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Introduccin y Optimizacin
10 Abril 2013 10 Abril 2013
Ariana Veiga
Western Blot
En qu
consiste el
Western
Blot?
Tambin llamado Inmunoblot
Tcnica utilizada para identificar una protena en una muestra que contiene
varias protenas
Cmo
funciona?
Las protenas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en funcin de su
peso molecular
A continuacin se utiliza un anticuerpo especfico para detectar la protena de inters
El resultado aporta informacin sobre el peso molecular de la protena y su cantidad
relativa en la muestra
2
relativa en la muestra
Calle 1: Anticuerpo anti- Actina (ab8226) diluido 1/1000
Calle 2: ab8226 diluido 1/10000
Calles 3-4: ab8226 diluido 1/500
Calle 1: Lisado celular HeLa (humano)
Calle 2: Lisado celular HeLa (humano)
Calle 3: Lisado celular HEK293 (humano)
Calle 4: Lisado celular 3T3 (ratn)
En qu casos es til utilizar
Western Blot?
Est la protena de inters presente en mi muestra?
El tratamiento con un determinado agente X,
aumenta o reduce el nivel de expresin de mi
protena?
3
protena?
Cmo vara el nivel de expresin de la protena en
distintos tejidos o lneas celulares?
Mi muestra es sana o patolgica? El WB permite
detectar enfermedades tales como la enfermedad de
Lyme, la de las vacas locas, el VIH, etc.
Organizacin del Webinar
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
4
Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
5
Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
Preparacin de las muestras para la
electroforesis
Lisis: Las clulas o los tejidos se tratan con un tampn de lisis y seguidamente se
degradan mecnicamente para liberar las protenas
Clulas: mantenerlas en hielo, lavar con PBS fro y aadir el tampn de lisis (~1ml por
cada milln de clulas). Despus agitar durante 30 minutos a 4 C
Tejido: diseccionar rpidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente
6
Tejido: diseccionar rpidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente
en nitrgeno lquido y homogeneizar en tampn de lisis (300 l por cada 5 g de tejido).
Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300 l de tampn, y agitar despus
durante 2 horas a 4 C
Centrifugar a 4 C durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo
en hielo
Lisis
Mantener las muestras en hielo o a 4C para evitar degradacin de las protenas
Los tampones deben prepararse en el momento y mantenerse en fro. Antes de realizar la
lisis, aadir al tampn un cocktail de inhibidores de proteasas
Si la protena de inters est fosforilada, es importante asegurarse de incluir inhibidores de
fosfatasas al tampn de lisis
Elegir un tampn de lisis adecuado en funcin de la localizacin celular de la protena
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Elegir un tampn de lisis adecuado en funcin de la localizacin celular de la protena
de inters
Localizacin de la protena Tampn de lisis recomendado
Clula entera NP-40 o RIPA
Citoplasmtica (soluble) Tris-HCl
Citoplasmtica (citoesqueleto) Tris-Triton
Membranal NP-40 o RIPA
Nuclear RIPA
Mitocondrial RIPA
Preparacin de las muestras para la
electroforesis
Lisis: Las clulas o los tejidos se tratan con un tampn de lisis y seguidamente se
degradan mecnicamente para liberar las protenas
Clulas: mantenerlas en hielo, lavar con PBS fro y aadir el tampn de lisis
(~1ml por cada milln de clulas). Despus agitar durante 30 minutos a 4 C
Tejido: diseccionar rpidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar
inmediatamente en nitrgeno lquido y homogeneizar en tampn de lisis (300 l
por cada 5 g de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300
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Determinar la concentracin de protenas
l de tampn, y agitar despus durante 2 horas a 4 C
Centrifugar a 4 C durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo
en hielo
Condiciones reductoras y desnaturalizantes: las muestras son normalmente
tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las protenas
(dmeros, estructuras terciarias)
Aadir el tampn de carga a la muestra y calentar 5 minutos a 95-100C o
durante 5-10 minutos a 70C
Condiciones reductoras y
desnaturalizantes
Un tampn de carga estndar contiene SDS (dodecilsulfato sdico) y -
mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol)
El SDS desnaturaliza la protena en su estructura primaria y la recubre de
cargas negativas
El -mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen los
puentes disulfuro
Todo ello permite que las protenas se separen en funcin del peso molecular
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Todo ello permite que las protenas se separen en funcin del peso molecular
mediante SDS-PAGE
La reduccin y desnaturalizacin permiten adems la accesibilidad del
anticuerpo a su sitio de unin
SDS y DTT/
-mercaptoetanol
Nota: Algunos anticuerpos solo reconocen las protenas nativas (no reducidas y/o no desnaturalizadas). En este caso SDS y/o -mercaptoetanol o
DTT no deben aadirse a los tampones.
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
SDS-PAGE
Definicin
Mtodo que permite separar las protenas bajo un campo elctrico
de acuerdo a su movilidad electrofortica
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SDS : Dodecilsulfato Sdico; PAGE : Electroforesis en gel de poliacrilamida
Cmo
funciona?
El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el
tampn de migracin. Un tampn de migracin suele contener 25mM Tris;
190mM glicina; 0,1% SDS; pH 8,3
Los lisados proteicos se cargan en las calles del gel, normalmente entre
20 y 40 g por calle
Se aplica un campo elctrico que provoca el movimiento de las protenas
hacia el polo positivo
Al haberse tratado las protenas con SDS (cargas negativas), las cargas
SDS-PAGE
funciona?
Al haberse tratado las protenas con SDS (cargas negativas), las cargas
endgenas de las mismas son despreciables
El resultado es que las protenas se separan en funcin de su talla, o
peso molecular
Las protenas de menor tamao quedan menos retenidas en la matriz del
gel y por tanto migran mas rpidamente
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-
+
Corriente elctrica
Frente de migracin
Geles
Constituidos de poliacrilamida, N, N-metilenbisacrilamida (Bis), persulfato de
amonio (APS) y TEMED
La estructura del gel puede modificarse alterando la proporcin de acrilamida
Para protenas pequeas, se usa un gel con un porcentaje elevado de
acrilamida, y viceversa para protenas de gran tamao
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Tamao de la protena (kDa) Porcentaje del gel
4-40 20
12-45 15
10-70 12,5
15-100 10
25-200 8
Los geles en gradiente se recomiendan en aquellos casos en los que el tamao
de la protena es desconocida
Electroforesis en condiciones no
reductoras y/o no desnaturalizantes
Forma requerida de
la protena
Condiciones
electroforesis Tampn de carga
Tampn de
migracin
Reducida-
Desnaturalizada
Reductor y
desnaturalizante
Con -mercaptoetanol
o DTT
Con SDS
Con SDS
Reducida - Nativa Reductor no Con -mercaptoetanol o Sin SDS
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Reducida - Nativa Reductor no
desnaturalizante
Con -mercaptoetanol o
DTT
Sin SDS
Sin SDS
Oxidada
Desnaturalizada
No reductor y
desnaturalizante
Sin -mercaptoetanol ni
DTT
Con SDS
Con SDS
Oxidada - Nativa No reductor y
nativo
Sin -mercaptoetanol ni
DTT
SinSDS
Sin SDS
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
Objetivo de la transferencia
Una vez realizada la electroforesis, es necesario marcar la protena de inters
para poder visualizarla
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El gel no es una superficie adecuada para poder marcar las protenas
Los anticuerpos no son retenidos en el gel
Los geles son frgiles y difciles de manipular
Por tanto, es necesario transferir las protenas a un soporte ms adecuado
Cmo funciona la transferencia?
El principio es similar al de PAGE, es decir, las protenas cargadas
negativamente migran hacia el polo positivo bajo el efecto de un campo elctrico
Se intercala una membrana entre el gel y el electrodo positivo
Las protenas se adhieren a la membrana siguiendo la misma disposicin que
en el gel
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Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF).
Estas ltimas requieren un pretratamiento con metanol
Montaje de la transferencia
Transferencia en medio
hmedo o semi seco?
Inconvenientes Ventajas
Medio
Hmedo
El gel y la membrana se intercalan y fijan
firmemente entre finas esponjas y papel
absorbente
Este montaje sndwich se sumerge en un
compartimento que contiene el tampn de
transferencia donde se aplica a continuacin
la corriente elctrica
El proceso de
transferencia es
ms largo
Adecuado
para protenas
grandes o
difciles de
transferir
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la corriente elctrica
Un tampn de transferencia se compone
normalmente de 25mM Tris, 190mM Glicina
y 20% de Metanol
Semi
Seca
El montaje papel-gel-membrana-papel se
humedece con tampn de transferencia
El montaje se coloca directamente entre el
ctodo y el nodo donde se aplica la corriente
El tampn de transferencia estndar suele
contener 48mM Tris, 39mM Glicina, 0,04%
SDS, y 20% Metanol
Ms rpido La membrana
puede secarse
afectando a la
transferencia de
las protenas
Transferencia de protenas >100 kDa
Transferencia en medio hmedo durante la noche a 4 C y bajo voltaje
Aadir 0.1% SDS al tampn de transferencia para reducir la formacin de
19
Aadir 0.1% SDS al tampn de transferencia para reducir la formacin de
aglomerados en el gel
Reducir la cantidad de metanol en el tampn de transferencia a 10% o incluso
menos para evitar la dispersin de protenas en el gel
Si la membrana es de PVDF, el metanol puede retirarse completamente del
tampn (sigue siendo necesario sin embargo su pre-tratamiento con metanol)
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
Por qu se utilizan anticuerpos?
Colorantes como Coomassie pueden
usarse para teir las protenas
despus de realizar el SDS-PAGE
SDS3
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Pero, cul de las bandas
corresponde a la protena de inters?
El uso de anticuerpos especficos
soluciona el problema detectando
nicamente la protena de inters
Lisado celular de SDS3 transfectado
(ab94303) en SDS-PAGE (izquierda)
y en Western Blot con el anticuerpo
ab89345 anti-SDS3 (derecha).
Inmunodeteccin
Bloqueo de la
membrana
Leche, BSA, etc
Incubacin con el
anticuerpo primario Anticuerpo
Eptopo
Protena Protena
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Lavado (TBST)
Lavado (TBST)
Incubacin con
anticuerpo secundario
conjugado
Anticuerpo
Protena
Protena
Deteccin
Protena
Deteccin
Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo
Sustrato (perxido de hidrgeno + luminol)
Producto (sensible a la luz)
Los sustratos cromognicos (4-cloronaftol o DAB) tambin pueden utilizarse con las
enzimas HRP o AP, dando lugar a un producto coloreado que se deposita en la
membrana prximo a la zona del anticuerpo
Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo
secundario conjugado a la enzima HRP, produciendo una seal que se captura en
una pelcula fotogrfica
Los anticuerpos secundarios conjugados a fluorforos tambin pueden usarse
siempre y cuando se disponga de un equipo de deteccin especial
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ECL : Enhanced chemiluminescence
HRP : HorseRadish Peroxidase
DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride
AP : Alkaline Phosphatase
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
Controles de carga
Los controles de carga son anticuerpos usados para asegurar que la carga de protenas en cada calle del gel de
SDS PAGE es constante
Un anticuerpo control de carga detecta una protena altamente conservada y presente en cantidades similares
independientemente del tipo de muestra
Control de carga
Tipo de
muestra
Peso molecular
(KDa) Precauciones
Actina Clula entera /
Citoplasma
42 No es vlido para muestras del musculo esqueltico. Cambios en
las condiciones de crecimiento celular e interacciones con los
componentes de la matriz extracelular pueden alterar la sntesis de
25
componentes de la matriz extracelular pueden alterar la sntesis de
la protena actina (Farmer et al, 1983)
GAPDH Clula entera /
Citoplasma
30-40 Algunos factores fisiolgicos, como hipoxia o diabetes, aumentan
el nivel de expresin de GAPDH en determinados tipos celulares
Tubulina Clula entera /
Citoplasma
55 La expresin de tubulina puede variar con la resistencia a
sustancias antimicrobianas y antimitticas (Sangrajrang S. et al,
1998, Prasad V et al, 2000)
VDCA1/Porinas Mitocondria 31
COXIV Mitocondria 16 Muchas protenas migran al mismo peso molecular (16KDa) que
COXIV
Lamin B1 Ncleo 66 No es vlido para muestras en las que se ha eliminado la
membrana nuclear
Protena de unin
a TATA (TBP)
Ncleo 38 No es vlido para muestras sin ADN
Controles de carga
Calle 1: Clulas HeLa (humano) a 20 g
Calle 2: Clulas 3T3 (ratn) a 20 g
Todas las calles - anticuerpo anti - Actina control de
carga (ab8227) diludo 1/1000
Nota: la afinidad del anticuerpo puede variar segn la especie o naturaleza de la protena (nativa o
recombinante), etc
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Calle 2: Clulas 3T3 (ratn) a 20 g
Calle 3: Hgado de pescado a 20 g
Calle 4: Hgado de conejo a 20 g
Calle 5: Clulas MDCK (perro) a 20 g
Calle 6: Clulas EBTr (bovino) a 20 g
Calle 7: Clulas SL-29 (pollo) a 20 g
Calle 8: Clulas CHO (Hamster chino) a 20 g
Calle 9: Embrin de Xenopus a 20 g
Controles positivos y negativos
Realizar en paralelo el ensayo de muestras desconocidas con muestras
en las que se ha comprobado el nivel de expresin de la protena de
inters
Protena recombinante
Clulas transfectadas con la protena de inters
Tejidos o lneas celulares que expresen la protena Tejidos o lneas celulares que expresen la protena
Incluir tambin una muestra que no exprese la protena a detectar
Muestras knockout o siRNA
Tejidos o lneas celulares que no expresen la protena
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Pptidos de bloqueo
La pre-incubacin del anticuerpo primario con el pptido inmungeno permite bloquear de
manera especfica los sitios de unin del anticuerpo
Las bandas especficas no sern visibles en el blot ya que el anticuerpo pre-incubado no
puede unirse a la protena en la membrana
til para determinar si las bandas observadas corresponden a isoformas, fragmentos de la
protena o protenas no especficas
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protena o protenas no especficas
Calle 1: Preparado de Histona, clulas HeLa
Calle 2: Preparado de Histona de clulas HeLa tratadas con colcemida
Calle 3: Preparacin de histona de clulas HeLa 0,5g con pptido de bloqueo
Histona H3 fosfo S10, trimetil K9 (ab15644) a 1 g/ml
Calle 4: Preparacin de histona de clulas HeLa tratadas con colcemida 0,5g
con pptido de bloqueo Histona H3 fosfo S10, tri metil K9 (ab15644) a 1 g/ml
Todas las calles:
Anti-Histona H3 (fosfoS10) [mAbcam 14955] - ChIP Grade (ab14955) a 1 g/ml
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
Adecuado para Western Blot
Utilizar anticuerpos que hayan sido previamente testados en Western Blot
Las aplicaciones en las que un anticuerpo ha sido testado se indican en la
ficha tcnica del anticuerpo
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Inmungeno y especificidad
Inmungeno: protena especfica o secuencia de amino cidos que se inyecta en un animal
para provocarle una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos especficos contra ella
La seleccin del inmungeno permite producir un anticuerpo que reconozca y se fije sobre
una regin especfica de la protena (eptopo)
Asegurarse que la secuencia del inmungeno est presente en la protena de inters
cuando se est estudiando una isoforma concreta de la protena, la forma madura o un
31
NERTCRCDKP
NERTCRCDKP
cuando se est estudiando una isoforma concreta de la protena, la forma madura o un
precursor de la misma si no, el anticuerpo no reconocer la protena
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
Ausencia de bandas,
o bandas muy dbiles
Origen del problema Solucin
Incompatibilidad con el anticuerpo
secundario
Seleccionar un anticuerpo secundario que sea
compatible con la especie y el isotipo del anticuerpo
primario (ej. Anticuerpo secundario anti-IgM de ratn
con anticuerpo primario IgM hecho en ratn)
No hay suficiente protena o
anticuerpo para producir una seal
Aumentar la cantidad de lisado, de anticuerpo
primario o de anticuerpo secundario (incluso una
combinacin de los tres)
Tiempo de incubacin insuficiente
para producir una seal
Incubar la membrana con el anticuerpo primario
durante la noche a 4C
33
para producir una seal durante la noche a 4C
La membrana no se ha bloqueado
correctamente
Bloquear durante menos tiempo o usando un agente
de bloqueo diferente. La adicin de Tween 20 al
tampn de bloqueo reduce la fijacin del anticuerpo
al agente de bloqueo
La protena no se ha transferido
correctamente del gel a la
membrana
Comprobar que se ha producido la transferencia
usando un colorante como rojo de Ponceau. Es
posible que sea necesario aumentar o disminuir el
tiempo de transferencia
Las protenas hidrfobas son ms
difciles de transferir
Para este tipo de protenas usar membranas de
PVDF
La muestra no expresa la protena
de inters
Revisar literatura y bases de datos sobre la protena
de inters
El anticuerpo no reconoce la
protena de inters
Verificar que la secuencia del inmungeno est
presente en la protena a estudiar
Ruido de fondo
Origen del problema Solucin
Exceso de lisado celular, anticuerpo
primario o secundario que provocan
uniones no especficas
Reducir la carga de protena en el gel y/o diluir ms
los anticuerpos
Temperatura de incubacin del
anticuerpo primario muy elevada
Incubar durante la noche a 4C
La membrana no se ha bloqueado
correctamente
Aumentar el tiempo de lavado, y aadir un
detergente, como Tween 20, al tampn de lavado.
Probar otro agente de bloqueo
34
Probar otro agente de bloqueo
Uso de una membrana no
adecuada
Las membranas de nitrocelulosa suelen dar menos
ruido de fondo que las membranas de PVDF
Degradacin de la protena Optimizar la preparacin de la muestra. Mantener
las muestras en hielo y aadir una solucin recin
preparada de inhibidores de proteasas.
Almacenamiento de muestras a largo plazo puede
daar las protenas
Presencia de isoformas o
fragmentos de la protena de inters
Consultar la literatura y SwissProt
Presencia de polmeros Hervir las muestras durante 10 minutos antes de
realizar la electroforesis
Exceso de protena y/o anticuerpo
35
Dilucin de
la muestra y
anticuerpo
primario
Optimizacin del tampn de bloqueo
5% leche 5% BSA
36
A cada anticuerpo le corresponder una solucin de bloqueo ptima
Anti-GAPDH [mAbcam 9484] - Loading Control
(ab9484) a una dilucin 1/1000
5% leche 5% BSA
Burbujas de aire, lavados insuficientes,
transferencia incompleta
Durante la transferencia,
contacto insuficiente entre
el gel y la membrana
37
Burbujas de aire entre el
gel y la membrana durante
la transferencia
Lavados insuficientes
Protenas en estado nativo
Algunos anticuerpos presentan mayor afinidad por las estructuras nativas de las
protenas que por las formas desnaturalizadas y/o reducidas
La imagen muestra un Western Blot de colgeno III humano purificado, en la
forma reducida y desnaturalizada a la izquierda, y en su forma nativa a la derecha
La estructura tridimensional del sitio de unin del anticuerpo al antgeno se
pierde al desnaturalizar y reducir la protena pierde al desnaturalizar y reducir la protena
Forma reducida y
desnaturalizada
Forma
nativa
Calle 1: Protena en su forma reducida y
desnaturalizada
Calle 2: Protena nativa (son reducir ni desnaturalizar)
Colgeno humano purificado (ab7535) a 5 g por
calle con el anticuerpo anti-colgeno III(ab6310)
Imagen cortesa de un Abreview enviado por
Michaela Leyh
38
Conocer la protena de inters
Las protenas no siempre muestran una nica banda al peso
molecular esperado
Posibles motivos: fragmentacin de la protena, modificaciones post
-traduccionales, expresin de isoformas, propiedades isoelctricas
39
Se aconseja consultar siempre SwissProt y la literatura
-traduccionales, expresin de isoformas, propiedades isoelctricas
Una diferencia del 10-15% respecto al tamao esperado se
considera aceptable y dentro de la normalidad
Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
Protocolos y material de inters
Protocolos detallados de WB
www.abcam.com/protocols
SwissProt www.uniprot.org
41
Gua sobre controles de carga:
http://www.abcam.com/loadingcontrolguide
Vdeo detallado sobre WB:
http://www.abcam.com/westernblotguide
Gua de trucos para WB
Descarga tu gua de trucos para WB en nuestra pgina de protocolos
O pide tu copia por e-mail: mailrequest@abcam.com
Reactivos para Western Blot
Geles prefabricados y soluciones tampn optimizadas para WB
Otros reactivos (tincin de gel, Bradford, etc )
www.abcam.com/Optiblot
Optiblot
Marcadores de peso molecular pre coloreados y listos para usar
Marcadores
de peso
42
www.abcam.com/prismproteinladders
de peso
molecular
Prism
Anticuerpos
secondarios
AbExcel
Anticuerpos secundarios validados para WB
Conjugados a fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa (HRP)
www.abcam.com/abexcel
Kits ECL
Sustratos ECL de alta sensibilidad para WB
www.abcam.com/ecl
Optiblot reactivos para WB
Fciles de usar pocillos
coloreados para facilitar la
carga de la muestra
Pocillos de alta
capacidad y sin peine
que remover
Hasta 10 veces ms
fuertes que los geles
convencionales
Larga duracin 1-2
aos de caducidad
43
Todos los reactivos necesarios para tus experimentos:
Tampones optimizados
Optiblot Blue (ab119211) tincin tipo Coomassie del gel en tan slo 15 minuots
Reactivo Bradford y ensayo BCA compatible con detergentes en la muestra
Otros productos membranas PVDF de baja fluorescencia, etc
Fciles de abrir, sin
esptulas o cuchillos
Geles compatibles con la
mayora de tanques
Ms informacin: www.abcam.com/Optiblot
Histona H3
(fosfoT3) RabMAb
Anticuerpos monoclonales de conejo
( ), ptimos para WB
RabMAb: ventajas para WB
Alta afinidad mayor factor de dilucin (hasta
1:500.000 en algunos RabMAbs)
Alta especificidad seal especfica, sin o
con muy poco ruido de fondo
Reconocen eptopos diversos ideal para la
deteccin de modificaciones post-
Anticuerpo histona H3 (fosfoT3)
(ab78351), dilucin 1/500,000 en HeLa.
1) Sin tratar,
2) Tratadas con FBS + Caliculina A.
44
deteccin de modificaciones post-
traduccionales (ej. fosforilacin, metilacin,
acetilacin)
Cada RabMAb has sido testado en WB en
muestras humanas, de ratn y rata para
determinar la reactividad
Ms de 4000 RabMAbs disponibles
Ms informacin: www.abcam.com/rabmabs
AbExcel anticuerpos secundarios
5 razones para usar secundarios AbExcel
Altamente testados
AbExcel conjugados a AP se pueden usar en
diluciones de 1/5000 a 1/50000
45
Ms informacin:
AbExcel: http://www.abcam.com/AbExcel
diluciones de 1/5000 a 1/50000
Con 1 vial de AbExcel conjugado a AP, se
pueden conseguir hasta 1.500 blots (usando
dilucin 1/5000 en 3ml leche/BSA)
AbExcel conjugados a HRP se pueden usar en
diluciones de 1/2000 a 1/20000
Con 1 vial de AbExcel conjugado a HRP, se
pueden conseguir hasta 600 blots (usando
dilucin 1/2000 en 3ml leche/BSA)
Bolgrafo Luminol para membrana
(ab166858)
La forma ms fcil y segura de calcular el peso molecular de la protena de
inters. Una vez las protenas han sido transferidas a la membrana:
Marca los estndares de PM con el boli Lumimol en la membrana
Contina con la hibridacin de la membrana segn tu procedimiento
habitual (bloqueo, etc)
Revela la membrana por quimioluminiscencia o colorimetra
Visualiza y localiza las bandas del estndar con pelcula o procesador
CCD
46
Contctanos
soportecientifico@abcam.com
Espaa: Telfono: 91 114 65 54, email: orders@abcam.com
Argentina: Tecnolab; Telfono: +54-11-4555-0010, email: patologia@tecnolab.com.ar
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