Universidad de Antioquia

Escuela de Microbiologa
Microbiologa I
Laboratorio
Transferencia Gnica: Transformacin
Astrid V. Cienfuegos, BS
IT!"#U$$I%
Muchos factores han contribuido a la emergencia y diseminacin de agentes infecciosos
ms virulentos, incluyendo el cambio climtico, la contaminacin ambiental, el movimiento
masivo de personas desplazadas y la pobreza. Al mismo tiempo, los microorganismos se
han adaptado y sobrevivido en nuevos hospederos y ambientes. La adaptabilidad de los
microbios se demuestra en el aumento alarmante de cepas resistentes a antibiticos, una
tendencia que ha sido potenciada por el mal uso de estos en dcadas recientes, y la
creencia comn que las infecciones bacterianas son tratables y por tanto de menores
consecuencias. !e hecho, comnmente se encuentran bacterias que son resistentes a ms
de un antibitico, las llamadas cepas M!" #multidrug resistant$.
%na bacteria puede adquirir resistencia a antibiticos por mutaciones espontneas, al azar
en su genoma, o tomando genes que codifican factores de resistencia a antibiticos.
Adicionalmente, las bacterias pueden tomar !&A codificante para factores de resistencia y
transferirlos a otras bacterias de tres formas' con(ugacin, transduccin, y transformacin.
$on&ugacin
La con(ugacin es la transferencia unidireccional de !&A de una clula donante #que lleva
un plsmido con(ugativo$ a una clula recipiente. )ste proceso ocurre durante el contacto
clula*clula y es similar a la recombinacin se+ual observada en otros organismos. La
transferencia comienza en un punto definido de la molcula de !&A y procede de manera
linear. )l !&A transferido puede ser todo o una parte de un plsmido y generalmente
tambin incluye una porcin del !&A del hospedero. ,or analog-a a otros procesos de
transferencia bacteriana, la bacteria recombinante puede ser llamada transcon(ugante. La
cantidad de !&A transferido por con(ugacin var-a de unos pocos .ilobases #.b$ hasta un
cromosoma bacteriano completo.
Transduccin
La transduccin es la transferencia de genes de una bacteria a otra mediada por un virus
capaz de infectar bacterias #bacterifago o fago$. Las infecciones por fagos, inician con la
unin de las part-culas virales a receptores espec-ficos presentes en la superficie celular de
la bacteria. Luego, el acido nuclico que se encuentra dentro de cpside viral, se transfiere
al citoplasma de la bacteria, donde se vuelve metablicamente activo, iniciando la
replicacin y transcripcin, o se integra en el genoma bacteriano. Los virus pueden empacar
genes bacterianos, (unto con los genes virales, y transferirlos a otras clulas. La cantidad de
!&A transferido de esta manera var-a considerablemente siendo de apro+imadamente
/00.b de longitud.
Transformacin
La transformacin fue el primer sistema bacteriano de transferencia gnica en ser
descubierto. )n 12/0 el bioqu-mico ingls 3rederic. 4riffith descubri por azar la
transformacin en Streptococcus pneumoniae, mientras traba(aba en el desarrollo de una
vacuna para la neumon-a. 4riffith encontr, que una cepa no virulenta de S. pneumoniae se
convert-a en virulenta tomando material de streptococos virulentos muertos.
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Streptococcus pneumoniae puede presentarse como dos variantes' 5 #smooth, lisa$ es de
alta virulencia puesto que tiene una cpsula que resiste la fagocitosis, o " #rough, rugosa$
no causa enfermedad puesto que no tiene cpsula y por tanto es fagocitada rpidamente
por las clulas fagoc-ticas. 6uando 4riffith inocul los ratones con la cepa 5, stos mor-an7
mientras que aquellos inoculados con la cepa ", permanec-an vivos #8er figura 1a$. Luego
inocul los ratones con bacterias de la cepa 5 muertas por calor, y como se esperaba, las
clulas muertas no ten-an capacidad de establecer infeccin y los ratones permanecieron
vivos y saludables #b$. ,osteriormente, 4riffith mezcl bacterias lisas muertas, con las
clulas " no patognicas vivas, e inesperadamente, los ratones murieron por la infeccin7
adems se recuperaron cepas 5 viables, demostrando as- que las cepas no virulentas "
hab-an sido transformadas al tomar el material gentico liberado por las clulas 5 muertas.
8einte a9os despus #12::$ Avery, Mc6arty y McLeod, e+tendieron estos resultados y
demostraron que este material gentico, o factor transformante es el !&A.
Figura 1. El principio transformante (tomado de Laboratory excercises in organismal and
molecular microbiology)
La transformacin slo ocurre naturalmente en ciertas especies bacterianas #al parecer es
una propiedad determinada genticamente$, pero ba(o condiciones de laboratorio, es
posible realizar transformacin en cualquier tipo de clula procaritica o eucaritica. )l
proceso ocurre cuando alguna bacteria, viva o muerta, libera !&A en el medio que la rodea.
)ste !&A es vulnerable a la degradacin, pero tambin puede encontrar otra clula
bacteriana, antes que ocurra cualquier cambio significativo en la molcula. La segunda
bacteria toma el !&A, lo transporta a travs de la pared y la membrana celular y permite
que se recombine con la porcin homloga del cromosoma residente bacteriano. . !urante
la transformacin las bacterias competentes unen primero !&A reversiblemente y en poco
tiempo esa unin pasa a ser irreversible. La clula recombinante es llamada transformante.
)n teor-a cualquier fragmento de informacin gentica puede ser transferido de esta forma,
aunque la cantidad de !&A transferida por clula es peque9a, del orden de 10.b de
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longitud. )n las bacterias que se pueden transformar naturalmente, la competencia esta
regulada y e+isten prote-nas especiales, como lo son prote-nas de membrana, de unin a
!&A, autolisinas de la pared celular y nucleasas, que (uegan un papel importante en el
transporte y procesamiento de !&A.
Figura 2. rocesos transferencia gen!tica (tomado de Broc" Biolog#a de los
microorganismos $%ed.)
Transformacin en el laboratorio
La transformacin bacteriana se realiza artificialmente en laboratorios de investigacin, y
biotecnolog-a para obtener un alto nmero de copias de un gen o un fragmento de !&A o
bien, para e+presar determinados genes y estudiar sus productos.
Esc&eric&ia coli no se transforma naturalmente, pero puede hacerse competente
suspendiendo las clulas en una solucin de cloruro de calcio. La membrana es permeable
a los iones cloro, pero no permeable a los iones de calcio. 6uando el cloro entra a la clula,
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el agua tambin lo hace, causando que sta se hinche ligeramente y se vuelva porosa.
6uando las clulas se someten a un choque de calor #:/;6, / minutos$ las molculas libres
de !&A, como los plsmidos, entran a la clula por los poros transientes.
)l plsmido que ingresa a la clula es preparado previamente para llevar el fragmento de
!&A que se requiere estudiar #genes de insulina, to+inas u otros$. Adicionalmente el
plsmido contiene un marcador de resistencia, que al e+presarse le da capacidad a la
bacteria de degradar o neutralizar algn antibitico #ampicilina, tetraciclina u otro$,
permitindole sobrevivir en el medio suplementado con ste7 de esta manera se seleccionan
las clulas que han recibido el plsmido. 5in embargo, las bacterias transformadas, es
decir, aquellas que han recibido el plsmido, pueden no contener el gen de inters debido a
la religacin del plsmido. ,ara determinar qu bacterias contienen realmente el plsmido
ligado al gen de inters, es necesario hacer un segundo tamiza(e en el medio, que puede
realizarse con <,=4*>gal.
3inalmente, se estimula el crecimiento en grandes cantidades de las bacterias que
contienen el inserto, estas pueden lisarse luego para aislar el plsmido con el fragmento de
!&A de inters o para obtener una gran cantidad de prote-nas. )sta es una forma fcil de
produccin de prote-nas, como por e(emplo la insulina o antibiticos.
)n este laboratorio se analizarn los resultados de un e+perimento de transformacin de la
cepa E. coli !?@A #eficiente para ser transformada #fcil introduccin del plsmido$, se
multiplica con facilidad y es resistente a condiciones de almacenamiento$ con el plsmido
p4em= )asy.
Figura 3. 'apa circular del (ector p)em*Easy y puntos de referencia (tomado del p)E'+,
*Easy Vector System *ec&nical 'anual *'-./)
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'!($TI$A
")*ETI+" GEE!AL
6omprender el proceso de transformacin
")*ETI+", E,'E$-.I$",
1. "evisar los protocolos de preparacin de clulas competentes y de transformacin.
/. 6omprender la importancia del uso de controles en un e+perimento de transformacin
MET"#"L"G-A
A cada grupo se le entregarn cuatro cultivos. 6ada ca(a corresponde a uno de los
siguientes controles' control de esterilidad #6)$, control de viabilidad #68$, control de
antibitico #6AB$ y transformacin #=$. 6on base en los resultados observados
desarrollarn la gu-a que se encuentra al final.
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'!"T"$"L",
,reparacin de clulas competentes con 6a6l/ #6urrent protocols in Molecular Biology$
?ay varios mtodos para preparar clulas competentes pero el ms utilizado se realiza con
cloruro de calcio ya que es eficiente, econmico y generalmente se obtienen clulas con
altos niveles de transformacin.
1. =omar una sola colonia bacteriana de E. coli !?@A #/*C mm de dimetro$ de un plato
incubado por 1D a /: horas a CE;6. =ransfiera la colonia a 100 ml de medio LB en un
erlenmeyer de 1L. <ncube el cultivo a CE;6 con agitacin vigorosa, monitoreando el
crecimiento del cultivo, hasta obtener una densidad !F@20nm de 0.CE@.
/. =ransfiera el cultivo a dos tubos 3alcon de @0 ml estriles fr-os. )nfr-e el cultivo a 0;6
almacenando los tubos en hielo por 10 minutos.
C. "ecupere las clulas por centrifugacin a /E00g #:100 rpm$ por 10 minutos a :;6.
:. !ecante el sobrenadante. 6oloque los tubos en posicin invertida sobre una toalla de
papel por un minuto para permitir que sean eliminadas las ltimas trazas de medio.
@. "esuspenda el sedimento de clulas haciendo vrte+ suave en 10 ml de 6a6l/ 0.1M
fr-o.
D. "epetir pasos C y :
E. "esuspenda el sedimento de clulas haciendo vrte+ suave en / ml de 6a6l/ 0.1M
fr-o.
G. "ealice al-cuotas de las clulas y congele a *E0;6 o util-celas para transformacin #ver
,rotocolo de =ransformacin$.
=ransformacin #adaptado del p4)MH*=)asy 8ector 5ystem =echnical Manual =M0:/$
1. ,repare / ca(as de petri con LBIAM,I<,=4I>gal por cada reaccin de transformacin
#mezcla de plsmido e inserto$.
/. 6entrifugue las reacciones de ligacin para colectar el contenido en el fondo del tubo.
Adicione /Jl de la reaccin de ligacin en / tubos ependorf 1.@ml.
C. "emueva las clulas competentes de la nevera y de(e descongelar en hielo #por @
minutos$. Mezcle las clulas suavemente inclinando el tubo.
:. =ransfiera cuidadosamente 100 Jl de clulas competentes a cada tubo preparado en el
paso /.
@. <ncline el tubo suavemente, y colquelo en hielo por /0 minutos.
D. "ealice choque de calor por :@*@0 seg en ba9o de agua a :/ ;6 #no sacudir$.
E. <nmediatamente coloque las clulas en hielo por / minutos.
G. Adicione 200 Jl de medio LB a temperatura ambiente al tubo que contiene las clulas y
luego transfiera el contenido a un tubo cnico de 1@ ml.
2. <ncube en ba9o mar-a 1.@ h a CE;6 con agitacin 1@0 rpm.
10. 5iembre 100 Jl de las clulas en las ca(as de LBIAM,I<,=4I>gal.
11. <ncube las ca(as 1D*/: h a CE;6.
Abreviaturas'
AM'' Ampicilina.
I'TG' <sopropil*1*tio*K*! galactsido #anlogo de la lactosa$.
/gal' @*Bromo*:*cloro*C*indolil*K*! galactsido #anlogo de la lactosa$.
L)' Luria Bertani #medio de cultivo l-quido nutritivo utilizado para el crecimiento de
microorganismos modificados genticamente el cual contiene =riptona, e+tracto de levadura
y &a6l$.
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!E,ULTA#",
&ombres' 3echa'
)+perimento &o.
!E'"!TE #E !E,ULTA#",
1. !e acuerdo a la e+plicacin recibida en el laboratorio, indique cmo se prepar cada
control.
6ontrol de )sterilidad'
6ontrol de 8iabilidad' L
6ontrol de Antibitico' L L
=ransformacin' L L
/. <ndique si hubo crecimiento #L$ o no crecimiento #*$ en cada ca(a.
*M)l medio est contaminadoN
*MLas clulas E. coli !?@A utilizadas
para la transformacin eran viablesN
*M)l antibitico funciona bienN
*MLa transformacin es e+itosaN
5iI& 6ontrol que demuestra esta
o observacin
6) 68 6AB =
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C. !iscuta los resultados con respecto a la presencia o ausencia de crecimiento
bacteriano en cada control. M5on los resultados esperadosN M6ules pueden ser
las posibles causasN
:. 5i las bacterias E. coli !?@A sin transformar crecen en agar LB L ampicilina, Mes
posible demostrar que hubo transformacinN )+plique.
@. 5i para la transformacin se hubiese utilizado un lisado de !&A que contiene clulas
viables, Mhabr-a sido posible determinar si ocurri transformacinN )+plique.
D. La eficiencia de transformacin es una medida del +ito de la transformacin. )sta
se e+presa como el nmero de colonias resistentes a antibitico por Jg de !&A
transformado. %na eficiencia de transformacin t-pica es de 1 + 10
D
%36IJg. %sando
el nmero de colonias obtenidas en la ca(a marcada O=P, determine la eficiencia de
transformacin. 5e debe tener en cuenta que se transform con 0.01ug !&A en 1 ml
de medio, y se sembr 100ul en el plato #para los grupos que no obtuvieron
crecimiento, o que en alguno de sus controles tuvieron resultados inadecuados,
hacer el clculo con /00 %36$.
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Investigue 0 res1onda brevemente las siguientes 1reguntas:
1. M6ul es el mecanismo de accin de la ampicilina sobre las bacterias sensiblesN
M6ul es el mecanismo de resistenciaN
/. M,or qu tener el gen de resistencia a antibitico en un plsmido es ms beneficioso
para la bacteria que tenerlo integrado en el cromosomaN
C. La transformacin ocurre en varios gneros bacterianos. Mencione dos e(emplos de
bacterias gram positivas y dos de bacterias gram negativas que sean competentes
naturalmente. M)n qu infecciones estn involucradasN
:. Esc&eric&ia coli debe hacerse competente con 6a6l/ para poder realizar el
procedimiento de transformacin. Adicionalmente, la cepa utilizada en la prctica, E.
coli !?@A, ha sido modificada genticamente para hacerla til en este
procedimiento. %na de las modificaciones incluye alteraciones del sistema de
metilacin*restriccin. <nvestigue en qu consiste esta alteracin, y cmo afectan la
transformacin.
@. <nvestigue una aplicacin del uso de plsmidos en el rea mdica, industrial o
agr-cola.
!eferencias
3rederic. M. Ausubel, "oger Brent, "obert ). Qingston, !avid !. Moore, R.4. 5eidman,
Rohn A. 5mith, Qevin 5truhl #eds.$ 6urrent ,rotocols in Molecular Biology. %nit 1.G'
<ntroduction of ,lasmid !&A into 6ells. Rohn Siley T 5ons, <nc., /00C
5teve Q. Ale+ander, !ennis 5trete, Mary Rane &iles. Laboratory e+cercises in organismal
and molecular microbiology. 5pieral Bound 6omb, /00:
QleynUBic.nell. Microbiology )+periments' A ?ealth 5cience ,erspective. 6hapter 1D'
=ransformation' A 3orm of 4enetic "ecombination. Mc4raVU?ill 6ompanies, /00C
Lecturas !ecomendadas
Lansing M. ,rescott, Rohn ,. ?arley, !onald A. Qlein. Microbiology, 3ifth )dition.
Mc4raVU?ill 6ompanies, /00/.
3rederic. M. Ausubel, "oger Brent, "obert ). Qingston, !avid !. Moore, R.4. 5eidman,
Rohn A. 5mith, Qevin 5truhl #eds.$ 6urrent ,rotocols in Molecular Biology. Rohn Siley T
5ons, <nc., /00C