS a concentracin constante se agregaron DBS y las
muestras de plasma y las mezclas resultantes fueron sometidas a los respectivos procedimientos
pretratamiento. Se obtuvo buena linealidad (r2 > 0.9995) para todos los analitos sobre rangos de
amplia concentracin; tanto los datos de linealidad y parmetros son registrados en la tabla 1.
Como se puede constatar, los valores LOQ y LOD para DBS son 10 veces superiores a los
encontrados por soluciones estndar; Esto es debido al factor de dilucin introducido durante el
tratamiento previo de la muestra DBS.Se realizaron anlisis de precisin y rendimiento de la
extraccin (recuperacin absoluta) en plasma enriquecido con concentraciones de analito
correspondiente al lmite inferior, un punto intermedio y un alto valor de las curvas de calibracin
correspondientes y DBS en blanco. Estos resultados se reportan en la tabla 2 como se puede
constatar, datos de rendimiento de extraccin fueron buenas, desde siempre superior al 91% (93%
para el IS). Precisin resultados tambin fueron satisfactorios: RSD valores de repetibilidad fueron
menores de 4,1% (3,9% para el IS); RSD valores de precisin intermedia fueron inferiores a 4,8%
(4,2% para el IS).Selectividad hacia xenobiticos se evalu mediante la inyeccin en las soluciones
estndar de HPLC de varios compuestos activos en el sistema nervioso central, ambos
medicamentos (por ejemplo antidepresivos, antipsicticos y ansiolticos-hipnticos) y abuso de
drogas. La lista completa de estos frmacos se divulga en la tabla 3. Como se puede ver, ninguno
de los compuestos probados interfiere con la determinacin. Evaluar la selectividad compuesta
endgena, en blanco muestras obtenidas de seis diferentes voluntarios sanos se sometidos al
procedimiento de pretratamiento de muestra y analizaron. De estas muestras no demostraron
ningn pico, que podra interferir con el anlisis. Por lo tanto, la selectividad puede considerarse
muy satisfactoria.
3.5 . Anlisis de muestras de las usuarias de AOC
Despus de haber validado por lo tanto el mtodo , que se aplic al anlisis de DBS y muestras de
plasma recogidas de unos pocos sujetos que eran usuarios de COC y , en algunos casos , COC y
abusadores de etanol . Como un ejemplo , el cromatograma de una muestra de DBS de uno de
estos consumidores de COC y de etanol se inform en la figura . 3a , mientras que el
cromatograma de una muestra de plasma del mismo sujeto se muestra en la figura . 3b : todos los
tres analitos son claramente visibles y simultneamente quantitable en ambos cromatogramas .
CET siempre se encontr en ambas matrices tomadas de los sujetos que fueron positivos tanto
COC y etanol , lo que confirma que el mtodo es adecuado para la deteccin de su ingesta
simultnea . Por otra parte , las cantidades de analito que se encuentran en DBS y las que se
encuentran en el plasma son siempre en buen acuerdo , teniendo en cuenta la presencia de
hematocrito en DBS y su ausencia a partir de plasma . Dado que el hematocrito normal de media
es de 38 % ( v / v ) en mujeres y 48 % ( v / v ) en los hombres , las concentraciones encontradas en
muestras de DBS se multiplica por un factor de correccin correspondiente ( 1,62 para las mujeres
y 1,92 para los hombres ) ; sin se necesitaba correccin adicional para la particin hematocrito / de
plasma , ya que este parmetro es aproximadamente igual a 1,0 para COC [ 19 ] . Los valores
transformados obtenidos de este modo son siempre muy similares a los encontrados en el plasma
. Por ejemplo , los niveles de analito que se encuentran en la muestra informaron de DBS en la
figura . 3a fueron: 37 ng / mL para COC , 113 ng / mL para BEG y 34 ng / ml para el CET ; una vez
trasnformed para el hematocrito hembra ( es decir , multiplicado por 1,62 ) , estos valores se
convierten en 60 ng / ml de COC , 183 ng / ml para BEG y 55 ng / ml para la HEC. Los ltimos
valores son casi idnticos a los encontrados en la muestra de plasma correspondiente (fig. 3b), que
eran 62 ng / ml de COC, 180 ng / mL para BEG y 56 ng / ml para la HEC. Precisin se evalu por
medio de ensayos de recuperacin. Las soluciones estndar de los analitos a tres concentraciones
diferentes y la SI en concentracin constante se aadieron a DBS y muestras de plasma de las
usuarias de AOC. Los ensayos se repitieron tres veces durante el mismo da para calcular
recuperacin media analito (%) y los valores de SD. Los resultados siempre fueron> 90% ( 3,1
significa SD) para DBS y> 91% ( 3,0 significa SD) para el plasma. Por lo tanto, el mtodo ha
demostrado poseer una buena precisin.
4. conclusin
El mtodo de HPLC con deteccin por fluorescencia presenta aqu para la determinacin de COC,
BEG y CET en DBS y el plasma es rpido, sensible y selectivo. El procedimiento de pre-tratamiento
para el DBS es una extraccin con disolvente simple, mientras que para el plasma se basa en la SPE
con cartuchos C8; ambos procedimientos permiten obtener buenos rendimientos de extraccin (>
91%) y una purificacin satisfactoria de interferencias tanto endgenas como exgenas. El mtodo
propuesto es una mejora significativa sobre los mtodos existentes [11-14], ya que tiene la ventaja
fundamental de que permite la cuantificacin simultnea de COC, BEG y HEC en DBS y muestras de
plasma, por lo que es posible detectar la ingesta simultnea de tanto COC y etanol. El mtodo
tiene tambin la ventaja de determinar los niveles de COC y BEG (junto con Niveles CET , en su
caso ) que consumen slo 10 u L de la sangre seca en un lugar , mientras que conserva la
sensibilidad suficiente para llegar a los puntos de corte comnmente aceptados para estos
compuestos en la matriz hemtica ( es decir , 50 ng / mL para COC , 25 ng / ml para los metabolitos
) [ 20,21 ] . Se ha aplicado con xito para el anlisis de DBS y muestras de plasma de usuarios de
COC , tanto en la presencia y en la ausencia de etanol : los resultados obtenidos a partir de las dos
matrices estaban en estricta acuerdo; tambin se obtuvieron buenos resultados de precisin . Por
lo tanto , el mtodo propuesto es adecuado para el monitoreo del uso de AOC y del COC -etanol
ingesta simultnea , a travs de pruebas de DBS y plasma. Los ensayos estn en curso , con el fin
de aplicar el mtodo a una poblacin ms numerosa a los efectos del consumo de drogas de
monitoreo y anlisis estadstico, en colaboracin con los centros italianos para el Estudio de las
Adicciones ( Ser.T. ) . En particular , la toma de muestras de DBS puede ser considerado como un
buen candidato para ser aplicado , en el futuro cercano , para la prueba de sujetos sospechosos de
conducir bajo la influencia de drogas y el alcohol , es de esperar convertirse en una herramienta
til y fiable para contener el nmero y gravedad de los los accidentes de trfico .