UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA





PROYECTO DE TESIS
EFECTO ANTIBACTERIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE Citrus reticulata
MANDARINA VARIEDAD SATSUMA EN EL CRECIMIENTO DE Pseudomona
aeruginosa Y DE Staphylococcus aureus

AUTOR: Br. MARA VICTORIA TRUJILLO LAGUNA

ASESOR: Dr. PEDRO MERCADO MARTNEZ



TRUJILLO PER
2012
PROYECTO DE INVESTIGACIN
I.- GENERALIDADES:
1.-Ttulo:
Efecto antibacteriano del aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata) variedad
Satsuma en el crecimiento de Pseudomona aeruginosa y de Staphylococcus aureus.
2.- Autor:
2.1. Nombres y Apellidos : Mara Victoria Trujillo Laguna
2.2. Facultad : Ciencias Biolgicas
2.3. Escuela : Microbiologa y Parasitologa
2.4. Categora : Bachiller
2.5. Nmero matrcula : 051900706
3. Asesor:
3.1. Apellidos y Nombres : Pedro Estuardo Mercado Martnez
3.2. Grado Acadmico : Doctor en Ciencias Biomdicas.
3.3. Ttulo Acadmico : Bilogo Microbilogo.
3.4. Direccin Laboral: Departamento acadmico de Microbiologa y Parasitologa
de la Universidad Nacional de Trujillo.
4. Tipo de Investigacin:

5.1. De acuerdo al diseo de investigacin : Experimental
5.2. De acuerdo al tipo de investigacin : Bsica
5. Rgimen de Investigacin:
Libre
6. Lugar: Trujillo
- Institucin : Universidad Nacional de Trujillo
Facultad de Ciencias Biolgicas.
Escuela de Microbiologa y Parasitologa

7. Duracin: 6 meses

Fecha de inicio : Marzo 2012
Fecha de trmino : Setiembre 2012

8. Cronograma de Ejecucin del Proyecto:


ETAPAS
AO 2012


MAR ABR MAY JUN JUL AGO SET
Formulacin y sustentacin del
proyecto
X
Pruebas experimentales X X X X
Evaluacin e interpretacin de
resultados

X
Redaccin del informe
cientfico

X X


9. Horas Semanales Dedicadas al Proyecto:
- Horas/Semana : 30

10. Presupuesto:

10.1. Recursos Disponibles:

a) Personal:
Personal tcnico del Departamento Tcnico de Microbiologa y Parasitologa.
b) Materiales de laboratorio, reactivos, medios de cultivo y Equipos e
instrumentos
Material de vidrio:
Descripcin Cantidad
Matraz de 500 ml Pyrex 05 unid
Matraz de 250 ml Pyrex 05 unid
Pipetas de 1 ml Corning 05 unid
Pipetas de 5 ml Presicolor 05 unid
Pipetas de 10 ml Presicolor 05 unid
Tubos de ensayo 16 x 125 mm. Pyrex 20 unid.
Vasos de precipitacin de 400 ml Pyrex 05 unid.
Vasos de precipitacin de 250 ml Pyrex 05 unid.
Frascos de penicilina oscuros 10 unid.
Mechero 01 unid.
Gradillas de metal x 48 tubos 01 unid.
pH metro digital, marca Hanna Instruments
Tubo N1 del Nefelmetro de Mac Farland

Equipos e instrumentos
Descripcin Cantidad
Autoclave Aschraft 01 unid
Balanza analtica Heraeus 01 unid
Balanza de dos platillos Ohams 01 unid.
Cmara fotogrfica Panasonic 01 unid
Estufa Heraeus 01 unid
Horno Muszeripan 01 unid.
Refrigeradora Coldex 01 unid
Cocina elctrica Insegresa 01 unid.
Termmetro Heraeus 01 unid
Equipo de destilacin

Materiales Biolgicos
Descripcin
3 Cultivos de Pseudomona aeruginosa
3 Cultivos de Staphylococcus aureus

10.2. Recursos no Disponibles

5.3.11.30: BIENES DE CONSUMO
ARTCULO MARCA CANTIDAD COSTO/UNIDAD
(S/.)
COSTO TOTAL
(S/.)
Guantes Endeglore 1caja 19.00 19.00
Mascarillas s/m 1caja 12.00 12.00
Alcohol Yodado Dropacsa 2 Litros 10.00 20.00
Jabn liquido
desinfectante
s/m 3frascos 1.80 5.40
Leja clorox 2 1.00 2.00
Ron s/m 5 Litros 1.00 5.00
Mechero s/m 2 10.00 20.00
Agua Destilada s/m 20 L. 1.00 20.00
Caldo BHI Difco 1 lb. 456.00 456.00
Agar Muller-
Hinton

Bolsas plsticas Alfa 3 1.00 3.00
Papel toalla Elite 2 3.50 7.00
Tubos de ensayo Pirex 15 1.50 22.50
Placas Petri Pirex 25 10.00 250.00
Pipetas s/m 10 7.00 70.00
Balones Pirex 2 30.00 60.00
Asa
bacteriolgica
s/m 1 11.00 11.00
Asa Drigalsky Pirex 1 12.00 12.00
Discos de
antibitico
Ciprofloxacina y
Cefalexina

2 frascos

30.00

30.00
Rayador de
acero
1 3.50 3.50
Mandarina 25 Kg. 2.00 50.00
TOTAL S/. 2745.00

5.3.11.32: VITICOS Y ASIGNACIONES

Tipo de servicio Cantidad Costo/da (S/.) Total (S/.)
Movilidad local 1 8.00 1152.00
Viticos y
asignaciones

1

6.00

864.00
TOTAL S/. 2016.00


5.3.11.39 SERVICIOS DE TERCEROS

5.3.11.42 MATERIAL DE ESCRITORIO
DENOMINACIN MARCA CANTIDAD COSTO/UNID
(S/.)
COSTO
TOTAL (S/.)
Papel bond de 80 g. Atlas 1 millar 24.00 24.00
Corrector lquido Faber Castell 2 2.50 5.00
Cartuchos de tinta
para impresora
Lex Marck 2 45.00 90.00
Tinta para
impresora
Arco iris 2 20.00 40.00
Lapicero azul Faber Castell 6 1.00 6.00
Resaltador Faber Castell 6 2.00 12.00
Regla Artesco 2 1.00 2.00
Marcador Faber Castell 2 2.00 4.00
TOTAL S/. 183.00



TIPO DE SERVICIO CANTIDAD COSTO/UNIDAD
(S/.)
COSTO TOTAL
(S/.)
Impresiones Fotogrficas 50 0.50 25.00
Impresin Tipogrfica 100 0.20 20.00
Fotocopias 100 0.05 5.00
Anillados 8 2.50 20.00
Empastados 10 15.00 150.00
TOTAL S/. 220.00
RESUMEN DE PRESUPUESTO
5.3.11.30: BIENES DE CONSUMO S/. 2745.00
5.3.11.29: MATERIAL BIOLGICO S/. 230.00
5.3.11.32: VITICOS Y ASIGNACIONES S/. 162.00
5.3.11.39: SERVICIOS DE TERCEROS S/. 70.00
5.3.11.42: MATERIAL DE ESCRITORIO S/. 188.00
TOTAL S/. 3395.00

11. Financiamiento:
Recursos disponibles
- Laboratorio de Fisiologa y Gentica Bacteriana. Facultad de Ciencias Biolgicas.
Universidad Nacional de Trujillo.
- Departamento Tcnico de la Escuela de Microbiologa y Parasitologa. Facultad de
Ciencias Biolgicas. Universidad Nacional de Trujillo.


Recursos no disponibles
- Autofinanciado
II.- PLAN DE INVESTIGACIN
1. REALIDAD PROBLEMTICA

Actualmente en el mundo moderno la poblacin crece aceleradamente y con
ella tambin las enfermedades infecciosas producidas por bacterias, virus, hongos,
etc. A pesar que existen muchos antibacterianos para su control o tratamiento, el uso
irracional de stos viene generando resistencia microbiana y otras secuelas; en tanto
que, la biodiversidad vegetal ofrece alternativas antibacterianas, tal es el caso de
algunas especies con excelentes resultados, debido a sus constituyentes qumicos
1
.
La mayora de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), son de
origen bacteriano, siendo uno de los problemas con mayor impacto en el mundo,
debido a que estas enfermedades se adquieren por el consumo de alimentos y/o agua
contaminados, representan un gran riesgo para la poblacin en general
2,3
.
Debido a esto, son muchos los trabajos que se han centrado en el uso de las
especies como preservacin de alimentos
4
, pero son pocos los trabajos en relacin a
su accin contra microorganismos patgenos y menos contra patgenos
intrahospitalarios, como Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus
5
. Estos
microorganismos son oportunistas, y tiene mecanismos de diseminacin y
patogenicidad mltiples. Son reducidos los antimicrobianos confiables contra estos
patgenos, incluyendo cefalosporinas y fluoroquinolonas
6
.
Las infecciones ocasionadas por cepas de S. aureus son un problema de
salud importante en todo el mundo ya que produce una gran variedad de
infecciones incluyendo osteomielitis, endocarditis invasora, artritis sptica y
septicemia; mientras que contaminacin de alimentos est asociada con una forma
de gastroenteritis que se manifiesta clnicamente por un cuadro caracterizado por
vmitos (76% de casos) y diarrea (77% de casos). La incidencia es desconocida
pero es probablemente una de las causas de enfermedad trasmitida por alimentos
ms frecuentes. Entre los alimentos implicados se encuentran: ensaladas de papas y
huevos, pastelera, jamn, pollo, cremas heladas
7-9
.
Pseudomonas aeruginosa tiene una distribucin mundial, es cosmopolita, Se
asla de suelos, agua, plantas, animales, incluyendo al hombre, algunas veces es
patgeno para animales y vegetales. Representa un problema importante de salud
en centros hospitalarios, especialmente cuando se trata de pacientes
inmunocomprometidos, con cncer, quemados o a los internos en terapia intensiva;
ya que puede producir complicaciones graves. Esta situacin se ve agravada ya que
esta bacteria presenta una muy alta resistencia natural a distintos antibiticos o
desinfectantes
10
.
En ambientes acuosos esta bacteria se adhiere a superficies, produciendo una
especie de agregado llamado biopelcula. La formacin de estos cmulus de
bacterias y material extracelular representa un problema en la salud pues contamina
dispositivos que se implantan dentro del cuerpo, como por ejemplo dispositivos
intrauterinos, catteres o vlvulas cardicas. As mismo, P. aeruginosa presenta
problemas en la industria alimenticia ya que puede descomponer los alimentos que
se mantienen en refrigeracin. Los alimentos implicados son vegetales crudos, agua,
leche no pasteurizada
10.11
.

Por lo anterior, la presencia de estos microorganismos en los alimentos as
como en el ambiente intrahospitalario conduce a buscar alternativas de inhibicin y
eliminacin con una mayor posibilidad de aplicacin como pueden ser las sustancias
naturales
6
.
El Per es conocido como el tercer pas megabiodiverso del mundo, siendo
catalogado por algunos cientficos como el segundo o primero, porque posee una
extraordinaria riqueza biolgica, fuente natural de molculas bioactivas. La
diversidad vegetal peruana llega aproximadamente a unas 50 000 especies detec-
tadas, mientras que todo el continente europeo posee 12 000 especies. Razones nos
sobran para maximizar el aprovechamiento sostenible de nuestros recursos na-
turales, previamente validados cientfica y tecnolgicamente con los respectivos
estudios
1
.
Algunas especies vegetales tales como Citrus reticulata se han reportado
como poseedoras de caractersticas antifngicas, antimicrobianas y fitoteraputicas,
las cuales le hacen una especie promisoria para su uso en actividades farmacuticas,
control de plagas en el sector agrcola y la preservacin de los alimentos para evitar
la proliferacin de microorganismos causantes de enfermedades
12,13
.
El hombre desde la antigedad ha usado sustancias naturales extradas de las
plantas, como los aceites esenciales, para combatir enfermedades y preservar
alimentos. Hoy en da, estas sustancias han perdido su uso debido a la aparicin de
sustancias qumicas, no obstante, tienen la ventaja de que no representan un peligro
para la vida y salud del hombre
14
.
Los aceites esenciales cubren un amplio espectro de actividades tales como
efectos farmacolgicos, antiinflamatorios, antioxidantes y anticancergenos. Otros
son biocidas contra una amplia gama de organismos como bacterias, hongos, virus,
protozoos, insectos y plantas
14-17
.
Tambin se ha estudiado la importancia de estos aceites debido a su
disponibilidad, a los pocos efectos secundarios o a la toxicidad que pueden causa,
as como la mejor biodegradabilidad comparado con antibiticos y preservativos
disponibles
12
. Por todas estas propiedades, se ha evaluado el control que pueden
ejercer estos compuestos contra microorganismos patgenos en alimentos, y por
tanto la posibilidad de ser utilizados como un mtodo de eliminacin
16
.
Muchas hierbas y especias han sido utilizadas durante siglos para
proporcionar sabores diferentes a los alimentos y stas pueden presentar tambin
actividad antimicrobiana
18
. Los compuestos responsables de esta actividad son a
menudo fracciones del aceite esencial, las cuales consisten principalmente en
compuestos fenlicos
19
, que presentan actividad antimicrobiana
20,21
, tienen gran
aplicacin para el control de crecimiento de patgenos en alimentos por lo que se
utilizan como mtodos de preservacin. Se ha reportado que la actividad
antimicrobiana se deriva de terpenoides y compuestos fenlicos en los aceites
22-24
.

Las plantas producen una gran cantidad de compuestos secundarios como
proteccin contra ataques microbianos e insectos. De hecho muchos de estos
compuestos han sido usados en forma pura o extractos vegetales como alimento o
aplicaciones mdicas en humanos
25,26
.
Los aceites esenciales son lquidos voltiles, casi inmiscibles en disolventes
polares asociados (agua, amoniaco), pero fcilmente solubles en los disolventes
orgnicos comunes como alcohol, ter y aceites vegetales y minerales
27-30
, se
concentran y se almacenan en tejidos secretores de los rganos vegetales aromticos
como hojas, corteza o frutos; y cuando esto ocurre en diferentes rganos en la
misma planta, frecuentemente su composicin es diferente
30,31
. En recientes estudios
se ha demostrado la actividad antibacteriana de diversos aceites esenciales, los
cuales pueden contener ms de 150 componentes
32,33
.

Poco se sabe acerca de los mecanismos de accin antimicrobiana, de los
compuestos mayoritarios de algunas especias, como la naranja, ya sea de forma
individual o como parte del aceite esencial completo
34,35
. Los sitios de accin de los
agentes antimicrobiano en la clula microbiana, incluye a la membrana celular,
pared celular, enzimas metablicas, sntesis de protenas y el sistema gentico
21
,
todos ellos estratgicos para la supervivencia de los microorganismos y cualquier
accin sobre ellos puede inactivar a la clula microbiana. Weber (1943) menciona
que los compuestos utilizados como antimicrobianos tiene varios sitios de ataque
dentro de las clular microbianas y que dependiendo de las concentraciones
utilizadas en los alimentos, pueden causar inhibicin o inactivacin de los
microorganismos
36
.

Conner (1993) sugiri que la actividad antimicrobiana de los aceites
esenciales, se basa en el deterioro de varios sistemas enzimticos, includos aquellos
involucrados en la produccin de energa y en la sntesis de componentes
estructurales. Una vez que el compuesto fenlico cruza la membrana celular, puede
interactuar con las enzimas y con las protenas causando un flujo contrario de
protones a travs de ella, afectando as a la actividad celular
19,37
.
Un mtodo ampliamente utilizado para la evaluacin de los antimicrobianos
naturales es el conocido como zona de inhibicin
38
. Se trata de un mtodo
sencillo, sin embargo, el efecto inhibitorio del compuesto que se va a evaluar,
depender de su habilidad para difundirse en el medio. Este mtodo, cae en la
clasificacin de los llamados de punto final y se le conoce como ensayo de disco.
Uno de los requisitos para obtener resultados confiables y repetibles es que el
microorganismo a evaluar se desarrolle rpida y uniformemente
39,40
.
La industria de los ctricos en Per se encuentra en constante crecimiento
debido principalmente a la demanda de naranja, mandarina y recientemente limn
17
.
Lozano (2005) afirma que en el Per se cultivan algunas variedades de mandarina,
entre las cuales destacan las variedades, Satsumas (Okitsu, Owari y Clausellina),
Clementinas (Clementina Fina, Oroval, Clemenules, Marisol, Oronules,
Clemenpons, Esbal, Loretina, Hernandina), Tangerinas y Tangelos. Teniendo en
cuenta que en general el flavedo de la mandarina se desecha, existe la posibilidad de
viabilizar de manera comercial la extraccin del aceite esencial del mismo mediante
arrastre con vapor de agua
41
.
Toda la planta contiene aceite esencial y principios amargos (flavonoides),
las hojas maduras pueden contener alcaloides, taninos y monoterpenos. Las flores
contienen adems glucsidos y cumarinas. La el flavedo (cscara) del fruto contiene
-pineno, -pineno, mirceno, limoneno, p-cimeno, -terpineno, linanol, acetato de
linalilo, -terpineol, citronelol, acetato de geranilo, N-metil antranilato de metilo,
entre otros componentes
42
.
En los ltimos aos se han realizado muchas investigaciones, que han
demostrado el poder antimicrobiano de los aceites esenciales, especialmente los
extrados de frutas ctricas; en estos estudios se puede mencionar el de Dabbah et
al
43
, quienes encontraron que los aceites esenciales de mandarina, naranja y toronja
mostraron tener actividad antibacteriana contra cepas bacterianas de:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas
aeruginosa y Salmonella entre otras.
Durante las primeras tres dcadas del siglo 20 se establece una metodologa
completa para la clasificacin de las variedades de mandarina que existan, esta
metodologa estableci cuales eran los distintos patrones que se cultivaban a nivel
mundial, dando esto lugar a la caracterizacin de las variedades de mandarina y a
sus aceites esenciales a nivel mundial
44
.
As mismo en el ao de 1934, Nelson realiz un estudio de la composicin
qumica del aceite esencial de distintas variedades de mandarina que se cultivaban
en Florida, Estados Unidos. Nelson extrae los aceites esenciales al comprimir el
flavedo (cscara), su estudio determina que variedades similares de mandarina
posean aceites esenciales con diferencias en su composicin qumica.
Martnez et al. (2003)

estudiaron la actividad antibacteriana y la
concentracin mnima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de mandarina (Citrus
reticulata Blanco) variedad Dancy. Las cortezas de las frutas fueron prensadas al
fro para la obtencin del aceite. Las cepas bacterianas que se utilizaron para
determinar la actividad antibacteriana fueron: Bacillus subtilis, Staphylococcus
aureus ATCC 259923, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Klebsiella
pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, y Escherichia coli ATCC
25922. La actividad antibacteriana se determin por el mtodo de difusin en agar
utilizando las siguientes concentraciones de aceite: 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,
90 y 100%. La CMI se determin por el mtodo de dilucin en caldo utilizando 6
concentraciones. El aceite esencial present actividad antibacteriana del tipo
bactericida contra B. subtilis, S. aureus y L. monocytogenes a todas la
concentraciones excepto al 1%. La CMI del aceite esencial de mandarina variedad
Dancy para B. subtilis fue de 9%, para S. aureus y L. monocytogenes fue de 7%
45
.
Mazariegos (2008) investig la composicin qumica del aceite esencial
extrado de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra),
Citrus reticulata (Mandarina comn) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina
(Mandarina Dancy), variedades de mandarina que se producen en Guatemala. Para
realizar la separacin, identificacin y cuantificacin de los principales
componentes de los aceites esenciales se realizaron anlisis mediante cromatografa
de gases acoplada a espectrometra de masas, esta tcnica instrumental permiti
establecer que los aceites esenciales posean al menos 28 componentes, 7 de los
cuales se encontraban presentes en las tres variedades de mandarina investigadas.
Las tres variedades de mandarina presentaron altas concentraciones relativas del
hidrocarburo monoterpnico limoneno seguido del -terpinoleno y en menor
concentracin relativa, el -terpineol y -pineno. La cromatografa de gases
acoplada a la espectrometra de masas permiti establecer tambin los tiempos de
retencin, as como la concentracin relativa para cada uno de los componentes y
ms importante an, esta tcnica instrumental permiti identificar a cada uno de los
componentes principales presentes en cada variedad, incluso los que se encontraban
a niveles traza, tal es el caso del acetato 9-decenlico, el sabineno, el -terpineno,
el 1-octanol, el Z-citral y el (+)-2-careno.
Cceres (1996) y Bergonzelli et al. (2003) extrajeron aceite esencial del
flavedo de la mandarina Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina
Dancy) para efectuar pruebas fitofarmacuticas, comprobando que este aceite
esencial presentaba capacidad inhibitoria hacia el crecimiento de bacterias tales
como: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas
aeruginosa, Helycobacter pilori y Salmonella sp. que resultan ser patgenas para el
hombre
42,46
.
Estos resultados hacen relevante el estudio de los aceites esenciales
especialmente de ctricos debido a la gran importancia que tienen para la industria
farmacutica y de alimentos. Se sabe que los aceites esenciales, utilizados como
aditivos en los alimentos tienen efecto antimicrobiano y actan al mismo tiempo
como saborizante
27
.
Por lo anterior y debido a que el aceite esencial de Citrus reticulata es
utilizada en Per como en muchos pases como saborizantes o en combinacin con
otros aceites esenciales, en extractos o jugos de fruta, para dar sabor a diversos
alimentos como son refrescos, productos horneados, dulces, quesos, tabaco,
condimentos, aderezos para ensaladas, jarabes, etc.
19
, podra utilizarse como
antimicrobiano en la industria de los alimentos para este caso contra S. aureus;
adems de usar P. aeruginosa como modelo para evaluar el efecto del aceite
esencial de mandarina, podr sugerir su uso como sanitizante o desinfectante
natural.

2.- JUSTIFICACIN.

Los alimentos pueden ser un vehculo de transmisin de microrganismos
patgenos y por tanto tienen gran trascendencia en la salud de los consumidores. La
adquisicin de enfermedades por el consumo de alimentos contaminados con
microorganismos como S. aureus o sobre infecciones por P. aeruginosa producto de
infeccin intrahospitalaria, ha hecho que cada vez ms pases reconozcan la
necesidad de someter estos productos a ciertas pruebas o estudios enfocados en
evaluar su inocuidad y su calidad. Actualmente se conocen muchas tcnicas para el
control e inhibicin de microorganismos con el fin de preservar los alimentos, una
de stas es la adicin de sustancias de origen natural que le provean al alimento
calidad microbiolgica y al mismo tiempo permitan sustitur los aditivos qumicos.
Adems; son pocos los trabajos en relacin al efecto que tienen los aceites
esenciales accin contra microorganismos patgenos intrahospitalarios, como
Pseudomonas aeruginosa y son reducidos los antimicrobianos confiables contra esta
bacteria, incluyendo cefalosporinas y fluoroquinolonas.
Teniendo en cuenta que la industria de los ctricos en el Per se encuentra
en constante crecimiento debido principalmente a la demanda de limn, naranja,
toronja y recientemente de mandarina. En el Per se cultivan principalmente la
variedad de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma y, por lo general el
flavedo de la mandarina se desecha, se pretende llevar a cabo la obtencin del aceite
esencial de mandarina por medio de una tcnica de destilacin, para su posterior
evaluacin mediante un protocolo donde se evaluar el aceite en una prueba in Vitro
determinando la actividad antimicrobiana frente a microorganismos causantes de
enfermedades transmitidas por alimentos como por infeccin intrahospitalaria como
S. aureus y P. aeruginosa.

3. OBJETIVOS

- Determinar las concentraciones del aceite esencial de mandarina (Citrus
reticulata) variedad Satsuma que presente mayor actividad antibacteriana tanto
para Pseudomona aeruginosa como para Staphylococcus aureus.
- Demostrar si existe diferencia significativa entre la actividad antibacteriana del
aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma y los
antibiticos empleados actualmente frente a P. aeruginosa y S.aureus.
- Demostrar si existe diferencia significativa entre la sensibilidad de P.
aeruginosa y S. aureus frente al aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata)
variedad Satsuma.


4. PROBLEMA

Cul es el efecto de las concentraciones de 0, 20, 40, 60, 80 y 100% del aceite
esencial de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma sobre el crecimiento de
Pseudomona aeruginosa y de Staphylococcus aureus?

5. HIPTESIS

Implcita


6. MATERIAL Y MTODOS

5.1. Material Biolgico
- Tres cultivos de Pseudomona aeruginosa (FGB-001, FGB-002,
FGB-003), proporcionados por el Laboratorio de Fisiologa y
Gentica Bacteriana.
- Tres cultivos de Staphylococcus aureus (ST-001, ST-002, ST-
003), proporcionados por el Laboratorio Referencial de la ciudad
de Trujillo.
- Mandarinas (Citrus reticulata) variedad Satsuma, obtenidos en el
mercado La Hermelinda de Trujillo.
5.2. Metodologa
1.- Obtencin del extracto de aceite esencial de mandarina
1.1. Obtencin de frutos de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma
Se adquirir 20 kg de los frutos de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma
en el marcado La Hermelinda de Trujillo, en completo estado de madurez
fisiolgica, se trasladarn al laboratorio. A los frutos se les retirar las cortezas y se
refrigerarn, para su posterior procesamiento en un lapso no mayor de 2 das.
1.2. Obtencin del aceite esencial
1.2.1. Seleccin
Slo sern utilizadas aquellas mandarinas que no presentasen magulladuras, cortes o
dems lesiones en su flavedo que indiquen que no estn aptas para entrar al proceso
de extraccin.
1.2.2. Lavado
Se realizar con el propsito de eliminar restos de partculas extraas, suciedad y
restos de tierra y pesticidas que puedan estar adheridos a la materia prima.

1.2.3. Rallado
Para esta etapa se utilizar un rallador de acero inoxidable, extrayndole solo el
flavedo de las mandarinas, para aumentar el rea de contacto con el vapor de agua.
1.2.4. Extraccin
Se realizar en los equipos de extraccin por arrastre con vapor e hidrodestilacin
simple, en donde se colocarn 150 g del flavedo en un baln de 1000 ml, el cual
ser calentado en una cocina hasta alcanzar la temperatura de ebullicin del agua lo
cual generar la salida de los aceites esenciales
36
.
El tiempo de extraccin depender del equipo utilizado para cada uno de los
ensayos. En el equipo de arrastre con vapor la duracin de la extraccin estar en el
rango de 20 a 80 min, contndose desde el instante en el que caa la primera gota en
la pera de decantacin, mientras que la extraccin en el hidrodestilador simple
estuvo en el rango de 30 a 110min. La temperatura del agua de enfriamiento fue un
parmetro que se mantuvo en todo momento en un rango de 15C a 18C, logrando
as la fase de condensacin
36
.
1.2.5. Decantacin
La fraccin de aceite esencial extrada se centrifugar a 6000 rpm durante 15 min,
con el fin de separar la fase acuosa de la oleosa.
La separacin de la menor porcin de agua podr ser separada por congelacin o
por adicin de sales deshidratantes, o con una jeringa.
1.2.6. Envasado
El aceite ser envasado en frascos mbar de 12 ml de capacidad, debido a que son
inestables fotoqumicamente.
1.2.7. Almacenamiento
El aceite esencial ser envasado en frascos color mbar y conservado en
refrigeracin a 4 C para los anlisis posteriores.


2.- Preparacin de los inculos bacterianos
2.1. Obtencin de los Cultivos bacterianos
Los seis cultivos bacterianos que se utilizarn para comprobar la actividad
antibacteriana del aceite esencial sern: S. aureus, P. aeruginosa que sern
proporcionados por el laboratorio Referencial de la ciudad de Trujillo y por el
Laboratorio de Fisiologa y Gentica Bacteriana de la Universidad Nacional de
Trujillo, respectivamente.
Los seis cultivos bacterianos sern reactivados, cultivndolos en caldo infusin
cerebro corazn (BHI) por 18 horas a 37 C y conservados a 5C, hasta el momento
de su uso.
2.2. Estandarizacin de los inculos bacterianos
Se tomar una pequea cantidad de colonias, para luego ser suspendidas en
Solucin salina fisiolgica estril hasta alcanzar la turbidez equivalente al tubo N1
del Nefelmetro de Mac Farland (3x10
8
ufc/mL).
3.- Preparacin de las diferentes concentraciones de aceite esencial
A partir del aceite esencial obtenido (100%) se prepararn concentraciones del
aceite a 0, 20, 40, 60, 80 y 100%, utilizando, como solvente, etanol al 99.9%.
Las muestras sern protegidas de la luz, envolviendo los balones en papel de
aluminio.
4.- Prueba de Sensibilidad
La actividad antibacteriana del aceite esencial de mandarina se determinar
utilizando los cultivos bacterianos, siguiendo la tcnica de difusin en agar en
placas
12
, por triplicado.
Las placas contendrn de 22 a 25 ml de agar Mueller-Hinton temperado a 45C
inoculado con una suspensin de cultivo joven bacteriano a la concentracin de 10
6

ufc/mL (previamente estandarizado). A cada placa se le har 4 orificios de 4mm de
dimetro cada uno utilizando un sacabocado estril. A estos orificios se le aadir
10 uL de cada una de las concentraciones de aceite esencial y las placas se
incubarn a 37C por 24 horas.
La actividad antibacteriana del aceite esencial se determinar midiendo el halo de
inhibicin alrededor de cada orificio (la distancia desde el borde del orificio hasta
donde termina el halo), el tamao de esta zona de inhibicin indica si las bacterias
objeto de anlisis tienen una sensibilidad alta, intermedia o baja frente a las
soluciones del aceite esencial. Se considera inhibitorio un valor de 2 mm
2,3,13,14
.
Tambin se realizar tres placas control:
- Para Staphylococcus aureus se utilizar el antibitico Cefalexina.
- Para Pseudomona aeruginosa se utilizar el antibitico Ciprofloxacina.
- Para determinar el efecto del etanol se realizar un control con etanol a las
mismas concentraciones empleadas para el aceite.

6.- Anlisis Estadstico
El procesamiento y anlisis de los resultados obtenidos para la actividad
antibacteriana del aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata) variedad
Satsuma sobre el crecimiento de Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus
se efectuar mediante el programa SPSS versin 18.0. Para realizar los anlisis se
tendr en cuenta los valores promedio de inhibicin de cada concentracin del aceite
esencial evaluado; ya que se realizar tres repeticiones por tratamiento Se realizar
el anlisis de varianza, especficamente un ANAVA unifactorial, a los datos
obtenidos para determinar si hay diferencias significativas en la actividad
antibacteriana entre los dos grupos de bacterias as como con los antibiticos
utilizados (controles). La significancia se reportar con un nivel de confianza del
95%
47
.


III. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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CARTA DE COMPROMISO


El que suscribe Dr. Pedro Estuardo Mercado Martnez, Profesor de la Facultad de Ciencias
Biolgicas, se compromete a asesorar a la seorita Mara Victoria Trujillo Laguna,
identificado con el nmero de matrcula 051900706 de la Escuela Acadmico Profesional
de Microbiologa y Parasitologa, en la ejecucin de su tesis, titulada: Efecto antibacteriano
del aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma en el crecimiento de
Pseudomona aeruginosa y de Staphylococcus aureus.

Trujillo, 23 de Marzo del 2012



...
Dr. Pedro Estuardo Mercado Martnez







CARTA DE COMPROMISO


El que suscribe Dr. Pedro Estuardo Mercado Martnez, Profesor de la Facultad de Ciencias
Biolgicas, se compromete a asesorar a la seorita Sandra Elisa Vidal Eustaquio,
identificado con el nmero de matrcula 051902406 de la Escuela Acadmico Profesional
de Microbiologa y Parasitologa, en la ejecucin de su tesis, titulada: Determinacin de la
Concentracin Mnima Inhibitoria del aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata)
variedad Satsuma en el crecimiento de Pseudomona aeruginosa y de Staphylococcus
aureus.

Trujillo, 23 de Marzo del 2012



...
Dr. Pedro Estuardo Mercado Martnez