INMUNOFLUORESCENCIA

INMUNOFLUORESCENCIA
Que es la fluorescencia?
Que es la fluorescencia?

..
..
Es la propiedad de una sustancia de emitir
Es la propiedad de una sustancia de emitir
luz cuando es expuesta a radiaciones de baja
luz cuando es expuesta a radiaciones de baja
longitud de onda y alta energ
longitud de onda y alta energ

a (UV
a (UV

Rx
Rx
). Las
). Las
radiaciones absorbidas (invisibles al ojo), son
radiaciones absorbidas (invisibles al ojo), son
transformadas en luz visible, o sea de una
transformadas en luz visible, o sea de una
longitud de onda mayor a la incidente.
longitud de onda mayor a la incidente.
Como se produce la fluorescencia?
Como se produce la fluorescencia?
La absorci La absorci n de luz por parte de la mol n de luz por parte de la mol cula de cula de
fluorocromo fluorocromo la eleva a un estado de la eleva a un estado de exitaci exitaci n n en el cual en el cual
contiene mayor energ contiene mayor energ a. a.
La mol La mol cula permanece en el estado de cula permanece en el estado de exitaci exitaci n n por un por un
per per odo de tiempo muy corto. odo de tiempo muy corto.
El retorno a un nivel de energ El retorno a un nivel de energ a menor es acompa a menor es acompa ado por ado por
emisi emisi n de luz (fluorescencia) n de luz (fluorescencia)
Inmunofluorescencia Directa
Inmunofluorescencia Directa
El procedimiento se realiza en El procedimiento se realiza en un paso b un paso b sico sico de reacci de reacci n. n.
La muestra cl La muestra cl nica que presuntamente contiene nica que presuntamente contiene
ant ant genos del microorganismo bajo estudio es puesta en genos del microorganismo bajo estudio es puesta en
contacto con un anticuerpo monoclonal dirigido contra contacto con un anticuerpo monoclonal dirigido contra
dicho microorganismo conjugado con fluoresce dicho microorganismo conjugado con fluoresce na. Si el na. Si el
ant ant geno esperado est geno esperado est presente se formar presente se formar un un
complejo ant complejo ant geno geno- -anticuerpo. La reacci anticuerpo. La reacci n positiva en n positiva en
forma de fluorescencia verde manzana puede verse con forma de fluorescencia verde manzana puede verse con
la ayuda de un microscopio de fluorescencia. la ayuda de un microscopio de fluorescencia.
Esquema de la t
Esquema de la t

cnica
cnica
Inmunofluorescencia Indirecta
Inmunofluorescencia Indirecta
Es una t Es una t cnica de doble capa en donde se aplica el cnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo anticuerpo sin sin
marcar marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza
por tratamiento con un suero por tratamiento con un suero anti anti- -inmunoglobulina conjugado con inmunoglobulina conjugado con
fluorocromo fluorocromo
El El proceso consta de proceso consta de dos etapas dos etapas: :
Primera etapa Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los ant : se fijan sobre un portaobjetos los ant genos que genos que
constituyen el substrato conocido espec constituyen el substrato conocido espec fico (c fico (c lulas que lulas que
contiene virus, contiene virus, T. T. gondii gondii, , T. T. pallidum pallidum, etc.) sobre , etc.) sobre l se coloca l se coloca
el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos
espec espec ficos, si la reacci ficos, si la reacci n es positiva se dar n es positiva se dar formaci formaci n de n de
complejo ant complejo ant geno geno- -anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no
estaba marcado estaba marcado
Segunda etapa Segunda etapa: se agrega una : se agrega una anti anti- -inmunoglobulina humana inmunoglobulina humana
marcada, que reaccionar marcada, que reaccionar con el anticuerpo del complejo con el anticuerpo del complejo
producido en la primera etapa. producido en la primera etapa.
Inmunofluorescencia Indirecta
Inmunofluorescencia Indirecta
La t
La t

cnica se realiza en dos etapas

cnica se realiza en dos etapas
PRIMERA ETAPA PRIMERA ETAPA
SEGUNDA ETAPA SEGUNDA ETAPA
Microscopio de
Microscopio de
inmunofluorescencia
inmunofluorescencia
Fuente de luz (l Fuente de luz (l mpara de mercurio) mpara de mercurio)
Filtros Filtros
Espejo dicroico Espejo dicroico
Excitaci
Excitaci

n
n
-
-
Emisi
Emisi

n
n
Tipos de filtros
Tipos de filtros
Fluorocromos
Fluorocromos
Sustancias que emiten un fot Sustancias que emiten un fot n cuando n cuando
son excitados por un fot son excitados por un fot n incidente. n incidente.
Formen uniones con las prote Formen uniones con las prote nas ( nas (Ac Ac) )
pero sin afectar los grupos de pero sin afectar los grupos de
combinaci combinaci n espec n espec fica del anticuerpo. fica del anticuerpo.
La reacci La reacci n de uni n de uni n ocurre entre los n ocurre entre los
grupos amino y carboxilo de la grupos amino y carboxilo de la
prote prote na y los grupos tiocianato o na y los grupos tiocianato o
cloruro de cloruro de sulfonilo sulfonilo de los colorantes de los colorantes
El pH afecta la fluorescencia El pH afecta la fluorescencia y y por por
esta raz esta raz n se debe trabajar a pH n se debe trabajar a pH
estable y adecuado dependiendo del estable y adecuado dependiendo del
colorante : fluoresce colorante : fluoresce na (pH 8), na (pH 8),
rodamina (pH 7), rodamina (pH 7),
DANS (pH 1.6 DANS (pH 1.6- -14) 14)
PARMETROS DE FLUORESCENCIA
Afinidad
Afinidad
Selectividad
Selectividad
Especificidad
Especificidad
Intensidad (brillo)
Intensidad (brillo)
Estabilidad
Estabilidad
Competitividad
Competitividad
Ventajas y desventajas
Ventajas y desventajas
VENTAJAS VENTAJAS
- - Se pueden obtener resultados r Se pueden obtener resultados r pidos. pidos.
- -No es necesario realizar cultivos. No es necesario realizar cultivos.
- -Se puede identificar microorganismos espec Se puede identificar microorganismos espec ficos en un grupo mixto. ficos en un grupo mixto.
- -Determina la identidad de un organismo muerto. Determina la identidad de un organismo muerto. E Es sensible s sensible. .
Nota: La figura muestra un ejemplo de fagocitosis Nota: La figura muestra un ejemplo de fagocitosis. .
DESVENTAJAS DESVENTAJAS
- -Costos en reactivo y equipo Costos en reactivo y equipo
- -Debe ser realizado por personal muy especializado. Debe ser realizado por personal muy especializado.
- -Los resultados no son 100% espec Los resultados no son 100% espec ficos ficos
Photobleaching
Photobleaching

Es la disminuci
Es la disminuci

n de la intensidad de emisi
n de la intensidad de emisi

n de
n de
la muestra debido a la descomposici
la muestra debido a la descomposici

n
n
irreversible de la fluorescencia de las
irreversible de la fluorescencia de las
mol
mol

culas.
culas.

Este fen
Este fen

meno esta directamente relacionado

meno esta directamente relacionado
con la intensidad de excitaci
con la intensidad de excitaci

n y y con el tiempo
n y y con el tiempo
durante el cual estamos excitando la muestra.
durante el cual estamos excitando la muestra.

Para reducir este efecto podemos utilizar

Para reducir este efecto podemos utilizar

anti
anti
fading
fading

(glicerina) en la preparaci
(glicerina) en la preparaci

n de la
n de la
muestra
muestra
.
.
Detecci
Detecci

n
n
de Anticuerpos
de Anticuerpos
Anti
Anti
-
-
C
C

ndidas por Inmunofluorescencia

ndidas por Inmunofluorescencia
1 1 - -Colocar Colocar 10 10 l l de de una una suspensi suspensi n n de de 106 106 c c ndidas ndidas en en cada cada wells wells
de de un portaobjeto de 7 un portaobjeto de 7 wells wells. Dejar secar. . Dejar secar.
2 2- - Agregar 20 Agregar 20 l l de suero de suero dilu dilu do do 1/16 1/16- - 1/32 1/32- - 1/ 64 1/ 64- - 1/128 1/128- - 1/256 1/256- -
1/512 1/512- - negativo en cada negativo en cada wells wells. Incubar 30 minutos a temperatura . Incubar 30 minutos a temperatura
ambiente en c ambiente en c mara h mara h meda. meda.

3 3- - Lavar 5 minutos con PBS. (Repetir 2 veces). Secar los bordes. Lavar 5 minutos con PBS. (Repetir 2 veces). Secar los bordes.
4 4- - Agregar 20ul Agregar 20ul de de suero suero anti anti Fc Fc- - FITC FITC (diluci (diluci n 1/100). n 1/100). Incubar 30 Incubar 30
minutos minutos a temperatura ambiente en oscuridad en c a temperatura ambiente en oscuridad en c mara h mara h meda. meda.
5 5- - Lavar 5 minutos con PBS. (Repetir 2 veces). Secar los bordes. Lavar 5 minutos con PBS. (Repetir 2 veces). Secar los bordes.
6 6- - Montar con 1 gota de glicerina Montar con 1 gota de glicerina bufferada bufferada. .
7 7- - Observar Observar en en microscopio microscopio de de Inmunofluorescencia. Inmunofluorescencia. La La imagen imagen es es
positiva positiva si permite ver fluorescente el contorno de la levadura. si permite ver fluorescente el contorno de la levadura.
Para recordar
Para recordar

..
..
APLICACIONES
APLICACIONES
Tcnicas analticas (cuali-y cuantitativas) en Qumica
y Bioqumica.
Mtodos inmunolgicos de diagnstico mdico.
Procedimientos microscpicos en Microbiologa,
Gentica, Histologa, Histoqumica, Biologa Celular,
Biologa Molecular, Biologa del Desarrollo, Patologa
(sondas vitales, ensayos de viabilidad, indicadores,
inmunofluorescencia, FISH).
Anlisis poblacional de clulas (citofluorimetra de
flujo).
APLICACIONES
APLICACIONES
Treponema Treponema Pallidum Pallidum agente etiol agente etiol gico de la S gico de la S filis. Determinaci filis. Determinaci n n
por inmunofluorescencia donde se observa la forma de espiroqueta por inmunofluorescencia donde se observa la forma de espiroqueta
Dengue
Dengue
Las c Las c lulas lulas
fluorescentes fluorescentes
representan c representan c lulas lulas
infectadas con el virus infectadas con el virus
dengue. dengue. Infecci Infecci n n
evidenciada con evidenciada con
anticuerpos anticuerpos
monoclonales para monoclonales para
cada cada serotipo serotipo. .
Biopsias renales :
Biopsias renales :
Anticuerpos contra Membrana basal glomerular de tipo Anticuerpos contra Membrana basal glomerular de tipo IgG IgG
Virus Respiratorios
Virus Respiratorios
Virus Influenza B (IFD
Virus Influenza B (IFD detecci detecci n de ant n de ant geno geno
)
)
Serotipificaci
Serotipificaci

n
n
Anticuerpos anti Toxoplasma gondii, agente etiolgico de la
toxoplasmosis. El sustrato antignico utilizado es una suspensin
de Toxoplasma gondii. Detecta antgenos de membrana .
ANCA C ANCA P
ANCA C ANCA P
Fluorescencia utilizando mas de un
Fluorescencia utilizando mas de un
fluorocromo
fluorocromo