Tcnica histolgica

Dr. Gabriel Magarios

Definicin
La tcnica histolgica es una serie secuencial de pasos a travs de los cuales una
muestra de tejido llega a transformarse en delgados cortes coloreados capaces de ser
observados al microscopio.
Sinopsis general
Paso Objetivos Medios usual es
Obtencin - Proveer el material para su
estudio al microscopio
- Bi opsi a
- Reseccin quirrgica
- Autopsia
Fijacin - Preservar el material
- Evitar la autlisis
- Eliminar los microorganismos
- Formol al 10 %
- Boui n
- Glutaraldehdo
Inclusin - Embeber el material en un medio
fcil de cortar en fetas muy
delgadas
- Parafi na
- Acrlicos
- Resinas Epoxi
Cort e - Lograr lminas muy delgadas que
sean atravesadas por la luz
- Micrtomo rotatorio
- M. de deslizamiento
- Ultramicrtomo
Coloracin - Visualizar los t ej i dos
- Identificar molculas en ellos
(Histoqumica)
- Hematoxilina - eosi na
- Tricrmicos
- Histoqumica
Montaje - Preservar el corte, mantenindolo
aislado del aire y deshidratado
- Blsamo del Canad
- Medios plsticos
Pasos de la tcnica histolgica
Obtencin
Consiste en la provisin del material que se desea estudiar por medio del
microscopio. El mtodo seleccionado debe ser el adecuado para cada tipo de
material. En todos los casos el instrumental con el cual se seccionan los tejidos debe
estar muy afilado para evitar aplastar sus elementos, as como se debe evitar
cualquier otro tipo de maltrato en su manipulacin. Los principales mtodos
empleados son: la biopsia, la reseccin quirrgica y la autopsia.
- La biopsia consiste en la extraccin de pequeos fragmentos de tejido de un
organismo vivo. Este procedimiento puede ser realizado de muy diversas formas,
consideraremos algunas:
- biopsia incisional : se realiza seccionando con instrumentos cortantes como el
bistur.
- biopsia por punch : el punch es un instrumento filoso con forma de sacabocados
que se utiliza para tomar biopsias de piel.
- biopsia por puncin : se realiza con agujas de biopsia y recientemente tambin
con agujas del tipo intramuscular (microbiopsia).
- biopsia endoscpica: se hace a travs de endoscopios, que son instrumentos
flexibles que permiten la observacin de algunas cavidades internas del organismo.
- La reseccin quirrgica consiste en la extirpacin de rganos completos o de
grandes partes de los mismos, a travs de un procedimiento quirrgico.
- La autopsia o necropsia es el examen de los rganos luego de la muerte,
generalmente con el objetivo de determinar las causas de la misma.
Cualquiera sea el procedimiento empleado para la obtencin, el material que resulta
del mismo debe ser inmediatamente fijado o congelado para evitar los procesos de
autodestruccin de las clulas conocidos como autlisis.
Fijacin
La fijacin es en esencia un mtodo para la preservacin de la morfologa y la
composicin qumica de las clulas y los tejidos. Consiste en producir la muerte de
las clulas, de manera tal que las estructuras que posean stas en el estado viviente
se conserven con un mnimo de modificaciones, a lo largo del tiempo y de los
subsiguientes pasos de la tcnica. Asimismo algunos mtodos tratan de conservar
intacta su composicin qumica.
La fijacin debe realizarse inmediatamente de extraer las clulas del organismo, para
evitar las lesiones agnicas ocasionadas por la anoxia, que inicialmente producen
cambios osmticos y luego alteraciones estructurales y bioqumicas ms profundas,
fenmenos conocidos en conjunto como autlisis. Por el mismo motivo los fijadores
deben actuar sobre fragmentos relativamente pequeos de tejidos (como regla
general menos de 1 cm cbico), para que la difusin del fijador desde las superficies
hasta la parte central del bloque tisular se haga en un tiempo reducido.
Propiedades de los fijadores:
- Producen una rpida muerte celular, evitando la autlisis
- Preservan la morfologa celular y tisular
- Preservan la composicin qumica
- Penetran a los tejidos con relativa rapidez
- Facilitan la coloracin posterior
- Inhiben el crecimiento microbiano y por lo tanto la putrefaccin
- Aumentan la consistencia de los tejidos
- Algunos de ellos colorean sustancias de los tejidos
- Efectos indeseables de algunos fijadores:
- Retraen los tejidos
- Precipitan en forma de cristales
- Endurecen demasiado las muestras
- Poseen olor desagradable e irritan la piel y las mucosas
- Producen alteraciones importantes a nivel molecular
- Producen alteraciones importantes a nivel ultraestructural
La eleccin del fijador adecuado est dictada por el propsito perseguido y para ello
deben tenerse en cuenta las propiedades y los efectos indeseables enumerados
arriba, que aparecen en mayor o menor medida en cada caso.
Clasificacin general de los fijadores
- Fsicos - Cal or
- Desecacin
- Microondas
- Qumicos
simples
- Alcoholes - Met anol
- Et anol
- Aldehdos - Formaldehdo
- Glutaraldehdo
- Acidos - Act i co
- P cr i co
- Osmi co
- Sales - Bicromato de pot asi o
- Bicloruro de mercurio
- Mezclas de
qumicos
- Carnoy - Alcohol etlico +
Acido act i co
- Bouin - Acido pcrico +
Formol +
Acido act i co
- Zenker - Bicromato de potasio +
Bicloruro de mercurio +
Acido act i co
- FaGlu - Formaldehdo +
Glutaraldehdo
Tambin debe considerarse:
- Su versatilidad para fijar distintos tipos de tejidos
- La facilidad para implementar su empleo
- Su estabilidad a temperatura ambiente
- Su costo comercial
Hoy en da el fijador histolgico universal de mayor versatilidad frente a los
diferentes tejidos, de fcil utilizacin y econmico, que cumple mejor con la
ecuacin entre propiedades y efectos indeseables, es el formol diludo al 10 %,
especialmente si se lo prepara en una solucin a pH neutro.
Revisin general sobre los diferentes tipos de fijadores
Los mtodos fsicos empleados para la fijacin son el calor, la desecacin y el
microondeado, aunque el fro se utiliza en ocasiones como alternativa a la fijacin.
El calor produce artificios de retraccin violentos y desnaturaliza severamente la
estructura proteica, por lo cual casi no se lo emplea. La desecacin se emplea para
fijar extendidos celulares realizados directamente sobre los portaobjetos a partir de
material fresco (por ejemplo una gota de sangre).
El microondeado, recientemente incorporado como mtodo de fijacin, produce
agitacin molecular a nivel de los dipolos que es ms o menos homognea en todo el
espesor de piezas de considerable tamao. Su efecto se produce por una
combinacin del calor generado en el tejido y la precipitacin in situ de las protenas
por ruptura de los puentes de hidrgeno.
Los mtodos de congelacin preservan la composicin qumica pero no son en
sentido estricto mtodos de fijacin, aunque en algunos casos pueden utilizarse para
reemplazarlos. La metodologa ideal para la congelacin comienza con la
introduccin de pequeas piezas del tejido en un bao de isopentano, refrigerado
por nitrgeno lquido a una temperatura de -160 a 180 C. No causa retraccin del
tejido; la preservacin es homognea en todo el espesor de la pieza; no hay
extraccin de sustancias solubles; la composicin qumica se mantiene
prcticamente sin cambios y la estructura, generalmente, se conserva con las muy
escasas modificaciones producidas por los cristales de hielo, que son menores
cuanto ms rpida haya sido la congelacin. La rapidez del congelamiento permite
tambin sorprender a las clulas en momentos crticos de su funcin, como en la
exocitosis de vesculas secretoras. Una de las mayores utilidades del sistema de
congelacin es poder obtener rpidamente cortes histolgicos durante una ciruga
para realizar un diagnstico intraoperatorio, mientras el paciente permanece an
anestesiado. En estas biopsias por congelacin, donde la rapidez del diagnstico
histopatolgico es esencial para determinar la conducta quirrgica, se utilizan por lo
general micrtomos de congelacin refrigerados por la expansin de dixido de
carbono lquido. La calidad de los preparados es apenas aceptable, pero suficiente
para los fines diagnsticos.
Algunos fijadores como el formol, el glutaraldehdo, el bicromato y el bicloruro de
mercurio actan formando puentes cruzados entre las protenas y dando lugar a
fuertes uniones entre molculas proteicas, siendo llamados por ello fijadores
generadores de puentes cruzados. En contraposicin los alcoholes, la acetona y el
cido actico precipitan las protenas en su lugar por alteracin de los puentes de
hidrgeno de las mismas sin daar su estructura primaria y por ello se los denomina
fijadores coagulativos.
Para el estudio de la cromatina y los cromosomas se emplean frecuentemente los
fijadores cidos (generalmente con cido actico), y para el estudio de la actividad
enzimtica se emplean la acetona, el glutaraldehdo o al formaldehdo, que preservan
muchos sistemas enzimticos.
Las mezclas se utilizan para aprovechar las cualidades ms sobresalientes de varios
fijadores a un mismo tiempo. Por ejemplo el Carnoy combina al etanol con el cido
actico, ambos muy buenos fijadores para cromatina. El Bouin posee formol, fijador
universal con gran poder de penetracin pero lento para actuar, con el cido actico
de gran velocidad penetracin y muy buen fijador nuclear, ambos sumados al cido
pcrico que acta principalmente a nivel citoplasmtico. Se lo emplea mucho en
biopsias de mdula sea por ser adems un buen decalcificador y en biopsias
testiculares por sus resultados empricos.
Para microscopa electrnica se emplea la fijacin con glutaraldehdo, seguida con
una posfijacin con tetrxido de osmio, en ambos casos controlando
cuidadosamente la osmolaridad y pH de las soluciones fijadoras.
El formol
Con el nombre de formol puro se conoce la solucin al 40 % de formaldehdo en
agua. El esta solucin se diluye al 10 % en agua o buffer (9 partes del solvente y 1
parte de formol puro) para su utilizacin, por lo que el formaldehdo en ella se
encuentra al 4 %. El formaldehdo es bastante inestable en solucin degenerando en
cido frmico, el cual es muy mal fijador. Para evitar que el cido frmico deteriore
los tejidos se lo neutraliza con carbonato de calcio o con soluciones buffer,
constituyendo el formol neutro en el primer caso y el formol buffereado en el
segundo. La solucin de formol al 10 % tiene un extraordinario poder de penetracin
a los tejidos, pudiendo fijarse con ella piezas relativamente grandes, pero su
velocidad de penetracin y de fijacin son lentas, demorando para ello no menos de
8 horas y siendo lo ptimo entre 12 y 24 horas. El formaldehdo reacciona con los
grupos amino, carboxilo e indol de las protenas, y produce entonces uniones de
metileno no solo dentro de una misma protena sino que adems lo hace con otras
molculas proteicas adyacentes (efecto conocido como cross-linking o formacin de
puentes cruzados). Este fenmeno sigue ocurriendo a lo largo del tiempo y deteriora
progresivamente la estructura molecular de los tejidos, en especial de las protenas,
dificultando el acceso de los anticuerpos hacia sus epitopes blanco, fenmeno
usualmente conocido como enmascaramiento antignico. Esto es reversible en un
comienzo a travs de una corta digestin enzimtica de las protenas o con
microondeado, que rompen parte de los puentes cruzados entre las protenas. Si la
fijacin se prolonga a lo largo del tiempo ms all de las 36 horas comienzan los
fenmenos de sobrefijacin que son progresivamente irreversibles. Por otra parte el
formaldehdo reacciona con los hidratos de carbono formando hemiacetales
inestables que pueden ser eliminados por lavado prolongado. Esto puede explicar
porqu los epitopes ricos en polisacridos son generalmente resistentes a la fijacin
en formol.
Es importante recordar:
- En caso de no saber cual es el fijador ideal para una determinada muestra de
tejido, debe utilizarse formol.
- Nunca debe emplearse el formol puro, sino diluido al 10 %.
- El tiempo de fijacin debe oscilar entre 12 y 36 horas.
- Siempre debe emplearse abundante fijador (unas 10 veces mayor volumen
que la pieza a fijar).
- El recipiente en el que se realice la fijacin debe tener boca ancha y debe ser
rotulado inmediatamente.
Inclusin
Para la obtencin de cortes finos es un requisito indispensable que el tejido haya
sido previamente endurecido: hasta un cierto punto, cuanto mayor sea la firmeza del
tejido, tanto ms delgada resulta el corte histolgico. Con el fin de endurecer los
tejidos existen dos mtodos principales: la congelacin o la inclusin.
Para las tcnicas ms frecuentes se emplea el mtodo de inclusin. El procedimiento
es lento pero los preparados son de gran calidad. El tejido se impregna en un
material que le confiere una consistencia adecuada para el corte. Para los cortes que
deben observarse con el microscopio ptico se usa casi exclusivamente la parafina.
Dado que sta es una sustancia hidrofbica los tejidos fijados se deshidratan en
alcoholes de concentracin creciente pasndolos despus por solventes
intermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno (conocidos como agentes
aclarantes), y luego son colocados en una estufa con parafina fundida entre 56 y 60
C, dado que esta es slida a temperatura ambiente. Luego de impregnar al tejido, se
deja solidificar a la parafina con el tejido includo, constituyendo los bloques o tacos
histolgicos.
En ocasiones el tejido se impregna con acrlicos de bajo peso molecular como el
metilmetacrilato, lo que permite obtener cortes ms delgados, procedimiento
conocido como microscopa ptica de alta resolucin.
Para microscopa electrnica se incluye casi invariablemente en resinas epoxi, y los
bloques resultantes, de gran dureza, son seccionados por la navaja de diamante o de
vidrio del ultramicrtomo
Corte
Los tejidos deben ser cortados en lminas delgadas para posibilitar su observacin
con el microscopio, los instrumentos utilizados para la obtencin de cortes son los
micrtomos. Bsicamente, todos los tipos de micrtomo constan de una navaja muy
afilada que seccionar el taco histolgico y un mecanismo de avance automtico
regulable de a unos pocos micrones (usualmente entre 5 y 8 micrones).
Los cortes as obtenidos presentan pequeos pliegues y arrugas que pueden
eliminarse si se los flota en agua tibia, debido a la elevada tensin superficial del
agua. Luego de ello se recogen sobre delgadas lminas de vidrio llamada
portaobjetos, a las cuales se adhieren generalmente a travs de adhesivos como el
silane o la poli-L-lisina.
Los cortes se secan y luego se los pasa por solventes intermediarios como el xileno,
el benceno o el tolueno y se los hidratada en alcoholes de concentracin decreciente
hasta llevarlos al agua destilada para su posterior coloracin.
El sistema de congelacin se utiliza para obtener rpidamente cortes histolgicos
durante una ciruga para realizar un diagnstico intraoperatorio por medio de
micrtomos de congelacin refrigerados por la expansin de dixido de carbono
lquido, o bien para conseguir cortes de tejido con su estructura qumica
prcticamente inalterada, para los cuales se emplea generalmente el denominado
criostato, compuesto por un micrtomo includo en una cmara de baja temperatura.
Coloracin
La obtencin de cortes delgados soluciona uno de los inconvenientes de la
observacin microscpica pero hace evidente a otro de ellos: si bien permite que los
cortes sean transparentes, la falta de colores y contrastes en las estructuras celulares
no permite visualizar prcticamente ningn componente. La tincin o coloracin se
efecta con dos propsitos:
- La coloracin rutinaria trata de posibilitar el estudio morfolgico o
estructural, sin que se pueda obtener mayor informacin sobre la naturaleza qumica
de las estructuras observadas.
- La histoqumica utiliza mtodos tendientes a identificar a un determinado
tipo de molcula o sustancia, visualizndola microscpicamente.
La mayora de los colorantes citolgicos o histolgicos son de naturaleza orgnica y
aromticos. Se reconocen dos tipos de colorantes: bsicos y cidos. En los
colorantes bsicos el grupo que imparte el color (grupo cromforo) es bsico
(catinico). Por ejemplo, el azul de metileno es el clorhidrato de tetrametiltionina, en
el que la parte cida (ClH) es incolora. Algunas veces los dos componentes de la sal
son cromforos, como en el caso del eosinato de azul de metileno. El grupo por
medio del cual el colorante se combina con el tejido se designa auxocromo. La
coloracin rutinaria ms empleada es la combinacin de un colorante bsico
(hematoxilina) y uno cido (eosina). Caractersticamente la hematoxilina colorea los
ncleos y el retculo endoplasmtico rugoso y la eosina colorea los citoplasmas y la
mayora de los elementos fibrilares del espacio intercelular.
Histoqumica
La histoqumica es el conjunto de tcnicas de coloracin destinadas a visualizar
sustancias especficas en los tejidos. Este propsito es tanto cualitativo como
cuantitativo. Puede realizarse con fines diagnsticos y desde ya resaltemos que los
procedimientos histoqumicos (en especial la inmunohistoqumica) se convirtieron
en un instrumento invalorable en el diagnstico y/o pronstico de innumerables
enfermedades. El mtodo histoqumico en sentido estricto es microscpico debiendo
cumplirse varias condiciones:
1) la sustancia original debe ser inmovilizada y visualizada por el microscopio en su
localizacin celular original
2) la sustancia debe ser identificada por un procedimiento que sea especfico para
ella o para el grupo qumico al que pertenece.
El siguiente cuadro permite una ubicacin general:
- Lpidos - Sudanes
- Aceite rojo 0
- Tetrxido de os mi o
- Hidratos de carbono - P AS
- Azul de Al ci an
- Metacromasia
- Protenas - Acidofilia y basofilia
- Impregnacin argntica
- Histoenzimologa
- Inmunohistoqumica
- Acidos nucleicos - Verde de metilo - Pi roni na
- Anaranjado de acri di na
- Reaccin de Feul gen
- Hibridacin in s i t u
Deteccin de lpidos
Durante la tcnica histolgica rutinaria los solventes orgnicos utilizados en los
procedimientos de inclusin previos al corte histolgico solubilizan los lpidos. Para
evitarlo, se emplean cortes por congelacin.
El procedimiento utilizado ms frecuentemente en la demostracin de los lpidos
consiste en su tincin con un colorante del grupo de los Sudanes o del Aceite Rojo 0.
Estas sustancias son muy solubles en los lpidos y relativamente solubles en
solventes como el alcohol 70. Por lo tanto, si una solucin de Sudanes en alcohol se
pone en contacto con una preparacin histolgica, como el colorante es menos
soluble en alcohol que en los lpidos tiende a abandonar la solucin para pasar a
stos (del mismo modo que el pimentn colorea intensamente las gotitas de grasa de
un puchero a la espaola), coloreando tanto las gotitas de triglicridos como
estructuras lipoproteicas del tipo de la mielina o polmeros lipdicos del tipo de la
lipofuscina.
El osmio es un fijador que insolubiliza a los lpidos y al mismo tiempo les imparte un
color oscuro, por lo que en ocasiones se lo utiliza como fijador y a la vez colorante
en preparados de microscopa ptica.
Deteccin de Hidratos de Carbono
Reaccin del PAS
Tanto la reaccin del PAS como la de Feulgen se basan en la utilizacin del reactivo
de Schiff. Este es un reactivo para grupos aldehdos, y stos se pueden demostrar en
algunos hidratos de carbono (por oxidacin selectiva), en el ADN (por hidrlisis
selectiva) y en algunos lpidos.
El reactivo de Schiff se prepara tratando fucsina bsica, que contiene parafucsina
(cloruro de triaminotrifenilmetano) con cido sulfuroso. La parafucsina se
transforma en un compuesto incoloro (cido bis-N aminosulfnico o reactivo de
Schiff), que luego es recoloreado por grupos aldehdo, en este caso los que puedan
estar presentes en los tejidos.
La reaccin de PAS (Periodic Acid-Schiff) est basada en la generacin de grupos
aldehdos libres mediante la oxidacin de los grupos gliclicos 1-2 de los
polisacridos, por medio del cido perydico. Este mtodo es positivo para
glucgeno, mucinas, mucoprotenas, cido hialurnico y quitina.
Metacromasia
La propiedad de teir ciertos componentes celulares con un color que difiere del
original del propio colorante se denomina metacromasia, y aparentemente depende
de la formacin de agregados polimricos del colorante al combinarse con ciertos
compuestos. Es caracterstica de algunos colorantes bsicos del grupo de las
tiazinas, especialmente la tionina, azur B y azul de toluidina, al colorear molculas
con grupos cidos ubicados de modo repetitivo y muy prximos entre s, como
ocurre con los glucosaminoglucanos, en particular con los sulfatados
(condroitin-sulfato, heparina). Por oposicin, la propiedad de los colorantes teir
con su color original se denomina ortocromasia.
Deteccin de protenas
Acidofilia y basofilia
Se conoce como acidofilia y basofilia a un conjunto de coloraciones basadas en el
comportamiento de las diferentes protenas a las variaciones del pH. Para
comprender esto es conveniente que aprender cul es el mecanismo de accin de la
mayora de los colorantes. Se deber recordar la propiedad que tienen las protenas,
ciertos polisacridos y cidos nucleicos de ionizarse como bases o como cidos. La
ionizacin cida se produce por los grupos carboxilo (.COOH), hidroxilo (-OH),
sulfato (.HSO4) o fosfato (.H2PO4). En las protenas la ionizacin bsica se realiza
en el grupo amino (.NH2) y en otros grupos bsicos. El punto isoelctrico es el pH en
el cual dichas molculas biolgicas no se ionizan en ningn sentido, y que es muy
caracterstico de cada una de ellas. Si el pH del medio en el que se realiza la
coloracin es superior al punto isoelctrico, los grupos cidos se ionizan y si es
menor, se ionizan los grupos bsicos. A causa de esta propiedad, por encima de su
punto isoelctrico las protenas reaccionan con colorantes bsicos (violeta cristalino,
azul de metileno, fucsina bsica) y por debajo de l, con colorantes cidos (naranja
G, azul de anilina), pudiendo de este modo identificarse por ejemplo los diferentes
grnulos proteicos de secrecin de una glndula como la hipfisis.
Es interesante considerar tambin que para los cidos nucleicos la carga neta est
determinada primeramente por la disociacin de los grupos fosfatos, y el punto
isoelctrico es muy bajo (pH 2 o menos). Por esta causa la tincin a pH bajo con
colorantes bsicos es casi selectiva para los cidos nucleicos.
Impregnacin argntica
El nitrato de plata, en condiciones muy controladas de concentracin, pH y salinidad
del medio, precipita sobre grupos amino libres muy caractersticos de algunas
protenas permitiendo su identificacin.
Actividad enzimtica
Las enzimas son catalizadores biolgicos de estructura proteica. La actividad de
muchas de ellas puede evidenciarse microscpicamente. En algunos casos la
preservacin de esta actividad requiere de cortes de criostato, pero en otros la
enzima resiste una breve fijacin en acetona fra, formaldehdo, glutaraldehdo y
otros dialdehdos. Las tcnicas enzimticas se basan en la incubacin de los cortes
de tejidos con un sustrato apropiado. Por ejemplo, en el mtodo de Gomori para la
fosfatasa alcalina se emplean como sustratos steres fosfricos de glicerol. El ion
fosfato liberado por hidrlisis enzimtica se convierte en una sal metlica insoluble
generalmente en presencia de calcio, y sta a su vez se puede visualizar por su
conversin en sulfuro de plomo, plata metlica, sulfuro de cobalto u otros
compuestos coloreados.
Inmunohistoqumica
La inmunohistoqumica se basa en la deteccin de sustancias de los tejidos por
medio del uso de anticuerpos. Dichos anticuerpos pueden obtenerse por medio de la
inmunizacin de animales de laboratorio contra la protena, polisacrido, cido
nucleico u otro tipo de molcula que se desea detectar, en cuyo caso las
inmunoglobulinas han sido producidas por varios clones de plasmocitos por lo cual
se denominan anticuerpos policlonales. La otra posibilidad, que vali el Premio
Nobel a C. Milstein, consiste en fusionar clulas inmortales de un plasmocitoma
(tumor maligno de los plasmocitos) con linfocitos B de un ratn sensibilizado contra
la sustancia que se desea detectar. El resultante se conoce como hibridoma. Dado
que se aslan colonias celulares (clones) en las fases iniciales, cada una de ellas
proveniente de una nica clula, los anticuerpos se denominan monoclonales.
Ultimamente la ingeniera gentica ha ingresado en el campo de la produccin de
anticuerpos, avanzando hacia el ideal de su obtencin "a medida" de la protena que
se desea detectar.
En la inmunohistoqumica se hace actuar sobre un corte histolgico una solucin
con la inmunoglobulina (anticuerpo) capaz de unirse especficamente al componente
del tejido que se pretende demostrar (el antgeno). Los anticuerpos que se unen al
antgeno no son visibles por s mismos, por lo que es necesario emplear sistemas de
visualizacin, habitualmente de tipo enzimtico, aunque tambin se emplean
sustancias fuorescentes para el correspondiente microscopio, o sustancias
electrodensas como el oro coloidal o la ferritina, que pueden ser identificadas en
microscopa electrnica.
Han aparecido seis generaciones sucesivas de sistemas, en orden cronolgico de
aparicin y de sensibilidad creciente:
1) Las marcaciones directas, en las que se liga una enzima, fluorocromo o metal
pesado al anticuerpo. Este sistema es de muy baja sensibilidad, restringindose
actualmente su utilidad a las tcnicas de inmunomicroscopa electrnica
cuantitativa.
2) Las marcaciones indirectas en un paso en las que aparece el concepto de
anticuerpo primario y secundario, siendo el primario el dirigido contra la protena
que se desea detectar y el secundario un anticuerpo contra el anticuerpo primario,
marcado enzimticamente. Esto aumenta la sensibilidad del mtodo y facilita el
trabajo, puesto que para varios anticuerpos primarios se emplea el mismo
secundario.
3) Los sistemas de tipo peroxidasa antiperoxidasa (PAP) que constituyen el primer
gran avance en el aumento de la sensibilidad. En estos, luego de incubar con el
anticuerpo primario se emplea un anticuerpo secundario en exceso que har de
puente entre el primario y un complejo de la enzima peroxidasa con anticuerpo
antiperoxidasa. Es importante que los anticuerpos antiperoxidasa sean producidos
en el mismo animal que el anticuerpo primario, para que el secundario pueda
funcionar como puente.
4) Los sistemas de tipo complejo de avidina biotina (ABC) que se basan en el uso
de las lectinas. Estas son sustancias de estructura polisacrida obtenidas de
vegetales, bacterias, huevos, etc., capaces de ligarse entre s con extraordinaria
afinidad. Para su empleo se liga biotina a los anticuerpos secundarios, despus de lo
cual se incuba el tejido con un complejo de avidina unida a biotina marcada con
peroxidasa. Recientemente la avidina ha sido reemplazada por la estreptavidina
(producida por los estreptococos), que tiene mayor afinidad y menor tendencia a
adherirse inespecficamente a los tejidos. Una variante de estos mtodos es el
sistema biotina - estreptavidina marcada (LsAB), en el cual luego del secundario
biotinilado se incuba el tejido con estreptavidina marcada con peroxidasa.
5) La tecnologa en polmeros consiste en montar los anticuerpos secundarios y las
enzimas sobre macromolculas muy flexibles y estables en solucin, de modo que se
puede reducir la tcnica a un solo paso luego de incubar con el anticuerpo primario e
inmediatamente revelar. Esta tecnologa ha aumentado significativamente la
sensibilidad de las tcnicas inmunohistoqumicas, permitiendo utilizar muy diluidos
los anticuerpos primarios. Con el mismo principio se han producido anticuerpos
primarios y las enzimas sobre las mismas macromolculas reduciendo la tcnica a un
solo paso.
6) Los sistemas de amplificacin catalizada de la seal (CSA) constituyen el salto
ms reciente en sistemas de deteccin. Este sistema consiste en efectuar una
inmunomarcacin convencional con sistema biotina-estreptavidina hasta el paso del
revelado. Normalmente las marcaciones con la enzima peroxidasa se revelan con
diaminobencidina (DAB), la cual permanece incolora y estable en solucin hasta
que se oxida con el oxgeno naciente en la degradacin del perxido de hidrgeno
por la accin de la peroxidasa, precipitando como su derivado de coloracin parda.
El sistema de amplificacin catalizada de la seal emplea para el paso del revelado
un derivado fenlico biotinilado (tiramina biotinilada) incoloro y estable en solucin
hasta que se oxida con el oxgeno naciente en la degradacin del perxido de
hidrgeno por la accin de la peroxidasa y precipita en el tejido, dejando en este
gran cantidad de biotina. Posteriormente el tejido se incuba nuevamente con
estreptavidina ligada a peroxidasa y finalmente se efecta el revelado convencional
con DAB. Este sistema multiplica unas 1000 veces la sensibilidad con respecto al
sistema ABC.
Deteccin de cidos nucleicos
Los mtodos citoqumicos para cidos nucleicos dependen de las propiedades delos
tres componentes que constituyen sus nucletidos (pentosa, cido fosfrico y base
nitrogenada). La basofilia est originada por la presencia de los grupos fosfato, tanto
del ADN como del ARN y para ella son muy utilizados el Azur B y el azul de
toluidina a pH muy bajo. El verde de metilo en ciertas condiciones colorea
principalmente al ADN, y la pironina al ARN. Utilizando el colorante anaranjado de
acridina sobre un corte de tejido, luego de la acetilacin, es posible obtener una
fluorescencia verde para el ADN y roja para el ARN.
Reaccin de Feulgen
La reaccin de Feulgen depende de la presencia de desoxirribosa. En este mtodo,
los cortes de tejido fijados se someten a una hidrlisis cida dbil con cido
clorhdrico, y luego se tratan con el reactivo de Schiff. Esa hidrlisis es suficiente
para extraer el ARN, que desaparece, pero no el ADN. El mecanismo de la reaccin
tiene los siguientes pasos: 1) la hidrlisis cida extrae las purinas a nivel de la unin
desoxirribosa-purina del ADN y de esta manera libera los grupos aldehdos de la
desoxirribosa; 2) los grupos aldehdos libres reaccionan con el reactivo de Schiff.
Cuando se aplica a la clula, la reaccin es positiva en el ncleo y negativa en el
citoplasma. En el ncleo las masas de cromatina condensadas son particularmente
positivas; el nucleolo es Feulgen-negativo. En condiciones estrictamente
controladas, la intensidad de esta coloracin se correlaciona con la cantidad de ADN
presente, y se puede determinar citoespectrofotomtricamente. La determinacin de
la ploida celular por este mtodo es particularmente empleado en el estudio ciertos
tumores humanos, especialmente como factor pronstico y condicionante de la
terapia.
Hibridacin in situ
La hibridacin in situ consiste en la deteccin de secuencias muy especficas de un
cido nucleico a travs de su capacidad de aparearse con una secuencia
complementaria. Esta tcnica se implementa usualmente para el ADN, consistiendo
su primer paso en separar las cadenas del mismo (desnaturalizacin), por medio del
calentamiento a 90 C. A continuacin se incuba el corte con una secuencia de ADN
de simple cadena y complementaria con la que se quiere investigar conocida como
sonda y que se ha marcado de alguna manera (generalmente con fluorescena o con
biotina). Posteriormente se visualiza con alguno de los sistemas similarmente a como
se lo hace para la inmunohistoqumica.
Los principales tipos de hibridacin in situ son:
1) La hibridacin no fluorescente de ADN, utilizada frecuentemente para detectar
virus y otros microorganismos con ADN, para identificar copias simples de genes
individuales, y para identificar traslocaciones y otras anomalas cromosmicas.
2) La hibridacin no fluorescente de ARN mensajero, empleada para el estudio de la
expresin de genes a nivel celular y subcelular.
3) La hibridacin fluorescente de ADN (FISH), de gran utilidad para realizar el
cariotipo del ncleo en interfase.
Montaje
Consiste en colocar sobre el corte histolgico ya coloreado una delgada lmina de
vidrio llamada cubreobjetos, el cual se adhiere con algn adhesivo transparente
conocidos como medios de montaje. Previamente, y dado que stos son una
sustancias hidrofbicas los cortes se deshidratan en alcoholes de concentracin
creciente pasndolos despus por solventes intermediarios como el xileno, el
benceno o el tolueno.
El medio de montaje clsico es el Blsamo del Canad, el cual prcticamente se ha
dejado de utilizar debido a que ha sido superado por los medios sintticos como el
DPX y otros.
Artificios de la tcnica
Con el nombre de artificios de la tcnica se conocen una serie de imgenes que se
observan en los cortes histolgicos ocasionadas por los diferentes pasos de la
tcnica histolgica.
El siguiente cuadro general sirve de orientacin:
- Obtencin - Atriccin y aplastamiento del tejido por pinzas, e t c .
- Desecacin, en general por depositar pequeas muestras de tejido
sobre una gasa y demorar su fi j aci n
- Autlisis, por demorar la fi j aci n
- Fijacin - Autlisis, por emplear pequeos volmenes de fijador para piezas
mayores de 1 cm cbi co
- Retraccin, mayor con los al cohol es
- Pobre coloracin, mayor con las sales y el os mi o
- Precipitados, mayor con las s al es
- Inclusin - Retraccin, por sobrecalentamiento
- Corte - Rayas, por melladura de las navaj as
- Pliegues, por falla al extender los cor t es
- Coloracin - Ausencia de coloracin, generalmente en las reacciones
histoqumicas por falla en alguno de sus pas os
- Sobrecoloracin, al extenderse en el t i empo
- Precipitados, por no filtrar los colorantes
- Montaje - Burbujas de aire y gotas en el medio de mont aj e