EDUCACIN CONTINUADA

EN EL LABORATORIO CLNICO 2009-2010

Ed Cont Lab Cln; 13: 94-103
ADN FETAL EN SANGRE MATERNA: UTILIDAD Y APLICACIO-
NES CLNICAS EN DESARROLLO
Beln Prieto Garca
1
, Alejandra Fernndez Fernndez
2
1
Servicio de Bioqumica Clnica. Hospital Universitario Central de Asturias. Oviedo. Asturias.
2
Laboratorio de Bioqumica. Servicio de Anlisis Clnicos. Hospital Alvarez Buylla. Mieres. Asturias.
INTRODUCCIN
El diagnstico prenatal rene un conjunto de estrategias para la identicacin de defectos con-
gnitos durante el embarazo, tales como alteraciones morfolgicas, estructurales, funcionales
o moleculares del feto.
Actualmente, el diagnstico de muchas de estas alteraciones requiere la obtencin de material
gentico fetal mediante tcnicas invasivas, que conllevan riesgos para el feto y la madre, por
lo que no se ofrecen a todas las gestantes. La obtencin no invasiva de tejido fetal permitira
generalizar el diagnstico de determinadas alteraciones bastante frecuentes, a todas las ges-
tantes, as como minimizar el nmero de tcnicas invasivas.
La deteccin de ADN fetal en sangre materna ha sido uno de los descubrimientos recientes
ms prometedores en el campo del diagnstico prenatal. El desarrollo paralelo de nuevas
tecnologas que permiten la deteccin de pequeas concentraciones de ADN fetal libre en
sangre materna ha hecho que muchos grupos de investigacin vean en esta fuente de material
gentico una opcin interesante para el diagnstico prenatal no invasivo. Las investigaciones
realizadas en patologas fetales y alteraciones del embarazo son prometedoras, aunque todava
son necesarias algunas mejoras en la amplicacin y deteccin del ADN fetal en sangre mater-
na para que pueda extenderse su uso a la prctica clnica.
ADN FETAL LIBRE EN LA CIRCULACIN MATERNA
Se ha descrito la presencia de ADN fetal en plasma materno a partir de la quinta semana de
gestacin. La concentracin de ADN total aumenta signicativamente durante el embarazo,
aproximadamente un 30 % en cada semana de gestacin. Sin embargo, la concentracin de
ADN fetal supone tan slo un 5-7 % del ADN total en sangre materna.
Se conoce poco sobre las caractersticas biolgicas y moleculares del ADN fetal presente en la
circulacin materna. Un descubrimiento interesante es que el ADN fetal es ms pequeo que
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el materno, lo que podra ser utilizado como un posible mtodo para la cuanticacin del ADN
fetal.
Tras el parto, el ADN fetal desaparece de la circulacin materna en cuestin de minutos. Se
han detectado secuencias de ADN fetal en orina de mujeres embarazadas portadoras de un
feto varn, lo que ha llevado a pensar en el aclaramiento renal como posible mecanismo de
eliminacin del ADN fetal.
Respecto al origen del ADN fetal en la circulacin materna, uno de los posibles mecanismos
de liberacin es la apoptosis de las clulas fetales intactas por interaccin con el sistema inmu-
nitario materno, lo que explicara el aumento del nmero de eritroblastos y de la cantidad de
ADN fetal en gestantes con preeclampsia o portadoras de fetos con aneuploidas. Sin embargo,
dado el bajo porcentaje de eritroblastos fetales en sangre materna, estas clulas difcilmente
pueden ser el nico origen del ADN fetal en plasma materno. La concentracin de ADN fetal
en plasma materno correlaciona tanto con la edad gestacional como con la concentracin de
gonadotropina corinica humana (hCG-). Este hallazgo, as como la deteccin de secuencias
de ADN fetal pocos das despus de la implantacin y la elevacin de las concentraciones de
ADN fetal en sangre perifrica de gestantes con preeclampsia, sugieren un origen placentario,
probablemente debido a la apoptosis de las clulas trofoblsticas. Por otra parte, se han detec-
tado secuencias de ADN fetal en otros uidos, como el lquido amnitico, la orina materna y
lquidos cefalorraqudeo y peritoneal maternos, lo que ha llevado a considerar la posibilidad de
una transferencia directa de ADN. Es muy probable que los tres mecanismos coexistan, apor-
tando la placenta la mayor parte del ADN fetal libre en plasma materno.
ANLISIS DE ADN FETAL EN PLASMA MATERNO
Existen diferencias importantes entre los mtodos descritos para el anlisis del ADN en plasma
materno, lo que explica la falta de homogeneidad en los resultados publicados. El mtodo ms
empleado hasta ahora ha sido la Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR) cuantitativa, pero
en la actualidad se estn desarrollando alternativas que combinan la PCR con la cuanticacin
de ratios allicas por espectrometra de masas, fundamentalmente con vistas al diagnstico de
aneuploidas. Algunos parmetros se consideran crticos para la calidad de los resultados, como
el retraso en el procesamiento de las muestras y la ecacia del proceso de extraccin de ADN
empleado. El tratamiento inadecuado de las muestras puede conducir a la lisis de clulas resi-
duales de origen materno en el plasma, lo que interere en la cuanticacin de las secuencias
de ADN fetal.
ADN FETAL EN PLASMA MATERNO Y DIAGNSTICO PRENATAL
En general, las aplicaciones clnicas de la deteccin de ADN fetal en plasma materno se basan
en la cuanticacin de secuencias de ADN fetal o en la deteccin de secuencias exclusivas del
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feto. Muchas de las complicaciones del embarazo se asocian a un aumento de la cantidad de
ADN fetal en la circulacin materna. La principal limitacin es la necesidad de marcadores fe-
tales independientes del sexo, como polimorsmos de ADN, marcadores epigenticos fetales
o mARN de genes expresados en la placenta. Sin embargo, la determinacin no invasiva de
enfermedades mendelianas, como la talasemia o la brosis qustica, parece cada vez ms cer-
cana.
Estudio del riesgo de desarrollar preeclampsia mediante anlisis del ADN fetal en
plasma materno
En patologas obsttricas, como el crecimiento intrauterino retardado o la preeclampsia, los
niveles plasmticos de ADN fetal en plasma materno son superiores a los observados en los
embarazos normales. A su vez, este incremento se asocia con la alteracin en los resultados de
la velocimetra Doppler de la arteria umbilical, pero no muestra relacin con las mediciones
obtenidas en la evaluacin de la arteria uterina. El hallazgo de que el ADN fetal en plasma ma-
terno aumenta incluso antes del desarrollo clnico de la preeclampsia fue descrito por primera
vez en el ao 2001, y se postularon como posibles causas el incremento de clulas fetales que
atravesaban la placenta en estos casos y/o un mayor ndice de apoptosis de las clulas placen-
tarias.
Determinacin no invasiva del Rh fetal
La determinacin del Rh fetal constituye el primer diagnstico prenatal realizado por un mto-
do no invasivo basado en el ADN fetal libre que se ha aplicado de manera rutinaria. El Servicio
Nacional Britnico de Sangre (British National Blood Service) realiza esta determinacin desde
2001.
La enfermedad hemoltica del recin nacido es un patologa que puede provocar secuelas en
el feto, como anemia, hidropsia y aborto. Est provocada en el 50 % de los casos por anti-
cuerpos anti-D maternos que atraviesan la placenta y se unen a los eritrocitos, destruyndolos
y provocando anemia. Desde la introduccin de la prolaxis preventiva, el riesgo de aloinmu-
nizacin anti-RhD se ha reducido considerablemente, disminuyendo del 13 % al 0,16 %. Sin
embargo, la presencia de anticuerpos anti-RhD que provocan aloinmunizacin es del 18,4 %,
con una prevalencia de enfermedad hemoltica del recin nacido de 1/21000 nacimientos en
Inglaterra.
El genotipado RhD se lleva a cabo de forma rutinaria durante el manejo de la enfermedad
hemoltica del recin nacido. Una vez que se detectan los aloanticuerpos en sangre materna y
los parmetros del laboratorio, como el ttulo de anticuerpos o el anlisis de la actividad bio-
lgica, son indicativos de posible hemlisis, es importante conocer el fenotipo del feto. En la
poblacin caucsica aproximadamente el 40 % de las mujeres RhD negativo recibe una admi-
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nistracin antenatal innecesaria de anti-D, ya que son portadoras de fetos RhD negativos. La
posibilidad de un diagnstico prenatal no invasivo para el gen RHD hara posible restringir la
prolaxis antenatal slo a aquellas mujeres con riesgo de inmunizacin. Las ventajas para estas
mujeres son claras e incluyen el evitar un tratamiento innecesario y la tranquilidad ante una
posible exposicin de la madre a la sangre fetal (por ej. ante un aborto espontneo). Adems,
se ha estimado que el coste del anlisis del ADN fetal empleando tecnologa automatizada es
inferior a un tercio del coste de la terapia con inmunoglobulinas.
Bases moleculares del gen RHD: implicaciones en la determinacin del Rh fetal en
sangre materna
El fenotipo RhD negativo se encuentra con una frecuencia aproximada del 15 % en la poblacin
caucsica y se caracteriza mayoritariamente por la homocigosidad para una delecin de RHD.
El locus del Rh est estructuralmente compuesto de 2 genes, uno codica al polipptido RhD
y el otro a los polipptidos CcEe.
En 1990 se clonaron los genes RHD y RHCE, altamente homlogos (93,8 %), lo que permiti la
investigacin y caracterizacin de sus bases moleculares.
Existen 3 mecanismos genticos que dan lugar a las variantes D y D parcial.
Sustitucin de parte del gen RHD con RHCE.
Delecin de parte del gen RHD.
Mutaciones resultantes en sustituciones de un nico aminocido en localizaciones extra-
celulares del polipptido.
La ausencia de uno o ms eptopos D conduce a variantes cualitativas, denominadas D parcia-
les, de las que se han denido siete categoras. La variante D
IV
, en la que estn ausentes la ma-
yora de los eptopos, es la ms habitual, con una frecuencia gnica de 0,02-0,05 %. El fenotipo
D
IV
es el nico dentro de las variantes D capaz de generar anticuerpos anti-D clnicamente rele-
vantes, que pueden causar enfermedad hemoltica del recin nacido grave y muerte neonatal.
La dicultad aadida de estos casos estriba en que, si se emplean anticuerpos policlonales para
genotipar, estas mujeres sern RhD positivo, y no obstante podrn generar anticuerpos frente
a esos eptopos ausentes.
Otro grupo de variantes D lo constituye el tipo D dbil. Se caracteriza por un antgeno D cuali-
tativamente normal, que se expresa a un nivel bajo. Estas variantes tienen su origen en cambios
de nucletidos que dan lugar a la mayora de las mutaciones puntuales de la regin transmem-
brana o citoplasmtica del polipptido, lo que afecta a la expresin ecaz o la correcta inser-
cin en la membrana y conduce a un reducido nmero de copias en la supercie de las clulas
de la serie roja. Algunos individuos D dbil son capaces de causar aloinmunizacin antiD, por
lo que un genotipado prenatal correcto clasicar a estos fetos como RhD positivo.
B. Prieto, A. Fernndez ADN fetal en sangre materna: Utilidad y aplicaciones clnicas en desarrollo
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El genotipado prenatal no invasivo del RhD es relativamente fcil, ya que la amplicacin no
especca del ADN materno es menos probable porque en la mayora de los casos las madres
RhD negativo carecen del gen RHD. No obstante, no existe un protocolo estandarizado. La
mayora de los estudios emplean como tcnica de eleccin la PCR a tiempo real. Debido a las
variantes del gen RHD lo deseable es utilizar ensayos PCR multiplex en los que se amplican
varias regiones del gen RHD para evitar falsos positivos. Los cebadores para la amplicacin
del gen RHD mediante PCR multiplex se seleccionan y disean para el RhD ms comn en la
poblacin a estudio. Es importante tambin evitar la amplicacin por error del gen homlogo
RHCE, mediante la amplicacin de mltiples regiones de una sola copia especcas del gen
RHD. Se han descrito dos diferencias principales entre RHD y RHCE que se han aplicado al de-
sarrollo de las reacciones de PCR: una regin 3 no traducida del exn 10 de RHD, que no est
presente en RHCE, y una diferencia de 600 pb en el intrn 4 entre RHD y RHCE.
La alternativa ms empleada para el genotipado prenatal de RhD se basa en el estudio de los
nucletidos especcos de RhD en el exn 7 del gen RHD (el ms sensible) y al menos una re-
gin secundaria, que puede ser el exn 6, 4 5, para prevenir resultados falsamente positivos
que resultaran en caso de que estuviera presente un gen no funcionante.
La prediccin del estado RhD fetal en plasma materno parece actualmente aplicable a la clnica
rutinaria. La mayora de los estudios alcanzan una sensibilidad y especicidad del 100 %, en
distintas edades gestacionales.
Determinacin no invasiva del sexo fetal
El primer marcador que se desarroll para la deteccin de ADN fetal en plasma materno fue el
cromosoma Y, presente en los fetos masculinos. La determinacin del sexo fetal en etapas tem-
pranas del embarazo es importante en aquellos fetos que presentan riesgo de sufrir patologas
ligadas al cromosoma X, ya que la identicacin de los fetos masculinos implica enfermedad
potencial si la madre es portadora, como ocurre en la hemolia. La determinacin del sexo es
tambin til en los fetos con riesgo de padecer hiperplasia adrenal congnita. Asimismo, re-
cientemente se ha descrito una relacin entre el sexo del feto y la gravedad de la hiperemesis
gravdica.
Actualmente, para la determinacin del sexo fetal en ADN presente en sangre materna se
emplean principalmente dos marcadores: DYS14 y SRY. DYS14 es una secuencia multicopia
localizada en el gen TSPY (testis-specic-protein Y encoded), mientras que SRY es un gen de
copia nica. La secuencia multicopia DYS14 parece ser ms sensible para el anlisis cuantitativo
del ADN fetal en sangre materna pero no se ha estudiado el efecto del nmero de copias en los
polimorsmos. SRY representa la mejor eleccin para el anlisis conrmatorio, ya que la mayo-
ra de los genes diana son tambin genes de copia nica. El anlisis mediante PCR cuantitativa
a tiempo real del gen SRY alcanza incluso un 100 % de sensibilidad.
B. Prieto, A. Fernndez ADN fetal en sangre materna: Utilidad y aplicaciones clnicas en desarrollo
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El principal reto en la determinacin del sexo fetal sigue siendo la ausencia de un marcador
especco de amplicacin del ADN fetal, necesario para asegurar que una ausencia de am-
plicacin se debe a que se trata de un feto femenino y no a un problema de extraccin poco
ecaz del ADN o un error de amplicacin. Las ltimas investigaciones al respecto proponen
el estudio de marcadores epigenticos, que permitan amplicar nicamente el ADN fetal, evi-
tando as las interferencias producidas por el exceso de ADN materno.
Deteccin de aneuploidas cromosmicas: trisoma 21
Aunque varios estudios describen un aumento de la concentracin del ADN fetal en gestantes
con fetos con trisoma 21, los resultados obtenidos son contradictorios. Se observa un solapa-
miento en las concentraciones totales de ADN fetal de las gestantes portadoras de fetos con
y sin trisoma en el cromosoma 21. Se han descrito tambin casos de Sndrome de Down en
los que se observa una disminucin de ADN fetal. Por otra parte, en otras complicaciones del
embarazo tambin se produce un aumento del ADN fetal, por lo que es necesario un mtodo
de deteccin de trisomas que permita distinguir de un modo ms especco el origen del au-
mento de ADN fetal.
Recientemente, se han desarrollado mtodos para la deteccin de aneuploidas basados en
la variacin allica entre la madre y el feto. Estos mtodos determinan la dosis cromosmica
fetal mediante el anlisis de ratios allicas de variantes genticas, si el feto es heterocigoto para
el locus detectado. La primera demostracin, empleando marcadores de metilacin de ADN,
utiliz las secuencias hipometiladas de SERPINB5, localizadas en el cromosoma 18, como dia-
nas especcas del feto. La determinacin de la ratio allica de un polimorsmo de un nico
nucletido (SNP) en el promotor hipometilado de SERPINB5 en fetos heterocigotos se conoce
como ratio allica epigentica.
Con el reconocimiento de marcadores de metilacin de ADN en el cromosoma 21, esta alter-
nativa podra aplicarse para la deteccin prenatal no invasiva de la trisoma 21. Sin embargo,
estos mtodos slo se pueden aplicar a ciertas poblaciones, ya que dependen de la presencia
de polimorsmos genticos en locus especcos. Algunos investigadores proponen la utiliza-
cin de mtodos universales que permitan la cuanticacin digital de ADN fetal, basado en
una secuenciacin y mapeo del cromosoma de origen y en la enumeracin de los fragmentos
por cromosoma, para el diagnstico de las trisomas 21, 13 y 18.
a) Anlisis de ratios allicas
Permiten establecer la ratio entre alelos de un locus heterocigtico localizado en el cromosoma
de inters (ej.: cromosoma 21). La ratio allica para dicho locus ser 1:1 para un feto euploide,
pero 2:1 o 1:2 para uno trismico (Figura 1 A).
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Figura 1. Determinacin de la dosis cromosmica fetal en ADN extrado deplasma materno, empleando la
trisoma 21 como ejemplo (Adaptado de Lo et al. Clin Chem 2008).
Esta opcin puede combinarse con estrategias de enriquecimiento para aumentar la cantidad
de dianas fetales. La opcin ms simple consiste en buscar dianas especcas fetales mediante
marcadores de metilacin de ADN o de mARN placentario.
El anlisis de la dosicacin cromosmica relativa permite establecer la ratio entre un locus del
cromosoma de inters (ej.: cromosoma 21) y otro de referencia localizado en otro cromosoma
distinto. Esta ratio entre molculas de cidos nucleicos fetales debera ser 2:2 para un feto eu-
ploide y 3:2 para uno trismico (Figura 1B).
b) Marcadores epigenticos
Las modicaciones epigenticas son alteraciones somticas del ADN que no alteran la secuen-
cia gentica pero que afectan a la expresin gnica. Una forma ampliamente descrita implica la
metilacin de nucletidos citosina, en los denominadas islotes CpG. Si una secuencia gentica
est hipermetilada, tender a no ser expresada. Un ejemplo clsico es el segundo cromosoma
X femenino, cuya expresin gnica est muy frenada por mecanismos epigenticos.
Como pueden existir diferencias epigenticas entre el ADN fetal y el materno, identicando
loci genticos que dieran en el patrn de metilacin entre madre y feto, es razonable que
dichas diferencias permitan distinguir entre los fragmentos de ADN fetal y materno con la
misma secuencia de nucletidos, por ejemplo mediante digestin con enzimas de restriccin
(Figura 2).
B. Prieto, A. Fernndez ADN fetal en sangre materna: Utilidad y aplicaciones clnicas en desarrollo
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Figura 2. Utilidad de la variacin gentica entre madre y feto, en relacin con el estado de metilacin
del ADN.
Figura 3. Representacin esquemtica de la deteccin no invasiva de trisoma 18 fetal mediante
anlisis de secuencias maspin modicadas epigenticamente (Adaptado de Hahn et al. Semin Fetal
Neonatal Med 2008).
B. Prieto, A. Fernndez ADN fetal en sangre materna: Utilidad y aplicaciones clnicas en desarrollo
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Estos marcadores son independientes del sexo y los polimorsmos y, por tanto, aplicables a
cualquier embarazo. Ej.: RASSF1A (hipermetilacin fetal), SERPINB5 (hipometilacin fetal).
Existe diferencia entre el grado de metilacin del locus maspin fetal y materno: el promotor
del gen no est metilado en la placenta pero est hipermetilado en sangre materna. Esto
puede aprovecharse mediante una reaccin con bisulto, en la que la citosina no metilada se
convierte en timina mientras que la citosina metilada permanece inalterada. As, se generan
secuencias de ADN fetal que pueden discriminarse de las maternas mediante espectrometra
de masas (MS) (Figura 3).
Como el locus maspin est en el cromosoma 18, se ha empleado para la deteccin de trisoma
18. Se cuantican 2 alelos, y se calcula la relacin, de modo que una ratio 1:1 ser propia de
fetos euploides y una ratio 1:2 2:1 signicar aneuploida fetal. Para el anlisis se puede em-
plear una variacin en una nica base (A/C) en la regin promotora de este gen.
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO
El anlisis del ADN fetal es una alternativa realista en el futuro del diagnstico prenatal no inva-
sivo. La relativa abundancia del ADN fetal en plasma materno facilita su deteccin. La principal
limitacin es que actualmente slo es posible detectar secuencias que dieran del ADN gen-
mico materno. Sern necesarios marcadores independientes del sexo, tales como la deteccin
de secuencias especcas fetales, ratios allicas o marcadores epigenticos.
Aunque an de manera limitada, ya se est aplicando en la prctica clnica el aislamiento de
ADN en sangre materna para el diagnstico del sexo fetal, en parejas con riesgo de enfermeda-
des genticas ligadas al cromosoma X, y del Rh fetal, en embarazos con riesgo de enfermedad
hemoltica del recin nacido.
El estudio de mARN fetal en sangre materna constituye tambin una alternativa actualmente
en estudio para el diagnstico prenatal no invasivo. La exploracin de nuevas protenas y trans-
critos placentarios probablemente ofrezcan en un futuro nuevas oportunidades como marca-
dores diagnsticos de cromosomopatas. Cabe esperar que surjan alternativas en el campo de
la postgenmica con suciente ecacia como para sustituir los mtodos actuales de cribado
de cromosomopatas por un diagnstico prenatal en sangre materna sin riesgo alguno para el
feto.
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EDUCACIN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLNICO
COMIT DE EDUCACIN
M.C. Vill (presidenta), D. Balsells, M. Gass, J.A. Lillo, A. Merino, A. Moreno, M. Rodrguez
ISSN 1887-6463
Mayo 2010